ES2345329T3 - Nueva isoforma del inhibidor del crecimiento celular endotelial vascular (vegi). - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que comprende: (a) la secuencia de SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o (c) un complemento de lo anterior.
Description
Nueva isoforma del inhibidor del crecimiento
celular endotelial vascular (VEGI).
Esta solicitud reivindica el beneficio de
prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. de nº de
serie 60/331.190, presentada el 9 de noviembre de 2001.
Esta invención se realizó con el apoyo del
Gobierno de los EE.UU. de acuerdo con la subvención del Departamento
de Defensa
DAMD17-98-1-8093; la
subvención de los Institutos Nacionales de la Salud NHLB1 RO1
HL60660; y la subvención del Instituto Nacional del Cáncer
CA58185-08. El Gobierno tiene ciertos derechos en la
invención.
La presente invención se refiere a composiciones
que son útiles en el tratamiento de afecciones en las que es
ventajoso que se inhiba la angiogénesis, por ejemplo, en el
tratamiento de tumores sólidos, retinopatía diabética, sarcoma de
Kaposi, psoriasis, y artritis reumatoide. En particular, la
invención se refiere a isoformas nuevas de inhibidores del
crecimiento endotelial vascular (VEGIs), a sus secuencias de ADN y
de las proteínas asociadas, a las composiciones y variantes de las
mismas, y a su uso en el tratamiento de las enfermedades controladas
por la angiogénesis.
En condiciones fisiológicas normales, los
humanos y los animales experimentan la angiogénesis, la generación
de vasos sanguíneos nuevos en un tejido u órgano, en situaciones
limitadas muy específicas. Por ejemplo, la angiogénesis se observa
normalmente en la cicatrización de heridas, el desarrollo
embrionario, y la formación del cuerpo lúteo, el endometrio y la
placenta. El término "endotelio" significa una fina capa de
células epiteliales planas que recubre las cavidades serosas, los
vasos linfáticos y los vasos sanguíneos. El término
"anti-angiogénico" o "actividad de
inhibición angiogénica" significa la capacidad de una molécula de
inhibir la angiogénesis en general.
Se cree que la angiogénesis controlada e
incontrolada se desarrolla de una manera similar. Las células
endoteliales están implicadas activamente en la inflamación,
adhesión celular, coagulación, trombosis, fibrinolisis, y
angiogénesis. Las células endoteliales y los pericitos, rodeados por
una membrana basal, forman los vasos sanguíneos capilares. La
angiogénesis comienza con la erosión de la membrana basal mediante
las enzimas liberadas por las células endoteliales y los
leucocitos. Las células endoteliales, que tapizan la luz de los
vasos sanguíneos, sobresalen después a través de la membrana basal.
Los agentes estimulantes angiogénicos inducen la migración de las
células endoteliales a través de la membrana basal erosionada. Las
células que migran forman un "brote" desde el vaso sanguíneo
de origen, en el que las células endoteliales experimentan la
mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se fusionan entre sí
para formar asas capilares, por lo que se crea el vaso sanguíneo
nuevo.
La angiogénesis no regulada persistente se da en
una diversidad de estados patológicos, metástasis tumoral y
crecimiento anormal de las células endoteliales, y favorece las
lesiones patológicas observadas en estas afecciones. Los diversos
estados patológicos en los que está presente la angiogénesis no
regulada se han agrupado entre sí como enfermedades dependientes de
la angiogénesis o asociadas a la angiogénesis.
Durante el crecimiento tumoral, las células
endoteliales proliferan, invaden el estroma, migran hacia la fuente
de estímulos angiogénicos tales como las células cancerosas,
interaccionan con las células perivasculares y las células del
estroma, y finalmente forman vasos capilares que unen el tejido
tumoral con la circulación (J. Folkman (1995) Nat. Med. 1:
27-31). Aunque todavía no se comprende el mecanismo
indudablemente complejo que regula la angiogénesis, cada vez es más
evidente que la iniciación o la terminación del proceso es el
resultado de un equilibrio entre reguladores positivos y negativos
de la angiogénesis. Se han descrito varios factores angiogénicos, a
menudo notablemente aumentados en los tejidos tumorales, que
incluyen varios miembros de la familia de factores de crecimiento
de fibroblastos, tales como FGF-I (G.
Gimenez-Gallego et al. (1985) Science
230.: 1385), FGF-2 (L. Schweigerer et al.
(1987) Nature 325: 257), y los de la familia de factores de
crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) (D. W. Leung
et al. (1989) Science 246: 1306), así como los
receptores de estos factores de crecimiento (L. W. Burrus y B. B.
Olwin (1989) J. Biol. Chem. 264: 18647; S. Wemistrom et
al. (1991) Growth Factors 4: 197; B. Tennan et al.
(1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579. C. de Vries
et al., (1992) Science 255: 989). Recientemente, se
ha descubierto que dos factores proteicos nuevos, la proliferina y
una proteína relacionada con la proliferina, participan en la
regulación de la iniciación y la finalización de la
neovascularización en placenta de ratón (Jackson D, et al.
Science 266, 1581-4, 1994).
También se ha informado de varios inhibidores de
la angiogénesis, que incluyen la trombospondina (D. J Good et
al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6624),
angiostatina (M. S. O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315),
endostatina (M.S. O'Reilly et al. (1997) Cell 88: 277)
y el factor plaquetario-4 (E. Maione et al.
(1997) Science 247:77). Es evidente que la angiogénesis
normal se activa rápidamente cuando es necesario, y finaliza
rápidamente cuando ya no es necesaria, mientras la angiogénesis
patológica, una vez iniciada, a menudo se prolonga y se detiene con
dificultad. Esto indica que el mecanismo de regulación negativa que
funciona en un proceso de angiogénesis normal está ausente o
inhibido en un proceso de angiogénesis patológica. Se ha propuesto
que las actividades proteolíticas que liberan los inhibidores de la
angiogénesis de varios precursores pueden justificar en parte la
inhibición de la angiogénesis, tal como se indica mediante la
activación proteolítica de angiostatina a partir del plasminógeno y
la de endostatina a partir del colágeno XVIII (M. S. O'Reilly,
(1997) Cell 88:277). Muchos de los reguladores conocidos de la
angiogénesis son pleiotrópicos y pueden actuar sobre otros tipos de
células además del que produce los reguladores, aunque es posible
que las células endoteliales puedan producir factores autocrinos
para inhibir un proceso angiogénico o mantener la inactividad de
una vasculatura madura. Por lo tanto, un objetivo de la presente
solicitud es describir reguladores negativos autocrinos nuevos de
la angiogénesis de una clase denominada Inhibidores del Crecimiento
de Células Endoteliales Vasculares (VEGI) que son expresados
específicamente por las células endoteliales.
La solicitud PCT publicada WO 99/23105 describe
una proteína VEGI (VEGI-_{174}) y una variante de
corte y empalme VEGI-_{251} y sus secuencias
nucleotídicas correspondientes. Se describió la actividad
anti-angiogénica de las formas truncadas de manera
N-terminal de VEGI-_{174}. La
proteína VEGI-_{174} exhibió un
20-30% de homología de secuencias respecto de
TNF\alpha, TNF\beta humanos, y el ligando Fas. Se produjo una
proteína con un peso molecular de 22 kD en un experimento de
transcripción y traducción in vitro mediante el uso de un
clon de cADN como molde, coherente con el marco de lectura abierto
predicho de 174 aminoácidos. Esta proteína se denomina en la
presente memoria VEGI-_{174}. El análisis de
hidrofobicidad de la proteína predijo una región hidrófoba de 12
aminoácidos inmediatamente después del segmento
N-terminal de 14 aminoácidos no hidrófobos. Esto
fue coherente con la estructura de una proteína transmembrana de
tipo II, similar a los TNFs (B. B. Aggarwal y K. Natarajan (1996)
Eur. Cytokine News. 7:93). También se describió una isoforma
de VEGI. Esta proteína se denomina en la presente memoria
VEGI-_{251}, que se predijo que era una proteína
de membrana.
Un análisis de Northern reciente de
preparaciones de ARN total de 22 tipos diferentes de células
cultivadas de diversos linajes indicó que los transcritos de esta
proteína solamente se pueden detectar en dos líneas de células
endoteliales: las células HUVE y las células endoteliales venosas
humanas de un pase temprano. No se detectó un mARN en células
endoteliales venosas humanas de un pase posterior, ni se observó en
células arteriales humanas. En claro contraste, los miembros de la
familia de TNF se expresan principalmente en células inmunitarias
(B. B. Aggarwal y K. Natarajan (1996), anteriormente mencionados).
Por ejemplo, TNF\alpha se produce en los macrófagos, monocitos,
neutrófilos, y células T, mientras TNF\beta se produce de manera
predominante en los leucocitos y linfocitos T estimulados con
mitógenos. De manera similar, los ligandos para Fas y otros
miembros de la familia de TNF, CD27, CD30, CD40, OX40, y
4-1 BB, se expresan todos en tipos de células del
sistema inmunitario. Mediante el uso de transferencias de Northern
de múltiples tejidos, se descubrió que un transcrito de EGI se
expresaba en placenta, pulmón, riñón, músculo esquelético, cerebro,
hígado, timo, testículo, ovario y linfocitos de sangre
periférica.
La inhibición de la angiogénesis en un tumor es
una aproximación importante para el tratamiento del cáncer, tal
como los tumores de mama y otros tumores sólidos. En primer lugar,
el crecimiento tumoral y la metástasis dependen de la angiogénesis.
Se ha demostrado en un sistema modelo que el bloqueo de los
capilares de la neovasculatura tumoral mediante una coagulación
inducida específicamente da lugar a la erradicación de la
vasculatura tumoral y conduce a la abrogación de los tumores.
Además, se ha propuesto que las células endoteliales son sumamente
proliferativas en los tejidos tumorales, pero son mayoritariamente
inactivas en los tejidos normales. Esto hace que la neovasculatura
tumoral sea un objetivo específico y atractivo. Además, mientras las
características de las células cancerosas pueden variar enormemente
en diferentes tumores, es probable que la población de células
endoteliales en la mayoría de los tumores sólidos no se transforme,
y así permanezca homogénea. Esto sería aplicable a sujetos humanos
y animales. Por lo tanto, puede ser posible desarrollar un agente
terapéutico antiangiogénico que se podría aplicar de manera
universal para el tratamiento de muchas neoplasias diferentes.
Además de los tumores sólidos, otras
enfermedades importantes controladas por la angiogénesis incluyen la
retinopatía diabética, sarcoma de Kaposi, psoriasis, artritis
reumatoide. Los pacientes que padecen estas enfermedades se pueden
beneficiar de una aproximación terapéutica
anti-angiogénica.
La presente invención identifica y describe
secuencias, funciones, composiciones, y usos terapéuticos de
isoformas nuevas de miembros de la familia de proteínas VEGI. Dos
isoformas nuevas que se denominan VEGI-_{192a} y
VEGI-_{192b} respectivamente, comprenden una
secuencia N-terminal nueva que altera de manera
sustancial las propiedades de la proteína con respecto a su
expresión, secreción y propiedades
anti-angiogénicas.
Se describen dos isoformas nuevas de VEGI
denominadas VEGI_{192a} y VEGI_{192b}, que consisten en 192
residuos de aminoácidos. Ambas isoformas muestran una expresión
específica de las células endoteliales y comparten un segmento
C-terminal de 151 residuos con las
VEGI-_{174} y VEGI-_{251}
previamente descritas. Las isoformas se generan a partir de un gen
humano de 17 kb mediante corte y empalme alternativo. VEGI_{251},
la isoforma más abundante, contiene una señal de secreción
supuesta. La proteína VEGI se detecta en medios acondicionados de
células endoteliales, suero humano y células mamíferas transfectadas
con VEGI_{251}. El patrón de localización subcelular de
VEGI_{251} sugiere una proteína secretora. La sobreexpresión de
VEGI_{251} en las células endoteliales provoca una muerte celular
dependiente de la dosis. Las células cancerosas transfectadas con
VEGI_{251} dieron lugar a tumores de xenoinjertos con una
velocidad de crecimiento y una densidad de microvasos reducidas en
comparación con los tumores de los transfectantes de VEGI_{174}.
La invención proporciona la visión de que la VEGI secretada por las
células endoteliales puede funcionar como un inhibidor autocrino de
la angiogénesis y un modulador que existe de manera natural de la
homeostasis vascular.
La presente invención se refiere a inhibidores
de la proliferación de las células endoteliales en general, y a
inhibidores de la angiogénesis en particular, y a sus métodos de
uso. Las secuencias nucleotídicas completas de
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, y
VEGI-_{251} se muestran en la Tabla 1 (SEQ ID NO:
1), Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), y Tabla 3 (SEQ ID NO: 3), y las
secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en la Tabla 4 (SEQ
ID NO: 4), Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), y Tabla 6 (SEQ ID NO: 6),
respectivamente.
Por lo tanto, en una realización, la invención
proporciona:
- un polinucleótido aislado que comprende: (a)
la secuencia de SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia nucleotídica que
codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o (c) un complemento de los
anteriores;
- un vector que comprende el polinucleótido de
la invención;
- una célula hospedadora que comprende el vector
de la invención;
- una composición farmacéutica que comprende un
polinucleótido de la invención y un excipiente farmacéuticamente
aceptable;
- un polipéptido aislado que comprende la
secuencia de SEQ ID NO: 4;
- un polipéptido aislado que consiste
esencialmente en la secuencia de SEQ ID NO: 4;
- una proteína de fusión que comprende un
polipéptido de la invención;
- una composición farmacéutica que comprende el
polipéptido de la invención y un excipiente farmacéuticamente
aceptable;
- un anticuerpo que se une de manera selectiva
al polipéptido de SEQ ID NO: 4, pero que no se une a
VEGI-_{174}, VEGI-_{192b} o
VEGI-_{251};
- un método para analizar un agente o un fármaco
en función de su actividad inhibidora de la angiogénesis, y dicho
método comprende medir la capacidad de dicho agente o fármaco para
incrementar la actividad anti-angiogénica del
polipéptido de la invención;
- un método para analizar un agente o un fármaco
para estimular la angiogénesis, y dicho método comprende medir la
capacidad de dicho agente o fármaco para reducir o eliminar la
actividad anti-angiogénica del polipéptido de la
invención;
- un método para detectar
VEGI-_{192a} que comprende poner en contacto una
muestra de un individuo con un anticuerpo que se une de manera
selectiva al polipéptido de la invención; y detectar la presencia o
ausencia de un complejo formado entre un polipéptido de la muestra y
el anticuerpo; y
- un método para detectar el polinucleótido de
VEGI-_{192a} que comprende poner en contacto una
muestra de un individuo con un oligonucleótido que se une de manera
selectiva al polinucleótido de la invención; y detectar la presencia
o ausencia de una molécula bicatenaria formada entre el
oligonucleótido y un polinucleótido de la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un polinucleótido aislado
que comprende al menos 10, al menos 15, al menos 18, al menos 20, al
menos 25, al menos 30, al menos 50, y al menos 100 o más nucleótidos
contiguos de SEQ ID NO: 1, en el que los nucleótidos contiguos están
dentro de los nucleótidos 1-93 de SEQ ID NO: 1.
También se describe un polinucleótido aislado
que comprende al menos 10, al menos 15, al menos 18, al menos 20, al
menos 25, al menos 30, al menos 50, y al menos 100 o más nucleótidos
contiguos de SEQ ID NO: 1, en el que los nucleótidos contiguos
comprenden los nucleótidos 93 y 94 de SEQ ID NO: 1.
Se describe un polinucleótido aislado que
comprende la secuencia mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), o su
complemento. También se describe un polinucleótido aislado que
comprende al menos 10, al menos 15, al menos 18, al menos 20, al
menos 25, al menos 30, al menos 50, y al menos 100 o más nucleótidos
contiguos de SEQ ID NO: 2, en el que los nucleótidos contiguos
están dentro de los nucleótidos 1-386 de SEQ ID NO:
2. También se describe un polinucleótido aislado que comprende al
menos 10, al menos 15, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al
menos 30, al menos 50, y al menos 100 o más nucleótidos contiguos de
SEQ ID NO: 2, en el que los nucleótidos contiguos comprenden los
nucleótidos 386 y 387 de SEQ ID NO: 2.
En ciertas realizaciones, la invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4. También se describe un
polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica
al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o
más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4, en el que los
aminoácidos contiguos están dentro de los aminoácidos
1-26 de SEQ ID NO: 4. También se describe un
polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica
al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o
más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4, en el que los aminoácidos
contiguos comprenden los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4. Los
aminoácidos contiguos pueden ser los aminoácidos de alrededor de
5-192, 10-192,
15-192, 20-192, o
25-192 de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ
ID NO: 4).
Se describe un polinucleótido aislado que
comprende una secuencia que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5.
También se describe un polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido que codifica al menos 5, al menos 10, al menos 15,
al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:
5, en el que los aminoácidos contiguos están dentro de los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5. También se
describe un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido
que codifica al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al
menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, en el que los
aminoácidos contiguos comprenden los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID
NO: 5. Los aminoácidos contiguos pueden ser los aminoácidos de
alrededor de 5-192, 10-192,
15-192, 20-192, o
25-192 de la secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ
ID NO: 5).
Se describen secuencias que codifican variantes
funcionalmente conservadas de las secuencias de ácidos nucleicos
descritas en la presente memoria, que incluyen sustituciones,
adiciones y/o deleciones de ácidos nucleicos. Las variantes
incluyen variantes naturales de la secuencia polinucleotídica (p.
ej. variantes degeneradas, variantes alélicas, etc.).
Se describe un polinucleótido aislado que tiene
al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%,
al menos un 94%, al menos un 96%, al menos un 98%, o al menos un 99%
de identidad de secuencias con los polinucleótidos de la invención
tal como se describe en la presente memoria. Se describe un
polinucleótido aislado que tiene al menos un 85%, al menos un 88%,
al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 96%,
al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencias con la
secuencia de nucleótidos 1-93 mostrada en la Tabla 1
(SEQ ID NO: 1) o los nucleótidos 1-386 mostrados en
la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2).
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos de
la invención comprenden además un marcador detectable. En ciertas
realizaciones, el polinucleótido de la invención está inmovilizado
sobre una superficie. En ciertas realizaciones de la invención, el
polinucleótido de la invención es monocatenario. En ciertas
realizaciones de la invención, el polinucleótido de la invención se
selecciona del grupo que consiste en ADN y ARN. En ciertas
realizaciones de la invención, el polinucleótido de la invención se
prepara en parte mediante síntesis química.
Se entiende que (a menos que se especifique o se
requiera de otra manera) cualquier realización de la invención
descrita en la presente memoria que es un polinucleótido abarca
tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas
monocatenarias complementarias que se sabe o se predice que
constituyen la forma bicatenaria.
Se entiende además que la invención proporciona
realizaciones "que consisten en" o "que consisten
esencialmente en" el polinucleótido, los polipéptidos, y/o los
anticuerpos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto, la invención proporciona
vectores y vectores de expresión que comprenden cualquiera de los
polinucleótidos descritos en la presente memoria.
Aún en otros aspectos, la invención proporciona
una célula hospedadora que comprende cualquiera de los
polinucleótidos o vectores descritos en la presente memoria. En
ciertas realizaciones, la célula hospedadora es procariótica, tal
como E. coli. En ciertas realizaciones, la célula hospedadora
es eucariótica, tal como células de ovario de hámster chino
(CHO).
También se describen células que contienen
polinucleótidos recombinantes, lo que comprende un polinucleótido
de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} o
variantes de un polinucleótido de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}. Se describe una célula mamífera o
célula bacteriana modificada genéticamente, tal como E. coli,
que comprende un polinucleótido de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} modificado de manera recombinante, de
forma que el polinucleótido se sobreexpresa. Se describen células
que comprenden una variante de un polinucleótido de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}. Se
describe un polinucleótido de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} unido de manera operable a un
promotor inducible. Las células modificadas genéticamente pueden
poseer un gen de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} variante en vez de un gen de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
nativo.
La invención también proporciona polipéptidos
VEGI-_{192a}. Por lo tanto, la invención
proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de
SEQ ID NO: 4. La invención también proporciona un polipéptido
aislado que comprende un polipéptido codificado por cualquiera de
los polinucleótidos de la invención, tal como se describe en la
presente memoria. También se describe un polipéptido aislado que
comprende al menos alrededor de 5, al menos 10, al menos 15, al
menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de una secuencia
representada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), en el que los
aminoácidos contiguos están dentro de los aminoácidos
1-26 de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID
NO: 4). También se describe un polipéptido aislado que comprende al
menos alrededor de 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al
menos 25, o más aminoácidos contiguos de una secuencia representada
en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), en el que los aminoácidos contiguos
comprenden los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4. Se describe que
los aminoácidos contiguos pueden ser los aminoácidos de alrededor de
5-192, 10-192,
15-192, 20-192,
25-192 de SEQ ID NO: 4.
También se describen polipéptidos
VEGI-_{192b}. Se describe un polipéptido aislado
que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. También se describe un
polipéptido aislado que comprende un polipéptido codificado por
cualquiera de los polinucleótidos de la invención, tal como se
describe en la presente memoria. También se describe un polipéptido
aislado que comprende al menos alrededor de 5, al menos 10, al menos
15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de una
secuencia representada en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), en el que los
aminoácidos contiguos están dentro de los aminoácidos
1-26 de la secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ ID
NO: 5). También se describe un polipéptido aislado que comprende al
menos alrededor de 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al
menos 25, o más aminoácidos contiguos de una secuencia representada
en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), en el que los aminoácidos contiguos
comprenden los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 5. Los aminoácidos
contiguos pueden ser los aminoácidos de alrededor de
5-192, 10-192,
15-192, 20-192,
25-192 de SEQ ID NO: 5.
En otras realizaciones, la invención proporciona
cualquier polipéptido descrito en la presente memoria, en el que el
polipéptido incluye un epítopo. En otras realizaciones, la invención
proporciona cualquier polipéptido descrito en la presente memoria,
en el que el polipéptido está inmovilizado sobre un soporte
sólido.
También se describen polipéptidos que conservan
una actividad biológica de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} y/o
VEGI-_{251}.
Como se demuestra en los Ejemplos, VEGI-_{192a} inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares; y VEGI-_{251} tras la expresión inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares, la formación de tubos similares a capilares en un modelo de angiogénesis in vitro, y también inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos en ratones atímicos.
Como se demuestra en los Ejemplos, VEGI-_{192a} inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares; y VEGI-_{251} tras la expresión inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares, la formación de tubos similares a capilares en un modelo de angiogénesis in vitro, y también inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos en ratones atímicos.
También se describen anticuerpos que se unen de
manera selectiva a VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}. Por lo tanto, se describe un
anticuerpo que se une de manera selectiva a cualquiera de los
polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} descritos en la presente memoria. Se
describe que el anticuerpo es capaz de unirse de manera selectiva a
VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}.
El anticuerpo puede ser capaz de unirse de manera selectiva tanto a VEGI-_{192a} como a VEGI-_{192b}, pero no a otras isoformas de VEGI. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une a un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de esta invención. También se describe un anticuerpo que es capaz de unirse de manera específica a un polipéptido que comprende (a) la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5); o (b) al menos 10 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, en el que los aminoácidos contiguos están dentro de los aminoácidos 1-26 mostrados en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). También se describe un anticuerpo que es capaz de unirse a una región del polipéptido mostrado en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), en el que dicha región es al menos de alrededor de 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, y dicha región comprende los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5.
El anticuerpo puede ser capaz de unirse de manera selectiva tanto a VEGI-_{192a} como a VEGI-_{192b}, pero no a otras isoformas de VEGI. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une a un polipéptido codificado por cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. En una realización, la invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de esta invención. También se describe un anticuerpo que es capaz de unirse de manera específica a un polipéptido que comprende (a) la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5); o (b) al menos 10 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, en el que los aminoácidos contiguos están dentro de los aminoácidos 1-26 mostrados en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). También se describe un anticuerpo que es capaz de unirse a una región del polipéptido mostrado en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) y/o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), en el que dicha región es al menos de alrededor de 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5, y dicha región comprende los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un
anticuerpo policlonal. En otras realizaciones, el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal. Aún en otras realizaciones, del anticuerpo
está inmovilizado sobre un soporte sólido. Aún en otras
realizaciones, el anticuerpo comprende además un marcador
detectable.
La presente invención también proporciona
composiciones, lo que incluye las composiciones farmacéuticas, que
comprenden los polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, vectores
recombinantes, y células hospedadoras de la invención. Se describe
una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de SEQ ID
NO: 4, o un fragmento del mismo, en la que el fragmento comprende
los aminoácidos 26 y 27, en un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
También se describe un inhibidor de la
angiogénesis, en el que el inhibidor comprende polinucleótidos,
polipéptidos o derivados de VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251} en
un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una cantidad
farmacéuticamente aceptable.
También se describe una composición represora o
inhibidora del crecimiento tumoral que comprende polinucleótidos o
polipéptidos de isoformas de VEGI sustancialmente purificados (es
decir, VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}) de
la invención.
Se describe un acelerador de la angiogénesis, y
el acelerador comprende un anticuerpo, un oligonucleótido inverso,
un antagonista, una ribozima, fármaco o agente que reduce o elimina
la función de VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}
cuando se suministra en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en
una cantidad farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona equipos o
matrices que comprenden cualquiera de los polinucleótidos,
polipéptidos y anticuerpos descritos en la presente memoria. Se
describen equipos o matrices para determinar la cantidad de
polinucleótido en una muestra que comprende cualquiera de los
polinucleótidos descritos en la presente memoria. Se describen
equipos o matrices para determinar el nivel de polipéptido en una
muestra que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos en la
presente memoria.
Se describe un método para inhibir la
angiogénesis que comprende administrar a un individuo (tal como un
humano o animal) una composición que comprende un polinucleótido de
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o
VEGI-_{251} sustancialmente purificado, los
polipéptidos de la invención, o una forma modificada de estas
isoformas de VEGI descritas en la presente memoria a una dosis
suficiente para inhibir la angiogénesis. Se describe una
composición que comprende un vector de administración génica que
comprende el polinucleótido mostrado en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 3) o
un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6. El
polinucleótido puede estar asociado de manera operable a una
secuencia reguladora que controla la expresión génica. La
composición puede comprender un polipéptido
VEGI-_{192a}
sustancialmente purificado de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento funcional, en el que el fragmento comprende los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4 o comprende al menos un aminoácido de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4.
sustancialmente purificado de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento funcional, en el que el fragmento comprende los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4 o comprende al menos un aminoácido de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4.
También se describe un método para el
tratamiento o la mejora de una enfermedad y de los procesos que
están mediados por una angiogénesis incontrolada, que comprende la
etapa de administrar a un individuo una composición que comprende
un polinucleótido de VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251},
polipéptidos, o una forma modificada de estas isoformas de VEGI
descritas en la presente memoria en una dosis suficiente para
controlar la angiogénesis. Se describe una composición que
comprende un vector de administración génica que comprende el
polinucleótido mostrado en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 3) o un
polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6. El
polinucleótido puede estar asociado de manera operable a una
secuencia reguladora que controla la expresión génica. La
composición puede comprender un polipéptido
VEGI-_{192a} sustancialmente purificado de la
secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento
funcional, en el que el fragmento comprende los aminoácidos 26 y 27
de SEQ ID NO: 4 o comprende al menos un aminoácido de los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4.
También se describe un método para tratar el
cáncer o inhibir el crecimiento tumoral que comprende administrar a
un individuo una composición que comprende un polinucleótido de
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o
VEGI-_{251}, polipéptidos, o una forma modificada
de estas isoformas de VEGI descritas en la presente memoria en una
dosis suficiente para inhibir el crecimiento tumoral. La
composición puede comprender un vector de administración génica que
comprende el polinucleótido mostrado en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 3) o
un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 6. El
polinucleótido puede estar asociado de manera operable a una
secuencia reguladora que controla la expresión génica. La
composición puede comprender un polipéptido
VEGI-_{192a} sustancialmente purificado de la
secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4), o un fragmento
funcional, en el que el fragmento comprende los aminoácidos 26 y 27
de SEQ ID NO: 4 o comprende al menos un aminoácido de los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4.
También se describe un método para acelerar la
angiogénesis que comprende administrar a un humano o animal una
composición que comprende un anticuerpo, un oligonucleótido inverso,
un antagonista, una ribozima, un fármaco, o un agente que reduce o
elimina la actividad de VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, y/o
VEGI-_{251}.
También se describe un método terapéutico y una
composición para el tratamiento o la mejora de enfermedades y
procesos que están mediados por la angiogénesis, que incluyen, pero
sin limitación, hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástasis,
telangiectasia, psoriasis, esclerodermia, granuloma piógeno,
angiogénesis miocárdica, neovascularización de placas, circulación
colateral coronaria, angiogénesis en miembros isquémicos,
enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma neovascular,
retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, artritis,
neovascularización diabética, uveítis, retinopatía de la
prematuridad, degeneración macular, neovascularización de injertos
corneales, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad
inflamatoria intestinal, mielosupresión, y reestenosis; en el que
la angiogénesis es incontrolada o excesiva, y requiere su
inhibición, y el método comprende proporcionar a un individuo que
necesita tal tratamiento una cantidad eficaz de polinucleótidos o
polipéptidos de isoformas de VEGI (es decir,
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o
VEGI-_{251}) de la invención de forma que se
inhibe la angiogénesis.
También se describe un método terapéutico y una
composición para el tratamiento o la mejora de enfermedades tales
como degeneración macular, cicatrización de heridas, úlcera péptica,
fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación,
menstruación, y placentación, en las que se desea la angiogénesis, y
el método comprende administrar a un individuo que necesita tal
tratamiento un antagonista de polinucleótidos o polipéptidos de
isoformas de VEGI (es decir, VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}) de
la presente invención; oligonucleótidos inversos específicos de
polinucleótidos de isoformas de VEGI, o anticuerpos
anti-VEGI, agentes, o fármacos que reducen o
eliminan la función de VEGI en un vehículo farmacéuticamente
aceptable, en una cantidad farmacéuticamente aceptable.
También se describe un método para detectar un
polipéptido de isoformas de VEGI (VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}) que comprende poner en contacto una
muestra de un individuo con un anticuerpo descrito en la presente
memoria que se une de manera selectiva al polipéptido VEGI de la
invención, y detectar la presencia o ausencia de un complejo
formado entre un polipéptido de la muestra y el anticuerpo. Estos
métodos de detección son aplicables también para detectar cualquiera
de los VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} descritos en la presente memoria.
También se describe un método para la detección
de polinucleótidos de isoformas de VEGI
(VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b})
que comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un
polinucleótido (tal como un oligonucleótido) que se une de manera
selectiva al polinucleótido de VEGI de la invención; y detectar la
presencia o ausencia de una molécula bicatenaria formada entre el
oligonucleótido y un polinucleótido de la muestra. Estos métodos
son aplicables también para detectar cualquiera de los
polinucleótidos de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} descritos en la presente memoria.
También se describe un método para el
diagnóstico de afecciones que implican una angiogénesis patológica,
en el que el método comprende detectar la presencia o ausencia de
polipéptidos derivados de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} en una muestra, y el método comprende
las etapas de:
(i) poner en contacto una muestra de un sujeto
que se sospecha que tiene una angiogénesis patológica con
anticuerpos que son específicos para los polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} de
la invención; y
(ii) detectar la presencia o ausencia de un
complejo formado entre VEGI-_{192a}, y/o
VEGI-_{192b}, y los anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un método para el
diagnóstico de la angiogénesis patológica que comprende detectar la
presencia o ausencia de polinucleótidos de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
(preferiblemente ARN) en una muestra, y el método comprende las
etapas de:
(i) poner en contacto una muestra de un sujeto
que se sospecha que tiene una angiogénesis patológica con
polinucleótidos (tales como oligonucleótidos) que se unen de manera
específica a los polinucleótidos de VEGI-_{192a}
o
VEGI-_{192b} de la invención (por ejemplo, ARN); y
VEGI-_{192b} de la invención (por ejemplo, ARN); y
(ii) detectar la presencia o ausencia de una
molécula bicatenaria formada entre los polinucleótidos y
oligonucleótidos derivados de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un método para el
diagnóstico de la angiogénesis patológica mediante el uso de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el método comprende
diseñar cebadores mediante el uso de la secuencia nucleotídica de
una isoforma de VEGI (es decir, VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}) tal como se muestra en SEQ ID NO:
1, y SEQ ID NO: 2, en el que la reacción en cadena de la polimerasa
amplifica de manera específica una región de VEGI como base para la
detección. Los cebadores se pueden usar para amplificar el ADN de
VEGI o el ARN de VEGI, y esta última amplificación se da después de
convertir el ARN en ADN complementario (cADN) mediante la
transcripción inversa del ARN. El ensayo de PCR se puede llevar a
cabo de manera cuantitativa comparando el producto amplificado con
un patrón, que se puede generar mediante el uso de los métodos
conocidos en la técnica.
