JP2003519463A

JP2003519463A - ＴＣＬ−１ｂ遺伝子、蛋白質、それらに関連した方法およびそれらに関連する物質

Info

Publication number: JP2003519463A
Application number: JP2000605597A
Authority: JP
Inventors: カルロ、エムクロセ、; ユリピカースキー、
Original assignee: トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティー
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2003-06-24
Also published as: EP1165586A1; WO2000055169A1; CA2367906A1; US20050287530A1; EP1165586A4

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ヒト染色体の１４ｑ３２．１遺伝子座に局在するＴＣＬ１遺伝子ファミリーがＴ細胞悪性腫瘍に関係すると考えられる。本発明はこの遺伝子ファミリーの新しい構成要素であるＴＣＬ−１ｂ遺伝子の同定と同定を開示する。ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列は正常な骨髄および末梢リンパ球において極めて低いレベルで発現するが、１４ｑ３２．１遺伝子座の組み換えによるＴ細胞白血病およびリンパ腫において活性化する。本発明はこれらの１４番染色体異常の同定、そして発生するどのようなＴ細胞悪性腫瘍をも検出および治療する方法、またこれらのＴ細胞悪性腫瘍の発生予防に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本出願は分子生物学の分野に関し、特に、Ｔ細胞白血病における染色体の組み
換えによっても活性化されるＴＣＬＩ遺伝子ファミリーの第三番目の構成要素に
関し、具体的にはＴｃｌ−１ｂの分離および同定に関する。

【０００２】本発明は一部国立保健研究所からの交付金番号ＣＡ３９８８０号およびＣＡ５
１０８３号のもとに政府の支援を受けてなされた。本発明に関して政府が多少の
権利を持つものである。

【０００３】関連出願への引照本出願は１９９９年３月１５日出願の米国仮特許出願番号６０／１２４，７１
４号に基づき３５ＵＳＣ１１９条の下に優先権を主張する。

【０００４】

【従来の技術】

染色体の転座、逆位、欠失等の特定の染色体異常と一定の型の悪性腫瘍の間に
は密接な関係があり、この異常が発癌過程において原因的な役割を果たしている
可能性がある。染色体異常は、大部分の骨髄系の悪性腫瘍に見られるように、遺
伝子融合を起こし、その結果として融合型の癌関連蛋白質（キメラオンコプロテ
イン）を生ずることがある。あるいは、リンパ系列において起こる転座に見られ
るように、染色体異常の結果として造血細胞において活性の調節部位の近傍への
挿入によって癌関連遺伝子の調節不全を起こす可能性もある（バージリオ他、19
93、Proc Natl Acad Sci USA 90：9275-9279）。

【０００５】特定遺伝子座を標的としたノンランダムな染色体の転座はほとんどのヒト造血
細胞悪性腫瘍の特徴であり（ハルスカ他、1987、Ann Rev Genet、21：321-345）
、いくつかの固型腫瘍に関係している可能性がある（クロース、1987、Cell 49
：155-156）。ＢおよびＴ細胞においては、染色体の転座や逆位はしばしば免疫
グロブリン（Ｉｇ）やＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のための正常な遺伝子組換え
過程における誤りの結果として起こる。これらの組み換えの結果として、Ｉｇや
ＴＣＲ遺伝子が、癌関連遺伝子の近傍へ置換され、そのためにその遺伝子の発現
が異常となる（クロース、1987、Cell 41：155-156）。多くの場合、リンパ性悪
性腫瘍に見られる組み換えは二種の異なる染色体の間に起こる。

【０００６】１４番染色体バンドｑ３２．１上のＴＣＬ‐1遺伝子座は、Ｔ細胞型前リンパ
球性白血病（T-PLL）（ブリト-ババプルおよびカトブスキー、1991、Cancer Gen
et. Cytogenet. 55：1-9）、免疫不全症候群血管拡張性失調症（ＡＴ）に関連し
た急性および慢性白血病（ラッソー他、1988、Cell 53：137-１４4；ラッソー他
、1989、Proc Natl Acad Sci USA、86：602-606）、および成人Ｔ細胞白血病（
バージリオ他、1993、Proc Natl Acad Sci USA、90：9275-9279）を含むいくつ
かの成熟型Ｔ細胞白血病やリンパ腫に見られるＴ細胞レセプター遺伝子の染色体
転座や逆位に関係していることが多い。

【０００７】１４番染色体１４ｑ３２．１上のＴＣＬ１腫瘍関連遺伝子も人間における慢性
Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＣＬＬ）の発生に関係しており、染色体転座、t(14;14)(q11
;32)、t(7;14)(q35;q32)、または逆位inv(14)(q11;q32)を原因とするＴ細胞レセ
プターα/δとの並列によってこれらの白血病中で活性化される。ふつうはＴＣ
Ｌ１発現は初期のＴ細胞プロジェニター(CD4^-CD8^-CD3^-)やＢ細胞系列のリンパ細
胞：プレＢ細胞とＢ細胞を発現する未熟ＩｇＭに見られる。ｌｃｋプロモーター
の制御下におけるＴＣＬ１遺伝子導入はマウスにおけるＴ細胞白血病の原因とな
った。（バージリオ他、1998、Proc Natl Acad Sci USA、95：3885-3889）。

【０００８】しかしながら、１４ｑ３２．１における遺伝子増幅のようないくつかのＴ細胞
悪性腫瘍の例においてはＴＣＬ１発現の活性化が見られなかった。これは恐らく
１４ｑ３２．１に少なくともあと一つの腫瘍関連遺伝子が位置しているのかもし
れないことを示唆するものである。ＴＣＬ１ファミリーの第二の構成要素である
ＭＴＣＰ１はＸｑ２８に位置しており、t(X;14)(q28;q11)転座を持つまれな成熟
Ｔ細胞白血病において活性化される。本発明は１４ｑ３２．１に位置し、これも
またＴ細胞白血病における１４ｑ３２．１の組み換えによって活性化されるＴＣ
Ｌ１遺伝子ファミリーの第三番目の構成要素であるＴＣＬ１ｂの分離および同定
（機能解析）に関するものである。

【０００９】１４番染色体１４ｑ３２．１におけるＴＣＬ-1遺伝子座の組み換えは、これら
の組み換えに関係した他の遺伝子座、すなわちＴＣＲα/δ遺伝子座もまた１４
番染色体上のサブバンドｑ１１にあるという点で独特のものである（クロース他
、1985、Science 227：1044-1047；磯辺他、1988、Proc Natl Acad Sci USA、85
：3933-3937）。このため、細胞遺伝学的に観察された組み換えは、ただ一つの
１４番染色体に関係した染色体逆位のinv(14)(q11;q32)か、またはt(14;14)(q11
;q32) のような両方の１４番染色体に関係した転座、またはよりまれには、７ｑ
３５におけるＴＣＲβ遺伝子座に関係した転座のt(7:14)(q53;q32)である（磯辺
他、1988、Proc Natl Acad Sci USA、85：3933-3937）。これらの転座に関係し
たいくつかの１４ｑ３２．１の切断点がクローン化され、同定されている（ラッ
ソー他、1988、Cell、51：137-１４4；ベアー他、1987、Proc Natl Acad Sci USA
、84：9069-9073；メングル-ゴー他、1987、MEBO、1：2273-2280；バートネス他
、1990、Cancer Genet Cytogenet、44：47：54）。

【００１０】長距離ゲノム地図上の転座転座切断点の位置同定の研究によって約３５０ｋｂ
の染色体部位であると推定されるＴＣＬ-1遺伝子座が最近クローン化された。（
バージリオ他、1993、Proc Natl Acad Sci USA、90：9275-9279）。転座現象に
このように大きな部位が関係しているということは、以前に外套型細胞リンパ腫
におけるＢＣＬ−１／ＣＣＤＤＩ遺伝子に関して（辻本他、1984、Science、22、4
：１４03-１４06；ローゼンバーグ他、1991、Proc Natl Acad Sci USA、88：9638-
9642；ウィザーズ他、1991、Mol Cell Biol、11：4846-4853；元倉およびアーノ
ルド、1993、Genes Chrom & Cancer、7：89-95）、またバーキットリンパ腫（ダ
ラ-ファベラ他、1982、Proc Natl Acad Sci USA、79：7824-7827；西倉他、1983、Pr
oc Natl Acad Sci USA 80：4822-4826）、および急性Ｔ細胞白血病（エリクソン
他、1986、Science、232：884-886）におけるMYC腫瘍関連遺伝子に関して観察され
たように、恐らくは何キロベースも離れた距離からＴＣＬ-1遺伝子の活性化が起
こり得ることを示唆する。

【００１１】ＴＣＬ-1遺伝子ファミリーの第三番目の構成要素であるＴＣＬ１ｂを完全に分
離し、同定（機能解析）することは必然性のある仕事として未だなされずに残っ
ている。Ｔ細胞白血病やリンパ腫の原因となる染色体異常に関連したあと一つの
腫瘍関連遺伝子の同定は、診断および治療・予防試薬がこの疾患状態を検出、治
療および予防する効能をより一層拡大するものである。本発明はＴＣＬ１ｂ遺伝
子の同定と機能解析によってこの必然性を満足する。

【００１２】前述の部分における参考文献の引用はそれらの参考文献が本発明の従来技術で
あることを認めていると解釈されるものではない。

【００１３】

【発明の概要】

Ｔ細胞悪性腫瘍の発生にＴＣＬ１遺伝子ファミリーが関係すると思われている
。本発明はこの遺伝子ファミリーの新しい構成要素であるＴＣＬ−１ｂ遺伝子の
構造と同定を開示する。本発明はＴＣＬ１ｂのヌクレオチド配列およびそれらの
コードされたＴＣＬ１ｂ蛋白質のアミノ酸配列、またそれらの誘導体および類似
体、そしてそれらへの抗体に関する。本発明はまた前述のヌクレオチド配列、お
よびＴｃｌ１ｂ蛋白質をコードする等価核酸配列に交雑可能または相補的な核酸
に関する。

【００１４】本発明はＴｃｌ１ｂ蛋白質、その誘導体または類似体をコードする発現ベクタ
ー、およびＴｃｌ１ｂ蛋白質、その誘導体または類似体をコードする発現ベクタ
ーを含む宿主細胞に関する。

【００１５】本発明はまた染色体異常、特に１４ｑ３２．１における異常に関連した疾患状
態の検出および治療用の診断および治療応用としてのＴＣＬ１ｂ遺伝子とそれら
のコード蛋白質の使用に関する。本発明の一具体例において、ＴＣＬ−１ｂ遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれらのコードＴｃｌ−１ｂ蛋白質のアミノ酸配列
は、それぞれ特に１４ｑ３２．１における染色体異常に関連したＴ細胞白血病や
リンパ腫の疾患状態やＴｃｌ１ｂ蛋白質の発現レベルの増加の検出に役立つ診断
試薬としてまたは診断薬の調製において、使用されている。

【００１６】本発明はまたＴＣＬ−１ｂ遺伝子のヌクレオチド配列およびそれらのコードＴ
ｃｌ１ｂ蛋白質のアミノ酸配列それぞれの、特に１４ｑ３２．１における染色体
異常に関連したＴ細胞白血病やリンパ腫の疾患状態やTc1１ｂ蛋白質の発現レベ
ルの増加の治療・予防における治療・予防薬としての使用に関する。

【００１７】ここで開示されるＴＣＬ−１ｂ遺伝子とＴｃｌ１ｂ蛋白質配列は、そしてそれ
らへの抗体は、染色体異常に関連したＴ細胞白血病やリンパ腫や、Tc1１ｂ蛋白
質の発現レベルの増加の診断へのアッセイ（検査）において使われる。

【００１８】ここで開示されるＴｃｌ１ｂ蛋白質またはそれらの誘導体や類似体はそれぞれ
抗Ｔｃｌ１ｂ抗体の生産に使われ、それらの抗体はそれぞれ患者標本におけるＴ
ｃｌ１ｂ蛋白質の検出または測定のためのイムノアッセイ法（免疫学的測定法）
において診断的に有用なものである。