También se describe un método para la detección
de polinucleótidos de isoformas de VEGI (es decir,
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}) en
una muestra, y el método comprende analizar la presencia o ausencia
de ARN o ADN de la isoforma de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} en una muestra mediante un ensayo de
hibridación.
También se describe un equipo de diagnóstico o
pronóstico que comprende anticuerpos que se unen a polinucleótidos
o polipéptidos de isoformas de VEGI (es decir,
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}) de
la invención; oligonucleótidos que hibridan a ADN o ARN de VEGI;
y/o cebadores de PCR para la amplificación de ADN o ARN de VEGI, y
reactivos auxiliares adecuados para el uso en la detección de la
presencia de una isoforma de VEGI en una muestra. Debido a que VEGI
puede funcionar como una proteína de membrana, una forma soluble que
existe de manera natural de VEGI asociada a membrana puede
funcionar como su antagonista, y los métodos para la detección de la
forma soluble se describen en la presente memoria.
También se describe un ensayo de diagnóstico que
comprende detectar la presencia o ausencia de una mutación en
polinucleótidos de isoformas de VEGI (es decir,
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}),
que da como resultado la disminución o el incremento de la
expresión o la función de la isoforma de VEGI. Tal ensayo incluiría
un ensayo de hibridación, ensayos de polimorfismos mediante
cartografía de restricción, y secuenciación génica, por nombrar
algunos.
También se describe un método para analizar
posibles agentes o fármacos en función de la actividad inhibidora
angiogénica analizando si el fármaco o el agente es capaz o no de
aumentar la expresión y/o actividad de la isoforma de VEGI (es
decir, VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}). Debido a que las isoformas de VEGI,
como otros inhibidores angiogénicos, se activan mediante proteasas
que liberan la proteína de la membrana celular, las proteasas, así
como otros agentes que facilitan tal activación, tales como iones
metálicos, serían útiles como agentes para incrementar la expresión
de las isoformas de VEGI.
También se describe un método para analizar
posibles agentes o fármacos antitumorales analizando si el fármaco o
el agente es capaz o no de inhibir la angiogénesis aumentando la
expresión y/o actividad de la isoforma de VEGI.
También se describe un método para analizar un
posible fármaco o agente que estimula la angiogénesis analizando si
el agente o fármaco puede o no bloquear y/o inhibir la función de
VEGI (por ejemplo, la inhibición de la angiogénesis). En este caso,
se puede usar la inhibición de las proteasas que activan las
isoformas de VEGI como se discutió anteriormente, o de los agentes
necesarios o los agentes que facilitan tal activación, tales como
los iones metálicos, para inhibir VEGI, por lo que se potencia la
angiogénesis.
Figura 1. Nivel de VEGI en suero en adultos
normales. Se midió el suero de 40 voluntarios normales (20 hombres,
20 mujeres) mediante ELISA con un anticuerpo
anti-VEGI. Cada punto representa un único valor. Se
usó VEGI recombinante purificado para generar una curva patrón. Las
barras horizontales entre los puntos indican los valores medios para
cada sexo.
Figura 2. VEGI se expresa en forma de múltiples
transcritos en tejido humano. La expresión de VEGI en tejidos
humanos adultos se determinó mediante análisis de transferencia de
Northern de múltiples tejidos, mediante el uso de cADN de
VEGI-_{174} de longitud completa marcado con
^{32}P como sonda. Se detectan tres mensajes distintos
relacionados con VEGI de los tamaños indicados.
Figura 3. Aislamiento de cADNs de VEGI nuevos.
A. Esquema que muestra la síntesis de productos de RACE de 5' tras
el cribado de una biblioteca de cADN para aislar cADNs de VEGI de
longitud completa de diversos tejidos humanos. Los rectángulos
sombreados representan adaptadores de 5' ligados presentes en el
panel de RACE. Los cebadores de PCR se indican mediante flechas con
puntas claras. Se visualizan productos de PCR de diferentes tamaños
mediante tinción con bromuro de etidio. Los productos de PCR se
aislaron y se sometieron a secuenciación. L=pulmón; U=útero;
B=cerebro. Se muestra una escalera de pesos moleculares de ADN de 1
Kb entre los carriles L y U. B. Alineación de secuencias de
aminoácidos de tres isoformas de VEGI. Las regiones hidrófobas
supuestas de VEGI-_{251} y
VEGI-_{174} están subrayadas. El asterisco indica
el comienzo de las secuencias homólogas.
Figura 4. Expresión diferencial de
VEGI-_{174} y VEGI-_{251} en
tejidos humanos. Se llevaron a cabo análisis de transferencia de
Northern de la expresión de VEGI en tejidos humanos adultos con
fragmentos de cADN específicos de VEGI-_{251} y
VEGI-_{174}. Se detecta un transcrito de 2 kb con
la sonda de VEGI-_{174}, a la vez que se detecta
un mensaje de 7,5 kb con la sonda de VEGI-_{251}.
Los tejidos humanos examinados fueron los siguientes: 1. Leucocitos
de sangre periférica, 2. Pulmón, 3. Placenta, 4. Intestino delgado,
5. Hígado, 6. Riñón, 7. Bazo, 8. Timo, 9. Colon, 10. Músculo
esquelético, 11. Corazón, 12. Cerebro.
Figura 5. Análisis de protección de
ribonucleasas de isoformas de VEGI en diversas células cultivadas.
El ARN total de cada cultivo mostrado se hibridó con sondas de VEGI
específicas de las isoformas y \beta-actina como
control de carga. Las sondas sin digerir de longitud completa se
muestran en el carril de las sondas (P), indicadas mediante puntas
de flecha oscuras, y los productos de la protección de RNasa se
indican mediante puntas de flecha claras. Y= ARN de levadura, Hc=
células endoteliales de arteria coronaria humana, Hm= células
endoteliales microvasculares dérmicas humanas, Hu= células
endoteliales de vena umbilical humana, Sm= células de músculo liso
de arteria coronaria humana, 3T= línea de células de ratón
embrionarias NIH3T3, Ba= células endoteliales aórticas bovinas
adultas, Bh= células endoteliales de corazón bovino fetal, Hy=
células de hibridoma humano EA.Hy926, bE=células de endotelioma de
cerebro de ratón bEND.3.
Figura 6. Estructura génica de VEGI humano y
generación propuesta de isoformas. Los segmentos numerados de 1 a 9
representan los fragmentos de PCR generados durante la cartografía
génica, con pares de cebadores específicos enumerados en la sección
de Materiales y Métodos. Los rectángulos con números romanos encima
representan exones, y las líneas horizontales representan secuencias
intrónicas. El sitio supuesto de comienzo de la transcripción se
indica mediante una punta de flecha doble. R indica la secuencia sin
traducir de 5' única para cada transcrito respectivo, y los
rectángulos punteados representan la región sin traducir común de
3'. Se indican los tamaños aproximados de los intrones. Las
secuencias específicas de VEGI-_{251},
VEGI-_{192a} o VEGI-_{174} se
marcan como "_{251}", "192" o "_{174}". El exón
IIIb codifica los residuos compartidos por
VEGI-_{251} y VEGI-_{192a}. Los
intrones en posición 5' de los exones III y IV están sin marcar
porque no se han determinado los extremos 5' o los sitios de
iniciación de los transcritos de
VEGI-_{192a} y VEGI-_{174}. "COM" indica la región codificante del último exón que es común para las tres isoformas.
VEGI-_{192a} y VEGI-_{174}. "COM" indica la región codificante del último exón que es común para las tres isoformas.
Figura 7. TNF\alpha induce la expresión de
isoformas de VEGI en células endoteliales de microvasos y de vasos
grandes. Los ensayos de protección de ribonucleasas muestran la
inducción paralela de la expresión de VEGI. Las flechas indican los
ARNs protegidos. A. Células HMVE tratadas con TNF\alpha a 15, 50 y
90 ng/ml a lo largo de 24 hr. B. Inducción de la expresión génica de
VEGI mediante TNF\alpha en células HUVE. Las células HUVE se
trataron (+) con 20 ng/ml de TNF\alpha durante 4, 8 y 24 hr. Los
controles (-) recibieron tratamientos con el vehículo
correspondiente.
Figura 8. Localización intracelular de
VEGI-_{174} y VEGI-_{251}
recombinantes en células endoteliales transfectadas. A.
VEGI-_{174}-myc y
VEGI-_{251}-myc (B) se detectaron
en células ABAE transfectadas mediante tinción con Rojo Texas de los
marcadores myc asociados. C. Tinción doble de
VEGI-_{251}-myc (rojo) y factor de
von Willebrand (verde) en células HUVE transfectadas. El diagrama de
D representa construcciones de expresión de VEGI con un marcador myc
C-terminal. E-J. Las construcciones
de VEGI marcado con GFP en posición N-terminal
mostraron una distribución diferente en las células ABAE. Las
células transfectadas con vector plasmídico (E) mostraron GFP por
toda la célula, mientras tres construcciones de VEGI (F,
H-J) dieron como resultado distribuciones
localizadas de GFP. En I y J, VEGI-_{251}
1-99 dirigió la distribución de GFP en la membrana
plasmática. K. Los marcadores de GFP en las construcciones de
expresión usados en F a J se localizan en los extremos
aminoterminales de los fragmentos de VEGI.
Figura 9. Detección mediante análisis de Western
de VEGI-_{251} en medio acondicionado mediante
células MB231 transfectadas y células HUVE sin transfectar. A. Medio
acondicionado de transfectantes estables de
MDA-MB231. Carril 1 = vector pcDNA3 solamente,
Carriles 2 y 3 = dos clones independientes que expresan
VEGI-_{251}. B. Carril 1 = medio acondicionado de
células HUVE, Carril 2 = lisado de células HUVE. En ambos
experimentos, los medios acondicionados se concentraron con columnas
Centricon (umbral de peso molecular 10.000), se inmunoprecipitaron
mediante el uso de un anticuerpo policlonal, después se sometieron a
SDS-PAGE y detección mediante transferencia de
Western con el uso de un anticuerpo monoclonal 1-8F
hacia la región C-terminal común de VEGI (residuos
29-_{174}). Ambos paneles muestran péptidos VEGI
de aproximadamente 25 kD.
Figura 10. La sobreexpresión de
VEGI-_{251} provoca la muerte de células
endoteliales e interfiere con la neovascularización tumoral. A. La
administración mediante lentivirus de VEGI secretado es letal para
las células HUVE. Citotoxicidad dependiente de la dosis de una
reserva lentiviral que expresa VEGI-_{251} y sVEGI
en comparación con VEGI-_{174}. Veinticuatro horas
tras la infección viral, se contaron las células adherentes que
quedaban en el cultivo mediante un contador Coulter. Se estimaron
los niveles de p24 viral, y la dosis viral se expresa como la
multiplicidad de infección (MOI). Los valores mostrados son la media
\pm EEM de tres experimentos independientes. B. retraso del
crecimiento del tumor de mama MDA-MB231 por
xenoinjerto mediante VEGI-_{251} y sVEGI. Se
inyectaron mezclas de células MDA-MB231
transfectadas de manera estable que expresaban la construcción
indicada de manera subcutánea en panículos adiposos mamarios de
ratones atímicos hembra, y los tamaños de los tumores se
monitorizaron con enmascaramiento. Los ratones de control recibieron
células MDA-MB231 transfectadas con un vector pcDNA3
vacío. La atenuación del crecimiento tumoral se observó para
VEGI-_{251} y sVEGI, pero no para
VEGI-_{174} de longitud completa. C. La
transfección con VEGI-_{251} y sVEGI dio como
resultado densidades reducidas de microvasos en tumores de
xenoinjertos de MB231. Se tomaron cortes en parafina (5 \mum) de
tumores de los ratones descritos en la Figura 10A. Los vasos se
identificaron mediante inmunotinción con CD31 como se describe en la
sección de Materiales y Métodos. Se usó del análisis unívoco de la
varianza. a: P < 0,0005; b: P < 0,05 respecto de
xenoinjertos de control con vector pcDNA3.
Figura 11. Fotografía de los resultados de un
análisis mediante transferencia de Northern de múltiples tejidos de
la expresión de VEGI en diversos órganos humanos, mediante el uso de
cADN de VEGI-_{174} marcado con
P-32 como sonda. Son visibles señales de mARN de
VEGI de diferentes tamaños.
Figura 12. Un esquema que ilustra los
procedimientos de RACE-PCR usados para buscar
isoformas de VEGI posibles. ADP1 y ADP2 indican los cebadores
específicos del adaptador. GSP1 y GSP2 indican los cebadores
específicos del gen.
Figura 13. Fotografía de los resultados de la
electroforesis en gel de agarosa de los productos de
RACE-PCR. Se visualizan cuatro productos de PCR de
diferentes tamaños a partir de diferentes tejidos humanos mediante
el uso de tinción con bromuro de etidio. Los productos de PCR se
aislaron y se sometieron a secuenciación.
Figura 14. Fotografía de un análisis de
transferencia de Western de los medios acondicionados de células
MDA-MB-231 transfectadas con un
vector vacío (carril 1) o cADN de VEGI-_{251}
(carril 2). Los medios acondicionados se sometieron a cromatografía
de filtración en gel y las fracciones con un intervalo de pesos
moleculares de 10-50 kD se recogieron y se
sometieron a SDS-PAGE. Panel A: Tinción con azul de
Coomassie del gel. Panel B: Transferencia de Western con un
anticuerpo monoclonal (13-2D) hacia VEGI.
Figura 15. Gráfico que muestra la inhibición del
crecimiento de tumores de xenoinjertos formados por células
MDA-MB-231 transfectadas con
VEGI-_{174}, VEGI-_{251},
IL6/VEGI, o un vector pcDNA-3 vacío. Se inyecta un
millón de células transfectadas de manera estable en panículos
adiposos mamarios de ratones atímicos hembra. Hay 2 sitios de
inyección por animal, y 5 animales por grupo. Los grupos se
codifican y se monitorizan los tamaños de los tumores de
xenoinjertos con enmascaramiento. Se observa la inhibición
estadísticamente significativa del crecimiento de los tumores para
las células que sobreexpresan VEGI-_{251} o
IL6-VEGI. La sobreexpresión de
VEGI-_{174} no tiene efecto sobre el crecimiento
tumoral.
Figura 16. Análisis inmunohistoquímico de las
muestras tumorales obtenidas de los experimentos descritos en la
Figura 7, mediante el uso de mAb 13-2D hacia VEGI
humano. Las células que sobreexpresan VEGI se tiñen de color marrón.
Los paneles de la izquierda son fotografías de cortes de tumores
formados por las células transfectadas con
VEGI-_{251}. Los niveles de producción de
VEGI-_{251} aparentemente fueron muy variables,
como es evidente a partir de la tinción intensa de algunos de los
cortes de tumor (G9-1R), lo que sugiere niveles
elevados de producción de VEGI, frente a la tinción notablemente
menor de algunos tumores del mismo grupo (G9-2R).
Los paneles de la derecha son fotografías de cortes de tumores
formados por células con vector de control. Es probable que la
tinción marrón en los cortes de tumores de control sea el resultado
de la reacción cruzada del anticuerpo hacia las moléculas de VEGI
intrínsecas en el endotelio de ratón.
Figura 17. Gráfico que muestra que la velocidad
de crecimiento de los tumores formados mediante las células
cancerosas MDA-MB-231 transfectadas
con VEGI-_{251} varía de acuerdo con la cantidad
de VEGI producida por las células cancerosas. Los tumores en los que
el nivel de VEGI es mayor (G9-1R) crecen mucho más
lentamente que los que tienen niveles bajos de VEGI
(G9-2R).
Figura 18. Análisis mediante transferencia de
Northern de transcritos de VEGI. Panel A, expresión de VEGI en
células humanas: Jurkat, células de leucemia de células T humanas;
L923, célula de riñón embrionario humano; HL60, leucemia
promielocítica humana; V.E, célula endotelial venosa humana (10º
pase); A431, carcinoma epidermoide humano; V.E.-2, célula endotelial
venosa humana (20º pase); Raji, linfoma de Burkitt humano; A.E,
célula endotelial arterial humana; THP-1, leucemia
monocítica humana; CCD-29Lu, enfisema pulmonar
humano; CAMA1, cáncer de mama; AN3CA, cáncer uterino; SK.UT.1,
cáncer uterino; MG63, osteoblastoma; HOS, osteoblastoma; MCF7,
cáncer de mama; OVCAR-3, cáncer ovárico;
CAOV-3, cáncer ovárico; HUVE, célula endotelial de
vena umbilical humana; AOSMIC, músculo liso. El tamaño del mensaje
estimado es de 6,5 kb. Panel B. Expresión de VEGI en tejidos humanos
adultos mediante el uso de transferencias de Northern de múltiples
tejidos (Clonetech): Se llevaron a cabo tres transferencias
distintas. Se muestran los resultados positivos de cualquiera de los
tres experimentos.
Figura 19. Gráfico que muestra el efecto de VEGI
sobre la proliferación de células endoteliales y células de cáncer
de mama. El número de células se representa frente a la
concentración de VEGI tal como se indica. Se muestra la inhibición
del crecimiento de las células ABAE (círculos oscuros), pero no el
de las células MDA-MB-231 (círculos
claros) o MDA-MB-435 (triángulos).
Las células cancerosas y las células ABAE se siembran a 2000 y 8000
células/pocillo, respectivamente, por triplicado en placas de 24
pocillos. Los medios de cultivo contuvieron IMEM (Gibco) y un 10% de
FCS. Se añade FGF-2 (1 ng/ml) a los medios para las
células ABAE. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC, 5% de CO_{2},
durante 6 días. Después se tripsinizan las células, y se determina
el número de células mediante el uso de un contador Coulter. Se
representa un quinto del número total de células ABAE recuperadas
para normalizar la comparación con las células cancerosas.
Figura 20. Expresión de VEGI en células
endoteliales en proliferación o en reposo. Se determinan los niveles
de mARN de VEGI en células HUVE cultivadas mediante análisis de
transferencia de Northern. Se carga una cantidad idéntica de ARN
total (15 \mug) en cada carril, tal como se indica mediante la
intensidad de \beta-actina. Se prepara el ARN
total en el punto de tiempo indicado (días tras la siembra). Se
determina simultáneamente el número de células en cada matraz de
cultivo. El experimento se lleva a cabo por duplicado. Las células
se sembraron a 125.000 células por matraz (T-25) en
IMEM, 10% de FCS, 6 ng/ml de FGF-2, y se cultivaron
a 37ºC, 5% de CO_{2}.
Figura 21. Gráfico que muestra el efecto de VEGI
sobre la capacidad de las células ABAE de formar tubos similares a
capilares en geles de colágeno. Se muestra la capacidad de VEGI
recombinante de inhibir la formación de tubos similares a capilares
de las células ABAE. Se obtienen los valores de p (prueba t)
proporcionados sobre las barras comparando el grado de formación de
tubos similares a capilares por las células ABAE en presencia de
diversas concentraciones de VEGI, tal como se indica, respecto de
cuando no hay VEGI en los medios de cultivo.
Figura 22. Gráfico que muestra la inhibición de
la angiogénesis en geles de colágeno colocados sobre una membrana
corioalantoidea embrionaria de pollo (CAM) mediante VEGI. El
crecimiento de los vasos capilares nuevos en esferas de gel de
colágeno (0,05 ml) colocadas sobre CAM se induce mediante
FGF-2 (100 ng) o VEGF (250 ng), impregnados de los
geles. El grado de angiogénesis en los geles se determina mediante
el análisis de la intensidad de fluorescencia de
FTIC-dextrano inyectado en la circulación de CAM y
retenido en el gel. Se muestra la inhibición del crecimiento de los
vasos capilares mediante VEGI, indicada mediante un valor menor de
100. El inhibidor se impregna también en los geles. Las barras de
error representan la desviación estándar de valores experimentales
por
triplicado.
triplicado.
Figura 23. Gráfico que muestra la inhibición del
crecimiento de tumores de xenoinjertos de cáncer de mama humanos en
ratones atímicos mediante VEGI. Se inyectaron mezclas de células CHO
que sobreexpresaban VEGI o transfectadas con vector (5x10^{6}
células por inyección) y células de cáncer de mama humano
(1x10^{6} células por inyección) en panículos adiposos mamarios de
ratones atímicos hembra. Se monitorizaron los tamaños de los tumores
tras la inyección. Panel A: Representación de los tamaños de los
tumores de xenoinjertos MDA-MB-231
(mm^{2}) como función del tiempo tras la inoculación (días). Panel
B: Representación de los tamaños de los tumores de xenoinjertos
MDA-MB-435 (mm^{2}) como función
del tiempo tras la inoculación (días). Círculos claros,
co-inoculados con células CHO transfectadas con
vector. Círculos oscuros, co-inoculados con células
CHO transfectadas con VEGI secretado.
Figura 24. Gráfico que representa el efecto de
VEGI-_{192a} sobre la proliferación de las células
endoteliales. Se muestra la inhibición del crecimiento de células
ABAE mediante VEGI-_{192a} replegada de manera
apropiada, pero no mediante VEGI-_{192a} replegada
de manera inapropiada o tampón. Las células ABAE se siembran a 8000
células/pocillo, respectivamente, por triplicado en placas de 24
pocillos. Los medios de cultivo contuvieron IMEM (Gibco) y un 10% de
FCS. Se añadió FGF-2 (1 ng/ml) a los medios para las
células ABAE. Los cultivos se mantuvieron a 37ºC, 5% de CO_{2},
durante 6 días. Después se tripsinizaron las células, y se determinó
el número de células mediante el uso de un contador Coulter. Se
representa un quinto del número total de células ABAE recuperadas
para normalizar la comparación con las células cancerosas.
En la presente memoria se describen isoformas
nuevas de polinucleótidos y polipéptidos VEGI que inhiben el
crecimiento de las células endoteliales vasculares y métodos para el
tratamiento de enfermedades y procesos que están mediados o
asociados a la angiogénesis a través de la administración de estos
polinucleótidos, polipéptidos, y otros agentes. Los polinucleótidos
o polipéptidos VEGI de la invención se pueden aislar a partir de
líquidos corporales que incluyen, pero sin limitación, suero,
orina, y liquido ascítico, o se pueden sintetizar mediante métodos
químicos o biológicos (por ejemplo, cultivo celular, expresión de
genes recombinantes).
Las técnicas recombinantes incluyen la
amplificación génica a partir de fuentes de ADN mediante el uso de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la amplificación
génica a partir de fuentes de ARN mediante el uso de la
transcriptasa inversa/PCR. Estos métodos se conocen bien en la
técnica. VEGI inhibe el crecimiento de vasos sanguíneos en tejidos
tales como tumores sin vascularización o vascularizados. Se discute
una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kD y
cualquier forma modificada de la proteína, que incluye, pero sin
limitación, un truncamiento o una modificación postraduccional tal
como una forma glicosilada de la proteína que es capaz de superar la
actividad angiogénica de los factores de crecimiento endógenos.
Tal como se describe en la presente memoria, un
polinucleótido o polipéptido de VEGI "mutante" o
"variante" es una secuencia polinucleotídica o polipeptídica
que comprende una o más deleciones, adiciones, transversiones, o
alteraciones de la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos. Tal
como se describe adicionalmente en la presente memoria, una
secuencia de VEGI mutante puede dar como resultado un polinucleótido
o polipéptido de VEGI truncado o alterado, la expresión
incrementada o disminuida de un polinucleótido o polipéptido de
VEGI, o cualquier combinación de los mismos. La mutación puede ser
en los nucleótidos codificantes, no codificantes, flanqueantes de 5'
o 3', genómicos o codificantes.
Una variante "conservada funcionalmente" de
un polinucleótido de isoforma de VEGI (es decir,
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o
VEGI-_{251}) o polipéptido de isoforma de VEGI es
una secuencia de VEGI que mantiene al menos un aspecto de la
función de la isoforma de VEGI. Las variantes conservadas
funcionalmente se pueden deber a diferencias de secuencia lineal,
que surgen, por ejemplo, de mutación(es), adición(es),
deleción(es), y/o modificación(es) de bases
individuales. La diferencia puede surgir también de cambios en
el/los carbohidrato(s) y/o enlace(s) entre las bases.
Con respecto a los polipéptidos, las variantes conservadas
funcionalmente puede surgir, por ejemplo, mediante sustituciones de
aminoácidos conservativas y no conservativas, análogos de
aminoácidos, y deleciones. La función que se conserva depende de la
función relevante que se considera. Por ejemplo, si se considera un
polinucleótido de isoforma de VEGI como sonda, entonces la capacidad
de una secuencia polinucleotídica variante de hibridar con el
objetivo es la función relevante. Si se considera un polinucleótido
por su capacidad de codificar un polipéptido de isoforma de VEGI (o
un fragmento del mismo), entonces la capacidad de una secuencia
variante de codificar el mismo polipéptido es la función relevante.
Si se considera un polipéptido de isoforma de VEGI por su capacidad
de unirse a una entidad particular (tal como un anticuerpo u otra
proteína), entonces la capacidad de una secuencia variante de
codificar un polipéptido con características de unión equivalentes
es la función relevante. Un polipéptido de isoforma de VEGI se puede
considerar por la actividad biológica del producto génico
codificado (p. ej., una actividad biológica atribuida a un producto
génico que corresponde a los polinucleótidos de la isoforma de VEGI
como resultado de la asignación del producto génico a una
familia(s) de proteínas y/o la identificación de un dominio
funcional presente en el producto génico). Un polipéptido que
demuestra "actividad funcional" significa un polipéptido capaz
de exhibir una o más actividades funcionales conocidas asociadas a
un polipéptido de isoforma de VEGI completo o maduro. Tales
actividades funcionales incluyen, pero sin limitación, la actividad
biológica (por ejemplo, la inhibición de la angiogénesis, la
inhibición de la proliferación de células endoteliales vasculares,
la inducción de la adhesión celular, la antigenicidad (capacidad de
unirse o competir con uno o más polipéptidos de isoformas de VEGI
por la unión a un anticuerpo anti-isoforma de
VEGI), inmunogenicidad (capacidad de generar anticuerpos que se unen
a uno o más polipéptidos de isoformas de VEGI), la capacidad de
formar polímeros con otros polipéptidos VEGI, y la capacidad de
unirse a un receptor o ligando para un polipéptido VEGI (por
ejemplo, DR3).
Tal como se usa en la presente memoria,
"expresión" incluye la transcripción y/o traducción.
"Heterólogo" significa derivado de (es
decir, obtenido de) una entidad distinta genotípicamente del resto
de la entidad con la que se está comparando. Por ejemplo, un
polinucleótido se puede colocar mediante técnicas de ingeniería
genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente,
por lo que se convierte en un polinucleótido heterólogo. Un
promotor que se une a una secuencia codificante a la cual no está
unida de manera natural es un promotor heterólogo.
Un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo
"reactivo" es una sustancia proporcionada para una reacción, y
la sustancia tiene ciertos parámetros conocidos y deseables para la
reacción. Una mezcla de reacción puede contener también un
"objetivo", tal como un polinucleótido, anticuerpo,
polipéptido, o construcción de polipéptidos con el cual el reactivo
es capaz de reaccionar. Por ejemplo, en ciertos tipos de ensayos de
diagnóstico, la presencia y/o cantidad del objetivo en una muestra
se determina añadiendo un reactivo, permitiendo que el reactivo y
el objetivo reaccionen, y midiendo la cantidad de producto de la
reacción (si existe). En el contexto del tratamiento clínico, un
"objetivo" puede ser también una célula, un grupo de células,
tejido, u órgano que es el objetivo de una sustancia administrada,
tal como un compuesto farmacéutico.
Una "molécula bicatenaria estable" de
polinucleótidos, o un "complejo estable" formado entre dos o
más componentes en una reacción bioquímica, se refiere a una
molécula bicatenaria o complejo que tiene una duración suficiente
para persistir entre la formación de la molécula bicatenaria o el
complejo y la detección posterior, que incluye cualquier etapa de
lavado opcional u otra manipulación que puede tener lugar entre
tanto.
Un gen o polinucleótido se "expresa de manera
diferencial" en una muestra de ensayo cuando el polinucleótido
se detecta a un nivel superior o inferior en comparación con una
muestra de control del mismo tipo. En general, un polinucleótido
expresado de manera diferencial incluye los polinucleótidos que se
expresan de forma que, por ejemplo, se halla mARN a niveles de al
menos alrededor del 25%, al menos alrededor del 50% al 75%, al
menos alrededor del 90%, al menos alrededor de 2 veces, al menos
alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 5 veces, y al menos
alrededor de 10 veces o más, más (p. ej., sobreexpresado) o menos
(p. ej., subexpresado). La comparación se puede realizar entre dos
tejidos, por ejemplo, si uno se está usando en hibridación
situ o en otro método de ensayo que permite cierto grado de
discriminación entre tipos celulares en el tejido. La comparación se
puede realizar también entre células extraídas de su fuente de
tejido.
Una "cantidad eficaz" de fármaco,
compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente
para llevar a cabo resultados beneficiosos o deseados que incluyen
resultados clínicos tales como la inhibición del crecimiento de las
células endoteliales vasculares, la inhibición de la angiogénesis,
la estimulación de la angiogénesis, la reducción del tamaño del
tumor, el retraso del crecimiento de las células cancerosas, la
disminución de uno o más síntomas que resultan de la enfermedad, el
incremento de la calidad de vida de los que padecen la enfermedad,
la disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para
tratar la enfermedad, el efecto de potenciación de otra medicación,
el retraso de la progresión de la enfermedad, y/o la prolongación de
la supervivencia de los pacientes, directamente o indirectamente.
Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más
administraciones. Como se entiende en el contexto clínico de una
enfermedad asociada a la angiogénesis, una cantidad eficaz de un
fármaco, compuesto, o composición farmacéutica se puede alcanzar o
no en conjunción con otro fármaco, compuesto, o composición
farmacéutica. Así, una "cantidad eficaz" se puede considerar en
el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos,
y se puede considerar que un único agente se administra en una
cantidad eficaz si, junto con otro u otros agentes, se puede
alcanzar o se alcanza un resultado deseable.
Tal como se usa en la presente memoria,
"tratamiento" o "tratar" es una aproximación para obtener
resultados beneficiosos o deseados que incluyen preferiblemente
resultados clínicos. Para los fines de esta invención, los
resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin
limitación, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación
de las células endoteliales vasculares, inhibir la angiogénesis,
estimular la angiogénesis, reducir el tamaño del tumor, disminuir
los síntomas resultantes de la enfermedad, incrementar la calidad de
vida de los que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras
medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retrasar la
progresión de la enfermedad, y/o prolongar la supervivencia de los
pacientes.
El "desarrollo" o la "progresión" de
una enfermedad asociada a la angiogénesis en la presente memoria
significa las manifestaciones iniciales y/o la progresión
subsiguiente del trastorno. El desarrollo de la enfermedad asociada
a la angiogénesis puede ser detectable y se puede determinar
mediante el uso de técnicas clínicas habituales. Sin embargo, el
desarrollo se refiere también a la progresión de la enfermedad que
puede ser indetectable. Para los fines de esta invención, el
desarrollo o la progresión se refiere al curso biológico del estado
de la enfermedad. El "desarrollo" incluye la manifestación,
recurrencia, y comienzo. Tal como se usa en la presente memoria,
"comienzo" o "manifestación" de una enfermedad asociada a
la angiogénesis incluye el comienzo inicial y/o la recurrencia.
Tal como se usa en la presente memoria,
"retrasar el desarrollo" de una enfermedad asociada a la
angiogénesis significa diferir, dificultar, ralentizar, retardar,
estabilizar, y/o posponer el desarrollo de la enfermedad. Este
retraso puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de
la historia del trastorno y/o del perfil médico del individuo a
tratar. Como es evidente para un experto en la técnica, un retraso
suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención,
puesto que el individuo no desarrolla una enfermedad detectable. Un
método que "retrasa" el desarrollo de la enfermedad es un
método que reduce el grado de la enfermedad en un espacio de tiempo
dado, cuando se compara con la no utilización del método. Tales
comparaciones se basan en general en estudios clínicos, mediante el
uso de un número estadísticamente significativo de sujetos, aunque
este conocimiento se puede basar en pruebas anecdóticas. "Retrasar
el desarrollo" puede significar que se reduce el grado y/o las
manifestaciones clínicas indeseables y/o se frena o se alarga el
curso de la progresión, en comparación con la ausencia de
administración del agente. Así, la expresión también incluye, pero
sin limitación, el alivio de los síntomas, la disminución del grado
de la enfermedad, un estado estabilizado (es decir, que no empeora)
de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de
la enfermedad, y la remisión (parcial o total), ya sea detectable o
indetectable.
Tal como se usan en la presente memoria y en las
reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un",
"y", y "el" incluyen las referencias plurales al menos
que el contexto lo imponga claramente de otra manera. Así, por
ejemplo, una referencia a "un polinucleótido" incluye una
diversidad de tales polinucleótidos, y la referencia "al
agente" incluye la referencia a uno o más agentes y equivalentes
del mismo conocidos para los expertos en la técnica, etc.
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La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de
biología molecular (que incluyen las técnicas recombinantes),
microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que
están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se
explican completamente en la bibliografía, tal como: "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et
al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed.,
1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987);
"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of
Experimental Immunology" (D.M. Wei & C.C. Blackwell, eds.);
"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller &
M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular
Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The
Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994);
"Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al.,
eds., 1991).
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria se discuten los
polinucleótidos de las isoformas de VEGI, que incluyen los
polinucleótidos que codifican VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, y VEGI-_{251}. Las
secuencias nucleotídicas que corresponden a las isoformas nuevas se
proporcionan en las Tablas 1, 2, y 3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y
SEQ ID NO: 3), y sus secuencias polipeptídicas respectivas se
proporcionan en las Tablas 4, 5, y 6 (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, y
SEQ ID NO: 6).
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La secuencia polinucleotídica mostrada en la
Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) se obtuvo secuenciando un clon de cADN
(______), que se depositó en ______ en la American Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, y se le proporcionó el número de acceso
______.
La secuencia polinucleotídica mostrada en la
Tabla 2 (SEQ ID NO: 2) se obtuvo secuenciando un clon de cADN
(______), que se depositó en ______ en la American Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209, y se le proporcionó el número de acceso
______.
Con respecto a la alineación de secuencias que
compara las secuencias de aminoácidos deducidas para SEQ ID NOS: 4,
5, y 6 (Tabla 7), la región C-terminal de los
polipéptidos codificados por estas SEQ IDs es idéntica desde la
Val-24 de VEGI-_{174} hasta el
extremo C-terminal de la proteína. Sin embargo, los
extremos N-terminales de las cuatro isoformas son
diferentes. En los Ejemplos se demuestra que
VEGI-_{174} no inhibe la angiogénesis porque no
se exporta de manera eficaz desde la célula tras la expresión. En
contraste, VEGI-_{251} se traslada de manera
eficaz al medio extracelular tras la expresión, y por lo tanto es
eficaz en la inhibición de la angiogénesis. La exportación de
VEGI-_{251} da como resultado la escisión de la
presecuencia; se cree que la localización de la proteolisis es en
la posición 61 ó 96 de
VEGI-_{251}; pero puede estar localizada también en otro sitio localizado aproximadamente entre Glu-20 y Ser-57 de
VEGI-_{251}. Los sitios posibles incluyen, pero sin limitación, E64, K73, E77, S81, R90, y K95. Los polipéptidos
VEGI-_{192a} purificados son eficaces también en la inhibición del crecimiento de las células endoteliales vasculares.
VEGI-_{251}; pero puede estar localizada también en otro sitio localizado aproximadamente entre Glu-20 y Ser-57 de
VEGI-_{251}. Los sitios posibles incluyen, pero sin limitación, E64, K73, E77, S81, R90, y K95. Los polipéptidos
VEGI-_{192a} purificados son eficaces también en la inhibición del crecimiento de las células endoteliales vasculares.
La presente invención proporciona moléculas de
ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias que corresponden
a la isoforma nueva de VEGI mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1).
Los polinucleótidos de esta invención, que incluyen los fragmentos
de polinucleótidos de esta invención, son útiles como sondas,
cebadores, en sistemas de expresión (que incluyen los sistemas de
expresión in vivo e in vitro, tal como se describen en
la presente memoria, que pueden ser también la base de la terapia
génica), y en sistemas de cribado. Las solicitudes especialmente
útiles de los polinucleótidos se discutirán más adelante.
Una molécula de ácido nucleico "aislada"
quiere decir una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha
extraído de su medio nativo. En ciertas realizaciones, se ha
eliminado al menos un 50%, preferiblemente al menos un 70%, más
preferiblemente al menos un 80%, y aún más preferiblemente al menos
un 90% de los materiales a los que está asociada en la naturaleza.
Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinantes contenidas en un
vector se consideran aisladas para los fines de la presente
invención. Los ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas
incluyen las moléculas de ADN recombinante mantenidas en células
hospedadoras heterólogas o moléculas de ADN purificadas
(parcialmente o sustancialmente) en disolución. Las moléculas de ARN
aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in
vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las
moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen además las moléculas
producidas de manera sintética. Por lo tanto, un polinucleótido o
polipéptido "aislado" se refiere también a formas recombinantes
u otras formas que no se dan de manera natural de polinucleótidos o
polipéptidos, las cuales, debido al origen o la manipulación: (1)
no están asociadas con todo o parte de un polinucleótido o
polipéptido con el que están asociadas en la naturaleza, (2) están
unidas a un polinucleótido o polipéptido distintos al que están
unidos en la naturaleza, o (3) no se dan en la naturaleza, o (4) en
el caso de polipéptidos, surgen de la expresión de polinucleótidos
recombinantes.
La presente invención también proporciona
moléculas de ácido nucleico (que incluyen, tal como entiende un
experto en la técnica y se describe en la presente memoria, formas
aisladas y/o recombinantes) que codifican una forma madura de las
proteínas polipeptídicas descritas en la presente memoria. La
secuencia de aminoácidos del polipéptido de la isoforma de VEGI
completa incluye una secuencia líder y una proteína madura. Según la
hipótesis de la señal, una vez que se ha iniciado la exportación de
la cadena proteica en crecimiento a través del retículo
endoplásmico rugoso, las proteínas secretadas por las células
mamíferas tienen una secuencia líder señal o secretora que se
escinde del polipéptido completo para producir una forma
"madura" secretada de la proteína. La mayoría de las células
mamíferas e incluso las células de insecto escinden las proteínas
secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en ciertos
casos, la escisión de una proteína secretada no es completamente
uniforme, lo que da como resultado dos o más especies maduras de la
proteína. Además, se sabe desde hace tiempo que la especificidad de
la escisión de una proteína secretada viene determinada finalmente
por la estructura primaria de la proteína completa, es decir, es
inherente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido.
La presente invención también proporciona
polinucleótidos que codifican una proteína de fusión. Tal como se
conoce en la técnica, una proteína o polipéptido de fusión es un
polipéptido que comprende regiones en una posición diferente de la
que se da en la naturaleza. Las regiones pueden existir normalmente
en proteínas distintas, y se juntan en el polipéptido de fusión, o
pueden existir normalmente en la misma proteína, pero se colocan en
una disposición nueva en el polipéptido de fusión. Por lo tanto, la
invención proporciona polinucleótidos, en los que la secuencia
codificante del polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo
marco de lectura a una secuencia polinucleotídica que ayuda en la
expresión y la secreción de un polipéptido de una célula
hospedadora, por ejemplo, una secuencia líder que funciona como
secuencia secretora para controlar el trasporte de un polipéptido
desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una
preproteína, y la célula hospedadora puede escindir la secuencia
líder para formar la forma madura del polipéptido. Los
polinucleótidos pueden codificar también una proproteína que es la
proteína madura más residuos de aminoácidos adicionales en 5'. Una
proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína, y es
una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia se
escinde, queda la proteína madura activa. Así, por ejemplo, el
polinucleótido de la presente invención puede codificar una
proteína madura, o una proteína que tiene una prosecuencia y una
presecuencia (secuencia líder).
Los polinucleótidos de la presente invención
proporcionan una secuencia codificante fusionada en el marco de
lectura a una secuencia marcadora que permite la purificación o la
detección del polipéptido de la presente invención. La secuencia
marcadora puede ser un marcador de hexa-histidina
suministrado por un vector pQE-9 para posibilitar
la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el
caso de un hospedador bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia
marcadora puede ser un marcador de hemaglutinina (HA) cuando se usa
un hospedador mamífero, p. ej., células COS-7. El
marcador de HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína
hemaglutinina de la gripe (Wilson. I., et al., Cell, 37:767
(1984)).
Así, la expresión "polinucleótido que codifica
un polipéptido" abarca un polinucleótido que incluye solamente
la secuencia codificante del polipéptido así como un polinucleótido
que incluye una secuencia codificante y/o no codificante adicional.
Para los fines de esta invención, y para evitar referencias
engorrosas a las cadenas complementarias, se dice también que la
cadena inversa (o complementaria) de tal polinucleótido codifica la
secuencia; es decir, una secuencia polinucleotídica que
"codifica" un polipéptido incluye tanto la cadena codificante
convencional como la secuencia (o cadena) complementaria.
Un mutante o una variante del polinucleótido
puede ser una variante alélica natural del polinucleótido o una
variante que no se da de manera natural del polinucleótido. Tales
mutantes o variantes nucleotídicas incluyen las variantes por
deleción, las variantes por sustitución y las variantes por adición
o inserción. Una secuencia variante puede dar como resultado un
polinucleótido o polipéptido truncado o alterado, la expresión
incrementada o disminuida de un polinucleótido o polipéptido, o
cualquier combinación de los mismos. La variante puede ser de los
nucleótidos codificantes, no codificantes, flanqueantes en 5' o 3',
genómicos o codificantes.
En ciertas realizaciones, la secuencia
polinucleotídica comprende una secuencia diferente de la mostrada en
la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) debido a la degeneración del código
genético. El código genético se conoce bien en la técnica. Sería
rutinario para un experto en la técnica generar tales variantes
degeneradas. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente
invención proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido
de SEQ ID NO: 4.
Se discuten también fragmentos o formas
truncadas de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en
la presente memoria. Un fragmento de una molécula de ácido nucleico
aislada que tiene la secuencia nucleotídica de las secuencias
nucleotídicas de la presente memoria, o la cadena complementaria de
la misma, quiere decir los fragmentos de al menos 5 nt, al menos 10
nt, al menos 15 nt, al menos 20 nt, al menos 30 nt, al menos 40,
50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, o 500 nt de longitud (nucleótidos
contiguos). Estos fragmentos tienen numerosos usos que incluyen,
pero sin limitación, las sondas y cebadores para diagnóstico tal
como se discuten en la presente memoria. Tal como se entiende en la
técnica, una sonda se usa en general para la detección de un
objetivo mediante hibridación. Una sonda puede comprender un
marcador o un medio mediante el cual se puede unir un marcador,
antes o a continuación de la reacción de hibridación. Los marcadores
adecuados incluyen, pero sin limitación, los radioisótopos,
fluorocromos, compuestos quimioluminiscentes, colorantes, y enzimas.
Además, los expertos en la técnica entienden que un cebador se
prolonga generalmente mediante polimerización después de la
hibridación a una secuencia objetivo. Por supuesto, los fragmentos
mayores de 50-1500 de longitud son útiles también
según la presente invención. Un fragmento de al menos 20 nt de
longitud, por ejemplo, quiere decir fragmentos que incluyen 20 o
más bases contiguas de la secuencia nucleotídica. Estos fragmentos
pueden comprender los nucleótidos 93 y 94 de la secuencia mostrada
en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) o los nucleótidos 386 y 387 de la
secuencia mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2). De manera
alternativa, los fragmentos pueden tener menos de 1500, 1250, 1000,
750, 500, 250, 200, 150, 100, 50, 40 nt de longitud, y comprenden
los nucleótidos 93 y 94 de la secuencia mostrada en la Tabla 1 (SEQ
ID NO: 1) o los nucleótidos 386 y 387 de la secuencia mostrada en la
Tabla 2 (SEQ ID NO: 2).
Los polinucleótidos pueden comprender la
secuencia de VEGI-_{192a} (nucleótidos 1 a 93 de
la secuencia mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1)), o
VEGI-_{192b} (nucleótidos 1 a 386 de la secuencia
mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2)).
El polinucleótido puede comprender al menos 10,
al menos 15, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al
menos 50, y al menos 100 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1
(a lo cual se puede hacer referencia en general como regiones), y
dichos nucleótidos contiguos están dentro de los nucleótidos 1 a 93
de la secuencia mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1). Los
polinucleótidos pueden comprender al menos 10, al menos 15, al menos
18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 50, y al menos
100 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1, y dichos
nucleótidos contiguos comprenden los nucleótidos 93 y 94 de SEQ ID
NO: 1.
Un polinucleótido puede comprender al menos 10,
al menos 15, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al
menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al
menos 250, al menos 275, al menos 300, al menos 350, al menos 375,
al menos 400 o más nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 2, y dichos
nucleótidos contiguos están dentro de los nucleótidos 1 a 386 de la
secuencia mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2). Un polinucleótido
puede comprender al menos 10, al menos 15, al menos 18, al menos 20,
al menos 25, al menos 30, al menos 50, al menos 100, al menos 150,
al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 275, al menos
300, al menos 350, al menos 375, al menos 400 o más nucleótidos
contiguos de SEQ ID NO: 2, y dichos nucleótidos contiguos comprenden
los nucleótidos 386 y 387 de SEQ ID NO: 2.
La invención proporciona un polinucleótido
aislado que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de
SEQ ID NO: 4. Un polinucleótido aislado puede comprender una
secuencia que codifica al menos 5, al menos 8, al menos 10, al
menos 15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de
SEQ ID NO: 4, y dichos aminoácidos contiguos están dentro de los
residuos de aminoácidos 1-26 mostrados en la Tabla 4
(SEQ ID NO: 4). Un polinucleótido aislado puede comprender una
secuencia que codifica al menos 5, al menos 8, al menos 10, al
menos 15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de
SEQ ID NO: 4, y dichos aminoácidos contiguos comprenden los
aminoácidos 26 y 27 de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID
NO: 4). Un polinucleótido aislado puede comprender una secuencia
que codifica los residuos de aminoácidos 5-192,
10-192, 15-192,
25-192 de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ
ID NO: 4).
Un polinucleótido aislado puede comprender una
secuencia que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 5. Un
polinucleótido aislado puede comprender una secuencia que codifica
al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al
menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, y dichos
aminoácidos contiguos están en los residuos de aminoácidos
1-26 mostrados en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). Un
polinucleótido aislado puede comprender una secuencia que codifica
al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al
menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, y dichos
aminoácidos contiguos comprenden los aminoácidos 26 y 27 de la
secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). Un polinucleótido
aislado puede comprender una secuencia que codifica los residuos de
aminoácidos 5-192, 10-192,
15-192, 25-192 de la secuencia
mostrada en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5).
Se entiende que una región de aminoácidos o
nucleótidos contiguos que están dentro de un par dado de aminoácidos
o nucleótidos pueden incluir, pero no necesariamente, cualquier
miembro del par especificado. Por ejemplo, los nucleótidos
contiguos dentro de los nucleótidos 1-93 de SEQ ID
NO: 1 pueden incluir el nucleótido 1 y/o el nucleótido 93 de SEQ ID
NO: 1.
Las realizaciones de la presente invención
excluyen los polinucleótidos que codifican un polipéptido que
consiste en los aminoácidos 27-192 de SEQ ID NO: 4 o
SEQ ID NO: 5 o cualquier forma truncada de tales
polinucleótidos.
La invención también proporciona polinucleótidos
que comprenden la secuencia que codifica cualquiera de los
polipéptidos VEGI descritos en la presente memoria.
En las realizaciones específicas, los fragmentos
polinucleotídicos de la invención codifican un polipéptido que
muestra una actividad funcional. Un polipéptido que muestra una
"actividad funcional" quiere decir un polipéptido capaz de
exhibir una o más actividades funcionales conocidas asociadas a un
polipéptido VEGI completo o maduro. Tales actividades funcionales
incluyen, pero sin limitación, la actividad biológica (por ejemplo,
la inhibición de la angiogénesis, la inhibición de la proliferación
de células endoteliales vasculares, la inducción de la adhesión
celular, la antigenicidad (la capacidad de unirse o competir con un
polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} por la unión a un anticuerpo
anti-VEGI-_{192a} y/o
anti-VEGI-_{192b}), la
inmunogenicidad (la capacidad de generar un anticuerpo que se une a
un polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}), la capacidad de formar polímeros
con otros polipéptidos VEGI, y la capacidad de unirse a un receptor
o ligando para un polipéptido VEGI (por ejemplo, DR3).
\newpage
De manera similar, los polipéptidos VEGI
codificados por cualquiera de los polinucleótidos descritos en la
presente memoria pueden tener una o más actividades funcionales de
VEGI tal como se describieron anteriormente y en la presente
memoria.
Un polinucleótido aislado puede tener al menos
un 85%, al menos un 88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos
un 94%, al menos un 96%, al menos un 98%, o al menos un 99% de
identidad de secuencias con los polinucleótidos de la invención,
tal como se describe en la presente memoria. Un polinucleótido
aislado puede tener al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un
90%, al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 96%, al menos un
98%, o al menos un 99% de identidad de secuencias con la secuencia
de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
mostrada en la Tabla 1 o en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:
2). Los polinucleótidos aislados pueden tener además menos de un
85%, 83%, 80%, 75%, 70% de identidad de secuencias con las
secuencias de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} anteriores. Los polinucleótidos
aislados pueden tener al menos un 85%, al menos un 88%, al menos un
90%, al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un 96%, al menos un
98%, o al menos un 99% de identidad de secuencias respecto de
fragmentos de al menos 10 nucleótidos contiguos (o más, tal como 15,
18, 20, 25, 35, 40, 45, 50, 60, 75, o 100 nucleótidos contiguos) de
la secuencia mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) o 2 (SEQ ID NO:
2), en los que los nucleótidos contiguos comprenden los nucleótidos
93 y 94 de SEQ ID NO: 1, o los nucleótidos 386 y 387 de SEQ ID NO:
2. Los polinucleótidos pueden tener al menos un 85%, al menos un
88%, al menos un 90%, al menos un 92%, al menos un 94%, al menos un
96%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad de secuencias
respecto de fragmentos de al menos 10 nucleótidos contiguos (o más,
tal como 15, 18, 20, 25, 35, 40, 45, 50, 60, 75, o 100 nucleótidos
contiguos) de la secuencia mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) o
de la secuencia mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), en los que
los nucleótidos contiguos están dentro de los nucleótidos
1-93 de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos
1-386 de SEQ ID NO: 2.
El que una región polinucleotídica o
polipeptídica tenga un cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%,
90%, o 95%) de "identidad de secuencias" respecto de otra
secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases
son iguales al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el
porcentaje de homología o identidad de secuencias se puede
determinar mediante el uso de programas informáticos conocidos en la
técnica, por ejemplo los descritos en Current Protocols in Molecule
Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) suplemento 30,
sección 7.718, Tabla 4.7.1. El porcentaje de identidad se puede
determinar electrónicamente, p. ej., mediante el uso del programa
MegAlign^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison Wiss.). El programa
MegAlign^{TM} puede crear alineaciones entre dos o más secuencias
según diferentes métodos, p. ej., el método clustal (véase, p. ej.,
Higgins, D. G. y P. M. Sharp (1988) Gene
73:237-244). El algoritmo clustal agrupa las
secuencias en grupos examinando las distancias entre todos los
pares. Los grupos se alinean por pares y después por grupos. El
porcentaje de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, p.
ej., la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la
longitud de la secuencia A, menos el número de residuos que actúan
como huecos en la secuencia A, menos el número de residuos que
actúan como huecos en la secuencia B, en la suma de las
coincidencias de residuos entre la secuencia A y la secuencia B,
por cien. Los huecos de baja similitud o sin similitud entre las dos
secuencias de aminoácidos no se incluyen en la determinación del
porcentaje de similitud. El porcentaje de identidad entre secuencias
de ácidos nucleicos se puede contar o calcular también mediante
otros métodos conocidos en la técnica, p. ej., el método de Jotun
Hein (véase, p. ej., Hein, J. (1990) Methods Enzymol.
183:626-645).
También se discute en la presente memoria un
ácido nucleico aislado que hibrida en condiciones de rigurosidad
elevada a un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a
la secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 2, o al ácido nucleico que tiene una
secuencia complementaria a un nucleótido que codifica un
polipéptido de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o el complemento del
mismo.
En cuanto a las condiciones de hibridación,
cuanto mayor es la identidad de secuencias necesaria, más rigurosas
son las condiciones de hibridación si tales secuencias se determinan
por su capacidad de hibridar a una secuencia polinucleotídica de la
invención. Por lo tanto, se discuten los polinucleótidos que son
capaces de hibridar a una secuencia que comprende un polinucleótido
de la invención en la presente memoria. Un ejemplo de condiciones
de hibridación rigurosas es una incubación durante la noche a 42ºC
en una disolución: 50% de formamida, SSC 1x (cloruro sódico 150 mM,
citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), disolución de
denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y 20 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón desnaturalizado y fragmentado, seguido de lavado
de los filtros con SSC 0,1x a alrededor de 65ºC. Para una discusión
con respecto a las reacciones de hibridación, véase más
adelante.
Un polinucleótido aislado puede comprender una
secuencia de al menos 10 nucleótidos contiguos (o más, tal como 15,
18, 20, 25, 35, 40, 45, 50, 60, 75, o 100 (o más) nucleótidos
contiguos) que hibrida con un polinucleótido (tal como ADN o ARN)
que comprende la secuencia representada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1)
o la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), o los fragmentos del mismo, tal como
se describió anteriormente, en condiciones en las que no hibrida
con otros polinucleótidos de una célula mamífera, preferiblemente
una célula humana, o en condiciones en las que la hibridación al
polinucleótido que tiene la secuencia representada en la Tabla 1
(SEQ ID NO: 1) o la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2) está enriquecida
respecto a la hibridación con otros polinucleótidos de una célula
mamífera. Los fragmentos pueden comprender los nucleótidos 93 y 94
de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos 386 y 387 de SEQ ID NO: 2. Los
fragmentos pueden estar dentro de los nucleótidos
1-93 de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos
1-386 de SEQ ID NO: 2.
Estos aspectos son particularmente útiles en el
contexto del diagnóstico (detección).
\newpage
Una secuencia polinucleotídica puede comprender
al menos 10, preferiblemente 15, preferiblemente 18, preferiblemente
20, más preferiblemente 25, más preferiblemente 35, más
preferiblemente 50, aún más preferiblemente 75, 100, 125, 150, 200,
250 nucleótidos contiguos de la secuencia no codificante (es decir,
flanqueante) mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) o la Tabla 2
(SEQ ID NO: 2). Estos aspectos pueden ser especialmente útiles como
sondas de diagnóstico, o como cebadores para la amplificación de
porciones no codificantes del gen de VEGI-_{192a}
o VEGI-_{192b}.
Se entiende que (a menos que se indique o se
requiera de otra manera), cualquier realización de la invención
descrita en la presente memoria que es un polinucleótido abarca
tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas
monocatenarias complementarias que se sabe o se predice que
constituyen la forma bicatenaria.
Las reacciones de hibridación se pueden llevar a
cabo en condiciones de diferente "rigurosidad". Se conocen muy
bien las condiciones que incrementan la rigurosidad de una reacción
de hibridación, y están publicadas en la técnica. Véase, por
ejemplo, Sambrook et al. (1989). Los ejemplos de condiciones
relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente):
temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC.;
concentraciones de tampón SSC 10x, SSC 6x, SSC 1x, SSC 0,1x (en
donde SSC es NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes
mediante el uso de otros sistemas tamponadores; concentraciones de
formamida del 0%, 25%, 50%, y 75%; tiempos de incubación de 5
minutos a 24 horas; 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de
incubación de lavado de 1, 2, o 15 minutos; y disoluciones de
lavado de SSC 6x, SSC 1x, SSC 0,1x, o agua desionizada. Un ejemplo
de condiciones de hibridación rigurosas es la hibridación a 50ºC o
más y SSC 0,1x (cloruro sódico 15 mM/citrato sódico 1,5 mM). Otro
ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es una incubación
durante la noche a 42ºC en una disolución: 50% de formamida, SSC 1x
(cloruro sódico 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM
(pH 7,6), disolución de denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano, y
20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
fragmentado, seguido de lavado de los filtros en SSC 0,1x a
alrededor de 65ºC. Las condiciones de hibridación rigurosas son
condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las
condiciones representativas anteriores. Se conocen en la técnica
otras condiciones de hibridación rigurosas, y se pueden emplear
también para identificar ácidos nucleicos de esta realización
particular de la invención.
También se discuten en la presente memoria los
cebadores y sondas que comprenden una región de SEQ ID NO: 1 o de
SEQ ID NO: 2, en los que la región está dentro de los nucleótidos
1-93 de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos
1-386 de SEQ ID NO: 2. Los cebadores y sondas pueden
comprender una región de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, en los que
la región comprende los nucleótidos 93 y 94 de SEQ ID NO: 1 o los
nucleótidos 386 y 387 de SEQ ID NO: 2.
Las sondas de más de una secuencia
polinucleotídica proporcionada en la presente memoria pueden
hibridar con el mismo ácido nucleico si el cADN del que proceden
corresponde a un mARN. Mediante el uso de estas sondas, en
particular de sondas marcadas de secuencias de ADN, se pueden aislar
genes homólogos o relacionados. La fuente de genes homólogos puede
ser cualquier especie, p. ej. especies primates, caninas, felinas,
bovinas, ovinas, equinas, levaduras, nemátodos. Se pueden usar
sondas de más de 10 nucleótidos ("nt"), p. ej. sondas de un
tamaño en un intervalo de alrededor de 15 nt, 18 nt, 20, nt, 25 nt,
75 nt, o 100 nt, pero en general alrededor de 15 nt representa una
secuencia suficiente para una identificación única.
"Tm" es la temperatura en grados
centígrados a la que un 50% de una molécula bicatenaria
polinucleotídica constituida por cadenas complementarias unidas por
puentes de hidrógeno en direcciones antiparalelas mediante el
emparejamiento de bases de Watson-Crick se disocia
en cadenas simples en las condiciones del experimento. La Tm se
puede predecir según una fórmula estándar, tal como:
Tm = 81,5 +
16,6 log [X^{+}] + 0,41(%G/C) - 0,61 (%F) -
600/L
en la que [X^{+}] es la
concentración de cationes (normalmente ión sodio, Na+) en mol/L;
(%G/C) es el número de residuos G y C como porcentaje de los
residuos totales en la molécula bicatenaria; (%F) es el porcentaje
de formamida en disolución (p/vol); y L es el número de nucleótidos
en cada cadena de la molécula
bicatenaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se ha descrito anteriormente, puede
haber variantes o modificaciones de los polinucleótidos de
VEGI-_{192a} y VEGI-_{192b} tales como deleciones, sustituciones, adiciones, o cambios en la naturaleza de cualquier resto de ácido nucleico. Una variante o modificación es cualquier diferencia en la secuencia nucleotídica en comparación con un polinucleótido mostrado en la presente memoria para codificar un polipéptido VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}, y/o cualquier diferencia en cuanto a los restos de ácidos nucleicos de el/los polinucleótido(s). Tales cambios pueden ser útiles para facilitar la clonación y la modificación de la expresión de los polinucleótidos de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}. Tales cambios pueden ser útiles también para conferir propiedades deseables a el/los polinucleótido(s), tales como estabilidad. La definición de polinucleótido proporcionada en la presente memoria da ejemplos de estas modificaciones. Por lo tanto, en la presente memoria se describen variantes funcionalmente conservadas de las secuencias de ácido nucleico, que incluyen sustituciones, adiciones y/o deleciones de los ácidos nucleicos. Las variantes incluyen las variantes naturales de la secuencia polinucleotídica (p. ej., las variantes degeneradas, variantes alélicas, etc.). En general, las variantes alélicas contienen un 15-25% de emparejamientos incorrectos de pares de bases (pb) y pueden contener sólo un 5-15%, o 2-5%, o 1-2% de emparejamientos incorrectos de pb, así como un único emparejamiento
incorrecto de pb.
VEGI-_{192a} y VEGI-_{192b} tales como deleciones, sustituciones, adiciones, o cambios en la naturaleza de cualquier resto de ácido nucleico. Una variante o modificación es cualquier diferencia en la secuencia nucleotídica en comparación con un polinucleótido mostrado en la presente memoria para codificar un polipéptido VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}, y/o cualquier diferencia en cuanto a los restos de ácidos nucleicos de el/los polinucleótido(s). Tales cambios pueden ser útiles para facilitar la clonación y la modificación de la expresión de los polinucleótidos de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}. Tales cambios pueden ser útiles también para conferir propiedades deseables a el/los polinucleótido(s), tales como estabilidad. La definición de polinucleótido proporcionada en la presente memoria da ejemplos de estas modificaciones. Por lo tanto, en la presente memoria se describen variantes funcionalmente conservadas de las secuencias de ácido nucleico, que incluyen sustituciones, adiciones y/o deleciones de los ácidos nucleicos. Las variantes incluyen las variantes naturales de la secuencia polinucleotídica (p. ej., las variantes degeneradas, variantes alélicas, etc.). En general, las variantes alélicas contienen un 15-25% de emparejamientos incorrectos de pares de bases (pb) y pueden contener sólo un 5-15%, o 2-5%, o 1-2% de emparejamientos incorrectos de pb, así como un único emparejamiento
incorrecto de pb.
En la presente memoria se discuten los
polinucleótidos de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} que incluyen los de longitud
completa (sin procesar), procesados, codificantes, no codificantes o
las porciones de los mismos. Un mapa parcial de la región genómica
de VEGI-_{192a} se muestra en la Figura 6, que
incluye los límites predichos para los
intrones-exones. La invención puede incluir además
las regiones sin traducir de 3' y 5' halladas en el mARN maduro,
las secuencias reguladoras específicas transcripcionales y
traduccionales, tales como promotores, potenciadores, etc., que
incluyen alrededor de 1 kb, y posiblemente más ADN genómico
flanqueante en el extremo 5' o 3' de la región transcrita. El ADN
genómico se puede aislar en forma de un fragmento de 100 kpb o
menos, y sustancialmente exento de secuencias cromosómicas
flanqueantes. El ADN genómico que flanquea la región codificante,
en 3' o 5', o las secuencias reguladoras internas tal como se hallan
a veces en los intrones, contiene secuencias necesarias para la
expresión apropiada específica del tejido, específica de la etapa o
específica de la enfermedad. También se discuten las secuencias de
mARN y cADN y los fragmentos de las mismas, lo que incluye los
fragmentos que incluyen una porción de un segmento que codifica
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}.
Normalmente, las especies de mARN tienen exones contiguos, con los
intrones intermedios, cuando están presentes, eliminados mediante
el corte y empalme del ARN nuclear, para crear un marco de lectura
abierto continuo que codifica un polipéptido. Las especies de mARN
pueden existir también tanto con exones como con intrones, en los
que los intrones se pueden eliminar mediante corte y empalme
alternativo. Además, pueden existir especies diferentes de mARNs
codificados por las mismas especies genómicas a niveles variables
en una célula, y la detección de estos diversos niveles de especies
de mARN puede ser indicativa de la expresión diferencial del
producto génico codificado en la célula.