【００１９】本発明の別な一面は染色体異常やＴｃｌ１ｂ蛋白質の発現増加に関連した疾患
や病態における治療法に関する。特に１４ｑ３２．１における逆位や転座のよう
な１４番染色体の異常はＴ細胞白血病やリンパ腫に関連している。ＴＣＬ−１ｂ
遺伝子配列やそれらの蛋白質生成物は１４番染色体異常関連疾患状態の治療にお
いて使われる。抗Ｔｃｌｂ抗体は、例えば、それぞれ疾患に関連した過剰発現の
Ｔｃｌ１ｂ蛋白質の活性を中和するときに治療目的で使われる。

【００２０】Ｔｃｌ−１ｂまたはｍＲＮＡの転写や翻訳を抑制するように設計されたアンチ
センスＲＮＡおよびＤＮＡ分子とリボザイムを含むオリゴヌクレオチド配列は
ＴＣＬ１ｂの発現増加に関連した疾患状態の治療において治療用に使われる。

【００２１】Ｔｃｌ１ｂの活動を変調できる蛋白質、ペプチドおよび有機分子はＴｃｌ１ｂ
の異所性発現に関連した疾患状態の治療において使われる。

【００２２】本発明はまたＴｃｌ１ｂ蛋白質、それらの誘導体または類似体、それらへの抗
体、Ｔｃｌ１ｂ蛋白質をコードする核酸、誘導体または類似体、そしてＴＣＬ−
１ｂアンチセンス核酸を含む治療用組成物に関する。

【００２３】本発明はまた、例えば組換え手段による、Ｔｃｌ１ｂ蛋白質、誘導体および類
似体の生産方法に関する。

【００２４】

【発明の実施の形態】

方法細胞系

【００２５】ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系以外の細胞系はＡＴＣＣ（メリーランド州、
ロックビル）から入手し、１０％のウシ胎仔血清と共にＲＰＭＩ培養基中で成長
させた。リンパ芽球細胞系はアルツハイマー病患者の末梢血リンパ球から、以前
に報告されたように（グリッチ、C他、1998、Blood、92：368-373）エプスタイン
バーウイルス（ＥＢＶ）での形質転換によって形成した。

【００２６】ノーザン、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥE）および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ
−ＰＣＲ）分析つぎの例外を除き、これらの実験は以前に説明された様に（ペカースキー、Y
他、1998、Proc Natl Acad Sci USA、95：8744-8749）行なわれた。ヒト骨髄お
よび胎盤ｍＲＮＡ、ヒト免疫系およびヒト癌細胞系のノーザン法はクロンテック
（カリフォルニア州、パロアルト）から購入した。図３ＣおよびＤのそれぞれの
系は３ｍｇのＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを含む。図４Ａに示されるＰＣＲは多組織ｃＤ
ＮＡパネル（クロンテック）と製造業者のプロトコルを使って２５〜３５サイク
ル行なった。プライマーは：上パネル、TC1、GGCAGCTCTACCCCGGGATGAA（配列番
号:１）; およびTC39、（配列番号:１）; ACAGACCTGAGTGGGACAGGA、（配列番号:
２）; 中パネル、TCLBTCCTCCTTGGCAGGAGTGGTA （配列番号:３）; およびTCLC、G
AGTTACGGGTGCTCTTGCGT、（配列番号:４）; 下パネル、対照3'および5'RACE G3PD
Hプライマー（クロンテック）。図４Ｂ、中および下パネル、プライマーは上記
と同じ。図４Ｂ、上パネル。ＰＣＲはプライマーのTC8、ATGGCCTCCGAAGCTTCTGTG
、（配列番号:５）; およびTC39と共に２２サイクル行なった。反応の０．１ｍ
ｌは繰り込まれたプライマーのTC10、TGGTCGTGCGGTTCAATCCCT、（配列番号:６）
; およびTC5、AATCTGGCCATGGTCTGCTATTTC、（配列番号:７）; と共に第二のＰＣ
Ｒに１５サイクル使われた。RACEプライマーは：TC1（3' RACE用）およびTC5（5
' RACE用）であった。

【００２７】パルス領域ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析と染色体局在。

【００２８】パルス時間が１１時間１−６秒であった以外、ＰＦＧＥ分析は記述されたよう
に（ペカースキー、Y他、1998、Cancer Res、58：3401-3408）行なった。ＴＣＬ１
ｂ遺伝子の染色体局在はGeneBridge 4放射線融合細胞染色体地図パネル（リサー
チジェネティックス、アラバマ州、ハンツビル）を用い、製造業者のプロトコル
に従って行なった。プライマーはTC1とTC4、TGCTAGGACCAGCTGCTCCATAGA、（配列
番号:８）であった。

【００２９】結果ＴＣＬ１ｂ遺伝子の同定。

【００３０】いくつかの１４ｑ３２．１における染色体異常を持つ成熟Ｔ細胞白血病におい
て、１４ｑ３２．１でのＴＣＬ１遺伝子の活性化はみられなかった（たきわざ、J
、他、1998、Jpn J Cancer Res、89：712-718；坂下、他、1998、Leukemia、12：970-
971）。他の未知のＴＣＬ１ファミリーが関係している可能性を調べるために、
ＴＣＬ１およびＭＴＣＰ１遺伝子生成物に相同の配列をＥＳＴデータベースで検
索した。一つのＥＳＴ（アクセス番号AA689513）が相同であることがわかったが
、どちらの遺伝子にも完全な対応ではなかった。よって、5'および3'ＲＡＣＥ過
程とヒト精巣ｍＲＮＡをｃＤＮＡ源として使い、全長〜１．２ｋｂのｃＤＮＡを
分離した（配列番号：９）。その１．２ｋｂＴＣＬ１ｂｃＤＮＡは１２８アミ
ノ酸（配列番号:１０）の１４ｋＤａ蛋白質をコードする；（図１）。その中に
は完璧なコザックコンセンサス配列内の位置２８に開始ＡＴＧコドンがある。Ｔ
ｃｌ１およびＭｔｃｐ１蛋白質と比較して（図１）Ｔｃｌ１ｂ蛋白質は１４アミ
ノ酸挿入があり、Ｔｃｌ１に３０％同一で６０％類似しており、Ｍｔｃｐ１に３
６％同一で６３％類似している（図１）。

【００３１】ヒトＴＣＬ１ｂ遺伝子の染色体局在のために放射線融合細胞染色体地図パネル
（GeneBridge ４）を使った。ＭＩＴデータベース（http://www-genome.wi.mit.
edu) でＰＣＲデータを分析することによって、ＴＣＬ１ｂ遺伝子は１４ｑ３２
において、D14S265のマーカーから3.05cRのところに局在された。ＴＣＬ１ｂ偽
遺伝子は5q12-5q13に局在した。ＴＣＬ１ｂ偽遺伝子には開始ＡＴＧやイントロ
ンがなく、オープンリーディングフレームの中間に停止コドンがある。

【００３２】ＴＣＬ１もＴＣＬ１ｂもどちらも１４ｑ３２に局在している。したがって、Ｔ
ＣＬ１とＴＣＬ１ｂが物理的に連結しているかどうか解析した。ヒト細菌人工染
色体（ＢＡＣ）ライブラリーにてＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂを含んでいるいくつかの
ＢＡＣクローンを見つけた。ＴＣＬ１ｂ遺伝子（配列番号:１１）;はサイズが６
．５ｋｂで、それぞれ189、171、69および697bpの四種のエクソンを含むが（図
２）、最初の三つのエクソンだけが蛋白質をコードする。両方の遺伝子のプロー
ブを使った陽性ＢＡＣクローンのパルス領域分析によってＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂ
の遺伝子は逆方向の転写を持ち、１６ｋｂの距離のみによって分離されることが
わかった（図２）。どちらの遺伝子も以前に公表された１４ｑ３２．１における
転座または逆位のあるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）における二組の
切断点の間（〜１６０ｋｂの領域）に局在している。（バージリオ、L他、1994
、Proc Natl Acad Sci USA、91：12530-12534；バージリオ、L他、1993、Proc Na
tl Acad Sci USA、90：9275-9279）。

【００３３】ＴＣＬ１ｂ遺伝子の発現およびＴ細胞悪性腫瘍における活性化。

【００３４】ＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂの遺伝子が構造、配列および局在において類似している
ことから、それらが類似した発現パターンを示す可能性がありそうに思えた。こ
れを確かめるために、ノーザンおよびＲＴ−ＰＣＲ実験をいくつか行なった（
図３および図４）。正常な組織におけるノーザン分析は、数日間のＸ線フィルム
感光のあと精巣と胎盤において１．２ｋｂ転写が検出された（図３Ｃ）以外は、
ＴＣＬ１ｂに関してほとんど陰性であった（図３Ａ）。しかし、ＴＣＬ１遺伝子
の発現は数日間の感光のあとほとんどの造血組織において検出された（図３Ａ）
。半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析（図４Ａ）によって脾臓、扁桃腺、胎児肝臓、胎児
腎臓、および胎児胸腺においてＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂのどちらもが発現している
ことがわかった。しかし、ＴＣＬ１ｂ遺伝子は胎盤、腎臓そして胎児脾臓を含む
より広い範囲の種類の組織で発現している（図４Ａ）。市販のヒト癌細胞系のノ
ーザン分析によると、ＴＣＬ１のほうがずっと高いレベルで発現したという違い
があるが（図３Ｂ）、ＴＣＬ１とＴＣＬ１bのどちらもラージバーキットリンパ
腫の細胞系でのみ発現した（図３Ｂ）。

【００３５】ＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂの遺伝子は類似した転写パターンを持ち、物理的に連結
されている。したがって、ＴＣＬ１ｂ遺伝子も１４ｑ３２における組み換えによ
って活性化され得るのかどうかを調べた。図３Ｃおよび図３Ｄに正常な骨髄およ
びＴＣＬ１が発現しているＲＢＶ形質転換リンパ芽球性Ｂ細胞系と比較して、１
４ｑ３２．１（SupT11）で転座のあるＴ白血病細胞系におけるＴＣＬ１ｂ遺伝子
の活性化が示されている（図３Ｃおよび図３Ｄ、中間のパネル）。ＴＣＬ１もＴ
ＣＬ１ｂも普通１４ｑ３２．１異常のない成熟Ｔ細胞や成熟Ｔ細胞白血病では発
現しないので（例えば、１４ｑ３２．１の異常のないT-ALL MOLT4、図３Ｂ、レー
ン４）、t(14;14)(q11;q32,1)を持つSupT11細胞におけるＴＣＬ１およびＴＣＬ
１ｂの発現は、ＴＣＬ１およびＴＣＬ１ｂをＴ細胞レセプターのａ／ｄ遺伝子座
に並列させることが両方の遺伝子の調節を不全にすることを示唆する。

【００３６】ＴＣＬ１ｂの発現をより深く調べるためにＴＣＬ１のレベルの上昇したＴ細胞
白血病四件とＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系六件の分析をした。図４ＢにＴ細
胞リンパ球性白血病の患者からの一つの白血病試料におけるＴＣＬ１ｂ発現の活
性化が示されている。ヒトＴ細胞前リンパ球性白血病は１４ｑ３２．１転座また
は逆位を持ち、ＴＣＬ１が過剰発現する（バージリオ、L他、1994、Proc Natl Ac
ad Sci USA、91：12530-12534；ナーダッシ、M.G.他、1997、Cancer Res、57：5452
-5456）。ＴＣＬ１ｂ遺伝子はまた六件のＥＢＶ形質転換リンパ芽球性B細胞系の
うち二件においても発現した（図３Ｄ、上パネル、レーン2-7）。

【００３７】討議本発明はＴＣＬ１遺伝子ファミリーの新しい構成要素であるＴＣＬ１ｂのクロ
ーン化、マッピングおよび発現分析を開示する。ＴＣＬ１遺伝子とＴＣＬ１ｂ遺
伝子は物理的に連結しており、構造上の類似性、類似した発現パターンおよびＴ
細胞悪性腫瘍への関係を示す。ＴＣＬ１遺伝子ファミリーの残りの二つの構成要
素が腫瘍関連遺伝子であるので（バージリオ、L他、Proc Natl Acad Sci USA、95
：3885-3889；グリッチ、C、他、1998、Blood、92：368-373）、ＴＣＬ１ｂもまた
腫瘍関連遺伝子である可能性が高い。また、ＴＣＬ１ｂの活性化がＴＣＬ１の活
性化を含まない１４ｑ３２における増幅を伴うＴ細胞白血病の事例を説明する可
能性も高い。