Se discuten los polinucleótidos que codifican
variantes y derivados funcionalmente equivalentes de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} de
longitud completa y fragmentos funcionalmente equivalentes (tales
como la deleción de aminoácidos de las posiciones
N-terminales y/o C-terminales de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}) de
los mismos que pueden aumentar, disminuir o no afectar de manera
significativa las propiedades de los polipéptidos codificados. Por
ejemplo, los cambios en una secuencia de ADN que no cambian la
secuencia de aminoácidos codificada, así como aquellos que dan como
resultado sustituciones conservativas de los residuos de
aminoácidos, sustituciones no conservativas que no son
perjudiciales, una o unas cuantas deleciones o adiciones de
aminoácidos, y la sustitución de residuos de aminoácidos por
análogos de aminoácidos son aquellas que no afectarán de manera
significativa a las propiedades del polipéptido codificado. Las
sustituciones de nucleótidos que no alteran los residuos de
aminoácidos codificados pueden ser útiles para optimizar la
expresión génica en diferentes sistemas. Los expertos en la técnica
conocen sustituciones adecuadas y se realizan, por ejemplo, para
reflejar la utilización preferida de los codones en los sistemas de
expresión particulares. En otro ejemplo, los polinucleótidos con
corte y empalme alternativo dan lugar a un fragmento o variante
funcionalmente equivalente de VEGI. Las variantes de secuencias
polinucleotídicas procesadas de manera alternativa se definen como
secuencias polinucleotídicas que corresponden a mARNs que difieren
en la secuencia entre sí, pero que derivan de la misma región
genómica, por ejemplo, mARNs que resultan de: 1) el uso de
promotores alternativos; 2) el uso de sitios de poliadenilación
alternativos; o 3) el uso de sitios de corte y empalme
alternativos.
Esta invención también proporciona un inserto de
ADN que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia
nucleotídica de SEQ ID NO: 1 o un complemento de la misma.
Tal como se entiende en la técnica, un
"polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de
nucleótidos de cualquier longitud, que contiene
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o sus análogos. Las
expresiones "polinucleótido" y "ácido nucleico", tal como
se usan en la presente memoria, se usan de manera intercambiable,
tal como se conoce en la técnica. Los polinucleótidos pueden tener
cualquier estructura tridimensional. El término
"polinucleótido" incluye las moléculas bicatenarias,
monocatenarias y de hélices triples. A menos que se especifique o
se requiera de otra manera, cualquier realización de la invención
descrita en la presente memoria que es un polinucleótido abarca
tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas
monocatenarias complementarias que se sabe o se predice que
constituyen la forma bicatenaria. No es necesario que todos los
enlaces en un polinucleótido sean idénticos.
Un polinucleótido puede comprender nucleótidos
modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de
nucleótidos. El uso del uracilo como sustituto de la timina en un
ácido desoxirribonucleico también se considera una forma análoga de
pirimidina.
Tal como se conoce en la técnica, si esta
presente, la modificación de la estructura nucleotídica se puede
realizar antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia
nucleotídica se puede interrumpir mediante componentes no
nucleotídicos. Tal como se describe en la presente memoria, un
polinucleótido se puede modificar adicionalmente tras la
polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de
marcaje. Otros tipos de modificaciones son, por ejemplo,
"caperuzas", la sustitución de uno o más de los nucleótidos
naturales con un análogo, las modificaciones internucleotídicas
tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces sin carga (p. ej.,
metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.)
y enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos,
etc.), las que contienen restos colgantes, tales como, por ejemplo,
proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
poli-L-lisina, etc.), las que tienen
intercaladores (p. ej., acridina, psoraleno, etc.), las que
contienen quelantes (p. ej., metales, metales radiactivos, boro,
metales oxidativos, etc.), las que contienen agentes alquilantes,
las que tienen enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa
anoméricos, etc.), así como las formas sin modificar de el/los
polinucleótido(s). Todas estas modificaciones se conocen bien
en la técnica.
Además, cualquiera de los grupos hidroxilo
presentes habitualmente en los carbohidratos se pueden sustituir
por grupos fosfonato, grupos fosfato, se pueden proteger mediante
grupos protectores habituales, o activarlos para preparar enlaces
adicionales para nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar a
soporte sólidos. Los grupos OH terminales de 5' y 3' se pueden
fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos orgánicos de
formación de caperuzas de 1 a 20 átomos de carbono. Se pueden
derivatizar otros hidroxilos hasta grupos protectores
habituales.
Los polinucleótidos pueden contener también
formas análogas de carbohidratos de ribosa o desoxirribosa que se
conocen en general en la técnica, que incluyen, pero sin limitación,
2'-O-metil-,
2'-O-alil-,
2'-fluoro- o
2'-azido-ribosa, análogos de
carbohidratos carbocíclicos, carbohidratos
\alpha-anoméricos, carbohidratos epiméricos tales
como arabinosa, xilosas o lixosas, carbohidratos de piranosa,
carbohidratos de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y
análogos de nucleósidos abásicos tales como metil ribosida.
Aunque se usan en general los carbohidratos y
las bases convencionales, la sustitución de formas análogas de
carbohidratos, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa al diseñar
un producto final, como lo pueden ser las estructuras alternativas
del esqueleto, como un esqueleto de poliamidas o un esqueleto de
fosforotioato.
Esta invención abarca las composiciones, que
incluyen las composiciones farmacéuticas, que comprenden los
polinucleótidos descritos en la presente memoria. Estas
composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales
como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones,
que se conocen bien en la técnica.
Se discuten también los equipos que comprenden
cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente memoria.
Los equipos pueden comprender los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1
y/o SEQ ID NO: 2. Los equipos pueden comprender los polinucleótidos
que codifican un polipéptido de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5. Los
equipos pueden comprender las sondas y los cebadores que comprenden
al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, o al menos 50
nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y dichos
nucleótidos contiguos están dentro de los nucleótidos
1-93 de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos
1-386 SEQ ID NO: 2. Estos equipos pueden incluir
además reactivos e instrucciones para detectar la presencia o
ausencia o el nivel de expresión de VEGI-_{192a}
y/o VEGI-_{192b}. Los equipos están en un envase
adecuado, y pueden proporcionar opcionalmente componentes
adicionales tales como tampones e instrucciones.
Esta invención proporciona también los
polinucleótidos descritos en la presente memoria unidos a un soporte
sólido. Los métodos para unir los polinucleótidos a un soporte
sólido, por ejemplo a la superficie de matrices, se conocen bien en
la técnica. El soporte sólido es de cualquier material adecuado, que
incluye esferas basadas en poliestireno y chips de vidrio, tales
como un producto GeneChip® (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Calif.).
Véanse las publicaciones internacionales nºs WO 97/10365, WO
97/29212, WO 97/27317, WO 95/11995, WO 90/15070, y las pat. de
EE.UU. nºs 5.744.305 y 5.445.934.
Una matriz puede comprender polinucleótidos de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}.
Las matrices de polinucleótidos proporcionan una técnica de alto
rendimiento que puede ensayar un gran número de polinucleótidos o
polipéptidos en una muestra. Esta tecnología se puede usar como
herramienta para ensayar la expresión diferencial. Se conocen en la
técnica una diversidad de métodos de producción de matrices, así
como las variaciones de estos métodos, y se contemplan para el uso
en la invención. Por ejemplo, se pueden crear matrices colocando
sondas polinucleotídicas sobre un sustrato (p. ej., vidrio,
nitrocelulosa, etc.) en una matriz bidimensional que tiene sondas
unidas. Las sondas se pueden unir al sustrato mediante enlaces
covalentes o mediante interacciones inespecíficas, tales como
interacciones hidrófobas. Las muestras de polinucleótidos se pueden
marcar de manera detectable (p. ej., mediante el uso de marcadores
radiactivos o fluorescentes) y después hibridarlas a las sondas. Los
polinucleótidos bicatenarios, que comprenden los polinucleótidos de
la muestra marcados unidos a los polinucleótidos de la sonda, se
pueden detectar una vez que la porción sin unir de la muestra se
elimina mediante un lavado. De manera alternativa, los
polinucleótidos de la muestra de ensayo se pueden inmovilizar sobre
la matriz, y las sondas se marcan de manera detectable. Las
técnicas para construir matrices y los métodos para usar estas
matrices se describen, por ejemplo, en Schena et al. (1996)
Proc Natl Acad Sci USA. 93(20): 10614-9;
Schena et al. (1995) Science
270(5235):467-70; Shalon et al. (1996)
Genome Res. 6(7):639-45, pat. de EE.UU. nº
5.807.522, documento EP 799 897; documento WO 97/29212; documento WO
97/27317; documento EP 785 280; documento WO 97/02357; pat. de
EE.UU. nº 5.593.839; pat. de EE.UU. nº 5.578.832; documento EP 728
520; pat. de EE.UU. nº 5.599.695; documento EP 721 016; pat. de
EE.UU. nº 5.556.752; documento WO 95/22058; y pat. de EE.UU. nº
5.631.734.
Las matrices se pueden usar para examinar la
expresión diferencial de los genes, y se pueden usar para determinar
la función de los genes. Por ejemplo, las matrices se pueden usar
para detectar la expresión diferencial de una isoforma de VEGI que
corresponde a un polinucleótido descrito en la presente memoria, en
el que la expresión se compara entre una célula de ensayo y una
célula de control. Por ejemplo, la expresión elevada de un mensaje
de una isoforma de VEGI particular en una célula de un sujeto que
tiene una enfermedad, que no se observa en una célula normal
correspondiente, puede indicar una asociación de esta isoforma de
VEGI con tal enfermedad. Los usos ejemplares de matrices se
describen adicionalmente, por ejemplo, en Pappalarado et al.,
Sem. Radiation Oncol. (1998) 8:217; y Ramsay Nature Biotechnol.
(1998) 16:40. Además, muchas variaciones sobre los métodos de
detección mediante el uso de matrices están dentro de la experiencia
en la técnica, y dentro del alcance de la presente invención. Por
ejemplo, en vez de inmovilizar la sonda en un soporte sólido, la
muestra de ensayo se puede inmovilizar sobre un soporte sólido que
se pone en contacto después con la sonda.
Un polinucleótido de una isoforma de VEGI que se
expresa de manera diferencial en una célula de un individuo que
tiene una enfermedad tendría importancia clínica con respecto a esta
enfermedad. Un polinucleótido de una isoforma de VEGI se expresa de
manera diferencial en una célula cuando el polinucleótido se detecta
a niveles mayores o menores en una célula de un individuo que tiene
una enfermedad en comparación con una célula del mismo tipo celular
que es de un individuo que no tiene la enfermedad. En general, el
cribado de polinucleótidos expresados de manera diferencial se
centra en un polinucleótido que se expresa de forma que, por
ejemplo, el mARN se halla a niveles de al menos alrededor del 25%,
al menos alrededor del 50% hasta alrededor del 75%, al menos
alrededor del 90%, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor
de 4 veces; al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 10
veces, o al menos alrededor de 50 veces o más, mayor (p. ej.
sobreexpresado) o menos (p. ej., subexpresado) en una célula de un
individuo que tiene la enfermedad en comparación con una célula del
mismo tipo celular que no es de tal individuo. La comparación se
puede realizar entre dos tejidos, por ejemplo, si se está usando la
hibridación in situ u otro método de ensayo que permite
cierto grado de discriminación entre los tipos celulares en el
tejido. La comparación se puede realizar también entre células
extraídas de su fuente tisular.
Así, la invención proporciona una matriz que
comprende polinucleótidos de isoformas de VEGI tal como se describen
en la presente memoria. Una matriz puede comprender una secuencia
polinucleotídica mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1), o una
región del polinucleótido de la secuencia mostrada en la Tabla 1
(SEQ ID NO: 1), en la que dicha región es de al menos 10
nucleótidos contiguos (o más, tal como al menos 15, 18, 20, 25, 35,
40, 45, 50, 60, 75 ó 100 nucleótidos contiguos). La región puede
comprender además los nucleótidos 93 y 94 de la secuencia mostrada
en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1). La región puede estar dentro de los
nucleótidos 1-93 de la secuencia mostrada en la
Tabla 1 (SEQ ID NO: 1).
Una matriz puede comprender una secuencia
polinucleotídica mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), o una región
del polinucleótido de la secuencia mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID
NO: 2), en la que dicha región es de al menos 10 nucleótidos
contiguos (o más, tal como al menos 15, 18, 20, 25, 35, 40, 45, 50,
60, 75 ó 100 nucleótidos contiguos). La región puede comprender
además los nucleótidos 386 y 387 de la secuencia mostrada en la
Tabla 2 (SEQ ID NO: 2). La región puede estar dentro de los
nucleótidos 1-386 de la secuencia mostrada en la
Tabla 1 (SEQ ID NO: 1).
Las matrices son útiles también para detectar
polinucleótidos de isoformas de VEGI mutantes. Los polinucleótidos
de isoformas de VEGI mutantes se pueden detectar en ADN genómico, p.
ej., ADN genómico aislado de la sangre de un individuo o de otra
muestra de tejido. Los polinucleótidos de isoformas de VEGI mutantes
se pueden detectar también mediante el uso de cADN o mARN de un
individuo que posee un polinucleótido de isoforma de VEGI alterado,
si el polinucleótido de isoforma de VEGI mutante da como resultado
un mARN que tiene un tamaño alterado (por ejemplo). Un gen de
isoforma de VEGI mutante puede dar como resultado también la
expresión diferencial (incrementada o disminuida) de un mARN de
isoforma de VEGI, que se puede detectar como se describe en la
presente memoria.
Una matriz puede comprender uno o más
polinucleótidos aislados que hibridan de manera específica con el
polinucleótido descrito en la presente memoria. Una matriz puede
comprender uno o más polinucleótidos aislados que hibridan de
manera específica con el polinucleótido mostrado en la Tabla 1 (SEQ
ID NO: 1), o una región del polinucleótido de la secuencia mostrada
en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1), en la que dicha región es de al menos
10 nucleótidos contiguos (o más, tal como al menos 15, 18, 20, 25,
35, 40, 45, 50, 60, 75 ó 100 nucleótidos contiguos). La región
puede comprender además los nucleótidos 93 y 94 de la secuencia
mostrada en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1). La región puede estar dentro
de los nucleótidos 1-93 de la secuencia mostrada en
la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1).
Una matriz puede comprender uno o más
polinucleótidos aislados que hibridan de manera específica con una
secuencia polinucleotídica mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2), o
una región del polinucleótido de la secuencia mostrada en la Tabla
2 (SEQ ID NO: 2), en la que dicha región es de al menos 10
nucleótidos contiguos (o más, tal como al menos 15, 18, 20, 25, 35,
40, 45, 50, 60, 75 ó 100 nucleótidos contiguos). La región puede
comprender además los nucleótidos 386 y 387 de la secuencia
mostrada en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2). La región puede estar dentro
de los nucleótidos 1-386 de la secuencia mostrada en
la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen las secuencias polipeptídicas de
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, y
VEGI-_{251} humanas mostradas en las Tablas 4
(SEQ ID NO: 4), 5 (SEQ ID NO: 5), y 6 (SEQ ID NO: 6). Los
polipéptidos VEGI se pueden recuperar y purificar a partir de
cultivos de células recombinantes mediante métodos que incluyen la
precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos,
cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en
fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía
de afinidad, cromatografía de hidroxiapatito y cromatografía de
lectina. Se pueden usar etapas de replegamiento de proteínas según
sea necesario para completar la configuración de la proteína
madura. Finalmente, se puede emplear la cromatografía líquida de
alto rendimiento (HPLC) para las etapas finales de purificación.
Los ejemplos de métodos de replegamiento y purificación de
proteínas se describen en la sol. de pat. de EE.UU. 20010044521 y en
el documento WO 01/55174.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser un producto purificado de manera natural o un producto de
procedimientos de síntesis química, o se pueden producir mediante
técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariótico (tal
como E. coli) o eucariótico (tal como células CHO).
Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de
producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención
pueden estar glicosilados o sin glicosilar. Los polipéptidos de la
invención pueden incluir también un residuo inicial de aminoácido
metionina.
Los polipéptidos VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, y VEGI-_{251}
(que, como se describe en la presente memoria, incluyen diversas
realizaciones, tales como de longitud completa, maduros, fusiones,
fragmentos, etc.) tienen una diversidad de usos, tal como se
describe en la presente memoria. Los polipéptidos son de interés
particular como marcadores genéticos o bioquímicos (p. ej., en
sangre o tejidos) que indican una enfermedad relacionada con la
angiogénesis, y/o para monitorizar la eficacia de diversas terapias
e intervenciones preventivas. Los métodos de diagnóstico (es decir,
detección) y de cribado se describen con más detalle más adelante.
Los polipéptidos son también útiles en la producción de anticuerpos
que se unen a estos polipéptidos, en su uso como un agente para
cribar candidatos farmacéuticos (tanto in vitro como in
vivo), para su uso en el diseño de fármacos racional (es decir,
basado en la estructura), así como en otros usos que incluyen los
usos terapéuticos que se describen en la presente memoria (por
ejemplo, si el VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} de longitud completa ejerce su acción uniéndose a otra proteína, un polipéptido que se una de manera competitiva a VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} podría comprometer la función de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} como un inhibidor competitivo, y así ejercer una actividad terapéutica). Los polipéptidos VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} se pueden usar también para identificar proteínas, en especial las proteínas de humanos que se unen (o interaccionan físicamente) con VEGI-_{192a}
o VEGI-_{192b}, que podrían ser ellas mismas objetivos farmacológicos.
VEGI-_{192b} de longitud completa ejerce su acción uniéndose a otra proteína, un polipéptido que se una de manera competitiva a VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} podría comprometer la función de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} como un inhibidor competitivo, y así ejercer una actividad terapéutica). Los polipéptidos VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} se pueden usar también para identificar proteínas, en especial las proteínas de humanos que se unen (o interaccionan físicamente) con VEGI-_{192a}
o VEGI-_{192b}, que podrían ser ellas mismas objetivos farmacológicos.
Se discuten polipéptidos, formas truncadas, o
fragmentos, de VEGI-_{192a} y
VEGI-_{192b}. Los polipéptidos VEGI de la
invención tienen una o más funciones, tal como se describió en la
sección previa. En ciertas realizaciones, el polipéptido VEGI sirve
para unirse a un anticuerpo específico. En otras realizaciones un
polipéptido VEGI es un inmunógeno. Aún en otras realizaciones, un
polipéptido VEGI inhibe el crecimiento de las células endoteliales
vasculares y/o la angiogénesis. Los métodos para analizar la
actividad de un polipéptido VEGI (que incluye una forma truncada de
VEGI) se conocen en la técnica, y se describen con detalle en los
Ejemplos, tales como un ensayo para analizar el efecto sobre el
crecimiento de las células endoteliales vasculares, la formación de
tubos similares a capilares, el crecimiento de capilares en geles de
colágeno colocados sobre una membrana corioalantoidea de embrión de
pollo, o el crecimiento de tumores de xenoinjertos.
El tamaño de los fragmentos polipeptídicos puede
variar ampliamente. Así, los fragmentos polipeptídicos de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} de
longitud completa pueden comprender una porción de la secuencia de
aminoácidos representada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) o en la Tabla
5 (SEQ ID NO: 5) en la que el polipéptido
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} es
de al menos alrededor de 5, alrededor de 10, alrededor de 15, 25,
50, 75, 100, 150, o más aminoácidos contiguos de la secuencia
mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) o en la Tabla 5 (SEQ ID NO:
5). Se entiende que los fragmentos comprenden al menos un
aminoácido dentro de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID
NO: 4 o SEQ ID NO: 5, preferiblemente una región, dentro de los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. La
porción de la secuencia de aminoácidos puede comprender los
aminoácidos 26 y 27 mostrados en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) o en la
Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). La porción de la secuencia de aminoácidos
puede estar dentro de los aminoácidos 1-26 de SEQ
ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. Como es evidente para un experto en la
técnica, estos polipéptidos, independientemente de su tamaño,
pueden estar asociados con, o conjugados con, otras sustancias o
agentes para facilitar, aumentar, o modular la función y/o la
especificidad de un polipéptido VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}. Estos fragmentos se pueden usar para
una diversidad de fines, lo que incluye su utilización como
inmunógeno (solo o junto con un agente adecuado), o como un agente
para inhibir la angiogénesis. Los fragmentos (como con los
polipéptidos) deberían tener una o más de las funciones biológicas
descritas anteriormente para un polipéptido VEGI. Los fragmentos
pueden inhibir la angiogénesis. Las formas truncadas pueden ser
menores que aproximadamente lo siguiente: 185, 170, 160, 150, 125,
100, 80, 50, 40, 25, 20, 15, o 10 aminoácidos.
Se entiende que una región de aminoácidos o
nucleótidos contiguos que están dentro de un par dado de aminoácidos
o nucleótidos puede incluir, pero no necesariamente, cualquier
miembro del par especificado. Por ejemplo, los aminoácidos
contiguos dentro de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID
NO: 4 pueden incluir el aminoácido 1 y/o el aminoácido 26 de SEQ ID
NO: 4.
Los polipéptidos de la invención pueden
comprender al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al
menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos dentro de los
residuos de aminoácidos 1-26 mostrados en la Tabla
4 (SEQ ID NO: 4) o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5) (a lo cual también
se puede hacer referencia en general como regiones). Los
polipéptidos pueden comprender residuos de aminoácidos de alrededor
de 5-192, 10-192,
15-192, 20-192,
25-192 de la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ
ID NO: 4) o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5).
Las realizaciones de la presente invención
excluyen cualquier polipéptido que consista en los aminoácidos
27-192 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 o una forma
truncada de tales polipéptidos.
Los polipéptidos pueden tener al menos un 90% de
similitud, más preferiblemente al menos un 95% de similitud, y aún
más preferiblemente al menos un 96%, 97%, 98% o 99% de similitud con
los descritos anteriormente. Los polipéptidos pueden comprender
también aquellos que son al menos un 80% idénticos, más
preferiblemente al menos un 90%, o 95% idénticos, aún más
preferiblemente al menos un 96%, 97%, 98% o 99% idénticos respecto
de los polipéptidos descritos en la presente memoria, y también
incluyen las porciones de tales polipéptidos con al menos 30
aminoácidos y más preferiblemente al menos 50 aminoácidos. Los
polipéptidos pueden tener al menos un 90% de similitud, más
preferiblemente al menos un 95% de similitud, y aún más
preferiblemente al menos un 96%, 97%, 98% o 99% de similitud
respecto del polipéptido de SEQ ID NO: 4 o del polipéptido de SEQ
ID NO: 5. Los polipéptidos pueden comprender también aquellos que
son al menos un 80% idénticos, más preferiblemente al menos un 90%;
o 95% idénticos, aún más preferiblemente al menos un 96%, 97%, 98% o
99% idénticos respecto del polipéptido de SEQ ID NO: 4 o del
polipéptido de SEQ ID NO: 5.
Esta invención también proporciona proteínas de
fusión que comprenden los polipéptidos descritos en la presente
memoria. Los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden
fusionar con secuencias, tales como secuencias que incrementan la
reactividad inmunológica, facilitan el acoplamiento del polipéptido
a un soporte o a un vehículo, o facilitan la purificación (p. ej.,
secuencias que codifican epítopos tales como Myc, HA derivada de la
hemaglutinina del virus de la gripe, His-6, o FLAG).
Además, la proteína o el polinucleótido se pueden fusionar a otros
polipéptidos que incrementan su función, o especifican su
localización en la célula, tal como una secuencia de secreción, tal
como se describe en la presente memoria. Los métodos para producir
la proteína de fusión recombinante descrita anteriormente son
habituales en la técnica. La proteína recombinante o de fusión se
puede aislar mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las
células hospedadoras transformadas se pueden usar para analizar la
eficacia de fármacos y agentes que inhiben o activan la función de
VEGI, tales como proteínas del hospedador o agentes derivados
químicamente u otras proteínas que interaccionan con los
polinucleótidos de VEGI para inhibir o alterar la expresión de los
polipéptidos VEGI o afectar a su capacidad de inhibir la
angiogénesis. Un método para ensayar la eficacia de un fármaco o
agente anti-VEGI o anti-angiogénesis
puede ser, por ejemplo, el bloqueo del inhibidor del crecimiento de
las células endoteliales.
Esta invención abarca las composiciones, que
incluyen las composiciones farmacéuticas, que comprenden los
polipéptidos descritos en la presente memoria. En ciertas
realizaciones, la composición comprende el polipéptido de SEQ ID
NO: 4. Esta composición es útil para inhibir la angiogénesis. Estas
composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales
como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen tampones,
que se conocen en la técnica.
Se discuten también los equipos que comprenden
los polipéptidos descritos en la presente memoria. En ciertos
aspectos, la composición comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 4.
En ciertos aspectos, los equipos se pueden usar para tratar la
angiogénesis patológica, inhibir la angiogénesis, o tratar el
cáncer, tal como reducir el tamaño del tumor. Los equipos están en
un envase adecuado, y pueden proporcionar opcionalmente componentes
adicionales tales como tampones e instrucciones.
Los polipéptidos descritos en la presente
memoria se pueden unir a un soporte sólido. Los métodos para
realizar tal unión, por ejemplo la unión a una superficie de una
matriz, se conocen bien en la técnica. Los polipéptidos de la
invención unidos a un soporte sólido, tal como partículas de
agarosa, SEPHADEX, o similares, son útiles para cribar moléculas
que se unen de manera selectiva a los polipéptidos descritos en la
presente memoria.
Una matriz puede comprender polipéptidos de
isoformas de VEGI de la invención, tal como se describen en la
presente memoria. Por lo tanto, en un aspecto, una matriz puede
comprender polipéptidos de isoformas de VEGI codificados por un
polinucleótido de la invención tal como se describe en la presente
memoria. En otro aspecto, una matriz puede comprender un
polipéptido que comprende la secuencia mostrada en la Tabla 4 (SEQ
ID NO: 4), o una región del mismo, en el que la región es de al
menos 5 aminoácidos contiguos de longitud (o más, p. ej. al menos
10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, o más aminoácidos de longitud). La
región puede comprender los aminoácidos 26 y 27 de la secuencia
mostrada en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4). La región puede estar dentro
de los aminoácidos 1-26 de la secuencia mostrada en
la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4).
Una matriz puede comprender un polipéptido que
comprende la secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5), o una
región del mismo, en el que la región es de al menos 5 aminoácidos
contiguos de longitud (o más, p. ej. al menos 10, 15, 25, 50, 75,
100, 150, o más aminoácidos de longitud). La región puede comprender
los aminoácidos 26 y 27 de la secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ
ID NO: 5). La región puede estar dentro de los aminoácidos
1-26 de la secuencia mostrada en la Tabla 5 (SEQ ID
NO: 5).
Los términos "polipéptido" y
"proteína" se usan de manera intercambiable en la presente
memoria, y, como se conoce en la técnica, para referirse a
polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. En las diversas
realizaciones, el polímero puede ser lineal o ramificado, puede
comprender aminoácidos modificados, puede estar interrumpido por
restos que no son aminoácidos, y/o se puede ensamblar en un complejo
de más de una cadena polipeptídica. Tal como se entiende en la
técnica, un polipéptido se puede modificar de manera natural o
mediante intervención; por ejemplo, la formación de enlaces
disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o
cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación
con un componente marcador. En ciertas realizaciones, los
polipéptidos contienen uno o más análogos de un aminoácido (lo que
incluye, por ejemplo, aminoácidos artificiales, etc.), así como
otras modificaciones conocidas en la técnica.
Esta invención incluye también variantes
funcionalmente conservadas de los polipéptidos VEGI descritos en la
presente memoria. Tales variantes se pueden producir mediante el uso
de métodos habituales en la técnica, por ejemplo, mediante
sustituciones conservativas de aminoácidos. En diversas
realizaciones, una variante funcionalmente conservada comprende (o,
en ciertas realizaciones, consiste en) cualquiera de una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez sustituciones
conservativas de aminoácidos.
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La presente invención se refiere también a
vectores que incluyen los polinucleótidos aislados de la presente
invención, a las células hospedadoras que se modifican genéticamente
con los vectores recombinantes, o que se modifican de otra manera
para producir los polipéptidos de la invención, y a la producción de
los polipéptidos de la invención mediante técnicas
recombinantes.
El término "vector" se refiere a un
plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que se ha
manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias
genéticas de VEGI-_{251},
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} o
de fragmentos de las mismas. Este elemento polinucleotídico (en
general, ADN) que hace que el vector sea adecuado para la
multiplicación puede ser un origen de replicación que funciona en
las células procarióticas o eucarióticas. Un ejemplo de un origen
de replicación que funciona en las células procarióticas es el colE1
ori. Un vector recombinante necesita además un marcador
seleccionable para controlar el crecimiento de estos organismos que
albergan el vector. Los marcadores seleccionables adecuados incluyen
los genes que protegen a los organismos de los antibióticos
(resistencia a antibióticos), por ejemplo, ampicilina,
estreptomicina, cloranfenicol, o que posibilitan el crecimiento en
condiciones ambientales de privación de compuestos (condiciones de
crecimiento auxótrofas) cuando se expresan como proteínas en las
células. En una realización preferida de la invención para la
multiplicación del vector recombinante, las células procarióticas
son bacterias. En las versiones especialmente preferidas de la
invención, las bacterias son en particular bacterias de
Escherichia coli o de Bacillus sp. En una realización
adicionalmente preferida de la invención para la multiplicación del
vector recombinante, las células eucarióticas son células de una
línea celular o células de levadura. En las versiones especialmente
preferidas de la invención, las células de la línea celular son
células de una línea celular CHO, COS, Hela, o 3T3, y las células de
levadura son células de Saccharomyces cerevisiae.
La presente invención se refiere a una
diversidad de vectores (es decir, vectores de clonación y/o
expresión, así como vectores para la clonación y/o la replicación)
que tienen clonados en ellos el/los polinucleótido(s)
de
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}. Estos vectores se pueden usar para la expresión de polipéptidos recombinantes y como una fuente de polinucleótidos de VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}. Los vectores de clonación se pueden usar para obtener copias replicadas de los polinucleótidos de VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251} que contienen, o como medio para almacenar los polinucleótidos en un depósito para su recuperación futura. Los vectores de expresión (y las células hospedadoras que contienen estos vectores de expresión) se pueden usar para obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que contienen. También se pueden usar cuando es deseable expresar los polipéptidos VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251} en un individuo, tal como para provocar una respuesta inmunitaria por medio de el/los polipéptido(s) codificado(s) en el/los vector(es) de expresión. Los vectores de clonación y de expresión adecuados incluyen cualquiera de los conocidos en la técnica, p. ej., los que se usan en sistemas de expresión bacterianos, mamíferos, de levaduras y de insectos. Los vectores específicos y las células hospedadoras adecuadas se conocen en la técnica, y no es necesario describirlos con detalle en la presente memoria. Por ejemplo, véase Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}. Estos vectores se pueden usar para la expresión de polipéptidos recombinantes y como una fuente de polinucleótidos de VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}. Los vectores de clonación se pueden usar para obtener copias replicadas de los polinucleótidos de VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251} que contienen, o como medio para almacenar los polinucleótidos en un depósito para su recuperación futura. Los vectores de expresión (y las células hospedadoras que contienen estos vectores de expresión) se pueden usar para obtener polipéptidos producidos a partir de los polinucleótidos que contienen. También se pueden usar cuando es deseable expresar los polipéptidos VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251} en un individuo, tal como para provocar una respuesta inmunitaria por medio de el/los polipéptido(s) codificado(s) en el/los vector(es) de expresión. Los vectores de clonación y de expresión adecuados incluyen cualquiera de los conocidos en la técnica, p. ej., los que se usan en sistemas de expresión bacterianos, mamíferos, de levaduras y de insectos. Los vectores específicos y las células hospedadoras adecuadas se conocen en la técnica, y no es necesario describirlos con detalle en la presente memoria. Por ejemplo, véase Gacesa y Ramji, Vectors, John Wiley & Sons (1994).
Los vectores de clonación y de expresión
contienen en general un marcador seleccionable (por ejemplo, un gen
que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el
crecimiento de una célula hospedadora transformada con el vector),
aunque tal gen marcador se puede portar en otra secuencia
polinucleotídica co-introducida en la célula
hospedadora. Solamente aquellas células hospedadoras en las que se
ha introducido el gen seleccionable sobrevivirán y/o crecerán en
condiciones selectivas. Los genes de selección típicos codifican
proteína(s) que (a) confieren resistencia a antibióticos u
otras sustancias tóxicas, p. ej., ampicilina, neomicina,
metotrexato, etc.; (b) complementan deficiencias auxótrofas; o (c)
aportan nutrientes críticos que no están disponibles en los medios
complejos. La elección del gen marcador apropiado dependerá de la
célula hospedadora, y se conocen en la técnica genes apropiados
para diferentes hospedadores. Los vectores de clonación y de
expresión también contienen generalmente un sistema de replicación
reconocido por el hospedador.
Los vectores de clonación adecuados se pueden
construir según técnicas habituales, o se pueden seleccionar de un
gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica.
Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar según la
célula hospedadora que se pretende utilizar, los vectores de
clonación útiles tendrán en general la capacidad de
auto-replicarse, pueden poseer un único objetivo
para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden portar
genes para un marcador que se puede usar para seleccionar los clones
que contienen el vector. Los ejemplos adecuados incluyen plásmidos
y vectores bacterianos, p. ej., pUC18, pUC19, Bluescript (p. ej.,
pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1,
RP4, ADNs de fagos, y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28.
Estos y otros muchos vectores de clonación están disponibles de
fuentes comerciales tales como BioRad, Stratagene, e Invitrogen.
Los vectores de expresión son generalmente
construcciones polinucleotídicas replicables que contienen un
polinucleótido que codifica un polipéptido VEGI de interés. El
polinucleótido que codifica el polipéptido VEGI está unido de
manera operable a elementos de control de la transcripción
adecuados, tales como promotores, potenciadores y terminadores.
Para la expresión (es decir, la traducción), también son necesarios
uno o más elementos de control de la traducción, tales como sitios
de unión al ribosoma, sitios de iniciación de la traducción, y
codones de parada. Estos elementos de control (transcripcionales y
traduccionales) pueden proceder de polinucleótidos de VEGI (es
decir, uno de los genes de las isoformas de VEGI), o pueden ser
heterólogos (es decir, procedentes de otros genes y/o otros
organismos). Se puede incluir también una secuencia polinucleotídica
que codifica un péptido señal para permitir que un polipéptido VEGI
cruce y/o se introduzca en las membranas celulares o se secrete
desde la célula. Varios vectores de expresión adecuados para la
expresión en las células eucarióticas incluyen células de levadura,
células aviares, y mamíferas conocidas en la técnica.
\newpage
Los vectores que contienen los polinucleótidos
de interés se pueden introducir en la célula hospedadora mediante
cualquiera de varios medios apropiados, que incluyen la
electroporación, la transfección mediante el empleo de cloruro
cálcico, cloruro de rubidio, fosfato cálcico,
DEAE-dextrano, u otras sustancias; el bombardeo con
microproyectiles; la lipofección; y la infección (en la que el
vector es un agente infeccioso, tal como un virus vaccinia). La
elección del medio para la introducción de los vectores o
polinucleótidos a menudo dependerá de la célula hospedadora.
La invención incluye además una célula
hospedadora y un cultivo celular que comprende las células
hospedadoras. Esta célula hospedadora que comprende al menos un
vector polinucleotídico recombinante (en general, ADN) se mencionó
anteriormente. Las "células hospedadoras" son células en las
que se puede propagar un vector, y se puede expresar su ADN. La
célula puede ser procariótica o eucariótica. El término también
incluye la progenie de la célula hospedadora en cuestión. Se
entiende que la progenie puede no ser idéntica a la célula original,
ya que puede haber mutaciones que se den durante la replicación.
Sin embargo, tal progenie está incluida cuando se usa la expresión
"célula hospedadora". Los métodos de transferencia estable, que
significa que el ADN exógeno se mantiene de manera continua en la
célula, se conocen en la técnica. Cuando la célula hospedadora se
toma de células procarióticas, consiste preferiblemente en una
célula de una bacteria, en particular de Escherichia coli o
Bacillus sp. Cuando esta célula hospedadora consiste en una
célula eucariótica, se prefiere una célula de una línea celular de
COS, Hela, o 3T3, o una célula de una levadura, en particular una
célula de Saccharomyces cerevisiae.
Las células hospedadoras de esta invención se
pueden usar, entre otros, como depósitos de los polinucleótidos de
VEGI y/o como vehículos para la producción de los polinucleótidos
y/o polipéptidos VEGI tal como se describen en la presente memoria.
Las células hospedadoras pueden servir también como depósitos de
polinucleótidos de VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}, o VEGI-_{251}
mutantes, como se describe adicionalmente en la presente memoria.
Tales células hospedadoras pueden ser útiles para el cribado, la
producción de proteínas o polipéptidos terapéuticos tal como se
describe adicionalmente en la presente memoria.
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La invención también proporciona anticuerpos que
se unen de manera selectiva a las proteínas
VEGI-_{192a} tal como se describe en la presente
memoria. El término "anticuerpo" incluye, pero sin limitación,
las moléculas intactas, los fragmentos de las mismas, tales como
Fab, (Fab')_{2}, Fv, que son capaces de unirse al determinante
epitópico. Estos fragmentos de anticuerpos mantienen cierta
capacidad de unirse de manera selectiva a su antígeno o receptor, y
se definen como sigue:
(1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento
de unión al antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, se
puede producir mediante la digestión de un anticuerpo completo con
la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una
porción de una cadena pesada;
(2) Fab', el fragmento de una molécula de
anticuerpo se puede obtener tratando un anticuerpo completo con
pepsina, seguido de reducción, para proporcionar una cadena ligera
intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos
fragmentos Fab' por cada molécula de anticuerpo;
(3) (Fab')_{2}, el fragmento del anticuerpo
que se puede obtener tratando el anticuerpo completo con la enzima
pepsina sin reducción posterior; (Fab')_{2} es un dímero de dos
fragmentos Fab' unidos entre sí mediante dos puentes disulfuro;
(4) Fv, definido como un fragmento modificado
mediante ingeniería genética que contiene la región variable de la
cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas
como dos cadenas; y
(5) Un anticuerpo de cadena simple ("SCA"),
definido como una molécula modificada mediante ingeniería genética
que contiene la región variable de la cadena ligera, la región
variable de la cadena pesada, unidas mediante una molécula
enlazadora polipeptídica adecuada en forma de una molécula de cadena
simple fusionada genéticamente.
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En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la
presente invención pueden ser cualquiera de uno o más de los
siguientes: policlonales, monoclonales, de cadena simple (ScFv),
mutantes de estas realizaciones, proteínas de fusión que comprenden
una porción de anticuerpo (tal como una o más regiones CDR),
anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos
humanos, o cualquier configuración modificada de la molécula de
inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del
antígeno de la especificidad necesaria.
Tal como se entiende en la técnica, un
"anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de
anticuerpos en la que el anticuerpo monoclonal está compuesto de
aminoácidos (naturales y no naturales) que están implicados en la
unión selectiva a un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son
sumamente específicos, y se dirigen contra un único sitio
antigénico. La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no
solamente los anticuerpos monoclonales intactos y los anticuerpos
monoclonales de longitud completa, sino también los fragmentos de
los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')_{2}, Fv), de
cadena simple (ScFv), los mutantes de los mismos, las proteínas de
fusión que comprenden una porción de anticuerpo, los anticuerpos
monoclonales humanizados, los anticuerpos monoclonales quiméricos,
y cualquier otra configuración modificada de la molécula de
inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del
antígeno de la especificidad necesaria y la capacidad de unirse a
un antígeno. No se pretende limitar la fuente del anticuerpo o la
manera en la que se produce (p. ej., mediante hibridomas, selección
de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.).
Los anticuerpos "humanizados" se refieren a
una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno que procede
sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, y
el resto de la estructura de inmunoglobulina de la molécula se basa
en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El
sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables
completos fusionados sobre dominios constantes o solamente las
regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) insertadas
sobre regiones estructurales apropiadas en los dominios variables.
Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo natural o
modificados mediante una o más sustituciones de aminoácidos, p.
ej., modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas.
Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las
secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que
contiene los seis CDRs de los anticuerpos de ratón). Otras formas de
anticuerpos humanizados tienen uno o más CDRs (uno, dos, tres,
cuatro, cinco, seis) que están alterados con respecto al anticuerpo
original, que se denominan también uno o más CDRs "derivados
de" uno o más CDRs del anticuerpo.
Los métodos para producir anticuerpos y
fragmentos de anticuerpos se conocen en la técnica (véase, por
ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).
Un anticuerpo puede unirse de manera selectiva a
un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o un
fragmento del mismo, en el que el fragmento está dentro de los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, o
el fragmento comprende los aminoácidos 26 y 27 de SEQ ID NO: 4 o SEQ
ID NO: 5. Un anticuerpo se puede unir de manera selectiva a
VEGI-_{192a} y VEGI-_{192b},
pero no a otras isoformas de VEGI (no se une de manera selectiva a
otras isoformas de VEGI, tales como VEGI-_{251}).
Los anticuerpos se pueden unir de manera selectiva a
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}.
La presente invención se refiere además a un
anticuerpo que se une de manera selectiva a un polipéptido
codificado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o un
fragmento del mismo.
Un anticuerpo se puede unir de manera selectiva
a un polipéptido que comprende una región de al menos 5, al menos
10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o más aminoácidos
contiguos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, en el que la región está
dentro de los residuos de aminoácidos 1-26 mostrados
en la Tabla 4 (SEQ ID NO: 4) o en la Tabla 5 (SEQ ID NO: 5). Un
anticuerpo se puede unir de manera selectiva a un polipéptido que
comprende una región de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al
menos 20, al menos 25, o más aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 4
o SEQ ID NO: 5, en el que la región comprende los aminoácidos 26 y
27 de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la
invención inhibe la actividad de VEGI; por ejemplo, tal anticuerpo
podría estimular la angiogénesis. Los métodos para cribar tal
anticuerpo se describen más adelante.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la
invención puede ser un anticuerpo agonista ya que estimula la
actividad de VEGI. Los métodos para cribar tal anticuerpo se
describen más adelante.
Se entiende que, en este contexto, en el que hay
diversas isoformas de VEGI, la unión selectiva indica la unión
preferentemente (o incluso exclusivamente) a una isoforma dada en
comparación con otra isoforma (a menos que se indique de otra
manera). En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une de manera
selectiva a un polipéptido VEGI de la invención en comparación con
una isoforma de VEGI no humana. Como ejemplo, un anticuerpo de la
invención se podría unir de manera selectiva a
VEGI-_{192a} humano, pero no a
VEGI-_{192a} de ratón (no humano).
Los anticuerpos de esta invención se pueden unir
(es decir, conjugar) a un hapteno o agente detectable. El complejo
es útil para detectar el/los polipéptido(s) (o los fragmentos
polipeptídicos) a los que se une de manera específica el anticuerpo
en una muestra, mediante el uso de técnicas inmunohistoquímicas
habituales tales como la inmunohistoquímica descrita por Harlow y
Lane (1988), anteriormente mencionados. Los ejemplos de tipos de
inmunoensayos que pueden utilizar los anticuerpos monoclonales de la
invención son los inmunoensayos competitivos y no competitivos en
formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son
el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo
(RIA) y el ensayo de tipo sándwich (inmunométrico). La detección
mediante el uso de los anticuerpos monoclonales de la invención se
puede llevar a cabo utilizando inmunoensayos que se realizan en
modo directo, inverso o simultáneo, lo que incluye los ensayos
inmunohistoquímicos con muestras fisiológicas. Los expertos en la
técnica conocerán, o pueden discernir fácilmente, otros formatos de
inmunoensayos sin experimentación excesiva.
Otra técnica que también puede dar como
resultado una sensibilidad mayor consiste en acoplar los anticuerpos
a haptenos de bajo peso molecular. Estos haptenos se pueden
detectar después de manera específica por medio de una segunda
reacción. Por ejemplo, es habitual utilizar haptenos tales como
biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenilo, piridoxal, y
fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos
anti-hapteno específicos. Véase Harlow y Lane
(1988), anteriormente mencionados.
Los anticuerpos de la invención se pueden unir a
muchos portadores diferentes. Así, esta invención también
proporciona composiciones que contienen anticuerpos y un portador.
Los portadores pueden ser activos y/o inertes. Los ejemplos de
portadores muy conocidos incluyen vidrio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La
naturaleza del portador puede ser soluble o insoluble para los
fines de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros
portadores adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales, o
serán capaces de determinarlos, mediante el uso de experimentación
rutinaria.
Existen muchos marcadores y métodos de marcaje
diferentes conocidos para los expertos en la técnica. Los ejemplos
de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente
invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos
fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes, y
compuestos bioluminiscentes. Los expertos en la técnica conocerán
otros marcadores adecuados para unir el anticuerpo monoclonal, o
serán capaces de determinarlos, mediante el uso de experimentación
rutinaria. Además, la unión de estos marcadores al anticuerpo
monoclonal de la invención se puede llevar a cabo mediante el uso de
técnicas habituales para los expertos en la técnica.
Para los fines de la invención, los polipéptidos
de esta invención se pueden detectar mediante los anticuerpos de la
invención cuando están presentes en las muestras, tales como
líquidos y tejidos. Este uso de los anticuerpos se discute con más
detalle más adelante.
Esta invención abarca las composiciones que
contienen los anticuerpos, los fragmentos de los mismos o las
líneas celulares que producen los anticuerpos. Cuando estas
composiciones se van a usar farmacéuticamente, se combinan con un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta invención abarca las
matrices que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de los
mismos. Los anticuerpos se pueden inmovilizar en una superficie, p.
ej., en una matriz para el uso en la detección y los ensayos de
diagnóstico descritos con más detalle más adelante. Los anticuerpos
se pueden inmovilizar también en un soporte para la purificación de
los polipéptidos o los fragmentos descritos en la presente
memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona además
composiciones, que incluyen las composiciones farmacéuticas, que
comprenden los polipéptidos, polinucleótidos, anticuerpos, vectores
recombinantes, y células hospedadoras de la invención. Estas
composiciones pueden incluir un tampón, que se selecciona según el
uso deseado del polipéptido, anticuerpo, polinucleótido, vector
recombinante, o célula hospedadora, y pueden incluir también otras
sustancias apropiadas para el uso deseado. Los expertos en la
técnica pueden seleccionar fácilmente un tampón adecuado, una
amplia diversidad de los cuales se conocen en la técnica, adecuados
para el uso deseado. En ciertos casos, la composición es una
composición farmacéutica y puede comprender un excipiente
farmacéuticamente aceptable, una diversidad de los cuales se
conocen en la técnica, y no es necesario discutirlos con detalle en
la presente memoria. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se
han descrito ampliamente en una diversidad de publicaciones, que
incluyen, por ejemplo, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science
and Practice of Pharmacy", 20ª edición, Lippincott, Williams,
& Wilkins.
\vskip1.000000\baselineskip
Los equipos pueden contener
polinucleótido(s), polipéptido(s), y/o anticuerpos de
esta invención, tales como equipos para el diagnóstico, para la
terapia. Los equipos incluyen aquellos que permiten a alguien llevar
a cabo un ensayo de la presencia de polinucleótidos, polipéptidos
VEGI y/o anticuerpos anti-VEGI, tales como
cualquiera de los descritos en la presente memoria, por lo que se
detectan y/o cuantifican esas moléculas. Por lo tanto, la invención
se refiere a (a) un equipo para la detección o la cuantificación de
un polinucleótido de VEGI en una muestra que comprende cualquiera
de los polinucleótidos de VEGI descritos en la presente memoria;
(b) un equipo que comprende cualquiera de los anticuerpos descritos
en la presente memoria para la detección o la cuantificación de un
polipéptido VEGI en una muestra; (c) un equipo que comprende
cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria
para la detección o la cuantificación de un anticuerpo
anti-VEGI en una muestra. La invención también se
refiere a equipos que comprenden polinucleótidos o polipéptidos de
la invención para el uso en terapia.
Los equipos están en un envase adecuado, y
pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son
útiles en el procedimiento. Estos componentes opcionales incluyen,
pero sin limitación, tampones, reactivos de captura, reactivos de
revelado, marcadores, superficies reactivas, medios para la
detección, muestras de control, instrucciones, e información
interpretativa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria se discuten también los
métodos que usan los polinucleótidos, polipéptidos y/o anticuerpos
de VEGI-_{192a} y VEGI-_{192b}
para detectar agentes adecuados en una muestra. Como evidencia esta
descripción, los métodos de detección se refieren a cualquiera de
detectar la presencia, ausencia, así como la cuantificación. Los
procedimientos para llevar a cabo ensayos de diagnóstico (es decir,
detección) mediante el uso de polinucleótidos, polipéptidos o
anticuerpos se conocen ampliamente en la técnica, y son rutinarios
para una persona de experiencia habitual. En general, para llevar a
cabo un método de diagnóstico de esta invención, se proporciona una
de las composiciones de esta invención como reactivo para detectar
un objetivo con el que reacciona en una muestra. El objetivo se
suministra obteniendo una muestra adecuada de un individuo para el
cual se va a medir el parámetro de diagnóstico. Son adecuados
muchos tipos de muestras para este fin. Si se desea, el objetivo se
puede purificar parcialmente a partir de la muestra, o se puede
amplificar antes de llevar a cabo el ensayo.
La presente invención se refiere a un método
para detectar la presencia o ausencia o el nivel de los polipéptidos
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} en
una muestra que comprende poner en contacto una muestra de un humano
o animal con anticuerpos que se unen de manera selectiva al
polipéptido descrito en la presente memoria, y detectar la
presencia o ausencia o la cantidad de un complejo formado entre el
polipéptido y los anticuerpos. Tal detección es útil para fines de
diagnóstico, pronóstico, y/o monitorización de una enfermedad
asociada a la angiogénesis. Un método para el diagnóstico de la
angiogénesis patológica puede comprender las etapas de poner en
contacto una muestra de un humano o animal que se sospecha que
tiene una angiogénesis patológica con anticuerpos que reconocen el
polipéptido descrito en la
presente memoria, y detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre el polipéptido y los anticuerpos.
presente memoria, y detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre el polipéptido y los anticuerpos.
Se puede emplear un ensayo competitivo en el que
los anticuerpos que se unen de manera selectiva a los polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
están unidos a un soporte sólido, y se hacen pasar
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
marcados y una muestra procedente del hospedador sobre el soporte
sólido, y la cantidad de marcador se detecta, por ejemplo, mediante
cromatografía con centelleo líquido, y se puede correlacionar con la
cantidad de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} en la muestra.
Un ensayo de tipo "sándwich" es similar a
un ensayo ELISA. En un ensayo de tipo "sándwich", se hace pasar
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
sobre un soporte sólido y se une a un anticuerpo unido a un soporte
sólido. Un segundo anticuerpo se une después a
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}.
Un tercer anticuerpo que está marcado y es específico del segundo
anticuerpo se hace pasar después sobre el soporte sólido y se une al
segundo anticuerpo, y después se puede cuantificar la cantidad.
Mediante el uso de la metodología estándar
conocida en la técnica, se puede construir un ensayo de diagnóstico
revistiendo sobre una superficie (es decir, un soporte sólido), por
ejemplo, una placa de microtitulación o una membrana (p. ej. una
membrana de nitrocelulosa), anticuerpos específicos o que se unen de
manera selectiva a los polipéptidos VEGI-_{192a}
o VEGI-_{192b} o ambos, y poniendo en contacto la
superficie revestida con suero, tejido u otra muestra biológica o
química obtenida de una persona que se sospecha que tiene una
enfermedad asociada a la angiogénesis. La presencia o ausencia de un
complejo resultante formado entre el polipéptido
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} de
la muestra y los anticuerpos específicos hacia él se pueden
detectar mediante cualquiera de los métodos conocidos habituales en
la técnica, tales como colorimetría o espectroscopia de anticuerpos
fluorescentes. Este método de detección se puede usar, por ejemplo,
para el diagnóstico o el pronóstico del cáncer.
El ensayo de los niveles de polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} en
una muestra puede usar cualquier técnica basada en anticuerpos que
se conozca en la técnica. Por ejemplo, la expresión de los
polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} en los tejidos se puede estudiar con los métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} incluyen los inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores para ensayos con anticuerpos adecuados se conocen en la técnica, e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In), y tecnecio (^{99}mTc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
VEGI-_{192b} en los tejidos se puede estudiar con los métodos inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} incluyen los inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores para ensayos con anticuerpos adecuados se conocen en la técnica, e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{121}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In), y tecnecio (^{99}mTc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.
Además de ensayar los niveles de los
polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} en una muestra obtenida de un
individuo, los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} se pueden detectar in vivo
mediante la formación de imágenes. Los marcadores de anticuerpos
para la formación de imágenes in vivo de los polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
incluyen los detectables mediante radiografía de rayos X, NMR o ESR.
Para la radiografía de rayos X, los marcadores adecuados incluyen
radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación
detectable pero no son abiertamente dañinos para el sujeto. Los
marcadores adecuados para NMR y ESR incluyen aquellos con un espín
detectable característico, tales como deuterio, que se pueden
incorporar en el anticuerpo marcando los nutrientes para el
hibridoma relevante.
Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se
une de manera selectiva a los polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} que se han marcado con un resto detectable apropiado para la formación de imágenes, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99}mTc), una sustancia radio-opaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, de manera parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero en el que se va a examinar un trastorno del sistema inmunitario. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad de resto de formación de imágenes necesario para producir las imágenes diagnósticas. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada oscilará normalmente de alrededor de 5 a 20 milicurios de ^{99}mTc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará después de manera preferente en la localización de las células que contienen los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}. La formación de imágenes de tumores in vivo fue descrita por Burchiel y colaboradores (capítulo 13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. y Rhodes, B. A., eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
VEGI-_{192b} que se han marcado con un resto detectable apropiado para la formación de imágenes, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99}mTc), una sustancia radio-opaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, de manera parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero en el que se va a examinar un trastorno del sistema inmunitario. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes utilizado determinarán la cantidad de resto de formación de imágenes necesario para producir las imágenes diagnósticas. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada oscilará normalmente de alrededor de 5 a 20 milicurios de ^{99}mTc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará después de manera preferente en la localización de las células que contienen los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}. La formación de imágenes de tumores in vivo fue descrita por Burchiel y colaboradores (capítulo 13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W. y Rhodes, B. A., eds., Masson Publishing Inc. (1982)).
Tal como se entiende en la técnica, los
polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} se pueden detectar mediante el uso de
cualquier agente que se una de manera selectiva a los
polipéptidos.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un equipo de diagnóstico que comprende anticuerpos que se
unen de manera selectiva a los polipéptidos de la presente
invención, por ejemplo, a los anticuerpos que se unen de manera
selectiva a los polipéptidos VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} o ambos, y reactivos auxiliares
adecuados para el uso en la detección de la presencia del
polipéptido en una muestra. Estos reactivos se conocen bien en la
técnica, y son adecuados para el uso en la detección de la presencia
o la ausencia de los polipéptidos VEGI en una muestra de suero,
tejido o de otro tipo. Las muestras de tejido contempladas se pueden
obtener de mono o humano, o de otros mamíferos. El equipo puede
incluir además instrucciones para el uso, controles e información
interpretativa.
Esta invención proporciona también un método
para detectar la presencia o ausencia o el nivel de los
polinucleótidos descritos en la presente memoria, que comprende
poner en contacto una muestra de un individuo tal como un humano o
un animal con un polinucleótido (en ciertas realizaciones, un
oligonucleótido) que se une de manera selectiva al polinucleótido
descrito en la presente memoria, y detectar la presencia o ausencia
o la cantidad de una molécula bicatenaria formada entre el
polinucleótido usado y un polinucleótido de la muestra. En ciertas
realizaciones, el método de la invención, que es útil para el
diagnóstico de la angiogénesis patológica, comprende las etapas de
poner en contacto una muestra de un humano o animal que se sospecha
que tiene una angiogénesis patológica con un polinucleótido (tal
como un oligonucleótido) que se une al polinucleótido descrito en la
presente memoria, y detectar la presencia o ausencia de una
molécula bicatenaria formada entre el polinucleótido usado y un
polinucleótido de la muestra. En otra realización, la presente
invención se refiere a ARN, ADN u otras secuencias nucleotídicas
para el uso en la detección de la presencia o ausencia de
polinucleótidos de VEGI mediante el uso de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) o la PCR con transcripción inversa
(RT-PCR). Se pueden usar otros métodos de
amplificación basados en cebadores. La secuencia de ADN mostrada en
la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1) o en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 2) se puede
usar para diseñar cebadores que se unen de manera específica a la
secuencia polinucleotídica de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} en el caso de la PCR, o a un cADN de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
producido a partir de la transcripción inversa de un ARN que
codifica un polipéptido VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}, con el fin de detectar la presencia,
ausencia, o cuantificar la cantidad de polinucleótido de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
mediante la comparación con un patrón. Los cebadores pueden ser de
cualquier longitud, que oscila, por ejemplo, de 7-40
nucleótidos, preferiblemente 10-15 nucleótidos, lo
más preferiblemente 18-25 nucleótidos. Los reactivos
y los controles necesarios para las reacciones de PCR o de
RT-PCR se conocen bien en la técnica. Los productos
amplificados se pueden analizar después en función de la presencia
o ausencia de secuencias polinucleotídicas de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b},
por ejemplo mediante fraccionamiento en gel, con o sin hibridación,
mediante radioquímica, y técnicas inmunoquímicas. Este método es
ventajoso, ya que es necesaria solamente una pequeña
cantidad de muestra para generar una cantidad suficiente de ADN molde con el que llevar a cabo la PCR o RT-PCR.
cantidad de muestra para generar una cantidad suficiente de ADN molde con el que llevar a cabo la PCR o RT-PCR.
Los métodos de detección pueden implicar el uso
de uno o más cebadores para amplificar la secuencia de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
de interés. La detección se puede llevar a cabo mediante el uso de
sondas específicas (tales como sondas marcadas) que detectan la
presencia o ausencia de (o que pueden cuantificar) una secuencia de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} de
interés. En ciertas realizaciones, la sonda comprende un
marcador.
El método se puede usar para detectar el nivel
de VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}
detectando la presencia o ausencia o la cantidad de ARN celular que
codifica VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} o un fragmento descrito en la
presente memoria. El ARN celular total se puede aislar a partir de
una muestra mediante el uso de una técnica adecuada, tal como el
método de tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo en una
única etapa descrito por Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162:
156-159 (1987)). Los niveles del mARN que codifica
el polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} se ensayan después mediante el uso de
cualquier método apropiado. Estos incluyen el análisis mediante
transferencia de Northern, cartografía con nucleasa S1, la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), transcripción inversa en
combinación con la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR), y transcripción inversa en combinación
con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).
Un equipo de diagnóstico puede contener
cebadores para PCR o RT-PCR, uno o más cebadores,
tales como cebadores específicos para los polinucleótidos de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}, y/o
cebadores específicos para otras isoformas de VEGI, tales como
VEGI-_{251}, VEGI-_{174}, y
reactivos auxiliares que se conocen bien en la técnica, y que son
adecuados para el uso en la detección de la presencia o ausencia de
polinucleótidos de isoformas de VEGI, o para la cuantificación de
la cantidad de un ARN que codifica un polipéptido de una isoforma
de VEGI en una muestra mediante el uso de PCR o
RT-PCR, o en otro u otros métodos de amplificación.
Las muestras contempladas se pueden obtener de humanos o
animales.
Un equipo de diagnóstico puede contener sondas,
una o más sondas, tales como sondas especificas para los
polinucleótidos de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}, y/o sondas específicas para otras
isoformas de VEGI, tales como VEGI-_{251},
VEGI-_{174}, y reactivos auxiliares que se conocen
bien en la técnica, y que son adecuados para el uso en la detección
de la presencia o ausencia de polinucleótidos de isoformas de VEGI,
o para la cuantificación de la cantidad de un ARN que codifica un
polipéptido de una isoforma de VEGI en una muestra mediante el uso
de un método, tal como la transferencia de Northern, o de otro u
otros métodos. Las muestras contempladas se pueden obtener de
humanos o animales.
Tal como se entiende en la técnica, una
"muestra" puede ser cualquier muestra obtenida de un individuo
(a menudo denominada "muestra biológica"), líquido corporal,
línea celular, cultivo tisular, u otra fuente que contiene o que
puede contener un polipéptido o mARN de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}.
Tal como se indica, las muestras biológicas incluyen los líquidos
corporales (tales como suero, plasma, orina, líquido sinovial y
líquido cefalorraquídeo) que contienen el polipéptido
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
libre, tejido de los sistemas inmunitario y circulatorio, y otras
fuentes de tejidos que se ha descubierto que expresan polipéptidos
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
completos o maduros o un receptor de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}. Los métodos para obtener biopsias tisulares y líquidos corporales de mamíferos se conocen bien en la técnica. Cuando la muestra biológica incluye mARN, se prefiere una biopsia tisular como fuente preferida.
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}. Los métodos para obtener biopsias tisulares y líquidos corporales de mamíferos se conocen bien en la técnica. Cuando la muestra biológica incluye mARN, se prefiere una biopsia tisular como fuente preferida.
"Analizar el nivel de expresión del gen que
codifica la proteína VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}" quiere decir medir o estimar
cualitativamente o cuantitativamente el nivel del polipéptido
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} o
el nivel del mARN que codifica el polipéptido
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} en
una primera muestra directamente (p. ej., determinando o estimando
el nivel absoluto del polipéptido o el nivel del mARN) o
relativamente (p. ej., comparando el nivel del polipéptido
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} o
el nivel del mARN en una segunda muestra). Preferiblemente, el
nivel del polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} o el nivel del mARN en la primera
muestra se mide o se estima, y se compara con un nivel de
polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} de referencia o un nivel de mARN de
referencia, y la referencia se toma de una segunda muestra obtenida
de un individuo que no tiene el trastorno, o se determina
calculando los niveles medios de una población de individuos que no
tienen un trastorno de los sistemas inmunitario y circulatorio. Tal
como se apreciará en la técnica, una vez que se conoce un nivel de
polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} de referencia o un nivel de mARN de
referencia, se puede usar de manera repetida como referencia para la
comparación.
Tal como se indicó anteriormente, los
polinucleótidos y polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} son útiles para el diagnóstico de
afecciones que implican una expresión anormalmente alta o baja de
las actividades de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}. Dadas las células y tejidos en los
que se expresan VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}, así como las actividades moduladas
por VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}, es evidente que un nivel
sustancialmente alterado (incrementado o disminuido) de expresión de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
en un individuo en comparación con el nivel de referencia o nivel
"normal" produce estados patológicos relacionados con el/los
sistema(s) corporal(es) en los que se expresan y/o son
activos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}.
Los métodos para ayudar en el diagnóstico de un
trastorno o afección asociada a VEGI ayudan a realizar una
determinación clínica con respecto a la clasificación o naturaleza
de la angiogénesis patológica o del pronóstico del cáncer, y pueden
o no ser concluyentes con respecto al diagnóstico definitivo. Por lo
tanto, un método para ayudar en el diagnóstico de la angiogénesis
patológica o el pronóstico del cáncer, o una enfermedad relacionada,
puede comprender la etapa de detectar el nivel de expresión de las
isoformas de VEGI (es decir, VEGI-_{192a},
VEGI-_{192b}) en una muestra de un individuo. Un
método para ayudar en el diagnóstico de una enfermedad asociada a
la angiogénesis puede comprender además la etapa de detectar niveles
alterados de un polinucleótido y/o polipéptido de una isoforma de
VEGI en una muestra del individuo, y/o detectar los niveles
incrementados o disminuidos de un polinucleótido y/o polipéptido de
una isoforma de VEGI en una muestra del individuo.
También se discute un método para detectar un
individuo en riesgo que puede o no tener una enfermedad asociada a
la angiogénesis detectable, y/o una afección asociada con un nivel
anormal de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b}, y puede haber o no manifestado una
enfermedad detectable antes de los métodos de tratamiento descritos
en la presente memoria. "En riesgo" indica un individuo que se
ha determinado que tiene más probabilidad de desarrollar un síntoma
basándose en los métodos de determinación de riesgos convencionales
o tiene uno o más factores de riesgo que se correlacionan con el
desarrollo de una enfermedad asociada a la angiogénesis. Un
individuo que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una
probabilidad mayor de desarrollar una enfermedad asociada a la
angiogénesis que un individuo sin estos factores de riesgo. Los
ejemplos (es decir, categorías) de grupos de riesgo se conocen en la
técnica, y se discuten en la presente memoria.