【００３８】ＴＣＬ１ｂ遺伝子はかすかにＴＣＬ１遺伝子よりもXq28におけるＭＴＣＰ１遺
伝子により相同であるが、二つのＴＣＬ１遺伝子が遺伝子重複の結果である可能
性がある。

【００３９】結晶構造によれば（フー、Z.Q.、他、1998、Proc Natl Acad Sci USA、95：3413-
3418）レチノイドやヌクレオシドまたは脂肪酸のような微小分子の輸送体として
機能するようにも見えるが、ＴＣＬ１のインビボ（生体内）での機能も、またそ
の腫瘍関連遺伝子的ポテンシャルのメカニズムも知られていない。上述の同じ研
究（フー、Z.Q.、他、1998、Proc Natl Acad Sci USA、95：3413-3418）はＴＣＬ１
がダイマーとして機能する可能性を示唆し、ＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂがヘテロダイ
マーを形成する可能性を示唆した。

【００４０】ＴＣＬ１とＭＴＣＰ１の遺伝子組み換えマウスがたった１５ヶ月後に成熟Ｔ細
胞白血病を発病するのだから（バージリオ、Ｌ他、1998、Proc Natl Acad Sci U
SA、95：3885-3889；グリッチ、C他、1998、Blood、92：368-373）、ＴＣＬ１ｂの遺
伝子組み換えマウスもまた成熟Ｔ細胞白血病を遅延して発病するのか、またＴＣ
Ｌ１とＴＣＬ１ｂの二重遺伝子組み換えマウスは白血病をより早く発病するのか
を決定することはかなり興味深いことである。よって、１４ｑ３２．１における
転座や逆位が二つの腫瘍関連遺伝子を同時に活性化して悪性変換を促進すること
が有り得るように思える。

【００４１】本発明はＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配列番号:１１）のヌクレオチド配列；それら
のコードＴｃｌ−１ｂ蛋白質（配列番号:１０）のアミノ酸配列、またそれらの
誘導体と類似体、そしてそれらへの抗体に関する。本発明はまたＴＣＬ−１ｂ遺
伝子およびそれらのコード蛋白質または誘導体または類似体およびそれらへの抗
体の、染色体異常やＴＣＬ１ｂの発現増加に関連した疾患状態の検出および治療
／予防のためのアッセイにおける使用に関する。本発明はまたＴｃｌ−１ｂ蛋白
質、それらの誘導体または類似体、それらへの抗体、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質をコー
ドする核酸、誘導体または類似体、そしてＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸を含む
治療応用に関する。

【００４２】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子は、哺乳動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類およ
びヒトを含む、しかしこれらに限られない、多くの異なる種からのもので、自然
配列または異型のもの、または自然、人工的または組換え等あらゆる源からのも
のである。ここで説明する一具体例において、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子はヒト配列で
ある。Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質は、哺乳動物、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、げっ歯類
およびヒトを含む、しかしこれらに限られない、多くの異なる種に存在するもの
で、自然配列または異型のもの、または自然、人工的または組換え等あらゆる源
からのものである。ここで説明する具体例において、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質はヒト
蛋白質である。

【００４３】ここでの定義において、Ｔｃｌ−１ｂ誘導体はＴｃｌ−１ｂ配列（配列番号:
１０）のフラグメントまたはアミノ酸変異体であり、そのフラグメントまたは
アミノ酸変異体が全長Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質に関連する生物学的活性の一つまたは
それ以上を示すことが条件である。この生物学的活動には、抗原性、つまり、抗
ＴＣＬ−１ｂ抗体に結合する能力や、免疫源性、つまりＴｃｌ−１ｂ蛋白質を結
合することのできる抗体を生成する能力が含まれるが、これらに限られてはいな
い。

【００４４】本発明は少なくとも１０のアミノ酸、または少なくとも２５のアミノ酸、また
は少なくとも５０のアミノ酸、または少なくとも１１４のアミノ酸からなるＴｃ
ｌ−１ｂ蛋白質のフラグメントを提供する。それらの誘導体や類似体をコードす
る核酸もまたこの発明の範囲に属する。好ましいＴｃｌ−１ｂ蛋白質変異体はＴ
ｃｌ−１ｂアミノ酸配列の少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、
または少なくとも１００の近接アミノ酸において自然Ｔｃｌ−ｂ蛋白質に少なく
とも７０％のアミノ酸配列相同性を共有するものであり、特に好ましいＴｃｌ−
１ｂ蛋白質変異体は少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を共有するものであ
り、そして別の特に好ましいＴｃｌ−１ｂ蛋白質変異体は少なくとも９０％のア
ミノ酸配列相同性を共有するものである。ここでの使用において、アミノ酸配列
相同性とは同一のアミノ酸残基を持つアミノ酸配列またはアミノ酸残基に保存的
変化を含むアミノ酸配列のことである。別の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂ相
同性蛋白質は引用された長さのアミノ酸において自然Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質に同一
の配列を前述の割合だけ共有するものである。

【００４５】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配列番号:１１）;は２群の切断点によってバンド結合さ
れた領域に局在する１４番染色体１４ｑ３２．１の領域に局在する。ＴＣＬ１と
ＴＣＬ−１ｂの遺伝子構造、配列および局在が類似しているので、それらの発現
パターンを比較した。ＴＣＬ１ｂの正常組織における発現はほとんど陰性であっ
た、（図３Ａ）。しかし、ＴＣＬ１遺伝子発現はほとんどの造血組織に検出され
た。またＴＣＬ１もＴＣＬ１ｂも脾臓、扁桃腺、胎児肝臓及び胎児胸腺において
発現がみられた。図４Ａに示すように、ＴＣＬ１ｂ遺伝子は胎盤、腎臓および胎
児脾臓を含むより広い範囲の種類の組織において発現がみられた。生検した細胞
や組織のような患者の試料におけるＴＣＬ−１ｂｍＲＮＡの検出は特定の１４番
染色体異常やＴｃｌ−１ｂ蛋白質の発現増加に関連したＴ細胞白血病やリンパ腫
の存在の指標として使われる。また、本発明のＴｃｌ−１ｂアミノ酸配列は患者
の試料におけるＴｃｌ−１ｂの検出や測定のためのイムノアッセイ（免疫学的測
定法）に有用な抗体を生成するために使われる。この抗ＴＣＬ−１ｂ抗体はＴ細
胞白血病やリンパ腫に関連したＴｃｌ−１ｂレベルの増加の検出や測定のための
診断イムノアッセイに使われる。

【００４６】本発明によれば、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質（配列番号:１０）、フラグメントのよ
うな誘導体、またはその類似体のポリヌクレオチド配列コードを、Ｔｃｌ−１ｂ
蛋白質の発現を支配する組換えＤＮＡ分子の生成に好適な発現ベクター、つまり
挿入された蛋白質コード配列の転写や翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入す
ることができる。このＴＣＬ−１ｂポリヌクレオチド配列また他のポリヌクレオ
チドやそれらの相補鎖は核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノ
ーザン法分析等にも使われる。一具体例において、ヒトＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配
列番号:１１）、またはヒトＴＣＬ−１ｂ遺伝子の機能的に活動的な部分をコー
ドする配列が発現している。また別の一具体例においては、ヒトＴＣＬ−１ｂ遺
伝子の誘導体またはフラグメントが発現している。

【００４７】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子がコードする配列発現した配列標識（ＥＳＴ）データベースアクセス番号AA689513番への参照で
ここで開示された特定の一具体例において、この発明はヒトＴＣＬ−１ｂ遺伝子
（配列番号:１１）の核酸配列に関する。この発明の好適なしかし限定的ではな
い一面において、ヒトＴＣＬ−１ｂｃＤＮＡ配列（配列番号:９）; が、ＴＣ
Ｌ１遺伝子ファミリーの他の構成要素であるＴＣＬ-1とＭＴＣＰ１に相同的なＥ
ＳＴデータベース（アクセス番号AA689513番）中に同定された。この配列は、下
記のように分離され１．２キロベース全長ｃＤＮＡとしてクローン化された。こ
の発明はまた前述の配列に交雑可能なまたは相補的な核酸配列、または、同等な
核酸配列もまたＴｃｌ−１ｂ蛋白質生成物をコードするという意味で、前述の配
列に同等な核酸配列にも関する。

【００４８】好適な一面において、公知のＴｃｌ−１ｂ配列（配列番号:９）を再現するオ
リゴヌクレオチドプライマーを使ってライブラリーにおける好ましい核酸配列を
増幅するためにポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）が使われる。このプライマーはＲ
ＮＡまたはＤＮＡ源、好ましくはｃＤＮＡライブラリーから対象配列を増幅する
ために使われる。当業者には公知のように、ＰＣＲはパーキン-エルマーシータ
ス温熱サイクラーとＴａｑポリメラーゼを使って行なう。増幅されるＤＮＡは任
意の真核種からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである。ＰＣＲ増
幅反応で使うためにいくつかの異なる変性プライマーを合成する。クローン化さ
れたＴＣＬ−１ｂ遺伝子と本発明のＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配列番号:１１）のヌ
クレオチド配列の相同性の度合いの高低調節を可能にするためにＰＣＲ反応をプ
ライムするときのハイブリダイゼーション条件の厳しさもまた変化させる。

【００４９】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子の一部分、対立遺伝子上のまたは遺伝子多形の、またはＴ
ＣＬ−１ｂ遺伝子の種相同性の増幅の成功で示されたように、今後はその部分は
分子的にクローン化および配列され、そして完全なｃＤＮＡまたはゲノムクロー
ンを分離するためのプローブとして使用される。これによって、その遺伝子の完
全なヌクレオチド配列の決定、その発現分析、そして将来の分析のための蛋白質
生成物の生産が可能になる。このようにしてＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードするそ
の他の遺伝子の同定が可能になる。

【００５０】潜在的に、どの真核性細胞でもＴＣＬ−１ｂ遺伝子の分子的クローン化の核酸
源として使うことができる。Ｔｃｌ−１ｂをコードする核酸配列は、例えば、ヒ
ト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌ、げっ歯類およびその他の霊長類源か
ら、分離される。ＤＮＡは当技術で公知の、例えばクローン化ＤＮＡ（例：ＤＮ
Ａ「ライブラリー」）、化学合成、ｃＤＮＡクローン化、または好ましい細胞
から精製したゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントのクローン化等、標準手法で
入手する。（参照例：サムブルック他、1989、Molecular Cloning、A Laboratory
Manual、2^nd Ed.,、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨ
ーク州、コールドスプリングハーバー;グローバー、D.Ｍ. （編）、1985、ＤＮＡ
Cloning：A Practical Approach、MRLプレス、Ltd.、英国、オックスフォード、Vol
. I、II）好ましい源は１４ｑ３２．１染色体異常関連白血病の白血病細胞のｃＤ
ＮＡである。ｃＤＮＡから誘導されたクローンがＴｃｌ−１ｂエクソン配列の
みを含むのに対して、ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは蛋白質コード領域
に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含む。本発明の特定の一具体例にお
いて、ゲノム配列は１０キロベース（ｋｂ）以下のもの、または２０ｋｂ以下の
もの、または５０ｋｂ以下のもの、または７０ｋｂ以下のものである。源が何で
あれ、遺伝子はその遺伝子の繁殖に適したベクターに分子的にクローン化される
べきである。特定の一具体例において、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列の分離のための
核酸の好ましい源はＢ前駆細胞からである。

【００５１】ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子的クローン化において、ＤＮＡフラグメント
が生成され、一部が好ましい遺伝子をコードする。ＤＮＡは特定の部位において
種々の制限酵素を使って分割される。あるいは、マンガンの存在中におけるＤＮ
ＡseをＤＮＡをフラグメントするために使う、または、例えば音波破砕によって
、ＤＮＡを物理的に切る。ＤＮＡの線状フラグメントをその後、アガロースおよ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動法やカラムクロマトグラフィーを含むがそれ
らに限られない、標準技術によってサイズごとに分別する。