El polinucleótido de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} se
puede usar también como sonda para la detección de la presencia o
ausencia de mutaciones o polimorfismos en el gen de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b},
así como en cualquier secuencia de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} de interés, sea o no una mutación. Un
mutante de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} puede estar asociado a la
angiogénesis o a diversos trastornos relacionados con los sistemas
inmunitario y circulatorio. Los métodos para detectar las secuencias
polinucleotídicas mutantes se conocen bien en la técnica, e
incluyen, p. ej., el polimorfismo conformacional de cadena
monocatenaria (SSCP), y diversos métodos basados en la
amplificación de secuencias para la detección de mutaciones de
secuencia que incluyen las mutaciones puntuales, p. ej., LCR,
NASBA, PCR, extensión limitada de cebadores, etc. Los métodos para
detectar secuencias proteicas alteradas incluyen el análisis
mediante transferencia de Western, electroforesis capilar,
espectroscopia de masas, y WAVE. En general, un experimento de
detección se llevará a cabo en paralelo con un polinucleótido o
polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} de control, o, en el caso de la
determinación de niveles de expresión alterados, con una muestra de
control que posee niveles normales de un polinucleótido o
polipéptido VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}.
Las secuencias de la presente invención son
valiosas para la identificación cromosómica. La secuencia se dirige
específicamente a, y puede hibridar con, una localización particular
en un cromosoma humano individual. Además, existe la necesidad
actual de identificar sitios particulares en los cromosomas. La
cartografía de los ADNs en los cromosomas según la presente
invención es un primer paso importante en la correlación de esas
secuencias.
Brevemente, las secuencias se pueden
cartografiar en cromosomas preparando cebadores de PCR
(preferiblemente de 15-25 pb) a partir del cADN. El
análisis informático de la región sin traducir de 3' de la secuencia
se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no abarcan más de
un exón en el ADN genómico, por lo que se complica el proceso de
amplificación. Estos cebadores se usan después para el cribado
mediante PCR de híbridos de células somáticas que contienen
cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que
contienen el gen humano que corresponde al cebador producirán un
fragmento amplificado.
La cartografía mediante PCR de los híbridos de
células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN
particular a un cromosoma particular. Mediante el uso de la presente
invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, se puede
llevar a cabo la sublocalización con paneles de fragmentos de
cromosomas específicos o mezclas de clones genómicos grandes de
manera análoga. Otras estrategias de cartografía que se pueden usar
de forma similar para cartografiar el cromosoma incluyen la
hibridación in situ, el precribado con cromosomas marcados
clasificados mediante citometría de flujo y la preselección mediante
hibridación para construir bibliotecas de cADN específico de
cromosomas.
La hibridación in situ de fluorescencia
(FISH) de un clon de cADN a una extensión cromosómica en metafase
se puede usar para proporcionar una localización cromosómica precisa
en una etapa. Esta técnica se puede usar con un cADN de sólo 50 ó
60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et
al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon
Press, Nueva York (1988).
Una vez que una secuencia se ha cartografiado en
una localización cromosómica precisa, la posición física de la
secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos de
cartografía genética. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V.
McKusick, Mendelian Inheritance in Man. La relación entre los genes
y las enfermedades que se han cartografiado en la misma región
cromosómica se identifican después por medio del análisis de
ligamiento (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en el cADN o la secuencia genómica entre los sujetos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o
todos los individuos afectados pero no en los sujetos normales,
entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la
enfermedad; un gen localizado en una región cromosómica asociada a
la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causantes
potenciales. Esto supone una resolución de cartografía de 1
megabase, y un gen por 20 kb. Mediante la utilización de las
técnicas descritas anteriormente, se determinó que la localización
cromosómica de VEGI es 9q32 con una gran seguridad. Los estudios
previos de cartografía cromosómica han asociado varios defectos del
desarrollo a loci en esta zona del cromosoma 9.
La presente invención también es útil para el
diagnóstico o el tratamiento de diversos trastornos relacionados
con los sistemas inmunitario y circulatorio en mamíferos,
preferiblemente en humanos. Tales trastornos incluyen las
infecciones por bacterias, virus, y otros parásitos, las
inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias, linfadenopatías,
enfermedades autoinmunitarias, enfermedad de injerto contra
hospedador, y cualquier alteración de la regulación de la función
de las células de los sistemas inmunitario y circulatorio que
incluyen, pero sin limitación, la autoinmunidad, las leucemias, los
linfomas, la inmunosupresión, inmunidad, inmunidad humoral,
enfermedad inflamatoria intestinal, mielosupresión, y similares.
Para varios trastornos, se pueden detectar
niveles sustancialmente alterados (incrementados o disminuidos) de
expresión génica de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} en diversos tejidos (tales como el
tejido circulatorio) o en otras células o líquidos corporales (p.
ej., suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido
cefalorraquídeo) tomados de un individuo que tiene tal trastorno,
respecto de un nivel de expresión génica de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
"de referencia", es decir, el nivel de expresión de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} de
un individuo que no tiene el trastorno. Así, un método de
diagnóstico útil durante el diagnóstico de un trastorno asociado a
VEGI, implica medir el nivel de expresión del gen que codifica la
proteína VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} en una muestra de un individuo y
comparar el nivel de expresión génica medido con un nivel de
expresión génica de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} de referencia, por lo que un
incremento o una disminución del nivel de expresión génica en
comparación con la referencia es indicativo del trastorno.
Un método de diagnóstico útil durante el
diagnóstico de un trastorno asociado a VEGI implica medir el nivel
de expresión del gen que codifica la proteína
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b} en
una muestra de un individuo y comparar el nivel de expresión génica
medido con un nivel de expresión génica de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
de referencia, por lo que un incremento o una disminución en el
nivel de expresión génica en comparación con la referencia es
indicativo del trastorno.
Cuando ya se ha hecho un diagnóstico de un
trastorno según los métodos convencionales, la presente invención
es útil como pronóstico y/o indicador de monitorización, por lo que
los pacientes que exhiben una expresión génica de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
disminuida experimentarán un resultado clínico peor respecto de los
pacientes que expresan el gen a un nivel más cercano al nivel de
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los polinucleótidos y polipéptidos de la
presente invención se pueden emplear como reactivos y materiales de
investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos
para enfermedades humanas.
Esta invención proporciona un método para la
identificación de agentes que modulan una actividad de
VEGI-_{192a}; métodos para la identificación de
agentes que modulan la expresión de VEGI-_{192a}
en una célula. En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo
exento de células. En otras realizaciones, el ensayo es un ensayo
basado en células.
\newpage
Tal como se usa en la presente memoria, el
término "modular" abarca "incrementar" y "disminuir".
Son de interés particular los agentes que inhiben una actividad de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}.
Tales agentes son útiles para estimular la angiogénesis. En otros
aspectos, los agentes de interés son aquellos que incrementan la
actividad de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}. Tales agentes son de interés para
inhibir la angiogénesis y tratar una enfermedad asociada a la
angiogénesis.
En general, los métodos de cribado o de análisis
emplean agentes o fármacos de una diversidad de fuentes. Un agente
o fármaco puede ser, por ejemplo, un compuesto biológico o químico
tal como una molécula orgánica o inorgánica simple o compleja, un
péptido, una proteína, un oligonucleótido, polinucleótido,
carbohidrato, o lipoproteína. Se puede sintetizar una amplia serie
de compuestos, por ejemplo oligómeros, tales como oligopéptidos y
oligonucleótidos, y compuestos orgánicos sintéticos basados en
diversas estructuras centrales, y estos también están incluidos en
el término "agente". Además, diversas fuentes naturales pueden
proporcionar compuestos para el cribado, tales como extractos
vegetales o animales, y similares. Los compuestos se pueden analizar
por separado o en combinación entre sí.
La invención proporciona métodos para la
identificación de agentes que modulan una actividad de
VEGI-_{192a} tras la unión a
VEGI-_{192a}. El método comprende en general poner
en contacto un agente de ensayo que se une de manera selectiva a
VEGI-_{192a} con una muestra que contiene
VEGI-_{192a}; y analizar la actividad de
VEGI-_{192a} en presencia o ausencia de los
agentes. Un incremento o una disminución de una actividad de
VEGI-_{192a} en presencia del agente en
comparación con la ausencia del agente indica que el agente
incrementa (agonista) o disminuye (antagonista) la actividad de
VEGI-_{192a}. Los agonistas o antagonistas
potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos,
polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la
invención, y por tanto incrementan o disminuyen su actividad.
Los ensayos para analizar la capacidad de un
agente de unirse de manera selectiva a un polipéptido de la
invención se conocen en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos
de la invención se pueden unir a un soporte sólido, y el agente que
se une de manera selectiva al polipéptido se puede identificar
mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. De manera
alternativa, los agonistas y/o antagonistas de
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}
se pueden detectar combinando VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} y un agonista y/o antagonista
potencial con receptores de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} asociados a membranas (si se
identifican tales receptores) o receptores recombinantes en
condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva.
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b} se
pueden marcar, tal como mediante reactividad, de forma que el número
de moléculas de VEGI-_{192a} o
VEGI-_{192b} unidas al receptor puede determinar
la eficacia del agonista y/o antagonista potencial.
Los ensayos para analizar la actividad de VEGI
se conocen en la técnica. Los ejemplos de tales ensayos basados en
células se describen con más detalle en los Ejemplos, tal como el
ensayo del efecto sobre el crecimiento de las células endoteliales
vasculares, la formación y organización de las células endoteliales
en estructuras tubulares similares a capilares, o la organización
de las células endoteliales en vasos capilares en membrana
corioalantoidea embrionaria de pollo.
Los anticuerpos que se unen de manera selectiva
a los polipéptidos VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} se pueden usar como antagonistas
mediante la unión a VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b} y evitando que éstos lleven a cabo su
actividad.
Esta invención también proporciona métodos para
la identificación de agentes que modulan la actividad de la
isoforma de VEGI descrita en la presente memoria sin unirse a la
isoforma de VEGI. Tales agentes incluyen, pero sin limitación,
agentes que llevan a cabo la regulación antes o después de la
actividad de VEGI. Estos métodos comprenden ensayar la actividad de
VEGI en presencia o ausencia de un agente a ensayar.
Esta invención también proporciona métodos para
la identificación de agentes que modulan un nivel de polipéptido y/o
mARN de VEGI descrito en la presente memoria.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método para la identificación de un agente que modula un nivel
de expresión de VEGI en una célula, y el método comprende: poner en
contacto un agente candidato a ensayar con una célula que comprende
un ácido nucleico que codifica un polipéptido VEGI descrito en la
presente memoria, y determinar el efecto de dicho agente sobre la
expresión del polipéptido VEGI. En ciertas realizaciones, el efecto
se mide detectando el nivel de mARN que codifica el polipéptido VEGI
mediante el uso de los polinucleótidos de VEGI descritos en la
presente memoria. En otras realizaciones, el efecto se mide
detectando el nivel del polipéptido VEGI mediante el uso de los
anticuerpos descritos en la presente memoria.
Otros antagonistas potenciales incluyen las
moléculas inversas. Se puede usar la tecnología de moléculas
inversas para controlar la expresión génica por medio del ADN o ARN
inverso o por medio de la formación de hélices triples. Las
técnicas con moléculas inversas se discuten en varios estudios (por
ejemplo, Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991);
"Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression". CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)). La formación
de hélices triples se discute también en varios estudios (por
ejemplo, Lee, et al., Nucleic Acids Research 6:3073 (1979);
Cooney, et al., Science 241:456 (1988); Dervan, et
al., Science 251: 1360 (1991)). Los métodos se basan en la
unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Por
ejemplo, la porción codificante de 5' de un polinucleótido que
codifica el polipéptido maduro de la presente invención se puede
usar para diseñar un oligonucleótido de ARN inverso de alrededor de
10 a 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de
ADN para que sea complementario a una región del gen implicada en
la transcripción, por lo que evita la transcripción y la producción
de VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}. El oligonucleótido de ARN inverso
hibrida con el mARN in vivo y bloquea la traducción de la
molécula de mARN hasta el polipéptido
VEGI-_{192a} y/o VEGI-_{192b}.
Los oligonucleótidos descritos anteriormente también se pueden
administrar a las células de forma que el ARN o ADN inverso se pueda
expresar in vivo para inhibir la producción del polipéptido
VEGI-_{192a} y/o
VEGI-_{192b}.
Esta invención también proporciona métodos para
la identificación de agentes tales como mutantes o variantes de
VEGI-_{192a} que pueden competir por la unión con
los objetivos a los que se une VEGI-_{192a}, y que
evitan que VEGI-_{192a} interaccione con sus
objetivos. Tales mutantes o variantes pueden ser agonistas o
antagonistas de VEGI-_{192a}.
Esta invención proporciona un método para la
identificación de agentes que se unen a
VEGI-_{192a} que comprende poner en contacto los
agentes con VEGI-_{192a} y después detectar la
unión de los agentes a VEGI-_{192a}.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente memoria se discuten métodos para
la inhibición del crecimiento de las células endoteliales
vasculares, para la inhibición de la angiogénesis, para el
tratamiento o la mejora de enfermedades y procesos que están
mediados por una angiogénesis incontrolada, el tratamiento del
cáncer, tal como la inhibición del crecimiento tumoral. Al
contrario de las enseñanzas de que VEGI-_{251} es
una proteína asociada a membranas, los Ejemplos demuestran que
VEGI-_{251} es una proteína secretada, que inhibe
el crecimiento de las células endoteliales vasculares, y que tiene
un efecto anti-angiogénesis tras la expresión.
Además, los Ejemplos también demuestran que
VEGI-_{192a} inhibe el crecimiento de las células
endoteliales vasculares.
Por lo tanto, las composiciones que se pueden
usar para el método descrito en la presente memoria incluyen, pero
sin limitación, los polinucleótidos descritos en la presente
memoria, tales como los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6; los
polipéptidos descritos en la presente memoria, tales como los
polipéptidos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6, o una
forma truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos de la
región de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4, los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los aminoácidos
1-85 de SEQ ID NO: 6; y agonistas o antagonistas de
los polipéptidos VEGI descritos en la presente memoria, tales como
un anticuerpo que bloquea la actividad del polipéptido VEGI.
La invención también se refiere a métodos para
retrasar el desarrollo de una enfermedad asociada a la angiogénesis
en un individuo.
Los polipéptidos de las isoformas de VEGI de la
presente invención (y los polinucleótidos que codifican los
polipéptidos de las isoformas de VEGI) se pueden usar para reducir
la formación de estructuras tubulares similares a capilares
formadas por las células endoteliales in vitro. Los
polipéptidos de las isoformas de VEGI de la presente invención se
pueden usar para inhibir la formación de células endoteliales
organizadas en estructuras tubulares similares a capilares en
respuesta a factores angiogénicos tales como FGF-2.
Además, los polipéptidos aislados de las isoformas de VEGI
descritos en la presente memoria de la presente invención se pueden
usar también para inhibir el crecimiento y la organización de las
células endoteliales en vasos capilares en una membrana
corioalantoidea (CAM) de pollo modificada. Como resultado, los
polipéptidos de las isoformas de VEGI de la presente invención se
pueden usar para inhibir la formación de capilares o estructuras
similares a capilares a partir de las células endoteliales in
vitro.
Se apreciará que las afecciones provocadas por
una disminución del nivel normal o de referencia de las actividades
de los polipéptidos de las isoformas de VEGI en un individuo, en
particular los trastornos de los sistemas inmunitario y
circulatorio, se pueden tratar mediante la administración de los
polipéptidos de las isoformas de VEGI descritos en la presente
memoria (o los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de las
isoformas de VEGI). Así, en la presente memoria se discute un
método de tratamiento de un individuo que necesita un nivel
incrementado de una actividad de una isoforma de VEGI que comprende
administrar a dicho individuo una composición farmacéutica que
comprende una cantidad de un polipéptido de una isoforma de VEGI
aislado de la invención (o un polinucleótido), tal como una forma
madura del polipéptido de una isoforma de VEGI de la invención,
eficaz para incrementar el nivel de actividad del polipéptido de la
isoforma de VEGI en tal individuo. También se discute un método de
tratamiento de un individuo que necesita un nivel disminuido de
actividad de una isoforma de VEGI que comprende la administración a
dicho individuo de una composición farmacéutica que comprende una
cantidad de un antagonista de la isoforma de VEGI, tal como un
anticuerpo específico para la isoforma de VEGI que bloquea la
actividad de la isoforma de VEGI, eficaz para disminuir el nivel de
actividad del polipéptido de la isoforma de VEGI en tal
individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos aspectos, la invención se refiere a
un método de inhibición de la angiogénesis en un tejido o célula
que comprende provocar que una cantidad eficaz de un polipéptido que
tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5,
o SEQ ID NO: 6, o una forma truncada que comprende al menos uno o
más aminoácidos de la región de los aminoácidos
1-26 de SEQ ID NO: 4, los aminoácidos
1-26 de SEQ ID NO: 5, o los aminoácidos
1-85 de SEQ ID NO: 6 entre en contacto con, o se
exprese en la cercanía de, el tejido o la célula, de forma que se
inhiba la angiogénesis. Un método para inhibir la angiogénesis puede
comprender administrar a un individuo, tal como un humano o animal,
una composición que comprende la molécula de ácido nucleico que
codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO:
6, o una forma truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos
de la región de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:
4, los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los
aminoácidos 1-85 de SEQ ID NO: 6, en una dosis
suficiente para inhibir la angiogénesis. La molécula de ácido
nucleico puede estar asociada de manera operable a una secuencia
reguladora que controla la expresión génica. Tales secuencias
reguladoras se conocen en la técnica.
Un individuo es un animal y, en ciertas
realizaciones, un individuo puede ser un mamífero.
También se describe un método para el
tratamiento o la mejora de enfermedades y procesos que están
mediados por una angiogénesis incontrolada, que comprende la etapa
de administrar a un individuo, tal como un humano o animal, una
composición que comprende una molécula de ácido nucleico que
codifica SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6, o una forma
truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos de la región
de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4, los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los aminoácidos
1-85 de SEQ ID NO: 6, en una dosis suficiente para
controlar la angiogénesis. La molécula de ácido nucleico puede estar
asociada de manera operable a una secuencia reguladora que controla
la expresión génica.
También se describe un método para el
tratamiento del cáncer o la inhibición del crecimiento tumoral que
comprende la etapa de administrar a un individuo, tal como un
humano o animal, una composición que comprende la molécula de ácido
nucleico que codifica SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6,
o una forma truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos
de la región de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:
4, los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los
aminoácidos 1-85 de SEQ ID NO: 6, en una dosis
suficiente para inhibir el crecimiento tumoral. La molécula de
ácido nucleico puede estar asociada de manera operable a una
secuencia reguladora que controla la expresión génica.
Se entiende que, si se usa una forma truncada de
VEGI y el truncamiento se da en la secuencia señal secretora, la
forma truncada incluye una secuencia señal secretora, homóloga o
heteróloga, para dirigir la secreción de la proteína. Las secuencias
señal secretoras heterólogas se conocen en la técnica.
Los métodos para administrar polinucleótidos
para la expresión en un individuo (tanto ex vivo como in
vivo) se conocen en la técnica. En general, se prepara y se
administra una construcción de vector polinucleotídico adecuado.
Se puede usar la administración dirigida de
composiciones terapéuticas que contienen polinucleótidos, vectores
de expresión, o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de
administración de ADN mediada por receptores se describen, por
ejemplo, en Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202;
Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of
Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J.
Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem.
(1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Las
composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se
pueden administrar en un intervalo de alrededor de 100 ng a
alrededor de 200 mg de ADN para la administración local en un
protocolo de terapia génica. Se pueden usar intervalos de
concentración de alrededor de 500 ng a alrededor de 50 mg, alrededor
de 1 \mug a alrededor de 2 mg, alrededor de 5 \mug a alrededor
de 500 \mug, y alrededor de 20 \mug a alrededor de 100 \mug
de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos
terapéuticos de la presente invención se pueden administrar
mediante el uso de vehículos de administración de genes. El vehículo
de administración de genes puede ser de origen viral o no viral
(véase en general, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51;
Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human
Gene Therapy (1995) 1: 185; y Kaplitt, Nature Genetics
(1994) 6: 148). La expresión de tales secuencias codificantes se
puede inducir mediante el uso de promotores heterólogos o mamíferos
endógenos. La expresión de la secuencia codificante puede ser
constitutiva o regulada.
Los vectores basados en virus para la
administración de un polinucleótido deseado y la expresión en una
célula deseada se conocen en la técnica. Los vehículos basados en
virus ejemplares incluyen, pero sin limitación, los retrovirus
recombinantes (véase, p. ej., las publicaciones PCT nºs WO 90/07936;
WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO
91/02805; las pat. de EE.UU. nºs 5.219.740 y 4.777.127; la patente
de GB nº 2.200.651; y el documento EP 0 345 242), los vectores
basados en alfavirus (p. ej., vectores del virus Sindbis, virus del
bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC
VR-1247), virus de Ross River (ATCC
VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la
encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC
VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC
VR-532)), y los vectores de virus adenoasociados
(AAV) (véase, p. ej., las publicaciones PCT nºs WO 94/12649, WO
93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655).
También se puede emplear la administración de ADN asociado a
adenovirus inactivos tal como se describe en Curiel, Hum. Gene
Ther. (1992) 3:147.
También se pueden emplear los métodos y
vehículos de administración no virales, que incluyen, pero sin
limitación, el ADN condensado policatiónico asociado o no a
adenovirus inactivo solo (véase, p. ej., Curiel, Hum. Gene
Ther. (1992) 3: 147); ADN unido a ligandos (véase, p. ej., Wu,
J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); vehículos de
administración de células eucarióticas (véase, p. ej., la pat. de
EE.UU. nº 5.814.482; las publicaciones PCT nºs WO 95/07994; WO
96/17072; WO 95/30763; y WO 97/42338) y la neutralización de cargas
nucleicas o la fusión con membranas celulares. También se pueden
emplear el ADN desnudo. Los métodos de introducción de ADN desnudo
ejemplares se describen en la publicación PCT nº WO 90/11092 y en la
pat. de EE.UU. nº 5.580.859. Los liposomas que pueden actuar como
vehículos de administración génica se describen en la pat. de EE.UU.
nº 5.422.120; las publicaciones PCT nºs WO 95/13796; WO 94/23697;
WO 91/14445; y el documento EP 0524968. Se describen
aproximaciones
adicionales en Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.
adicionales en Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411, y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.
Así, por ejemplo, las células de un paciente se
pueden modificar con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un
polipéptido, tal como VEGI-_{251}, ex vivo, y las
células modificadas se proporcionan después al paciente a tratar
con el polipéptido. Tales métodos se conocen bien en la técnica, y
son evidentes a partir de las enseñanzas de la presente memoria.
Por ejemplo, se pueden modificar las células mediante el uso de una
partícula viral o retroviral que contiene ADN o ARN que codifica un
polipéptido de la presente invención.
De manera similar, las células se pueden
modificar in vivo para la expresión de un polipéptido in
vivo, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Por ejemplo, una célula productora para producir una
partícula retroviral que contiene ARN que codifica un polipéptido de
la presente invención se puede administrar a un paciente para
modificar las células in vivo y la expresión del polipéptido
in vivo. Estos y otros métodos para administrar un
polipéptido de la presente invención mediante tal método deberían
ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las
enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de
expresión para modificar las células puede ser distinto de un
retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que se puede usar para
modificar células in vivo tras la combinación con un vehículo
de administración adecuado.
Los retrovirus a partir de los cuales pueden
derivar los vectores plasmídicos retrovirales mencionados
anteriormente incluyen, pero sin limitación, el virus de la
leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis esplénica,
retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del
sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia
del mono gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus,
virus de sarcoma mieloproliferativo, y virus de tumor mamario. En
una realización, el vector plasmídico retroviral deriva del virus de
la leucemia murina de Moloney.
El vector incluye en general uno o más
promotores. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen,
pero sin limitación, el LTR retroviral; el promotor de SV40; y el
promotor de citomegalovirus (CMV) humano descrito por Miller y
colaboradores (Biotechniques 7:980-990 (1989)), o
cualquier otro promotor (p. ej., promotores celulares tales como
promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero sin limitación,
los promotores de histona, pol III, y b-actina).
Otros promotores virales que se pueden emplear incluyen, pero sin
limitación, los promotores de adenovirus, promotores de timidina
quinasa (TK), y promotores de parvovirus B19. La selección de un
promotor adecuado será evidente para los expertos en la técnica a
partir de las enseñanzas contenidas en la presente memoria.
La secuencia de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de la presente invención está bajo el control de un
promotor adecuado. Los promotores adecuados que se pueden emplear
incluyen, pero sin limitación, los promotores adenovirales, tales
como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores
heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el
promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores
inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de
metalotioneína; los promotores de choque térmico; el promotor de
albúmina; el promotor de ApoAI; los promotores de globina humana;
los promotores de timidina quinasa viral, tales como el promotor de
timidina quinasa de herpes simple; LTRs retrovirales (que incluyen
los LTRs retrovirales modificados descritos anteriormente en la
presente memoria); el promotor de b-actina; y los
promotores de hormonas del crecimiento humanas. El promotor puede
ser también el promotor nativo que controla el gen que codifica el
polipéptido.
Si se elige un sistema de vector retroviral, el
vector plasmídico retroviral se emplea para transducir líneas de
células de encapsulación para formar líneas de células productoras.
Los ejemplos de células de encapsulación que se pueden transfectar
incluyen, pero sin limitación, las líneas celulares PE501, PA317,
b-2, b-AM, PA12,
T19-14X,
VT-19-17-H2, CRE,
\beta-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y
DAN, tal como describió Miller (Human Gene Therapy
1:5-14 (1990)), que se incorpora en la presente
memoria como referencia en su totalidad. El vector puede transducir
las células de encapsulación a través de cualquier medio conocido en
la técnica. Tales medios incluyen, pero sin limitación, la
electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación con fosfato
cálcico. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral se
puede encapsular en un liposoma, o acoplarlo a un lípido, y después
administrarlo a un hospedador.
La línea de células productoras genera
partículas de vectores retrovirales infecciosas que incluyen
la(s) secuencia(s)
de ácidos nucleicos que codifica(n) los polipéptidos. Tales partículas de vectores retrovirales se pueden emplear después para transducir células eucarióticas, in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifica(n) el polipéptido. Las células eucarióticas que se pueden transducir incluyen, pero sin limitación, células pluripotenciales embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células pluripotenciales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales.
de ácidos nucleicos que codifica(n) los polipéptidos. Tales partículas de vectores retrovirales se pueden emplear después para transducir células eucarióticas, in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos que codifica(n) el polipéptido. Las células eucarióticas que se pueden transducir incluyen, pero sin limitación, células pluripotenciales embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células pluripotenciales hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales.
Estos principios generales son aplicables a
otros sistemas de administración basados en virus, tales como
AAV.
\vskip1.000000\baselineskip
Un método para la inhibición de la angiogénesis
puede comprender administrar a un individuo, tal como un humano o
animal, un polipéptido descrito en la presente memoria, tal como el
polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6, o una
forma truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos de la
región de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 4, los
aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los aminoácidos
1-85 de SEQ ID NO: 6, en una dosis suficiente para
inhibir la angiogénesis.
\newpage
Un método para el tratamiento o la mejora de
enfermedades y procesos que están mediados por una angiogénesis
incontrolada puede comprender la etapa de administrar a un
individuo, tal como un humano o animal, una composición que
comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO:
6, o una forma truncada que comprende al menos uno o más aminoácidos
de la región de los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:
4, los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO: 5, o los
aminoácidos 1-85 de SEQ ID NO: 6, en una dosis
suficiente para controlar la
angiogénesis.
angiogénesis.
Un método para el tratamiento del cáncer o la
inhibición del crecimiento tumoral puede comprender la etapa de
administrar a un individuo, tal como un humano o animal, una
composición que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
5, o SEQ ID NO: 6, o una forma truncada que comprende al menos uno o
más aminoácidos de la región de los aminoácidos 1-26
de SEQ ID NO: 4, los aminoácidos 1-26 de SEQ ID NO:
5, o los aminoácidos 1-85 de SEQ ID NO: 6, en una
dosis suficiente para inhibir el crecimiento tumoral.
Los métodos para analizar la actividad de un
polipéptido VEGI (que incluye una forma truncada de VEGI) se conocen
bien en la técnica, y se describen con detalle en los Ejemplos, tal
como un ensayo para analizar el efecto sobre el crecimiento de las
células endoteliales vasculares, la formación de tubos similares a
capilares, el crecimiento capilar en geles de colágeno colocados
sobre una membrana corioalantoidea embrionaria de pollo, o el
crecimiento de tumores de xenoinjertos.
Tal como se usa en la presente memoria, una
"enfermedad asociada a la angiogénesis" es una enfermedad o
afección que está asociada a una angiogénesis indeseada y/o
desregulada, o una enfermedad o afección para la cual es ventajoso
inhibir la angiogénesis. Esto incluye las enfermedades o procesos
mediados por una angiogénesis indeseada y/o incontrolada. Los
ejemplos de tales enfermedades asociadas a la angiogénesis, tales
como el crecimiento tumoral, se describen en la presente
memoria.
Los polipéptidos de las isoformas de VEGI
descritos en la presente memoria se pueden usar para inhibir la
proliferación de las células endoteliales, por ejemplo, las células
endoteliales aórticas. Como resultado, el polipéptido
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b} y/o VEGI-152 se puede usar para tratar enfermedades y trastornos en los que es ventajosa la inhibición del crecimiento de las células endoteliales.
VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b} y/o VEGI-152 se puede usar para tratar enfermedades y trastornos en los que es ventajosa la inhibición del crecimiento de las células endoteliales.
La composición del polipéptido de isoforma de
VEGI se formulará y se dosificará de una manera coherente con la
buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del
paciente individual (en especial los efectos secundarios del
tratamiento con los polipéptidos de isoformas de VEGI solos), el
sitio de administración de la composición de polipéptido de
isoforma de VEGI, el método de administración, el calendario de
administración, y otros factores conocidos para los médicos. La
"cantidad eficaz" del polipéptido de isoforma de VEGI para los
fines de la presente memoria se determina así mediante tales
consideraciones.
Los polipéptidos de las isoformas de VEGI y los
agonistas y antagonistas de la presente invención se pueden emplear
en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Tales
composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del
compuesto, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Tales vehículos incluyen, pero sin limitación, solución salina,
solución salina taponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y las
combinaciones de los mismos. La formulación debería adaptarse al
modo de administración.
La invención también proporciona un paquete o
equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de
uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de
la invención. Puede haber asociada a tal(es)
recipiente(s) una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la comercialización de productos farmacéuticos o biológicos, cuya nota refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la comercialización para la administración a seres humanos. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
recipiente(s) una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la comercialización de productos farmacéuticos o biológicos, cuya nota refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la comercialización para la administración a seres humanos. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden emplear junto con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar de una manera conveniente tal como mediante las vías
tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea,
intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se
administran en una cantidad que es eficaz para el tratamiento y/o la
profilaxis de la indicación específica. En general, se administran
en una cantidad de al menos alrededor de 10 g/kg de peso corporal,
y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad no
mayor de alrededor de 8 mg/kg de peso corporal por día. En la
mayoría de los casos, la dosis es de alrededor de 10 g/kg a
alrededor de 1 mg/kg de peso corporal por día, teniendo en cuenta
las vías de administración, síntomas, etc.
Se conocen varios sistemas de administración y
se pueden usar para administrar los polipéptidos de las isoformas
de VEGI de la presente invención, p. ej., la encapsulación en
liposomas, micropartículas, microcápsulas, endocitosis mediada por
receptores (véase, p. ej., Wu y Wu 1987, J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción
incluyen, pero sin limitación, las vías tópica, intradérmica,
intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea,
intranasal, epidural, oftálmica, y oral. Los compuestos se pueden
administrar mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo,
mediante infusión o inyección rápida, mediante absorción a través de
membranas epiteliales o mucocutáneas (p. ej., mucosa oral, mucosa
rectal e intestinal, etc.), y se pueden administrar junto con otros
agentes biológicamente activos.