【００５２】ＤＮＡフラグメントが生成されたら、数々の方法で好ましい遺伝子を含む特定
のＤＮＡフラグメントを同定する。例えば、本発明のＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配列
番号:１１）またはその特定なＲＮＡ、またはそのプローブやプライマーのよう
なフラグメントを分離し、標識表示し、そして生成されたＴＣＬ−１ｂ遺伝子を
検出するためにハイブリダイゼーションアッセイにおいて使う（ベントン、W、お
よびデービス、R、1977、Science、196:180;グランスタイン、M、およびホッジズ、D、
1975、Proc Natl Acad Sci USA、72:3961）。プローブに実質的な配列相同性を共
有するＤＮＡフラグメントは厳しい条件下でハイブリッド形成する。ここで使わ
れる「厳しい条件」とは、（バージリオ、L他、1994、Proc Natl Acad Sci USA、
91：12530-12534）例えば、５０℃における０．０１５ＭＮａｃｌ／０．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳのように低いイオン強度と高
温を洗浄に採用する；（ナーダッシ、M.G.他、1997、Cancer Res、57:5452-5456）ハ
イブリダイゼーション中に、例えば０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％の
フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＡのｐＨ６．５の燐酸ナ
トリウム緩衝液と７５０ｍＭのＮａｃｌを含む５０％（容量/容量）ホルムアミ
ドのような、ホルムアミドのような変性剤と７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを４
２度Ｃで採用する;または（３）５０％のホルムアミド、５倍のＳＳＣ（０．７
５ＭＮａＣｌ，０．０７５Ｍピロリン酸ナトリウム、５倍のデンハート
溶液、音波破砕したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、およ
び１０％の硫酸デキストランを４２度Ｃで、また０．２倍ＳＳＣおよび０．１％
ＳＤＳ中で４２度Ｃでの洗浄を採用するようなハイブリダイゼーション条件のこ
とである。

【００５３】適切なフラグメントはまた制限酵素の消化およびフラグメントのサイズと公知
の制限地図に従って予測されるサイズとの比較によって同定される。それ以上の
選択は遺伝子の性状に基づいて行なわれる。あるいは、遺伝子の存在はその発現
した生成物の物理的、化学的、または免疫学的性状に基づいたアッセイによって
検出される。例えば、ｃＤＮＡクローン、または適切なｍＲＮＡをハイブリッド
選択するゲノムＤＮＡクローンは、類似したまたは同一の電気泳動移動、等電点
解析での挙動、蛋白質分解消化地図、Ｔｃｌ−１ｂに公知の結合活動や抗原性状
を持つ蛋白質を生成するものが選ばれる。あるいは、例えば、イライザ（エンザ
イム-リンクドイムノソルベントアッセイ）型の手法におけるように、Ｔｃｌ−
１ｂ蛋白質は標本抗体を推定上Ｔｃｌ−１ｂを発現するクローンに結合すること
によって同定することもある。

【００５４】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子はまた核酸ハイブリダイゼーションに続くインビトロな翻
訳によるｍＲＮＡ選択によっても同定される。この手法において、ハイブリダイ
ゼーションで相補的ｍＲＮＡを分離するためにフラグメントを使う。このＤＮＡ
フラグメントは別のＴＣＬ−１ｂ遺伝子の使用可能な精製したＴＣＬ−１ｂＤＮ
Ａを再現することもある。分離ｍＲＮＡの分離生成物のインビトロ翻訳生成物の
免疫沈降反応分析または機能アッセイはそのｍＲＮＡを同定し、よって、好まし
い配列を含む相補的ＤＮＡフラグメントを同定する。その上、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白
質に特に抗する固定抗体への細胞から分離されたポリソームの吸着によって特定
のｍＲＮＡが選択されることもある。放射標識表示されたＴＣＬ−１ｂｃＤＮ
Ａは選択されたｍＲＮＡ（吸着ポリソームから）を鋳型として使い、合成される
。その放射標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡはその後他のゲノムＤＮＡフラグメント
の中からＴＣＬ−１ｂＤＮＡフラグメントを同定するプローブとして使われる
。

【００５５】ＴＣＬ−１ｂゲノムＤＮＡを分離する方法には他に、遺伝子配列そのものを公
知の配列から化学的に合成するか、ｃＤＮＡをＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードする
ｍＲＮＡにする等があるが、これらに限られない。例えば、Ｔｃｌ−１ｂ細胞の
ｃＤＮＡクローン化に役立つＲＮＡは、Ｂ前駆急性白血病細胞や細胞表面ＩｇＭ
を発現し免疫グロブリンを分泌しない風土病性バーキットリンパ腫のように、Ｔ
ｃｌ−１ｂを発現する細胞から分離される。その他の方法は当業者に公知であり
、本発明の範囲に属する。

【００５６】同定および分離された遺伝子はその後適当なクローン化ベクターに挿入される
。当技術において公知の多くのベクター-ホスト系が使われ得る。このベクター
にはプラスミドや変性ウイルスが含まれるが、それらに限られず、またそのベク
ター系は使用ホスト細胞に適合しなければならない。このベクターには、ラムダ
誘導体のようなバクテリオファージやPBR322やpUCプラスミド誘導体のようなプ
ラスミドが含まれるが、こららに限られない。クローン化ベクターへの挿入は、
例えばＤＮＡフラグメントの相補的凝着末端を持つクローン化ベクターへの結さ
つを伴うことができる。しかし、ＤＮＡをフラグメントするのに使った相補的制
限部位がクローン化ベクターに存在しないと、ＤＮＡ分子の末端が酵素的に修飾
されることがある。あるいは、任意の好ましい部位をヌクレオチド配列（リンカ
ー）をＤＮＡ末端に結さつすることによって生成することもできる；これらの結
さつリンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成オ
リゴヌクレオチドを含む。他の一方法において、分割ベクターとＴＣＬ−１ｂ遺
伝子は単独重合的テーリングによって修飾される。組換え分子は変換、トランス
フェクション、感染、電気穿孔法またはその他の当業者に公知の方法で宿主細胞
に導入され、数多くの遺伝子のコピーが生成される。

【００５７】他の一方法において、好ましい遺伝子は「ショットガン」的方法で適したクロ
ーン化ベクターに挿入された後、同定および分離される。その好ましい遺伝子の
例えばサイズ分割による強化がクローン化ベクターへの挿入の前に行なわれる。

【００５８】特定の具体例において、宿主細胞の、分離ＴＣＬ−１ｂ遺伝子、ｃＤＮＡ、ま
たは合成ＤＮＡ配列を取り入れた組換えＤＮＡ分子を含む変換によって、その遺
伝子のコピーが複数生成できるようになる。よって、組換えＤＮＡ分子は形成転
換体から分離され、そして、必要なら、挿入遺伝子を分離した組換えＤＮＡから
検索し、成長する形成転換体によってその遺伝子は大量に入手される。

【００５９】Ｔｃｌ−１ｂコードまたはノンコーディング配列の一部を含む、またはＴｃｌ
−１ｂ蛋白質の一部をコードする（例えば、ＰＣＲで使われるプライマー）オリ
ゴヌクレオチドは当業者に公知の方法で合成される。このオリゴヌクレオチドは
好ましくは８から２５ヌクレオチドの範囲のサイズを持つ。ここにおける特定の
一具体例において、このオリゴヌクレオチドは１５から２５ヌクレオチドまたは
１８から２５ヌクレオチドの範囲のサイズを持つ。

【００６０】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子の発現本発明によると、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質、フラグメントのような誘導体、または
その類似体をコードするポリヌクレオチド配列は、適当な発現ベクター、つまり
Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質の発現を支配する組換えＤＮＡ分子の生成のための、挿入蛋
白質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入されること
ができる。このＴｃｌ−１ｂポリヌクレオチド配列また他のポリヌクレオチドま
たはそれらの相補体はまた核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよび
ノーザン法分析等においても使われ得る。一具体例において、ヒトＴＣＬ−１ｂ
遺伝子、またはヒトＴＣＬ−１ｂ遺伝子の機能的に活動的な部分をコードする配
列が発現している。さらに別の一具体例においては、ヒトＴＣＬ−１ｂ遺伝子の
誘導体またはフラグメントが発現している。

【００６１】遺伝子コードのもつ「ゆらぎ」のために他のＤＮＡ配列で実質的に同一のまた
は機能的に同等のＴｃｌ−１ｂアミノ酸配列をコードするものも本発明の範囲に
属する。このＤＮＡ配列の中には厳しい条件下でヒトＴｃｌ−１ｂ配列に雑種を
作れるものが含まれる。

【００６２】本発明によって使われる改変ＤＮＡ配列には、異なるヌクレオチド残留物の欠
失、追加、置換を含み、結果的に同一のまたは機能的に同等の遺伝子生成物をコ
ードする配列になるものが含まれる。遺伝子生成物自身がＴｃｌ−１ｂ配列中の
アミノ酸残基の欠失、追加、または置換を含み、結果的に沈黙（アミノ酸配列の
変化しない）変化を持ち、よって機能的に同等なＴｃｌ−１ｂ蛋白質を生成して
いることもある。このアミノ酸置換は残留物の極性、電荷、溶解性、疎水性、親
水性、そして／または両親媒性に基づいて行なわれる。例えば、陰性電荷のアミ
ノ酸にはアスパラギン酸やグルタミン酸が含まれ; 陽性電荷のアミノ酸にはリシ
ンやアルギニンが含まれ; 類似した親水性値を持つ非荷電のアミノ酸にはロイシ
ン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン
；セリン、トレオニン；フェニルアラミン、チロシンがある。

【００６３】本発明のＤＮＡ配列は、ＴＣＬ−１ｂコード配列を遺伝子生成物の処理や発現
を修飾する変更等を含むがそれに限られない種々の目的のために改変させるため
に、作られる。例えば、特定部位の突然変異誘発、新制限部位の挿入、燐酸化等
、当業者に公知の技法を使って導入された変異である。

【００６４】この発明の別の一具体例において、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列またはその誘導体
がキメラ融合蛋白質をコードするために非ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配合に結されてい
る。融合蛋白質はＴｃｌ−１ｂ配列と非Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質配列のあいだに局在
する介在部位を含んで作られており、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質がノンＴｃｌ−１ｂ部
分から分割できるようになっている。特定の一具体例において、この融合蛋白質
におけるＴｃｌ−１ｂアミノ酸配列はＴｃｌ−１ｂ蛋白質配列の少なくとも１０
の近接アミノ酸、少なくとも２５の近接アミノ酸、少なくとも５０の近接アミノ
酸、少なくとも７５の近接アミノ酸、少なくとも１００の近接アミノ酸、または
少なくとも１１４のアミノ酸を含む。

【００６５】この発明の他の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂのコード配列は全部または一
部技術に公知の化学的方法を使って合成さる。参照例：カルーサーズ他、1980、
Nuc Acids Res Symp Ser、7:215-233；クレアおよびホーン、1980、Nuc Acids Re
s、9（10）:2331；マテウシおよびカルーサーズ、1980、Tetrahedron Letters 21:
719;そしてチョウおよびケンプ、1981、Nuc Acids Res 9（12）:2807-2817。ある
いは、蛋白質そのものがＴｃｌ−１ｂアミノ酸配列の全体または一部を合成する
化学的方法を使って生成される。例えば、ぺプチドは固相技法で、樹脂から分割
して、調製用高性能液体クロマトグラフィーで精製して合成される。（参照例：
クレイトン、1983、Proteins Structures And Molecular Principles、W.H.フリー
マンカンパニー、ニューヨーク、pp. 50-60）。合成ぺプチドの組成はアミノ酸
分析または配列決定法によって確認できる（例：エドマン分解手法；参照：クレ
イトン、1983、Proteins Structures And Molecular Principles、W.H.フリーマ
ンカンパニー、ニューヨーク、pp. 34-49）。

【００６６】生物学的に活性なＴｃｌ−１ｂ蛋白質またはその誘導体を発現するために、Ｔ
ｃｌ−１ｂ蛋白質またはその誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を適当な
発現ベクターに挿入する。つまり、挿入コード配列の転写および翻訳に必要な要
素を含むベクターである。ＴＣＬ−１ｂ遺伝子生成物また宿主細胞または組換え
Ｔｃｌ−１ｂ発現ベクターでトランスフェクトされたまたは変換された細胞系は
種々の目的に使われる。これらには免疫特異的にＴＣＬ-１b蛋白質に結合する抗
体の生成（つまり、モノクローナルまたはポリクローナル）が含まれるが、これ
に限られてはいない。抗ＴＣＬ-１b抗体は患者試料におけるＴＣＬ-１b蛋白質の
レベルの検出や測定に使われる。

【００６７】発現系ＴＣＬ−１ｂコード配列と適当な転写／翻訳制御信号を含む発現ベクターの構
成のために当業者に公知の方法を使う。これらの方法にはインビトロ組換えＤＮ
Ａ技法、合成技法、そしてインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、
サムブロック他、1989、Molecular Cloning、A Laboratory Manual 2^nd ed．、
ニューヨーク州、コールドスプリングハーバーラボラトリー、およびオースベル
他、1989、Current Protocols in Molecular Biology、グリーンパブリッシング
アソーシエツアンドワイリーインターサイエンス、ニューヨークを参照。

【００６８】Ｔｃｌ−１ｂコード配列を発現するために種々のホスト発現ベクター系が使わ
れる。これらには、Ｔｃｌ−１ｂコード配列を含む組換えバクテリオファージＤ
ＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで変換した細菌のよ
うな微生物；Ｔｃｌ−１ｂコード配列を含む組換えイースト発現ベクターで変換
されたイースト；Ｔｃｌ−１ｂコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（
例、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター
（例、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、Ｔ
ＭＶ）またはＴｃｌ−１ｂコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例
、Ｔｉプラスミド）に感染した植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、こ
れらに限られてはいない。これらの系の発現要素は強度や特異性において変化す
る。使われるホスト／ベクター系によって、構成性および誘導性プロモーターを
含む任意の適切な転写および翻訳要素が発現ベクターにおいて使われる。例えば
、細菌系のクローン化ではバクテリオファージ.ラムダ.、plac, ptrp, ptac （p
trp-lac ハイブリッドプロモーター）のような誘導性プロモーターが使われる；
昆虫細胞系のクローン化では、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターのよ
うなプロモーターが使われる；植物細胞系のクローン化では、植物細胞のゲノム
から誘導されたプロモーター（例、ヒートショックプロモーター；RUBISCOの小
部分ユニット用のプロモーター; クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質用のプロモータ
ー）または植物ウイルスから誘導されたプロモーター（例、ＣａＭＶの３５５Ｒ
ＮＡプロモーター；ＴＭＶのコート蛋白質プロモーター）が使われる；哺乳動物
細胞系のクローン化では、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（
例、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスから誘導されたプ
ロモーター（例、アデノウイルス遅延プロモーター；種痘ウイルス７・５ｋプロ
モーター）が使われる；ＴＣＬ−１ｂＤＮＡの複数のコピーを含む細胞系の生
成においては、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−、およびＥＢＶ−ベースのベクターが適当
な選択マーカーと共に使われる。

【００６９】細菌系においては、発現したＴｃｌ−１ｂ蛋白質の使用意図によって、いくつ
かの発現ベクターが優位に選択される。例えば、抗体の生成のためにＴｃｌ−１
ｂ蛋白質が大量に生成されるときは、すぐに精製できる融合蛋白質生成物のレベ
ルが高い発現を支配するベクターが好ましい。このベクターには、ハイブリッド
AS-lac Z蛋白質が生成されるようにlac Zコード領域と共にフレームのベクター
にＴｃｌ−１ｂコード配列が結さつする、Ｅ．大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８
（ルーサー他、1983、EMBO J、2：1791）;pINベクター（井上および井上、1985、N
ucleic Acids Res、13、3101-3109；バンヒークおよびシュースター、1989、J Bio
l Chem、264：5503-5509）；等が含まれるが、これらに限られない。ｐＧＥＸベ
クターはまた異種ポリペプチドをグルタチオンＳトランスファラーゼ（ＧＳＴ）
を持つ融合蛋白質として発現するのに使われる。一般にそれらの融合蛋白質は溶
解性でグルタチオン-アガロースビードへの吸着に続く遊離グルタチオンの存在
中における溶出によって溶解細胞から簡単に精製される。ＰＧＥＸベクターは当
該クローン化ポリペプチドをＧＳＴ部分から放出するためにトロンビンまたはＸ
ａ因子プロテアーゼ分割部位を含むようにできている。

【００７０】イーストにおいては、構成性または誘導性プロモーターを含むいくつかのベク
ターが使われる。参考文献：Current Protocols in Molecular Biology、Vol. 2
、1988、オースベル他編、Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience、第1
3章;グラント他、1987、Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Met
hods in Enzymology、ウーおよびグロスマン編、1987、Acad. Press、ニューヨ
ーク、153:516-544；グローバー、1986、ＤＮＡ Cloning. Vol. II、IRL Press、
ワシントンDC、第3章; ビター、1987、Heterologous Gene Expression in Yeast
, Methods in Enzymology、バーガーおよびキンメル編、 Acad. Press、ニューヨ
ーク、152:673-684; The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、1982
、ストラザーン他編、Cold Spring Harbor Press、Vols. IおよびII。

【００７１】植物発現ベクターが使われる場合、いくつかのプロモーターの内任意のものが
Ｔｃｌ−１ｂコード配列発現の動因となる。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ
および１９ＳＲＮＡプロモーターのようなウイルス性プロモーター（ブリッソ
ン他、1984、Nature 310：511-5１４）、またはＴＭＶのコート蛋白質プロモータ
ー（高松他、1987、EMBO J、6:307-311）が使われる；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯ
の小部分ユニットのような植物プロモーター（コルッジ他、1984、EMBO J、3：167
1-1680；ブログリー他、1984、Science、224：838-843）；またはダイズhsp17.5-
Eまたはhsp17.3-Bのようなヒートショックプロモーター（ガーリー他、1986、Mo
l Cell. Biol、6：559-565）が使われる。これらの構造物はＴｉプラスミド、Ｒ
ｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ変換、マイクロインジェクシ
ョン、エレクトロポレーション等によって植物細胞に導入される。これらの技法
の参考文献として、例えば、ワイスバックおよびワイスバック、1988、Methods
for Plant Molecular Biology、Academic Press、ニューヨーク、第VIII節、pp.
421-463；グリアーソンおよびコーリー、1988、Plant Molecular Biology, 2^nd
Ed.、Blackie、ロンドン、7-9章がある。

【００７２】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子の発現に使われ得る他の一発現系は昆虫系である。この一
系において、オートグラファカリフォルニカ核ポリヘドロシスウイルス（Ａｃ
ＮＰＶ）が異種遺伝子を発現するベクターとして使われている。このウイルスは
スポドプテラフルジペルダ細胞において成長する。Ｔｃｌ−１ｂコード配列はそ
のウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローン化され、AcNP
Vプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の支配下におかれる。Ｔｃ
ｌ−１ｂコード配列挿入の成功によってポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非
閉塞組換えウイルス（例：ポリヘドリン遺伝子によってコードされた蛋白質性コ
ートを欠くウイルス）が生成される。これらの組換えウイルスはその後その中で
挿入遺伝子が発現するスポドプテラフルジペルダ細胞を感染するために使われる
。（参照例：スミス他、1983、J Virol、46：584；スミス、米国特許第4,215,05
1号）。

【００７３】哺乳動物の宿主細胞においては、いくつかのウイルス性に基づいた発現系が使
われる。アデノウイルスが発現ベクターとして使われる場合、Ｔｃｌ−１ｂコー
ド配列は例えば遅延プロモーターや3連リーダー配列のようなアデノウイルス転
写／翻訳制御複合体に結さつされる。そしてキメラ遺伝子がインビトロまたはイ
ンビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入される。ウイルス性ゲノムを
非必須領域（例：E1またはE3領域）に挿入すると、感染宿主中で生存可能なそし
てＴｃｌ−１ｂ発現可能な組換えウイルスができる。（参照例：ローガン及びシ
ェンク、1984、Proc Natl Acad Sci USA、81：3655-3659）。あるいは、種痘7.5K
プロモーターが使われる。（参照例：マケット他、1982、Proc Natl Acad Sci US
A、79：7415-7419;マケット他、1984、J Virol、49：857-864; パニカリ他、1982、
Proc Natl Acad Sci USA、79：4927-4931）。

【００７４】挿入Ｔｃｌ−１ｂコード配列の効率的翻訳のために特定の開始信号が必要なこ
とがある。これらの信号にはＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。自身の開
始コドンと隣接配列を含むＴＣＬ−１ｂ遺伝子全部が適当な発現ベクターに挿入
される場合は、それ以外の翻訳制御信号は不必要なことがある。しかし、Ｔｃｌ
−１ｂコード配列の一部のみが挿入されて５’末端を欠く場合は、ＡＴＧ開始コ
ドンを含む外因性翻訳制御信号を与える必要がある。さらに、挿入部全体の翻訳
を確実にするためにその開始コドンはＴｃｌ−１ｂコード配列の読み枠と同相で
なければならない。これらの外因性翻訳制御信号と開始コドンは自然および人工
的を含み種々の源からのものである。適当な転写エンハンサー、転写ターミネー
ター等を含むことによって発現効率を上げることができる。（参照：ビットナー
他、1987、Methods in Enzymol、153：516-544）。

【００７５】加えて、特定の好ましい方法で挿入配列発現を変化する、または遺伝子生成物
を修飾および処理する宿主細胞株が選ばれる。この蛋白質生成物の修飾（例：燐
酸化）および処理（例：分割）は蛋白質の機能にとって大切なことがある。それ
ぞれの異なる宿主細胞は蛋白質の翻訳後処理および修飾の特性的そして特定のメ
カニズムを持っている。発現された異種蛋白質の適正な修飾および処理を確実に
するために適当な細胞系や宿主系が選ばれる。この目的のために一次転写の適切
な処理用の細胞機構を持つ真核性宿主細胞と遺伝子生成物の燐酸化が使われる。
これらの哺乳動物宿主細胞にはCHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、 293、WI38等
が含まれるが、これらに限られてはいない。

【００７６】組換え蛋白質の長期の高収率生成のためには、安定発現が好ましい。例えば、
Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質を安定して発現する細胞系が作られている。ウイルス性複製
源を含む発現ベクターを使う代わりに、宿主細胞は適当な発現制御要素（例：プ
ロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル酸化部位
、等）に制御されるＴＣＬ−１ｂＤＮＡ、および選択可能なマーカーを使って変
換される。

【００７７】異種ＤＮＡ導入の後、作られた細胞を強化培地で1-2日育て、その後選択培地
に切り換える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーが選択に抵抗を与え、細
胞が安定してプラスミドを染色体中に取り込み細胞増殖巣を形成できるようにし
、それがクローン化され細胞系へと拡張される。この方法はＴｃｌ−１ｂ蛋白質
を発現する細胞系の作成に使用して有利である。本発明はＴｃｌ−１ｂ蛋白質が
細胞に発現するようにＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードする組換え発現ベクターで変
換された宿主細胞を培養し、発現したＴｃｌ−１ｂ蛋白質を回収することによっ
て組換えＴｃｌ−１ｂ蛋白質を生産する方法を提供する。

【００７８】単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ウィグラー他、1977、Cell、11：223）、ヒ
ポキサンチン-グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（スズィバルス
カおよびスズィバルスキー、1962、Proc Natl Acad Sci USA、48：2026）および
アデニンフォスフォリボシルトランスファーゼ（ローウィ他、1980、Cell、22：
817）遺伝子を含む、しかしこれらに限られない、いくつかの選択系が使われ、こ
れらはそれぞれtk-、hgprt-、またはaprt-細胞において使われ得る。また、メ
トトレキセートに抵抗を与えるdhfr（ウィグラー他、1980、Natl Acad Sci USA、7
7：3567; オヘア他、1981、Proc Natl Acad Sci USA、78：1527）；ミコフェノ
リン酸に抵抗を与えるgpt（マリガンおよびバーグ、1981、Proc Natl Acad Sci U
SA、78：2072）；アミノグリコシドG-418に抵抗を与えるneo （コルベレ-ガラピ
ン他、1981、J Mol Biol、150：1）；そしてヒグロマイシンに抵抗を与えるhygro
（サンテレ他、1984、Gene、30：１４7）の選択ベースとしてアンチメタボライト
抵抗が使われる。最近、この他の選択可能遺伝子が記述されている。主なものは
、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを使わせるtrpB; 細胞にヒスチジ
ンの代わりにヒスチノールを使わせるhisD （ハートマンおよびムリガン、1988、
Proc Natl Acad Sci USA、85：8047）; そしてオルニチンデカルボキシラーゼ抑
制因子、2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン、DFMOに抵抗を与えるオルニチ
ンデカルボキシラーゼ（マクコンローグ、L、1987、Current Communications in M
olecular Biology中、コールドスプリングラボラトリー編）である。