\newpage
En una realización específica, puede ser
deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención
localmente al área que necesita tratamiento. Esto se puede
realizar, por ejemplo, y sin limitación, mediante infusión local
durante cirugía, aplicación tópica, p. ej., con un vendaje para
heridas, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de
un supositorio, o por medio de un implante, y dicho implante es de
un material poroso, no poroso o gelatinoso, lo que incluye las
membranas, tales como las membranas o fibras de tipo Sialastic.
El estudio de la enfermedad se lleva a cabo
mediante el uso de métodos habituales en la técnica, tales como los
métodos de formación de imágenes y la monitorización de marcadores
apropiados.
Alguien de experiencia habitual apreciará
también que, ya que los polipéptidos de las isoformas de VEGI de la
invención son miembros de la familia de TNF, la forma secretada
madura de la proteína se puede liberar en forma soluble de las
células que expresan los polipéptidos de las isoformas de VEGI
descritos en la presente memoria mediante escisión proteolítica.
Por lo tanto, cuando la forma madura o el dominio extracelular
soluble de los polipéptidos de las isoformas de VEGI se añade a
partir de una fuente exógena a las células, tejidos o el organismo
de un individuo, el polipéptido ejercerá sus actividades
fisiológicas sobre las células objetivo de ese individuo. Además,
las células que expresan este polipéptido transmembrana de tipo II
se pueden añadir a las células, tejidos o el organismo de un
individuo, y estas células añadidas se unirán a las células que
expresan el receptor para los polipéptidos de las isoformas de VEGI
descritos en la presente memoria, por lo que las células que
expresan los polipéptidos de las isoformas de VEGI pueden provocar
acciones (p. ej. la regulación del crecimiento de las células
endoteliales) sobre las células objetivo que albergan los
receptores.
Como se indicó anteriormente, se demuestra que
VEGI tiene un potente efecto anti-proliferación
sobre el crecimiento de las células endoteliales. Por lo tanto, se
puede emplear también VEGI para regular el desarrollo de las células
endoteliales a partir de las células precursoras endoteliales
hematopoyéticas y circulantes.
Por lo tanto, los métodos para potenciar la
angiogénesis pueden comprender la administración de un inhibidor de
VEGI-_{192a} o VEGI-_{192b}, de
forma que se potencia la angiogénesis. Tal potenciación puede ser
deseable, por ejemplo, en el contexto de afecciones asociadas a una
obstrucción de un vaso sanguíneo, tales como afecciones isquémicas
o ataques cardiacos. Las formulaciones se pueden administrar de
manera local o sistémica mediante el uso de métodos conocidos en la
técnica.
El anticuerpo de la presente invención que
bloquea o inhibe la actividad del polipéptido VEGI se puede usar
para estimular o potenciar la angiogénesis.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describen los ejemplos de la
presente invención, que se proporcionan solamente con fines
ilustrativos, y no para limitar el alcance de la presente invención.
A la luz de la presente descripción, serán evidentes numerosas
realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones para las
personas de experiencia habitual en la técnica.
La presente invención se describirá
adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos, sin
embargo, se debe entender que la presente invención no se limita a
tales ejemplos.
Se ha informado recientemente del descubrimiento
de un producto génico específico de las células endoteliales, el
inhibidor del crecimiento de las células endoteliales vasculares
(VEGI) (Zhai Y, et al., FASEB J, 13:
181-189, 1999; Zhai, Y, et al., Int. J.
Cancer, 82: 131-136, 1999). La proteína consiste
en 174 aminoácidos, es decir, VEGI-_{174}, con un
20-30% de homología de secuencias respecto de los
miembros de la superfamilia de TNF. El análisis mediante
transferencia de Northern de una amplia diversidad de líneas
celulares y cultivos de células primarias indica que el gen de
VEGI-_{174} se expresa de manera predominante de
las células endoteliales. Además, el mARN de
VEGI-_{174} es detectable en muchos órganos
humanos adultos, lo que sugiere un papel fisiológico del gen en una
vasculatura normal. La función de VEGI-_{174} se
examinó en varios modelos celulares y animales. La forma truncada
recombinante de VEGI-_{174} inhibió la
proliferación de las células endoteliales con una potencia notable,
pero no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento de cualquier otro
tipo de células examinado. La forma truncada de la proteína inhibió
también la formación de estructuras similares a capilares por las
células endoteliales en geles de colágeno, y el crecimiento de
capilares en geles de colágeno colocados sobre una membrana
corioalantoidea de pollo. La sobreexpresión de una forma secretada
de VEGI-_{174} en células de cáncer de colon
murinas (MC-38) evitó casi completamente que estas
células formasen tumores en ratones C57/BL singénicos. Además, la
co-inoculación de células de cáncer de mama humanas
con células de ovario de hámster chino que sobreexpresaban la forma
secretada de VEGI-_{174} condujo a una inhibición
notable del crecimiento de los tumores de xenoinjertos de cáncer de
mama en ratones atímicos.
\newpage
Se obtienen sueros humanos normales de hombres y
mujeres normales del banco de sangre del Lombardi Cancer Center. Se
usó un ELISA de tipo sándwich para medir el contenido de VEGI en
suero. Se añadieron muestras de suero (100 \mul) o cantidades
variables de proteína VEGI recombinante en BSA del 3% a placas de 96
pocillos revestidas con un anticuerpo anti-VEGI
policlonal y se bloquearon con BSA del 3%. Se añadió un anticuerpo
monoclonal (100 \mul, 2 \mug/ml) contra VEGI
(3-12D). Se añadió un anticuerpo
anti-IgG de ratón biotinilado (2 \mug/ml, Vector
Laboratories, Burlingame, CA), seguido de
avidina-peroxidasa de rábano, con
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Vector Laboratories)
como sustrato. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente
durante 10 min, la reacción se finalizó con 50 \mul de
H_{2}SO_{4} 1 M, y después se analizó a 450 nm con un lector de
placas espectrofotométrico, mediante el uso de la curva patrón y=
-0,72 + 0,409*log(x). El intervalo de proteína patrón
utilizado fue 0,32-1000 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hibridaron transferencias de Northern de
múltiples tejidos y paneles de transferencias puntuales de múltiples
tejidos (Clontech, Palo Alto, CA) en disolución ExpressHyb
(Clontech) con sondas de cADN bicatenarias. La sonda de
VEGI-_{174} de longitud completa utilizada fue un
fragmento de cADN Hind III-BamHI (nº de acceso de
GenBank AF03990) en pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para las
sondas específicas de isoforma, se produjo un molde de
VEGI-_{251} de 297 pb que codificaba sus 99
aminoácidos N-terminales por amplificación mediante
PCR, y se marcó con ^{32}P-dCTP mediante cebadores
aleatorios (Life Technologies, Invitrogen, CA). La sonda específica
de VEGI-_{174} que correspondía a sus 22
aminoácidos N-terminales se produjo marcando en el
extremo un producto de PCR de 66 pb. Las transferencias se
hibridaron a 42ºC durante la noche y se lavaron con tampón de
lavado 1 (SSC 2x, 0,1% de lauril sulfato sódico) y tampón de lavado
2 (SSC 1x, 1% de SDS) a 42ºC seguido de autorradiografía a -70ºC con
una pantalla intensificadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de 5' de VEGI se amplificaron a
partir de un panel de RACE de múltiples tejidos (ORIgene, Rockville,
MD) según las instrucciones del fabricante. Este panel contiene
muestras de cADN preparadas a partir de 24 tejidos humanos
individuales, con un adaptador ligado en los extremos 5' de los
cADNs. Se llevaron a cabo dos rondas de PCR anidadas mediante el
uso de dos pares de cebadores oligonucleotídicos. En la primera
ronda de PCR, se usó un cebador adaptador, ADP1, 5' CGGAATTCGT
CACTCAGCG 3' (SEQ ID NO: 8) y un cebador específico del gen de
VEGI, GSP1, 5' CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC 3' (SEQ ID NO: 9). Los
productos de la reacción se diluyeron después 1:10 con agua. Las
muestras de PCR diluidas se usaron después para la segunda ronda de
PCR con otro cebador adaptador, ADP2, 5' AGCGCGTGAA TCAGATCG 3'
(SEQ ID NO: 10), y un cebador específico del gen de VEGI, GSP2, 5'
CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG 3' (SEQ ID NO: 11). Los productos de
la PCR se resolvieron en un gel de agarosa, se purificaron, y se
secuenciaron en un secuenciador automático ABI.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores específicos del gen diseñados
según los resultados de la secuenciación de los productos de RACE
se usaron para repetir la segunda ronda de PCR para confirmar sus
identidades de secuencias. Los productos de RACE purificados en gel
se clonaron después en el plásmido pCR3.1 (Invitrogen, Frederick,
MD) y se secuenciaron. Basándose en estas secuencias, se diseñaron
cebadores específicos de las isoformas. El cebador inverso
compartido, Vg161 (161), 5' GTGTAATCCA CCAAAGAG 3' (SEQ ID NO: 12)
se usó con los cebadores directos enumerados en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células endoteliales de vena
umbilical humana (HUVE), y células endoteliales de corazón bovino
fetal (FBHE) de Clonetics (Walkersville, MD), y se cultivaron en
EGM-2 (Clonetics). Se obtuvieron células
endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HMVE), células
endoteliales de arteria coronaria humana (HCAE) y células NIH3T3 de
la American Type Culture Collection, y se cultivaron en
EGM2-MV (Clonetics). Las células endoteliales
aórticas bovinas adultas (ABAE), y las células de endotelioma de
cerebro de ratón bEND.3 fueron donaciones del Dr. Peter Bohlen de
ImClone Inc, Nueva York, N.Y. Se cultivaron células de músculo liso
de arteria coronaria humana (HCASM) (Clonetics) y células ABAE en
IMEM (Biofluids, Biosource International, Camarillo, CA), 10% de
FBS, 1 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos 2 (Promega,
Madison, WI). EA.Hy926, una línea de células derivadas de endotelio
humano, fue una donación de la Dra. Cora-Jean
Edgell, University of North Carolina. Estas células, junto con las
líneas de células de endotelioma bEND.3 de cerebro de ratón y de
endotelioma H5V de corazón, se mantuvieron en IMEM con un 10% de
FBS. Las células subconfluentes cultivadas en placas de 100 mm se
trataron con diversas dosis de factor de necrosis tumoral \alpha
(TNF\alpha) (Biosource International, Camarillo, CA) antes del
análisis de ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las sondas específicas de isoformas, se
generaron fragmentos de cADN de VEGI-_{174}
(862-1062 pb), VEGI-_{251}
(1-160 pb), VEGI-_{192a}
(277-656 pb) humanos mediante PCR y se insertaron
entre los sitios EcoRI y NotI de pcDNA3 (Invitrogen) en la
dirección inversa. Se clonó una sonda de
\alpha-actina de ratón (824-942)
en pSP72 (Promega) entre los sitios HindIII y BamHI. Los moldes de
VEGI y \beta-actina se linealizaron con HindIII y
EcoRI, respectivamente. Se sintetizaron sondas inversas con ARN
polimerasa SP6 mediante el uso del equipo de transcripción
Maxiscript (Ambion, Woodward TX). Para la protección de nucleasas
con el equipo RPAIII (Ambion, TX), se hibridaron
15-20 \mug de ARN total durante la noche con
1-3x10^{5} cpm de cada sonda a 52ºC. La digestión
con RNasa se llevó a cabo con una dilución 1:100 de mezcla RNasa
A/T1 (Ambion) durante 30 min a 37ºC. Los productos de la digestión
se precipitaron, se resolvieron en un gel de poliacrilamida del 6%,
y se sometieron a autorradiografía a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la organización del gen de VEGI
humano mediante PCR con el uso de un clon de cromosoma artificial
bacteriano (BAC) (Genome Systems, Inc, St Louis, MO). Se diseñaron
cebadores de PCR de las secuencias exónicas que generaban productos
de PCR solapantes. Estos productos de PCR se secuenciaron para
determinar sus posiciones relativas. Los cebadores para la región
intrónica se diseñaron basándose en la entrada de GenBank para el
cóntigo del cromosoma 9 NT_017568, que corresponde a las secuencias
entre las bases 2.643.881 y 2.694.724. Estas se enumeran en la
Tabla 9. Con el ADN de placenta humana como molde, se llevó a cabo
una PCR extralarga mediante el uso de un equipo de PCR rTth XL de
Perkin Elmer (Foster City, CA) y en las siguientes condiciones de
PCR extralarga: 95ºC, 1 min, 97ºC, 15 seg, 60,5ºC, 10 min, 17
ciclos; 97ºC, 15 seg, 60,5ºC, 10 min más una extensión de 15 seg,
13 ciclos, seguido por una extensión final de 72ºC durante 11 min.
Los fragmentos de PCR se generaron con los pares de cebadores
mostrados en la Tabla 9. Los productos de PCR se secuenciaron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se insertaron los marcos de lectura abiertos de
VEGI-_{174} y VEGI-_{251} en
pcDNA3.1-myc (Invitrogen, MD) para generar péptidos
que albergaban un marcador myc C-terminal. Los
plásmidos resultantes se transfectaron en células ABAE y HUVE para
los estudios de localización celular. Para las transfecciones
celulares, se sembraron 3x10^{4} células en cubreobjetos de
vidrio con cámara Lab-Tek (Nalge, Naperville, IL)
durante la noche. Se mezcló el ADN plasmídico (400 ng) en 25 \mul
de IMEM exento de suero con el reactivo PLUS (4 \mul)
(GIBCO-BRL). Se diluyó el reactivo LipofectAMINE
(GIBCO) (1 \mul) 200 veces y se mezcló con la disolución de ADN
durante 15 min. El complejo ADN-lipofectAMINE se
añadió después a las células con 200 \mul de IMEM y se incubó a
37ºC durante 3 h. Las células se dejaron recuperar en un medio de
cultivo que contenía suero durante 36 h antes de la
inmuno-tinción, y la microscopia de fluorescencia
posterior. La región codificante de longitud completa de
VEGI-_{174} o VEGI-_{251} se
insertó también entre los sitios EcoR1 y BamH1 de
pEGFP-C2 (Clontech) para producir proteínas de
fusión GFP-VEGI. Las construcciones de fusión
GFP-VEGI se transfectaron en células ABAE tal como
se describió anteriormente. A las 48 h tras la transfección, la
localización celular de la proteína de fusión se examinó mediante
microscopia de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células aórticas bovinas adultas (ABAE) y
HUVE transfectadas se lavaron con PBS y se fijaron con un 3,7% de
paraformaldehído/0,1% de Triton X-100 en PBS durante
10 min, se permeabilizaron con un 0,5% de Triton
X-100 en PBS durante 5 min, y después se incubaron
con una dilución 1:300 de un anticuerpo monoclonal
anti-myc 9-10E (Sigma) durante 1 h.
Las células se lavaron con PBS y se incubaron con un anticuerpo
monoclonal anti-IgG de ratón conjugado con Rojo
Texas a una dilución 1:60 (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc West
Grove, PA), y después se lavaron
tres veces con PBS. Las células se visualizaron mediante microscopia de fluorescencia confocal (Olympus IX70-SIF).
tres veces con PBS. Las células se visualizaron mediante microscopia de fluorescencia confocal (Olympus IX70-SIF).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectó a ratones BALB/c hembra de seis
semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) de
manera subcutánea una proteína VEGI purificada recombinante
(residuos 29-_{174}) a 50 \mug por ratón en 0,1
ml de un adyuvante completo de Freund (Life Technologies). Tras
inyecciones intraperitoneales de refuerzo, los ratones con títulos
elevados recibieron una inyección intraperitoneal final de antígeno
de 30 \mug/ratón. Se aislaron las células del bazo y se
fusionaron con células SP2/O de mieloma de ratón, mediante el uso de
polietilenglicol 1500 (Boehringer Mannheim). Los hibridomas se
seleccionaron con el medio HAT y se cribaron mediante ELISA. Se
clonaron los hibridomas positivos, y se determinó la subclase de los
anticuerpos monoclonales mediante el uso del equipo de isotipos de
ratón (SIGMA, MO). Los hibridomas se cultivaron en un INTEGRA CL
350 (INTEGRA Biosciences, Inc., Iiamsville, MD), se recogieron los
sobrenadantes, y se purificaron los anticuerpos monoclonales con
proteína A-agarosa AffiGel
(Bio-Rad).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inocularon a conejos blancos New Zealand SPF
de cuatro a seis meses de edad (Charles River) de manera subcutánea
100 \mug de VEGI recombinante expresada en E. coli (como
anteriormente) mezclada con adyuvante completo de Freund (Life
Technologies). Tras inyecciones intramusculares de refuerzo, se
recogió el suero de los ratones que mostraban una respuesta
inmunitaria sustancial. El suero se purificó mediante la absorción
con lisado de células de E. coli (transformadas con un
vector de expresión vacío), y después con un lisado de células
musculares lisas de arteria coronaria humana.
\vskip1.000000\baselineskip
La región codificante de
VEGI-_{251} de longitud completa se insertó entre
los sitios Hind III y BamHI de pcDNA3 (Invitrogen). Estos plásmidos
pcDNA3, que incluyen el vector, se transfectaron en células de
cáncer de mama MDA-MB231 mediante electroporación.
Los transfectantes estables se seleccionaron en 2 mg/ml de G418
sulfato (GIBCO). Los medios acondicionados se concentraron con
columnas Centricon (umbral de PM de 10.000). Tanto los lisados
celulares como los medios acondicionados se inmunoprecipitaron con
proteína A/agarosa G (Oncogene, Boston, MA) y el anticuerpo
policlonal contra VEGI. Las muestras se analizaron mediante
transferencia de Western. La detección se llevó a cabo con una
dilución 1:1000 de anticuerpos monoclonales de ratón
1-8F, y se visualizó con un anticuerpo
anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano
(equipo ECL, Amersham).
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.870000\baselineskip
Se prepararon los vectores lentivirales que
contenían VEGI-_{174}, sVEGI y
VEGI-_{251} mediante el uso de los métodos
previamente descritos (Dull, et al. J Virol 72,
8463-8471, 1998; Naldini, et al. Proc Natl Acad
Sci (USA) 93, 11382-11388, 1996; Naldini, et
al. Science 272, 263-267, 1996; Stewart, et
al. Proc Natl Acad Sci (USA) 96, 12039-12043,
1999). Brevemente, el vector lentiviral se generó en células 293T
con 3 plásmidos: el plásmido de transducción
pHR'CMV-VEGI, el plásmido de encapsulación pCMV
\DeltaR8.2 \Deltavpr y el plásmido de la cubierta
pCMV-VSV-G. Los sobrenadantes
virales se recogieron cada 24 h a partir de dos días tras la
transfección, se purificaron mediante filtración de 0,45 \mum y se
titularon mediante el ensayo p24 (Dull, et al. J Virol 72,
8463-8471, 1998; Naldini, et al. Proc Natl Acad
Sci (USA) 93, 11382-11388, 1996; Naldini, et
al. Science 272, 263-267, 1996; Stewart, et
al. Proc Natl Acad Sci (USA) 96, 12039-12043.
1999). Se definió un pg de recuento de p24 como una dosis
infecciosa de cultivo de tejidos (TCID). Para los ensayos de
toxicidad celular, las células HUVE se colocaron en placas a una
densidad de 2x10^{4} células por pocillo en una placa de 24
pocillos 20 h antes de la infección con el sobrenadante viral. Se
supuso que el número de células se doblaría 20 h tras la colocación
en las placas. Se añadieron dosis crecientes de vector viral a las
células HUVE. Se estimó la multiplicidad de infección (MOI) como la
TCID por célula en el momento de la infección. Se determinó el
número de células adherentes que permanecían en cultivo 24 h tras
la infección viral mediante un contador Coulter.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inyectaron células
MDA-MB-231 transfectadas de manera
estable que contenían el vector pcDNA3 vacío,
VEGI-_{174}, VEGI-_{251} o
sVEGI en panículos adiposos mamarios de ratones atímicos hembra
(1x10^{6} células/inyección). Hubo 2 sitios de inyección por
animal, y 15 animales en cada grupo que recibieron los
transfectantes de VEGI-_{174},
VEGI-_{251} y sVEGI. Se usó como control un grupo
de 5 animales a los que se inyectaron los transfectantes del vector
pcDNA3. Los tamaños de los tumores de xenoinjertos resultantes se
monitorizaron con enmascaramiento. Se llevó a cabo la determinación
de la densidad de microvasos tal como se ha descrito (Weidner, et
al. N Engl J Med 324, 1-8, 1991). Brevemente, se
inmunotiñeron los microvasos intratumorales con anticuerpo
monoclonal de rata anti-CD31 de ratón
(PECAM-1) (clon MEC13.3, Pharmingen International,
San Diego, CA). El anticuerpo se diluyó 1:100 en PBS, se incubó
durante la noche con 5 \mum de cortes tumorales fijados en
parafina, y se visualizó con un anticuerpo anti-IgG
de rata biotinilado (Vector Laboratories) mediante el método
Vectastain ABC (Vector Laboratories). Cada muestra se examinó a poco
aumento (lentes objetivos x10 y lentes oculares x10) para
identificar las áreas más vasculares del tumor ("puntos
calientes", véase la referencia (Weidner, et al. N Engl J
Med 324, 1-8, 1991)). En estas áreas, se examinó
un máximo de 10 campos a un aumento de x400 (lentes objetivos x40 y
oculares x10; 0,16 mm^{2} por campo), y se calcularon los valores
medios. Se excluyeron los vasos grandes con paredes musculares. La
luz no fue necesaria para identificar un vaso. Cualquier célula
endotelial o grupos de células teñidos positivamente, claramente
diferentes de los microvasos adyacentes, las células tumorales y
los elementos del tejido conectivo, se consideraron microvasos
contables diferentes. Todas las medidas se llevaron a cabo con
enmascaramiento. Los resultados se analizaron mediante un análisis
unívoco de la varianza (ANOVA). El nivel a priori de
significación se ajustó un valor de P menor de 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Como cribado inicial para determinar si VEGI
existe en una forma soluble, se analizó un banco de suero humano de
adultos sanos con anticuerpos monoclonales. Se pudieron detectar,
mediante ELISA con un anticuerpo contra el extremo
C-terminal, concentraciones de VEGI que oscilaban
entre 1 y 10 ng/ml (Figura 1). Esto indicó que, además del VEGI
previamente caracterizado que se creía que estaba asociado a
membranas, una forma soluble de VEGI tendría también una
importancia fisiológica significativa. Debido a que los estudios
previos habían demostrado que la actividad apoptótica de un péptido
C-terminal recombinante, y la sobreexpresión del
VEGI-_{174} de longitud completa fue ineficaz
sobre los tumores de xenoinjertos formados mediante células
cancerosas transfectadas, se razonó que no era probable que el
péptido soluble que contenía el extremo C-terminal
hallado en los sueros humanos procediera de
VEGI-_{174}. Esta observación llevó a proponer que
el gen de VEGI se podría expresar en formas alternativas en los
tejidos humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con un cADN de longitud completa del VEGI humano
descubierto inicialmente como sonda, las transferencias de Northern
de tejidos humanos normales revelaron sistemáticamente múltiples
bandas de los siguientes tamaños: 7,5 kb, 2,0 kb y 1,5 kb (Figura
2). Estos múltiples transcritos de VEGI mostraron cierta
distribución tisular solapante y demostraron la existencia de una
familia de VEGI. Para dilucidar la estructura de los transcritos
relacionados con VEGI, se emprendió el aislamiento de las isoformas
de VEGI mediante PCR. Con cebadores de 3' específicos de VEGI, se
empleó RACE de 5' para amplificar los extremos de 5' de los mensajes
de VEGI a partir de varios tejidos humanos. Los productos de RACE
se clonaron después en pCR3.1 y se secuenciaron (Figura 3). El
análisis de las secuencias reveló dos secuencias nuevas de VEGI,
VEGI-_{251} y VEGI-_{192a}
(Tabla 8 y Figura 3). Basándose en estas secuencias de 5', se
diseñaron cebadores específicos de las isoformas, y se aislaron
clones de cADN de longitud completa a partir de los paneles de cADN
ordenados. Así, se aislaron tres isoformas de VEGI a partir de
cerebro fetal, útero adulto y pulmón (Figuras 3A y B). Los cADNs
nuevos contienen marcos de lectura abiertos de _{251} y 192
aminoácidos (Figura 3B), con pesos moleculares calculados de 28.086
y 21.952 Daltons, respectivamente. Los dos péptidos VEGI nuevos,
VEGI-_{251} y VEGI-_{192a},
comparten los 151 residuos de aminoácidos del extremo carboxilo con
el VEGI original (Zhai, et al. Int J Cancer 82,
131-136, 1999), ahora denominado
VEGI-_{174}. El perfil hidropático de las
proteínas indicó una región hidrófoba de 20 residuos de aminoácidos
en VEGI-_{251} cerca de su extremo
N-terminal (Figura 3B) que está ausente en
VEGI-_{174} y VEGI-_{192a}. Se
predijo que esta secuencia comprendía un péptido señal. Otra región
sumamente hidrófoba, posiblemente transmembrana, se identificó
previamente en el extremo N-terminal de
VEGI-_{174} (Figura 3B).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los patrones de expresión individuales de las
isoformas se examinaron adicionalmente mediante análisis de
Northern con transferencias de múltiples tejidos. Se detectó un
transcrito de VEGI-_{251} de 7,5 kb en placenta,
riñón, pulmón e hígado, mientras el transcrito de
VEGI-_{174} de 2 kb se observó en hígado, riñón,
músculo esquelético y corazón (Figura 4). Cuando se usan estas
mismas sondas en una transferencia puntual de ARN de múltiples
tejidos, se observó que, además de la expresión solapante entre VEGI
_{251} y _{174} en próstata, glándula salival y placenta,
VEGI-_{251} fue más abundante que
VEGI-_{174} en riñón fetal y pulmón fetal,
mientras VEGI-_{174} es más abundante en corazón,
músculo esquelético, páncreas, glándula suprarrenal e hígado (Tabla
10). La importancia de tales patrones de expresión todavía no es
fácilmente evidente. El mARN de VEGI-_{192a} no se
pudo detectar fácilmente mediante transferencia de Northern, debido
a su baja abundancia.
La expresión de VEGI in vitro se examinó
también mediante ensayo de protección de RNasa. De acuerdo con las
observaciones previas para VEGI-_{174},
VEGI-_{251} y VEGI-_{192a} se
detectaron en los mismos tipos celulares que
VEGI-_{174},
y estaban presentes en las células endoteliales humanas, que incluyen las células endoteliales arteriales coronarias (HCAE), las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVE) y las células endoteliales microvasculares humanas (HMVE), y fueron indetectables en las células musculares lisas de arteria coronaria humana (HCASM), ABAE y endoteliomas de ratón bEND.3 (Figura 5). También se debería indicar que se expresó más de una isoforma en el mismo tipo de células, y VEGI-_{251} fue la más abundante. Esto sugiere que la expresión de estas isoformas desempeña un papel regulador en la función de VEGI.
y estaban presentes en las células endoteliales humanas, que incluyen las células endoteliales arteriales coronarias (HCAE), las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVE) y las células endoteliales microvasculares humanas (HMVE), y fueron indetectables en las células musculares lisas de arteria coronaria humana (HCASM), ABAE y endoteliomas de ratón bEND.3 (Figura 5). También se debería indicar que se expresó más de una isoforma en el mismo tipo de células, y VEGI-_{251} fue la más abundante. Esto sugiere que la expresión de estas isoformas desempeña un papel regulador en la función de VEGI.
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Para determinar la relación estructural de los
tres transcritos de VEGI, se analizó la organización del gen de
VEGI humano. Esto se realizó con un clon BAC así como con ADN
genómico aislado a partir de muestras de placenta humana. Se
descubrió que el gen de VEGI humano abarca 17 kb, con 4 exones y 3
intrones (Figura 6). Las uniones intrón-exón se
ajustan a la regla GT-AG. Basándose en el tamaño del
fragmento 2, se estimó que el intrón 1 estaba en
13-15 kb, aunque no se pudo obtener información de
la secuencia a partir de este producto de PCR. Las tres isoformas
comparten una región común de 438 pb que codifica los residuos
29-174 de VEGI-_{174} (Tabla 12)
codificados por el exón IVb (Figura 6), pero sus regiones de 5' se
generan a partir del uso alternativo de los exones. De manera
interesante, VEGI-_{251} y
VEGI-_{192a} utilizan sitios aceptores de corte y
empalme exónico para generar sus productos respectivos (Tabla 11).
Los estudios mediante protección de ribonucleasas y RACE de 5'
mediante el uso de sondas genómicas y ARN de HUVE indicaron que el
sitio de iniciación de la transcripción supuesto para
VEGI-_{251} está localizado alrededor de 100 pb en
dirección 5' de su ATG (sin publicar, Chew LJ), pero los de
VEGI-_{174} y VEGI-_{192a}
todavía se tienen que cartografiar. Debido a la abundancia muy baja
del ARN de VEGI-_{192a}, los estudios posteriores
se centraron en VEGI-_{251}. Aunque actualmente
no está claro si todas las isoformas se inician en el mismo
promotor, se razonó que la importancia de generar múltiples
transcritos podría residir en la regulación diferencial de la
síntesis, lo que a su vez apunta hacia la importancia relativa de
una isoforma particular de VEGI.
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\newpage
Para ensayar la posibilidad de una regulación
diferencial en la transcripción de las isoformas de VEGI, se
analizó la regulación del gen de VEGI mediante el uso de un
paradigma anti-angiogénico de tratamiento con
TNF\alpha. Aunque muchos estudios describen los efectos
anti-proliferativos de las citocinas
proinflamatorias como TNF\alpha sobre las células endoteliales,
estas citocinas pueden ser también angiogénicas dependiendo de la
dosis y del sistema utilizados (véase la Discusión). Tales efectos
moduladores sobre las células endoteliales pueden servir para
regular los niveles de una citocina específica de células
endoteliales tal como VEGI. Se descubrió que las concentraciones de
15 ng/ml de TNF\alpha o más podrían inducir un incremento de los
niveles de ARN de VEGI en las células endoteliales de los vasos
grandes (de vena umbilical) y de los vasos pequeños
(microvasculares dérmicas) (Figura 7), y que todas las isoformas se
indujeron en ambos tipos de células endoteliales. También es
evidente que VEGI-_{251} sigue siendo la isoforma
más abundante. El aumento paralelo de la regulación de los
transcritos de VEGI por TNF\alpha no solamente indica que la
actividad mediada por VEGI es potencialmente un objetivo de la
acción de TNF\alpha, sino que, además, el control de la función de
VEGI por medio de la síntesis de múltiples péptidos reside muy
probablemente a nivel postraduccional.
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Debido a que los polipéptidos similares a TNF
están presentes a menudo como formas asociadas a membranas y formas
solubles, se investigó la posibilidad de usar células ABAE
transfectadas con VEGI recombinantes. Se llevaron a cabo los
experimentos de localización con construcciones que albergaban un
marcador myc en los extremos C-terminales de las
regiones codificantes de VEGI (Figura 8). Las construcciones de
expresión de las isoformas de VEGI en pcDNA3.1-myc
se transfectaron en células ABAE y se analizó la distribución del
producto VEGI-myc mediante inmunocitoquímica con un
anticuerpo anti-myc. Se detectó
VEGI-_{174} en las células con una distribución
similar al retículo endoplásmico/Golgi (Figura 8A). Sin embargo,
VEGI-_{251} mostró una tinción granular
peri-nuclear más limitada (Figura 8B). En ambos
casos, la localización en la superficie celular no fue evidente
mediante microscopia de fluorescencia confocal. En células HUVE, se
descubrió que las vesículas que contenían
VEGI-_{251}-myc no eran los
cuerpos de Weibel-Palade de las células
endoteliales, porque la señal de myc no se
co-localizó con la tinción de factor de von
Willebrand (vWF) (Figura 8C). Por lo tanto, es posible que, en
contraste con vWF, el procesamiento de
VEGI-_{251}
no implique una ruta secretora regulada en las células endoteliales.
no implique una ruta secretora regulada en las células endoteliales.