【００７９】Ｔｃｌ−１ｂを発現する遺伝子導入体または形質転換体の同定コード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子生成物を発現する宿主細胞は少な
くとも大きく分けて次の4種の方法で同定される。（a）ＤＮＡ-ＤＮＡまたはＤ
ＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーション;（b）「マーカー」遺伝子機能の存在また
は不在;（c）宿主細胞におけるＴｃｌ−１ｂｍＲＮＡ転写の発現によって測定
される転写レベルの評価;そして（d）イムノアッセイ（免疫学的測定法）または
生物学的活性によって測定される遺伝子生成物の検出。

【００８０】第一の方法では、それぞれＴｃｌ−１ｂコード配列、または部分、またはその
誘導体に相同なヌクレオチド配列を構成するプローブを使ったＤＮＡ-ＤＮＡま
たはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーションによって発現ベクターに挿入された
Ｔｃｌ−１ｂコード配列の存在を検出する。

【００８１】第二の方法では、組換え発現ベクター／ホスト系は特定の「マーカー」遺伝子
機能（例：チミジンキナーゼ活動、抗生物質への抵抗、メトトレキセートへの抵
抗、変換発現型、バキュロウイルス中の閉塞体形成等）の存在または不在を基に
同定、選択される。例えば、ヒトＴｃｌ−１ｂコード配列がベクターのマーカー
遺伝子配列内に挿入されると、Ｔｃｌ−１ｂコード配列を含む組換え細胞はマー
カー遺伝子機能の不在によって同定される。あるいは、マーカー遺伝子がＴｃｌ
−１ｂ配列と連合してＴｃｌ−１ｂコード配列発現の制御に使われた同じまたは
異なるプロモーターの制御下におかれる。誘導または選択への反応におけるマー
カーの発現がＴｃｌ−１ｂコード配列の発現を示す。

【００８２】第三の方法では、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子の転写活動をハイブリダイゼーションア
ッセイによって評価する。例えば、ＲＮＡをＴｃｌ−１ｂコード配列または転写
ノンコーディング配列またはそれらの特定の部分へ相同性を有するプローブを使
ってノーザン法で分離及び分析する。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、こ
のプローブへのハイブリダイゼーションを定量的にアッセイする。

【００８３】第四の方法では、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質生成物のレベルを例えばウエスタン法、
放射線同位元素を用いた免疫沈降法、酵素結合イムノアッセイ等のイムノアッセ
イ（免疫学的測定法）によって免疫学的に評価する。

【００８４】発現遺伝子生成物の精製ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列を発現する組換えを同定したら、その遺伝子生成物を
分析する。これは生成物の放射性標識表示を含む物理的または機能的性状に基づ
くアッセイによって行ない、その後ゲル電気泳動法、イムノアッセイ、または当
業者に公知のその他の検出方法で分析する。

【００８５】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質を同定したら、クロマトグラフィー（例：イオン交換、ア
フィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、吸収
率較差溶解度、または任意の他の蛋白質精製標準技法を含む標準方法でそれを分
離、精製する。機能性状を任意の適切なアッセイで評価する。

【００８６】あるいは、組換え体によってＴｃｌ−１ｂ蛋白質を同定したら、その蛋白質の
アミノ酸配列を、その組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から
演繹する。結果として、その蛋白質を技術に公知の標準的化学法で合成する（
参照例：ハンカピラー他、1984、Nature、310：105-111）。本発明の特定の一具体例において、このＴｃｌ−１ｂ蛋白質は、組換えＤＮＡ技
法で生成されようが化学合成法で生成されようが、一次アミノ酸配列として、図
１（配列番号:１０）に表わすアミノ酸配列の全部または一部を実質的に含むも
の、またフラグメントおよび他の誘導体、そしてその類似体を含むが、それに限
られてはいない。

【００８７】Ｔｃｌ−１ｂへの抗体の生産この発明によれば、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質、そのフラグメントまたはその他の誘
導体、またはその類似体はそのイムノゲンを認識する抗体を生産するイムノゲン
として使われる。この抗体にはポリクローン性、モノクローン性、キメラ、単鎖
、Fabフラグメント、そしてFab発現ライブラリーが含まれるが、これらに限られ
てはいない。特定の一具体例において、ヒトＴｃｌ−１ｂ蛋白質への抗体が生産
されている。

【００８８】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質へのポリクローン性抗体、または誘導体、または類似体の
生産には技術で公知の種々の手法が使われる。抗体の生産のために、ウサギ、マ
ウス、ラットを含む、しかしこれらに限られない種々の宿主動物が天然Ｔｃｌ−
１ｂ蛋白質、または合成版、またはその誘導体（例：フラグメント）の注射で免
疫化されている。宿主種によって免疫反応の強化のために、フロイント（完全お
よび不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチン、プル
ロニックポリオル、ポリアニオン、ぺプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘ
モシニアン、ジニトロフェノールのような表面活性物質、そしてBCG（カルメッ
ト-ゲランかん菌）およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトアジュバン
トを含む、しかしこれらに限られない種々のアジュバントが使われる。

【００８９】特定の一例において、ウサギをＴｃｌ−１ｂに対して免疫化するために細菌に
発現されたＴＣＬ−１ｂ遺伝子の１４ｋＤａ蛋白質が使われた。この抗体は１４
ｋＤａＴｃｌ−１ｂ蛋白質を種々の白血病及びリンパ腫中にウエスタン法および
免疫沈降法によって認識した。

【００９０】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質配列（配列番号:１０）またはその類似体用のモノクロー
ン性抗体の調製には、培養における連続細胞系によって抗体分子を生成する任意
の技法が使われる。例えば、最初にコウラーおよびミルスタインによって開発さ
れたハイブリドーマ法（1975、Nature、256：495-497）、またトリオーマ法、ヒ
トB細胞ハイブリドーマ法（コズボー他、1983、Immunolgy Today、4：72）、そし
てヒトモノクローン性抗体生成用EBV-ハイブリドーマ法（コール他、1985、Mon
oclonal Antibodies and Cancer Therapy中、Alan R. Liss, Inc.、pp.77-96）が
ある。本発明のさらに別の一具体例において、最近の技術を使ってモノクローン
性抗体を無菌動物に生成している（PCT/US90/02545)。この発明によると、ヒト
の抗体が使われ、ヒトハイブリドーマを使って（コート他、1983、Proc Natl Ac
ad Sci USA、80：2026-2030）またはヒトB細胞をEBVウイルスでインビトロに変
換して（コール他、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中、Alan
R. Liss, Inc.、pp.77-96）得られている。事実、この発明によれば、遺伝子を
Ｔｃｌ−１ｂ特異のマウス抗体分子から適当な生物学的活動のヒト抗体分子と共
にスプライスすることによる「キメラ抗体」の生成のために開発された技法（モ
リソン他、1984、Proc Natl Acad Sci USA、81：6851-6855；ニューバーガー他
、1984、Nature、312：604-608；竹田他、1985、Nature、3１４：452-454）を使
っている；この抗体は本発明の範囲に属するものである。

【００９１】この発明によれば、単鎖抗体の生産のために記述された技法（米国特許番号4,
946,778号）がＴｃｌ−１ｂ特異の単鎖抗体の生産に適用されている。この発明
のさらに別の一具体例では、Fab発現ライブラリーの構築のために記述されたＴ
ｃｌ−１ｂ蛋白質、誘導体、または類似体の好ましい特異性を持つモノクローン
性Fabフラグメントを迅速で簡単に同定するための技法（ヒュース他、1989、Sci
ence、246：1275-1281）を使っている。

【００９２】分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技法で生産される。例
えば、このフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生産されるF(ab
').sub.2フラグメント；F(ab').sub.2フラグメントのジスルフィド架橋を軽減す
ることによって生成されるFab'フラグメント、そして抗体分子をパパインと還元
剤で処理することによって生成されるFabフラグメントが含まれるが、これらに
限られてはいない。

【００９３】抗体の生産において、好ましい抗体のスクリーニングはその技術で公知の技法
、つまりＥＬＩＺＡ（エンザイムリンクドイミュノソルベントアッセイ）で行な
われる。例えば、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質の特定の領域を認識する抗体を選択するに
は、その領域を含むＴｃｌ−１ｂフラグメントに結合する生成物用に生成された
ハイブリドーマをアッセイすればよい。ヒトＴｃｌ−１ｂに特異の抗体を選択す
るには、ヒトＴｃｌ−１ｂへの陽性結合そして例えば、マウスＴｃｌ−１ｂへの
陰性結合を基に選択すればよい。

【００９４】前述の抗体はこの発明の蛋白質配列の局在および活動、例えば適当な生理学的
試料におけるこれらの蛋白質のイメージング、そのレベルの測定等、に関連した
技術において公知の方法で使われている。

【００９５】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子および蛋白質の構造ＴＣＬ−１ｂ遺伝子および蛋白質の構造はこの技術において公知の種々の方法
で分析されている。

【００９６】遺伝学的分析ＴＣＬ−１ｂ遺伝子に対応するクローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡは、サザンハ
イブリダイゼーション（サザン、E.M.、1975、J Mol Biol、98：503-517）、ノー
ザンハイブリダイゼーション（参照例：フリーマン他、1983、Proc Natl Acad Sc
i USA、80：4094-4098）、制限エンドヌクレアーゼマッピング（マニアティス、T.
,1982、Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)、およ
びＤＮＡ配列分析を含む、しかしこれらに限られない方法で分析されている。ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許番号4,683,202号、4,683,195号、および
4,889,818号；Proc Natl Acad Sci USA、85：7562-7656；オーチマン他、1988、
Genetics、120：621-623；ロー他、1989、Science、243：217-220）に続くＴｃ
ｌ−１ｂ特異のプローブでのサザンハイブリダイゼーションによって種々の細胞
型からのＤＮＡにおけるＴＣＬ−１ｂ遺伝子の検出が可能になる。一具体例にお
いて、Ｔｃｌ−１ｂの遺伝学的リンケージの決定にサザンハイブリダイゼーショ
ンが使われている。ＰＣＲに続くハイブリダイゼーションアッセイもＴｃｌ−１
ｂＲＮＡまたは１４ｑ３２．１染色体異常の検出または測定に使われている。
ノーザンハイブリダイゼーション分析はＴＣＬ−１ｂ遺伝子の発現レベルの決定
に使われている。Ｔｃｌ−１ｂ発現のために種々の発展または活動状態における
種々の細胞型が検査されている。サザンおよびノーザンの両方のハイブリダイゼ
ーションにおいて、またはドットブロットにおいて、ハイブリダイゼーション条
件の厳しさは使われた特定のＴｃｌ−１ｂプローブへの好ましい関連度を持つ核
酸の検出を確実にするために操作している。

【００９７】制限エンドヌクレアーゼマッピングはＴＣＬ−１ｂ遺伝子の遺伝学的構造を大
概的に決定するために使われる。制限エンドヌクレアーゼ分割によって誘導した
制限地図はＤＮＡ配列分析で確認する。

【００９８】ＤＮＡ配列分析はこの技術において公知の任意の技法で行なわれる。これらは
、マクサムおよびギルバートの方法（1980、Meth Enzymol、65：499-560）、サン
ガーダイデオキシ法（サンガー他、1977、Proc Natl Acad Sci USA、74：5463）
、または自動ＤＮＡシークエネーター（例：アプライドバイオシステム、カリフ
ォルニア州、フォスターシティ）の使用を含むが、これらに限られてはいない。
代表的なＴＣＬ−１ｂ遺伝子のｃＤＮＡ配列は実質的にここにおいて開示した配
列からなる（配列番号:９）。

【００９９】蛋白質分析Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質のアミノ酸配列はＤＮＡ配列からの演繹によって、あるい
は自動アミノ酸シークエンサーによる蛋白質の直接的な配列活定法によって誘導
される。代表的なＴｃｌ−１ｂ蛋白質のアミノ酸配列は実質的に図１（配列番号
:１０）に表わされたような配列からなり、アミノ酸番号1-128で示された代表的
成熟蛋白質を持つ。

【０１００】Ｔｃｌ−１ｂ配列はまた親水性分析によっても特性化される（ホップ、Tおよ
びウッヅ、K、1981、Proc Natl Acad Sci USA、78：3824）。親水性プロフィール
を使ってＴｃｌ−１ｂ蛋白質の疎水性および親水性領域、およびそれらの領域を
コードする遺伝子配列の対応する領域を同定する。

【０１０１】二次構造分析（チョー、P.およびファスマン、G.、1974、Biochemistry、13：2
22）もまた行なわれ、Ｔｃｌ−１ｂの特定な二次構造を想定する領域を同定して
いる。

【０１０２】操作、翻訳、および二次構造予測、またオープンリーディングフレーム予測お
よびプロッティングもこの技術において入手可能なコンピューターソフトを使っ
て行なっている。

【０１０３】その他の構造分析もまた使われている。これらには、Ｘ線結晶解析（イングス
トム、A.、1974、Biochem Exp Biol 11：7-13）およびコンピューターモデリン
グ（フレッテリック、R.、およびゾラー、M.、（編）1986、Computer Graphics an
d Molecular Modeling、Current Communications in Molecular Biology中、コ
ールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州、コールドスプリング
ハーバー）が含まれるが、これらに限られてはいない。

【０１０４】Ｔｃｌ−１ｂおよびそのＴｃｌ−１ｂ蛋白質生成物およびそのための抗体の用途例えば、t(14:14)(q11;q32)染色体転座、inv(14)(q11;q32)染色体逆位、およ
びt(7:14)(q35:q32)染色体転座のような１４番染色体におけるＴＣＬ−１ｂ遺伝
子座に関連した染色体転座および逆位は、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（T-PLL
）（ブリト-ババプルおよびカトヴスキー、1991、Cancer Genet Cytogenet、55：
1-9）、免疫不全症候群血管拡張性失調症（AT）に関連した急性および慢性白血
病（ラッソー他、1988、Cell、53：137-１４4：ラッソー他、1989、Proc Natl Ac
ad Sci USA、86：602-606）、および成人Ｔ細胞白血病（バージリオ他、1993、P
NAS、90：9275-9279）を含む、しかしこれらに限られないいくつかの成熟型Ｔ細
胞白血病に関連している。AT関連転座のいくつかの例において、１４ｑ３２．１
バンドに関係したＴ細胞白血病およびリンパ腫において、１４ｑ３２．１中に異
常を持つ細胞のクローン性拡張が顕性悪性腫瘍の発生の前にいくつかの例におい
て記録されている（ラッソー、他、1988、Cell、35：137-１４4）。したがって、
Ｔｃｌ−１ｂポリヌクレオチド、そのＴｃｌ−１ｂ蛋白質生成物およびそれへの
抗体は上述の疾患、またＴＣＬ−１ｂ遺伝子座に関連した染色体転座および逆位
に関連したその他の障害、そして／またはＴｃｌ−１ｂＲＮＡや蛋白質の発現
増加に対する診断、治療／予防目的に使われる。Ｔｃｌ−１ｂポリヌクレオチド
、そのＴｃｌ−１ｂ蛋白質生成物およびそれへの抗体はそれ自身のみで治療／予
防目的に使われるか、またはその他のＴ細胞白血病の治療に役立つ治療薬と組み
合わせて使われる。この分子はまた、種々のＴＣＬ−１ｂ遺伝子発現関連の容態
、疾患および障害の検出、治療後経過予測、診断またはモニター、またはそれら
の治療をモニターするためのイムノアッセイ等の診断アッセイにも使われる。よ
って、具体例において、この組織におけるＴ細胞悪性腫瘍または前癌変化は、類
似する非悪性試料（その患者からまたは他の人から実験的に測定されるか、この
試料における標準レベルとして公知のもの）におけるＴｃｌ−１ｂ発現レベルと
比較して、患者試料におけるＴｃｌ−１ｂ発現の増加を検出することによって診
断される。診断目的のために、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子発現やＴ細胞白血病やリンパ
腫のような疾患状態におけるＴＣＬ−１ｂ遺伝子の発現増加の検出に使われる。
治療目的のために、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質はＴｃｌ−１ｂ活動を中和する抗ＴＣＬ
１ｂ抗体を作るために使われる。本発明の範囲にはＴＣＬ−１ｂＲＮＡや蛋白
質の発現を抑制するように機能するアンチセンスＲＮＡやＤＮＡ分子とリボザイ
ムを含むオリゴヌクレオチド配列も含まれる。

【０１０５】診断用途下記に示すように、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列はＴＣＬ−１ｂ遺伝子座のまわり
の１４番染色体転座および逆位に関連した疾患状態に関連しており、選択的にT
およびBリンパ球分化に初期に発現し、また１４番染色体の逆位、inv(14)(q11;q
32)を持つT-PLLを診断された患者またはt(14:14)(q11;q32)染色体転座を持つ患
者からの細胞に高レベルの発現を示す。よって、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列（配列
番号:１１）は１４番染色体のＴＣＬ−１ｂ遺伝子座に関係する染色体異常、つま
り転座、逆位および欠失、の結果として起こる疾患の検出のための治療用途を持
つ。配列番号:９の少なくとも８のヌクレオチド、少なくとも１５のヌクレオチ
ド、少なくとも２５のヌクレオチド、少なくとも５０のヌクレオチド、少なくと
も１００のヌクレオチド、少なくとも２００のヌクレオチド、少なくとも３００
のヌクレオチド、または少なくとも３８７のヌクレオチドから１３２４までのヌ
クレオチドのＴＣＬ−１ｂヌクレオチド配列を含む核酸はＴＣＬ−１ｂ遺伝子（
配列番号:１１）の検出および測定のためのハイブリダイゼーション検査におけ
るプローブとして使われる。５キロベース以下の、１０キロベース以下の、２５
キロベース以下の、５０キロベース以下の、または７０キロベース以下のＴＣＬ
−１ｂ遺伝子に交雑可能な核酸、ｃＤＮＡ、または相補ストランドがＴＣＬ−１
ｂヌクレオチド配列の検出および測定のためのハイブリダイゼーション検査にお
けるプローブとして使われる。例として、ＴＣＬ−１ｂＤＮＡ配列は、例えば、
Ｔｃｌ−１ｂ発現の異常を診断するために患者の試料のインシチューハイブリダ
イゼーション検査を含むサザンまたはノーザン分析のような、ハイブリダイゼー
ション検査において使われる。ハイブリダイゼーション検査はＴｃｌ−１ｂ発現
の迷入変化や上記の活動に関連したＴ細胞悪性腫瘍のような容態、障害または疾
患状態を検出、治療後経過予測、診断またはモニターするために使われる。特に
、このハイブリダイゼーション検査はハイブリダイゼーションが起こりうる条件
下において、ＴＣＬ−１ｂＤＮＡまたはＲＮＡに交雑可能な核酸プローブを持
つ核酸を含む試料への接触、そして結果として起こるハイブリダイゼーションを
検出または測定することを含む方法によって行なわれる。特に、ハイブリダイゼ
ーション検査は、患者の試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをＴｃｌ−１ｂプロ
ーブと交雑させて結果として起こるハイブリダイゼーションの量を測定して、Ｔ
ｃｌ−１ｂｍＲＮＡの発現増加と関連した異常の存在を検出するために使われ
る。例えば、使われる検査法には、ノーザン法、ドット法、逆転写ＰＣＲ等が含
まれるが、これらに限られない。好ましいハイブリダイゼーション検査は、図Ｘ
に示す、少なくとも１５から全長ｃＤＮＡ配列（配列番号:９）までのポリヌク
レオチドのＴＣＬ−１ｂ遺伝子プローブを使って行なう患者の試料のノーザン法
である。別の好ましいハイブリダイゼーションアッセイは抗ＴＣＬ−１ｂ抗体ま
たはＴＣＬ−１ｂヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使う、患者の
試料のインシチューハイブリダイゼーション分析である。これらの技法はその技
術において公知であり、実際多くの市販の診断キットのベースとなっている。

【０１０６】ここで使われている患者試料には、インシチューハイブリダイゼーション検査
において使われる新鮮または凍結組織試料；Ｔリンパ球を含む細胞または組織試
料、そして、概して、ＴＣＬ−１ｂ核酸を測定または定量するアッセイ（検査）
に使われる末梢血リンパ球（PBL）やTリンパ球のような核酸を含む患者試料を含
むが、これらに限られない。

【０１０７】プライマー依存性核酸増幅法におけるプライマーとして役立つ少なくとも８か
ら２５のヌクレオチドを含むＴｃｌ−１ｂのポリヌクレオチド配列は、患者試料
におけるＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列の検出に使われる。本発明に役立つプライマー
依存性核酸増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、競合性ＰＣＲ、周
期性プローブ反応、そしてリガーゼ連鎖反応が含まれるが、これらに限られない
。これらの技法は当業者に公知である。本発明の好ましい核酸増幅法は逆転写Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である（シーバート他、1992、Nature、359：557-558）。

【０１０８】本発明の特定の一具体例において、プライマー依存性核酸増幅法で使われる一
対のプライマーのそれぞれのプライマーはゲノムＴＣＬ−１ｂヌクレオチド配列
の異なるエクソンから選択される。例えば、一対のプライマーの第一のプライマ
ーがＴＣＬ−１ｂゲノム配列のエクソン1から選択されれば、第二のプライマー
はそのＴＣＬ−１ｂゲノム配列のエクソン2、3または4から選択されることになる
。別な一例として、一対のプライマーの第一のプライマーがＴＣＬ−１ｂゲノム
配列のエクソン2から選択されれば、第二のプライマーはそのＴＣＬ−１ｂゲノ
ム配列のエクソン1、3または4から選択されることになる。プライマー依存性核酸
増幅法で使われる一対のプライマーのそれぞれのプライマーが異なるエクソンか
ら選択されることによって、増幅ゲノムヌクレオチド配列は、結果として生ずる
増幅配列のサイズの差異のために、増幅ｃＤＮＡヌクレオチド配列から区別され
る。結果として生ずる増幅ゲノムヌクレオチド配列は増幅イントロン配列を含む
ことになるので、増幅イントロン配列を含まない増幅ｃＤＮＡヌクレオチド配列
より大きなサイズとなる。ｃＤＮＡヌクレオチド配列の増幅のためには、プライ
マー配列は検出可能な増幅ヌクレオチド配列を与えるために充分に離れたエクソ
ン配列から選択されるべきである。

【０１０９】本発明のＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列（配列番号:９および１１）は１４番染色体
異常、特に１４ｑ３２．１における転座t(14:14)(q11:q32)およびinv(14)(q11;q3
2)逆位を検出するために診断的に使われる。よって、本発明は、８から２５のヌ
クレオチドの、好ましくは１８から２５のヌクレオチドの、配列番号:１１または
配列番号:９のヌクレオチド配列に相補的な第一プライマー、およびＴＣＬ−１
ｂ遺伝子にテロメア側またはセントロメア側の領域に相補的な、そして増幅標的
配列の存在が異常を指摘するような結果的産物である増幅標的配列を検出する第
二のプライマーを使って試料における標的配列を増幅する段階を含む、試料にお
いて１４番染色体異常を示すまたは含む標的配列を検出する過程を提供する。本
発明はまた増幅標的配列の存在が患者におけるＴ細胞悪性腫瘍の存在を指摘する
ような上述の方法に従って１４番染色体異常を検出することによって患者におけ
る１４番染色体異常に関連したＴ細胞悪性腫瘍の診断法を提供する。結果として
生ずる増幅標的配列はゲル電気泳動法で検出され、１４番染色体異常を含まない
正常試料または標準と比較される。上述のバージリオ他はポリヌクレオチド配列
が第二プライマーとして有用であることを開示している。その他の第二プライマ
ーとして有用なポリヌクレオチド配列はＴ細胞レセプター.alpha./.delta.遺伝
子座、Ｔ細胞レセプター.beta.鎖、または、１４番染色体異常が逆位関連なら、
ＴＣＬ−１ｂ遺伝子のポリヌクレオチド配列5'からエクソン1まで、または、染色
体異常が転座関連なら、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子のポリヌクレオチド配列３'から３'
イントロンまでから選ばれる。ゲノムＤＮＡ標的配列の増幅には長ＰＣＲ生成物
の生成が必要なことがある。長ＰＣＲ生成物のＰＣＲ生成技法はScience（1994
）263：1564-1565に記述されている；長ＰＣＲ生成物生成ＰＣＲキットはパーキ
ンエルマーおよびタカラ酒造株式会社から市販されている。本発明はまた少なく
とも配列番号:１１のヌクレオチド配列の一部に相補的な15-1324のヌクレオチド
の範囲を含む、１０キロベース以下の核酸プローブを持つ試料を交雑する、そし
て試料内におけるプローブと標的配列との間の結果として生ずるハイブリダイゼ
ーションの量を検出または測定する段階を含む、核酸試料中に少なくとも１４番
染色体異常の一部を指摘または包含する標的ヌクレオチド配列を検出する方法を
提供する。結果として生ずる増幅標的配列はゲル電気泳動法で検出され、１４番
染色体異常を含まない正常試料または標準と比較される。本発明はまた、患者に
おいて増幅標的配列の存在がＴ細胞悪性腫瘍の存在を指摘する上述の方法に従っ
て該１４番染色体異常を検出することによって患者における１４番染色体異常関
連Ｔ細胞悪性腫瘍の診断法を提供する。ハイブリダイゼーションプローブと標的
配列の間の絶対相補性は、好ましくはあるが、要求されていない。ここで言う「
少なくとも一部に相補的」な配列とは、核酸と交雑して安定ハイブリダイゼーシ
ョン複合体を形成するに充分な相補性を持つ配列を意味する。交雑能力は相補性
の度合いと核酸の長さの両方に依存する。概して、交雑核酸が長いほどＴｃｌ−
１ｂＲＮＡとのベースミスマッチも多いが、それでも安定二重鎖を形成する（
または、場合によって、三重鎖を形成する）。当業者は交雑複合体の融点を測定
する標準手法を用いてミスマッチの許容度を確認することができる。