Para determinar si las isoformas podrían exhibir
diferencias dirigidas por el extremo N-terminal en
la localización subcelular, se produjeron construcciones de
expresión quiméricas GFP-VEGI con VEGI de longitud
completa y sus secuencias N-terminales únicas
correspondientes. Estas construcciones, con marcadores de GFP en sus
extremos N-terminales (Figura 8), se transfectaron
de manera transitoria en células ABAE. Como se muestra en las
Figuras 8E a 8J, con la excepción de 8G, la distribución de
GFP-VEGI fue distinta de la de GFP no dirigida.
VEGI-_{174} de longitud completa mostró una
localización en RE/Golgi, tal como se observó previamente con
VEGI-_{174} marcada con myc, mientras los
primeros 22 residuos de VEGI-_{174} parecieron
inadecuados para dirigir la distribución de GFP hacia un orgánulo
intracelular específico (Figura 8G). En contraste, los primeros 99
aminoácidos de VEGI-_{251} fueron suficientes
para dar como resultado la localización de GFP en las vesículas, que
estaban próximas a la membrana plasmática. Esta distribución se
observó como una banda fluorescente que perfiló el límite celular
(Figuras 8H a J). Las observaciones indicaron que
VEGI-_{251} podría estar localizada en las
vesículas secretoras que experimentaron una exocitosis
constitutiva.
A diferencia de
GFP-VEGI-_{251}, la carencia de
localización en la membrana plasmática de
VEGI-_{251}-myc (Figura 8B)
indicó firmemente que el marcador myc C-terminal se
perdió de la célula, posiblemente debido a la escisión de la señal
secretora, y la secreción del fragmento C-terminal
soluble. Se supo que las auténticas secuencias señal que se
colocaron tras los extremos N-terminales, tales como
en GFP-VEGI-_{251} y
GFP-VEGI-1-99, no
se escindieron durante la síntesis en el RE. Esta diferencia en los
patrones de distribución de VEGI-_{251} con
marcadores C-terminales y
N-terminales estuvo de acuerdo con un mecanismo
secretor que implicó la escisión de VEGI-_{251} en
o dentro de su secuencia N-terminal antes de la
liberación en el medio extracelular.
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Dados los residuos hidrófobos en el extremo
N-terminal de VEGI-_{251} y su
distribución subcelular observada, parece probable que
VEGI-_{251} sea una proteína secretada. Para
estudiar esta hipótesis, se generaron transfectantes estables de
VEGI-_{251} en células de cáncer de mama
MDA-MB-231. Como control negativo,
también se produjeron transfectantes del vector pcDNA3. La
expresión de las construcciones en
MDA-MB-231 se confirmó mediante el
ensayo de protección de RNasa. Se debería indicar que la
supervivencia y la proliferación de estas células in vitro
no se vio afectada por el vector o por la transfección con VEGI. Los
medios acondicionados de los transfectantes MB-231
se recogieron, se concentraron y se inmunoprecipitaron con un
anticuerpo policlonal hacia VEGI y se sometieron a análisis de
Western con un anticuerpo monoclonal anti-VEGI
3-12D. Los resultados revelaron una proteína de
peso molecular de alrededor de 25 kD (Figura 9A). La aparición del
doblete no se puede explicar fácilmente, pero puede ser el
resultado de una glicosilación alternativa o de otra modificación
postraduccional del péptido recombinante en las células MB231
transfectadas. No se detectó la proteína VEGI en los medios de las
células sin transfectar o células que albergaban el vector pcDNA3
vacío (Figura 9A). No se pudo detectar
VEGI-_{174} en el medio acondicionado en
condiciones experimentales similares (no mostrado). En un
experimento distinto, el análisis de Western de medio acondicionado
con células HUVE concentrado reveló también una banda de peso
molecular similar a la obtenida con los transfectantes de
VEGI-_{251}, al igual que el medio acondicionado
con células HUVE inmunoprecipitado con el anticuerpo policlonal
(Figura 9B). Estas observaciones indican que
VEGI-_{251} no está asociada a la membrana, sino
que es una proteína secretada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estudiar la actividad biológica de
VEGI-_{251} en las células endoteliales, se
seleccionó un sistema de administración génica con lentivirus para
transfectar células HUVE con construcciones de expresión de VEGI.
La administración génica lentiviral se ensayó primero con una
construcción de GFP, y se confirmó que más de un 90% de las células
HUVE se pudieron transducir (no mostrado). Las observaciones con
VEGI-_{174}, VEGI-_{251} y la
forma secretada de VEGI con el péptido señal de IL6, sVEGI,
demostraron que solamente las formas secretadas de VEGI, que
incluyen VEGI-_{251}
y sVEGI, fueron citotóxicas para HUVEC (Figura 10A), mientras VEGI-_{174} no tuvo efecto. Estos resultados indican que las células HUVE albergan receptores de membrana para VEGI que se pueden activar por medio de un mecanismo autocrino.
y sVEGI, fueron citotóxicas para HUVEC (Figura 10A), mientras VEGI-_{174} no tuvo efecto. Estos resultados indican que las células HUVE albergan receptores de membrana para VEGI que se pueden activar por medio de un mecanismo autocrino.
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Se ha demostrado previamente que una forma
recombinante de VEGI-_{174} que porta el péptido
señal secretor de IL-6, sVEGI, fue eficaz en la
inhibición del crecimiento de carcinomas de colon MC38 in
vivo (Zhai, et al. Int J Cancer 82,
131-136, 1999). Debido a que
VEGI-_{251} nativa es una proteína secretada, se
determinó si también podría inhibir el crecimiento de tumores de
xenoinjertos humanos in vivo. Se seleccionaron quince líneas
de clones MDA-MB-231 transfectados
de manera estable para cada construcción, con cinco líneas de
controles transfectados con el vector. Las células de cada grupo se
mezclaron y se inyectaron en panículos adiposos mamarios de ratones
atímicos hembra. Se determinaron los volúmenes de los tumores como
una función del tiempo tras la inyección. Se compararon los
cultivos de células mezcladas de manera similar de
VEGI-_{174} y clones transfectados con sVEGI. Los
clones mezclados transfectados con vector se usaron como controles.
También se ensayaron las células originales sin transfectar, y se
descubrió que eran idénticas a los clones transfectados con
vector.
Los resultados demuestran que la sobreexpresión
de VEGI-_{174} de longitud completa por las
células cancerosas tuvo poco efecto sobre el crecimiento de los
tumores de xenoinjertos (Figura 10B). Sin embargo, la sobreexpresión
de la VEGI-_{251} intacta, así como la proteína
de fusión sVEGI, retrasó de manera significativa el crecimiento
tumoral. Estas observaciones están completamente de acuerdo con el
efecto de la transfección lentiviral in vitro (Figura 10A),
lo que confirma la actividad biológica de
VEGI-_{251} nativa.
Después se determinó el efecto de la
sobreexpresión de VEGI-_{251} de longitud completa
por las células cancerosas sobre la neovascularización tumoral. Se
descubrió que la densidad de microvasos asociados a los tumores se
redujo de manera significativa con la expresión de
VEGI-_{251}. El grado de reducción fue comparable
al de los tumores que sobreexpresaban sVEGI. Ya que la proteína de
fusión sVEGI consiste en el péptido señal de secreción de IL6 y los
residuos 23-_{174} de
VEGI-_{174}, los resultados indican que los
residuos 23-_{174} contenían el equivalente
biológico de VEGI-_{251} nativa. En conjunto,
estos hallazgos demuestran que la secreción de
VEGI-_{251} en la matriz extracelular es necesaria
para su actividad antitumoral. Además, de manera similar a sVEGI,
esta actividad antitumoral de VEGI-_{251} no es
debida a un efecto directo sobre las células tumorales, sino a la
interferencia con el desarrollo de la vasculatura asociada a los
tumores.
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Se observó que, cuando se analizó una membrana
de transferencia de Northern de tejidos humanos con una sonda de
cADN de VEGI, apareció un número múltiple de bandas de mARN en
diferentes tejidos (Fig. 11). Ya que las condiciones experimentales
usadas en estos experimentos no favorecieron la unión inespecífica
de las sondas, y a juzgar por los tamaños aproximados de las
moléculas de mARN, hubo al menos tres isoformas que correspondían a
7,5 kb, 2,0 kb, y 1,5 kb, respectivamente. La diferente distribución
de estas isoformas en diversos tejidos sugirió que desempeñan
papeles fisiológicos diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante el uso de la amplificación rápida de
extremo de cADN (RACE) (disponible comercialmente de OriGene
Technology, Rockville, MD), se usó un panel de bibliotecas de cADN
que representaban diversos tejidos humanos para buscar las
isoformas de VEGI. Este panel contiene muestras de cADN preparadas a
partir de 24 tejidos humanos individuales, con un adaptador ligado
al extremo 5' de cada molécula de cADN. Se usó un cebador
oligonucleotídico específico del gen (GSP) que correspondía a parte
del cADN de VEGI, y un cebador adaptador (ADP) para llevar a cabo
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Fig. 12). Se llevaron
a cabo dos rondas de PCR anidadas mediante el uso de dos pares de
cebadores oligonucleotídicos. Tras la primera ronda de PCR (94ºC 3
min, 4 ciclos de 94ºC durante 30 seg, 65ºC durante 30 seg, 72ºC
durante 2 min; 16 ciclos de 94ºC durante 30 seg, 60ºC durante 30
seg, 72ºC durante 2 min; después 72ºC durante 6 min) con un cebador
adaptador (ADP1, 5'-CGGAATTCGT
CACTCAGCG-3')
(SEQ ID NO: 8) y un cebador específico del gen de VEGI (GSP1, 5'-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3') (SEQ ID NO: 9), los productos de la reacción se diluyeron 1:10 con agua. Las muestras de PCR diluidas se usaron en la segunda ronda de PCR (94ºC durante 3 min; 35 ciclos de 94ºC durante 30 seg; 54ºC durante 30 seg, 72ºC durante 2 min; después 72ºC durante 6 min) con otro cebador adaptador (ADP2, 5'-AGCGCGTGAA TCAGATCG-3') (SEQ ID NO: 10) y un cebador específico del gen de VEGI (GSP2, 5'-CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG-3') (SEQ ID NO: 11). Los productos de la PCR se fraccionaron en un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN positivos se cortaron del gel, y se purificaron para el análisis de secuenciación. Se obtuvieron cuatro productos de PCR con longitudes diferentes de tejidos diferentes (Fig. 13). Estos productos de PCR se sometieron a secuenciación del ADN, que confirmó que las secuencias nucleotídicas de estos productos de PCR fueron diferentes entre sí. Estas isoformas se denominan ahora VEGI-_{174}, VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, y VEGI-_{251}, según el número de residuos de aminoácidos en las proteínas codificadas por estas moléculas de cADN.
(SEQ ID NO: 8) y un cebador específico del gen de VEGI (GSP1, 5'-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3') (SEQ ID NO: 9), los productos de la reacción se diluyeron 1:10 con agua. Las muestras de PCR diluidas se usaron en la segunda ronda de PCR (94ºC durante 3 min; 35 ciclos de 94ºC durante 30 seg; 54ºC durante 30 seg, 72ºC durante 2 min; después 72ºC durante 6 min) con otro cebador adaptador (ADP2, 5'-AGCGCGTGAA TCAGATCG-3') (SEQ ID NO: 10) y un cebador específico del gen de VEGI (GSP2, 5'-CGGTGGATCC CGAGTTTGTC TCACAACTG-3') (SEQ ID NO: 11). Los productos de la PCR se fraccionaron en un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN positivos se cortaron del gel, y se purificaron para el análisis de secuenciación. Se obtuvieron cuatro productos de PCR con longitudes diferentes de tejidos diferentes (Fig. 13). Estos productos de PCR se sometieron a secuenciación del ADN, que confirmó que las secuencias nucleotídicas de estos productos de PCR fueron diferentes entre sí. Estas isoformas se denominan ahora VEGI-_{174}, VEGI-_{192a}, VEGI-_{192b}, y VEGI-_{251}, según el número de residuos de aminoácidos en las proteínas codificadas por estas moléculas de cADN.
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Se usaron los cebadores específicos del gen
diseñados según los resultados de la secuenciación de los productos
de PCR obtenidos de los experimentos RACE descritos anteriormente
para repetir la segunda ronda de PCR para confirmar la
especificidad de las secuencias. Los productos de RACE purificados
se clonaron después en el plásmido pCR 3.1 de Invitrogene (San
Diego, CA) para preparar muestras de ADN de gran calidad para la
secuenciación. Basándose en la presencia de un codón de parada en
el marco de lectura y un codón de iniciación en la secuencia de 5'
de VEGI_{192a} y VEGI_{192b}, se construyó la molécula de cADN
de longitud completa de VEGI_{192a} con dos pares de cebadores de
PCR anidados: Vg3A: 5'-AATCTCACCT GTCTCTGCCT
G-3' (SEQ ID NO: 43) y
Vg-3'-1:
5'-CTAAACCGTT GTCCCTGTGG-3' (SEQ ID NO: 44); Vg3B: 5'-CCTGTAAAAA TGGTTATAGT AG-3' (SEQ ID NO: 45) y Vg-3'-2: 5'-GGTGGCAGAG GACTTTC-3' (SEQ ID NO: 46). La molécula de cADN de longitud completa de VEGI_{192b} se construyó con el cebador vg_{4b} 5'-CTCTACTTAC GCCAAGG-3' (SEQ ID NO: 47) y el cebador JY2 5'-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3' (SEQ ID NO: 48). Se usaron las bibliotecas de cADN a partir de las cuales se identificaron las isoformas para la PCR. Tanto VEGI_{192a} como VEGI_{192b} se clonaron en pCR3.1 de Invitrogen (San Diego, CA). Debido a que no se pudo hallar el codón de iniciación de la traducción en el marco de lectura en la secuencia de 5' de VEGI_{251}, se usó un par de cebadores específicos del gen, vg5B: 5'-CACCACATAC CTGCTTG-3' (SEQ ID NO: 49) y vg161: 5'-GTGTAATCCA CCAAAGAG-3' (SEQ ID NO: 12), para aislar un clon de cADN de VEGI_{125} de longitud completa a partir de los paneles de biblioteca de cADN ordenados de OriGene (Rockville, MD). La secuencia de cADN de VEGI-_{192a} se muestra en la Tabla 13.
5'-CTAAACCGTT GTCCCTGTGG-3' (SEQ ID NO: 44); Vg3B: 5'-CCTGTAAAAA TGGTTATAGT AG-3' (SEQ ID NO: 45) y Vg-3'-2: 5'-GGTGGCAGAG GACTTTC-3' (SEQ ID NO: 46). La molécula de cADN de longitud completa de VEGI_{192b} se construyó con el cebador vg_{4b} 5'-CTCTACTTAC GCCAAGG-3' (SEQ ID NO: 47) y el cebador JY2 5'-CCCGGATCCT ATAGTAAGAA GGCTCC-3' (SEQ ID NO: 48). Se usaron las bibliotecas de cADN a partir de las cuales se identificaron las isoformas para la PCR. Tanto VEGI_{192a} como VEGI_{192b} se clonaron en pCR3.1 de Invitrogen (San Diego, CA). Debido a que no se pudo hallar el codón de iniciación de la traducción en el marco de lectura en la secuencia de 5' de VEGI_{251}, se usó un par de cebadores específicos del gen, vg5B: 5'-CACCACATAC CTGCTTG-3' (SEQ ID NO: 49) y vg161: 5'-GTGTAATCCA CCAAAGAG-3' (SEQ ID NO: 12), para aislar un clon de cADN de VEGI_{125} de longitud completa a partir de los paneles de biblioteca de cADN ordenados de OriGene (Rockville, MD). La secuencia de cADN de VEGI-_{192a} se muestra en la Tabla 13.
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Una proteína recombinante producida de una forma
truncada de VEGI_{174}, que consistía en los residuos
29-_{174}, es un potente inhibidor de la
tumorigénesis (Zhai Y, et al., FASEB J, 13:
181-189, 1999; Zhai, Y, et al., Int. J.
Cancer, 82: 131-136, 1999). Se demuestra que
VEGI no tiene un efecto directo sobre el crecimiento de las células
cancerosas, y que el mecanismo de acción de VEGI en la inhibición
del crecimiento tumoral es inhibir la formación de los vasos
sanguíneos en los tumores. Por lo tanto, el cADN de longitud
completa de VEGI_{251} se transfectó en una línea de células de
cáncer de mama humanas MDA-MB-231,
después se implantó en panículos adiposos mamarios de ratones
atímicos hembra para demostrar que el producto del gen era capaz de
inhibir el crecimiento de los tumores de estas células. Para inhibir
el crecimiento de las células endoteliales en la cercanía inmediata
de las células cancerosas, es necesario que el producto del gen de
VEGI se libere al exterior de las células transfectadas. Se
demostró que a) el producto del gen se pudo hallar en los medios
acondicionados de las células transfectadas en cultivo, y b) las
células transfectadas pudieron hacer crecer tumores en ratones
atímicos.
Las células de cáncer de mama
MDA-MB-231 se transfectaron con el
vector vacío, el cADN de VEGI-_{174} de longitud
completa, el cADN de VEGI-_{251} de longitud
completa, o con un gen de fusión en el que la proteína VEGI estaba
unida a un péptido señal de secreción derivado de la
interleucina-6 (IL6/VEGI). Cuando se analizó
mediante transferencia de Western, mediante el uso de un anticuerpo
monoclonal (13-2D) hacia VEGI, se descubrió el
producto génico de VEGI-_{251} en los medios
acondicionados de las células transfectadas (Fig. 14). En
contraste, el producto génico de VEGI-_{174} no
fue detectable en los medios acondicionados.
Los clones de
MDA-MB-231 transfectados de manera
estable se inyectaron en panículos adiposos mamarios de ratones
atímicos hembra (1 x 10^{6} células por inyección). Se
determinaron los tamaños de los tumores como función del tiempo.
También se analizó la densidad de microvasos en los tumores. La
sobreexpresión de VEGI-_{174} de longitud
completa por las células cancerosas tuvo poco efecto sobre el
crecimiento de los tumores de xenoinjertos, y la sobreexpresión de
la forma secretada del dominio extracelular supuesto de VEGI y de
VEGI-_{251} de longitud completa inhibió
notablemente el crecimiento tumoral (Fig. 15). Además, se demostró
que la proteína VEGI estuvo disponible en los tumores llevando a
cabo análisis inmunohistoquímicos de los cortes de los tumores
mediante el uso de un anticuerpo monoclonal hacia VEGI. Algunos de
los tumores (G9-1R) tuvieron células cancerosas que
producían una cantidad notable de VEGI-_{251},
mientras otros tuvieron células cancerosas que producían poco
VEGI-_{251} (G9-2R), en
comparación con los tumores formados por células transfectadas con
vector (G10-2R) (Fig. 16). Cuanto más
VEGI-_{251}
producían los tumores, menor era la velocidad de crecimiento de los tumores (Fig. 17). Estos hallazgos demuestran que VEGI-_{251} es secretada por las células cancerosas transfectadas, y que la VEGI-_{251} secretada es un inhibidor potente del crecimiento tumoral al inhibir el crecimiento de las células endoteliales en las cercanías. En contraste, VEGI-_{174} no es secretada por las células, y, por lo tanto, no puede inhibir el crecimiento de las células endoteliales.
producían los tumores, menor era la velocidad de crecimiento de los tumores (Fig. 17). Estos hallazgos demuestran que VEGI-_{251} es secretada por las células cancerosas transfectadas, y que la VEGI-_{251} secretada es un inhibidor potente del crecimiento tumoral al inhibir el crecimiento de las células endoteliales en las cercanías. En contraste, VEGI-_{174} no es secretada por las células, y, por lo tanto, no puede inhibir el crecimiento de las células endoteliales.
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A diferencia de otros miembros de la familia de
TNF, VEGI-_{174} se expresa de manera específica
en las células endoteliales. El análisis mediante transferencia de
Northern de preparaciones de ARN total de 23 líneas celulares y
cultivos de células primarias demostró que VEGI se detectó solamente
en células HUVE y en células endoteliales venosas humanas (Fig.
18). Tampoco se observó VEGI-_{174} en células
endoteliales arteriales humanas. Mediante el uso de transferencias
de Northern de múltiples tejidos, el transcrito de
VEGI-_{174} se halló en muchos tejidos humanos
adultos, que incluyen placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón,
páncreas, bazo, próstata, intestino delgado, y colon (Fig. 18), lo
que sugiere que el producto del gen puede desempeñar un papel en la
función de la vasculatura normal.
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Se generó una versión truncada de
VEGI-_{174} que correspondía al dominio
extracelular supuesto que consistía en los residuos
39-_{174}. La proteína se expresó en E.
coli, se purificó hasta una homogeneidad aparente tal como se
determinó mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida, y se examinó en una diversidad
de ensayos celulares. La proteína truncada fue capaz de inhibir de
manera específica la proliferación de células endoteliales aórticas
bovinas adultas (ABAE) (Fig. 19). Se consiguió la inhibición
prácticamente completa del crecimiento de las células endoteliales
a 10 \mug/ml, con un valor de concentración inhibitoria media
(CI_{50}) de alrededor de 1 \mug/ml (alrededor de 70 nM). En
contraste, la proteína no tuvo efecto sobre el crecimiento de las
células de cáncer de mama humano
(MDA-MB-231 o
MDA-MB-435) en condiciones
experimentales similares (Fig. 19). VEGI tampoco inhibió la
proliferación de las células de leucemia de células T humana
(Jurkat), las células de linfoma de Burkitt humano (Raji), las
células de leucemia monocítica humana (THP-1), o
las células de leucemia promielocítica humana (HL60), células que a
menudo responden a la actividad citotóxica de los TNFs. La potencia
de VEGI pareció ser menor que la que se podría esperar de una
citocina; sin embargo, es comparable a la de los inhibidores
proteicos conocidos de la angiogénesis, tales como angiostatina y
endostatina, así como el ligando de CD40 (otro miembro de la
familia de TNF). La potencia relativamente baja de la VEGI truncada
observada se puede deber en parte también a un sitio de truncamiento
sin optimizar, o a la carencia de la modificación postraduccional,
tal como la glicosilación, ya que la proteína recombinante se
expresó en E. coli.
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La actividad inhibidora específica de las
células endoteliales de VEGI indica que la proteína actúa como un
regulador negativo de la angiogénesis. Para demostrar que el gen de
VEGI está inhibido en las células endoteliales en proliferación
pero estimulado cuando las células están en reposo, se examinó la
expresión de VEGI en células HUVE cultivadas mediante transferencia
de Northern (Fig. 20). Se observaron niveles bajos de mARN de VEGI
en células HUVE recién sembradas; sin embargo, a medida que el
número de células se incrementa en los cultivos, el nivel de mARN
de VEGI se incrementa paralelamente, y alcanza una meseta cuando los
cultivos celulares se hacen confluentes.
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La actividad anti-angiogénica de
VEGI truncada se examinó con un modelo de angiogénesis in
vitro (Montesano, R. y Oorci, L., Cell 42:469, 1985)).
Las células endoteliales cultivadas en la superficie de un gel de
colágeno tridimensional forman una monocapa en reposo cuando el
cultivo alcanza la confluencia. Tras la estimulación de las células
de la monocapa con un factor angiogénico tal como
FGF-2, sin embargo, las células invaden el gel y
forman estructuras tubulares similares a capilares en el gel. La
formación de tubos se puede inhibir mediante factores
anti-angiogénicos. El grado de la formación de tubos
se puede estudiar de manera cuantitativa mediante el uso del
análisis de imágenes asistido por ordenador (Li, L. Y.,
Biochemistry 33: 10999, 1994). La
VEGI-_{174} truncada fue capaz de inhibir la
formación de tubos similares a capilares por las células ABAE (Fig.
21). El valor de CI_{50} para la inhibición fue de aproximadamente
1 \mug/ml, similar al observado para la inhibición del crecimiento
de las células endoteliales.
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La actividad anti-angiogénica de
VEGI-_{174} se demostró adicionalmente mediante el
uso de un ensayo de membrana corioalantoidea (CAM) embrionaria de
pollo modificado (Nguyen, M. et al., Microvasc. Res. 47:31,
1994). El método se basa en el crecimiento de vasos capilares nuevos
en una esfera de gel de colágeno colocada sobre la CAM. Los vasos
sanguíneos se estimularon para que crecieran verticalmente hacia el
interior de un gel de colágeno polemizado en presencia de un factor
angiogénico, tal como FGF-2 o VEGF, impregnado en
el gel. El inhibidor se incorporó en los geles para determinar su
efecto sobre el crecimiento capilar. Se determinó el grado de la
angiogénesis en el gel mediante el uso de
FITC-dextrano inyectado en la circulación de la
CAM. La VEGI-_{174} recombinante (5,0 \mug/ml)
inhibió alrededor de un 50% del crecimiento de capilares nuevos en
los geles de colágeno inducido mediante FGF-2 (2,0
\mug/ml) (Fig. 22).
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La actividad anti-cáncer de VEGI
se demuestra con un modelo de tumor de xenoinjerto, mediante el uso
de células de cáncer de mama que son sumamente tumorigénicas cuando
se implantan en panículos adiposos mamarios de ratones atímicos
hembra. Se construye una forma secretada de
VEGI-_{174} sustituyendo el segmento
N-terminal y el segmento transmembrana supuesto de
VEGI-_{174} (residuos 1-25) con el
péptido señal de secreción derivado de la
interleucina-6 humana. La construcción de
VEGI-_{174} secretada se clonó en un vector de
expresión en eucariotas, que después se transfectó en células de
ovario de hámster chino (CHO). La expresión de la construcción
correspondiente se confirmó mediante análisis de transferencia de
Northern. La secreción de la VEGI modificada por las células
transfectadas se confirmó por la capacidad del medio acondicionado
de inhibir el crecimiento de las células ABAE. Las células CHO
transfectadas se mezclaron después con células de cáncer de mama
humanas (MDA-MB-231 o
MDA-MB-435), y las mezclas celulares
se inyectaron en panículos adiposos mamarios de ratones atímicos.
Se monitorizó el crecimiento de los tumores de xenoinjertos tras la
inyección. A pesar de la tumorigenicidad elevada de las líneas
celulares de cáncer de mama usadas, se observó una inhibición
notable del crecimiento de los tumores de xenoinjertos formados por
las células MDA-MB-231 (Fig. 23A) o
por las células MDA-MB-435 (Fig.
23B). En una repetición del experimento mediante el uso de células
MDA-MB-435, la
co-inyección también condujo a la inhibición
completa de la formación de tumores. Las células CHO transfectadas
con vector no tuvieron ningún efecto sobre el crecimiento tumoral
en ningún caso. Ya que VEGI no inhibió el crecimiento de estas
células de cáncer de mama en cultivo, la actividad anticancerosa de
la proteína surgió de su actividad
anti-angiogénica.
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Se expresó VEGI-_{192a} de
longitud completa en E. coli y se replegó y se purificó
mediante el uso del método descrito en la sol. de pat. de EE.UU.
20010044521 y el documento PCT WO 01/55174. En concreto, se
construyó un vector de expresión (PET11, Novagen) que contenía una
inserción polinucleotídica que codifica el polipéptido
VEGI-_{192a} de longitud completa. El vector de
expresión se transformó en E. coli y la E. coli
transformada se cultivó para que expresase el polipéptido
VEGI-_{192a}. Las células se recogieron, y los
cuerpos de inclusión se purificaron a partir de las células
fragmentadas. La DO_{280} de la disolución que contenía los
cuerpos de inclusión se ajustó hasta pH 5,0 con una disolución de
urea 8 M. La disolución final contenía los siguientes reactivos
reductores: \beta-mercaptoetanol 10 mM, DTT
(Ditiotreitol) 10 mM, glutatión reducido (GSH) 1 mM, glutatión
oxidado (GSSG) 0,1 mM. El pH final de la disolución fue 10,0. La
disolución anterior se diluyó rápidamente en 20 volúmenes de
TRIS^{TM} base 20 mM, y el pH se ajustó a 9,0, y después se
ajustó lentamente a 8,0 con HCl 1 M, ajustando el pH a 8,8 durante
veinticuatro horas, y después a 8,6 durante veinticuatro horas,
etc., hasta que el pH fue 8,0. De manera alternativa, las proteínas
se pudieron replegar mediante el uso de diálisis. La DO_{280} de
la disolución de urea 8 M se ajustó a 0,5, y se dializó con 20
volúmenes de TRIS^{TM} base. El pH de la disolución se ajustó de
nuevo lentamente a 8,0. El material replegado se concentró después
mediante ultrafiltración, y se separó mediante filtración en gel,
por ejemplo, en una columna SEPHACRYL^{TM} S-300
equilibrada con TRIS^{TM} 20 mM, HCl, urea 0,4 M, pH 8,0. Las
fracciones de S-300 se pudieron comprobar llevando
a cabo una SDS-PAGE no reductora. La proteína
replegada erróneamente se desplazó a un peso molecular muy elevado,
mientras las proteínas replegadas correctamente se desplazaron a un
peso molecular normal.
Las proteínas VEGI-_{192a} de
las fracciones de S-300 se ensayaron en función de
su capacidad de inhibir el crecimiento de las células endoteliales.
Las células endoteliales aórticas bovinas adultas (ABAE) se
sembraron por triplicado a 8.000 células/pocillo en placas de 24
pocillos, en IMEM (GIBCO, Gaithersburg, MD), 10% de suero bovino
fetal. Se añadió FGF-2 (1 ng/ml) a los medios. Los
cultivos se mantuvieron a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante 6 días. Las
células se tripsinizaron después, y se determinó el número de
células mediante el uso de un contador Coulter (Hialeah, FL).
Tal como se muestra en la Figura 24, la
VEGI-_{192a} plegada correctamente, pero no la
VEGI-_{192a} plegada incorrectamente, de las
fracciones de S-300 fue capaz de inhibir el
crecimiento de las células ABAE. Se consideró una inhibición media
prácticamente completa del crecimiento de las células endoteliales a
1000 ng/ml, con un valor de concentración inhibidora media
(CI_{50}) de alrededor de 10 ng/ml.
Claims (24)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Un polinucleótido aislado que comprende: (a) la secuencia de SEQ ID NO: 1; (b) una secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4 o (c) un complemento de lo anterior. - 2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1.
- 3. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido comprende además un marcador detectable.
- 4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polinucleótido está inmovilizado en una superficie.
- 5. El polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de anti-angiogénesis.
- 6. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína de fusión que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 4.
- 7. Un vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 ó 6.
- 8. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector de expresión.
- 9. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 7 ó 8.
- 10. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 11. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.
- 12. El polipéptido de la reivindicación 13, en el que el polipéptido consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4.
- 13. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 4.
- 14. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, en el que el polipéptido inhibe el crecimiento de las células endoteliales vasculares.
- 15. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13, en el que el polipéptido tiene actividad de inhibición de la angiogénesis.
- 16. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 ó 13.
- 17. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- 18. Un anticuerpo que se une de manera selectiva al polipéptido de SEQ ID NO: 4, pero que no se une a VEGI-_{174}, VEGI-_{192b} o VEGI-_{251}.
- 19. Una composición según la reivindicación 17 para el uso en la inhibición de la angiogénesis.
- 20. Una composición según la reivindicación 17 para el uso en la inhibición del crecimiento tumoral.
- 21. Un método in vitro para ensayar un agente o un fármaco en función de la actividad inhibidora angiogénica, y dicho método comprende medir la capacidad de dicho agente o fármaco de incrementar la actividad anti-angiogénica del polipéptido de la reivindicación 11.
- 22. Un método para ensayar un agente o un fármaco en función de la estimulación de la angiogénesis, y dicho método comprende medir la capacidad de dicho agente o fármaco de reducir o eliminar la actividad anti-angiogénica del polipéptido de la reivindicación 11.
- 23. Un método para la detección de VEGI-_{192a} que comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un anticuerpo que se une de manera selectiva al polipéptido de la reivindicación 11; y detectar la presencia o ausencia de un complejo formado entre un polipéptido de la muestra y el anticuerpo.
- 24. Un método para la detección de un polinucleótido de VEGI-_{192a} que comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un oligonucleótido que se une de manera selectiva al polinucleótido de la reivindicación 1; y detectar la presencia o ausencia de una molécula bicatenaria formada entre el oligonucleótido y un polinucleótido de la muestra.
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