【０１１０】本発明のさらに別な一面はＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列およびＴｃｌ−１ｂ蛋白質
の検出または測定用の診断キットに関係する。よって、本発明は、１０キロベー
ス以下のそして配列番号:９のヌクレオチド配列またはその相補体の15-1324ヌク
レオチドの範囲を含むプローブを含む容器中の化合物を含む診断キットを提供す
る。あるいは、本発明は、一つまたはそれ以上の容器中に、少なくともプライマ
ーの一つは配列番号:９またはその相補体に交雑可能である少なくとも8-25ヌク
レオチドの一対のプライマーを含み、そのプライマーは増幅反応においてｃＤＮ
Ａ合成をプライムすることのできる診断キットを提供する。本発明はまたプライ
マーの一つが配列番号:９またはその相補体に交雑可能であり、プライマーの一
つがＴＣＬ−１ｂ遺伝子にテロメア側またはセントロメア側に局在するＤＮＡ配
列に交雑可能である診断キットを提供する。特定の一具体例において、前述の容
器の化合物の一つは検出可能に標識表示されている。

【０１１１】本発明の増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応、競合ＰＣＲおよび競合逆転写ＰＣ
Ｒ（クレメンティ他、1994、Genet Anal Tech Appl、11(1):1-6およびシーバート
他、1992、Nature、359：557-558）；ハイブリッドＲＮＡ/ＤＮＡプローブとＲ
ＮＡseを使った標的配列の増幅を許す周期的プローブ反応（ID Biomedical）；
リガーゼ連鎖反応（ウー他、1989、Genomics、4：560-569）である。特定の一具
体例において、1992年11月12日付けPCT Publication No．WO/92/19775に記述さ
れたように、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子座関連染色体異常が検出されている。特定の一
具体例において、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使われたＴｃｌ−１
ｂプローブが検出可能に標識表示されている。この標識はその技術において公知
の任意のもので、放射（性同位元素による）標識、蛍光標識、ビオチン、化学発
光標識等を含むが、これらに限られない。

【０１１２】アッセイ（検査）がプライマーを使う特定の一具体例において、少なくとも一
つのプライマーは検出可能に標識表示されている。別の一具体例において、プラ
イマー対の一つが捕獲に備える部分、つまり磁気ビードに取り付けられている。

【０１１３】抗ＴＣＬ−１ｂ抗体は生成され、患者の試料におけるＴｃｌ−１ｂ蛋白質生成
物の存在を検出することによって１４番染色体異常関連疾患状態を同定するため
に診断的に使われる。Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質配列の検出のために、本発明の診断キ
ットは一つまたはそれ以上の容器中に選択的に検出可能に標識表示されている抗
ＴＣＬ−１ｂ抗体を含む。異なる一具体例において、キットは容器に入れた標識
表示された特定の抗体の結合部を含むことができる。ここでの使用において検出
可能な標識とは直接的または間接的に検出可能な信号を与える標識のことで、例
えば、酵素、放射性標識化分子、蛍光性分子、粒子、化学発光物、酵素基質また
はコファクター、酵素阻害剤、または磁気粒子を含む。本発明において検出可能標
識として有用な酵素の例にはアルカリフォスファターゼとわさび大根ペルオキシ
ダーゼがある。対象蛋白質に検出可能な標識を付ける方法は色々あり、例えば、
対象蛋白質への例えばわさび大根ペルオキシダーゼのような酵素の添付のための
4、4'-ジフルオロ-3、3'-ジニトロフェニルサルフォンのような二官能剤の使用
がある。添付酵素はその後検出可能な反応生成物を産する基質と反応させる。本
発明は、免疫特異結合が起こるような条件下で抗ＴＣＬ−１ｂ抗体を持つ患者試
料に接触し、抗体による免疫特異結合の量を検出または測定することによって患
者試料におけるＴｃｌ−１ｂ蛋白質を検出する方法を提供する。

【０１１４】試料はＴｃｌ−１ｂ蛋白質を含む患者からの任意の試料で、例えば、組織の一
部、末梢血リンパ球等がある。疾患状態の診断において、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質、
誘導体、そして類似体の機能的活動は種々の方法のアッセイで検定される。従っ
て、本発明はまた、正常な個体からの相似試料におけるレベルと比べてＴｃｌ−
１ｂ蛋白質レベルが高いことが患者におけるＴ細胞悪性腫瘍の存在を指摘する場
合に、患者からの試料にＴｃｌ−１ｂ蛋白質発現増加を検出することによって、
患者における１４番染色体異常関連Ｔ細胞悪性腫瘍を診断する方法を提供する。

【０１１５】例えば、抗ＴＣＬ−１ｂ抗体への結合のアッセイによってＴｃｌ−１ｂ蛋白質
を検出または測定する一具体例において、種々のこの技術で公知のイムノアッセ
イが使われる。これらには、ラジオイムノアッセイ、ELISA（エンザイムリンク
ドイムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジ
オメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー
イムノアッセイ（例えばコロイド金、酵素または放射性同位元素による標識の
使用）ウエスタン法、インサイチューハイブリダイゼーション、沈降反応、凝集
反応アッセイ（例：ゲル凝集反応アッセイ、ヘマグルチネーションアッセイ）、
相補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、蛋白質Aアッセイ、および免疫電気泳
動アッセイ等を含むが、これらに限られない。一具体例において、一次抗体に標
識を検出することによって抗体結合が検出されている。別の一具体例において、
二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって一次抗体を発見
している。さらに別の一具体例において、二次抗体が標識表示されている。その
技術においてイムノアッセイにおける結合検出のための多くの手段が公知であり
、それらは本発明の範囲に属するものである。特にこのイムノアッセイは、免疫
特異な結合が起こる条件下において抗ＴＣＬ−１ｂ抗体を持つ患者から誘導した
試料に接触し、その抗体による免疫特異な結合の量を検出または測定する方法で
行なわれる。特定の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質のレベル増加が疾患
状態の指標であるとき、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質の存在の検定のためにＴｃｌ−１ｂ
蛋白質への抗体が患者の組織や血清のアッセイに使われている。本発明の一具体
例において、患者試料の免疫細胞化学法によってＴｃｌ−１ｂ蛋白質を検出また
は測定している。別の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂ発現増加関連疾患の療法
のモニターのためにＴｃｌ−１ｂ蛋白質またはＲＮＡのレベルを測定するアッセ
イを使っている。例えば、治療前に比べてＴＣＬ−１ｂＲＮＡまたは蛋白質のレ
ベルが治療後に下がっているということはその治療法への好ましい反応を指摘し
ている。治療後にレベルが上がっているようなら、治療への反応がよくないこと
を示す。

【０１１６】別の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質またはＲＮＡ発現のレベルが疾患
を表現させるために使われている。つまり、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質またはＲＮＡ発
現増加が疾患の悪化を指摘している。その他の方法は専門家に公知のものであり、本発明の範囲に属するものである。

【０１１７】治療／予防用途Ｔｃｌ−１ｂの阻害剤は特に１４ｑ３２．１における１４番染色体異常そして
／またＴｃｌ―１ｂ蛋白質発現増加に関連した疾患の治療のための治療用途で使
われる。本発明の一具体例において、Ｔｃｌ―１ｂ蛋白質そして／またはＴｃｌ
−１ｂ蛋白質を発現する細胞系はＴｃｌ−１ｂ蛋白質に結合してＴｃｌ−１ｂ蛋
白質の作動薬または拮抗薬として働き得る抗体、ぺプチド、またはその他の分子
のスクリーニングに使われる。例えば、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質の活動を中和できる
抗ＴＣＬ−１ｂ抗体は、Ｔ細胞白血病やリンパ腫のような１４番染色体異常やＴ
ｃｌ−１ｂ蛋白質の発現に関連した疾患状態を抑制または予防するために使われ
る。従って、本発明は、１４番染色体関連疾患状態を患う哺乳類に治療効果のあ
る量の抗ＴＣＬ−１ｂ抗体を与えることによって１４番染色体関連疾患状態を患
う哺乳類において１４番染色体関連疾患状態を治療する方法を提供する。あるい
は、組換えＴｃｌ−１ｂ蛋白質を持つ有機またはペプチドライブラリーのスクリ
ーニングはＴｃｌ−１ｂ蛋白質の活動を抑制するように機能する治療性分子の同
定に有用である。当業者にとって日常的と思われている数々の方法において合成
および天然生成物をスクリーニングする。

【０１１８】抗体、ペプチド、またはその他の分子のＴｃｌ−１ｂ蛋白質の効果を変調させ
る能力をモニターする。例えば、本発明のＴＣＬ−１ｂヌクレオチド配列、Ｔｃ
ｌ−１ｂ蛋白質配列、その誘導体または類似体、またはそれへの抗体からなる治
療性組成物の投与以前、以後両方において、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子配列またはＴｃ
ｌ−１ｂ蛋白質配列は上述のように検出される。

【０１１９】ＴＣＬ−１ｂポリヌクレオチドは、Ｔ細胞白血病やリンパ腫のような種々の１
４番染色体関連疾患状態、そして／またはＴｃｌ−１ｂ蛋白質の発現増加の治療
に有用である。ＴＣＬ−１ｂアンチセンス遺伝子配列を細胞に導入することによ
って、ＴＣＬ−１ｂ遺伝子の過剰発現に関連した容態の治療に遺伝子療法が使わ
れる。従って、本発明は、１４番染色体関連疾患状態を患う哺乳類に治療効果の
ある量のＴＣＬ−１ｂアンチセンス分子を与えることによって１４番染色体関連
疾患状態を患う哺乳類において１４番染色体関連疾患状態を治療する方法を提供
する。

【０１２０】アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子そしてリボザイムを含む、そしてＴＣＬ
−１ｂｍＲＮＡの翻訳を抑制するように機能するオリゴヌクレオチド配列は、
本発明の範囲に属するものである。ここで使われる「アンチセンス」とは、何ら
かの配列相補性のお陰でＴＣＬ−１ｂＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）の一部
に交雑可能な核酸のことである。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は標的ｍ
ＲＮＡに結合して蛋白質翻訳を予防することによって直接ｍＲＮＡの翻訳を妨げ
るように働く。アンチセンスＤＮＡに関して、ＴＣＬ−１ｂヌクレオチド配列の
翻訳開始部位、つまりー１０と＋１０の間の領域から誘導されたオリゴデオキシ
リボヌクレオチドが好ましい。本発明は、ＴＣＬ−１ｂｍＲＮＡに交雑可能な
Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質のコード配列の少なくとも一部に相補的な核酸配列を含むア
ンチセンス分子を提供する。本発明はまた、ＴＣＬ−１ｂコード配列（配列番号
：１１）に交雑するノンコーディング配列（配列番号：１１）の少なくとも一部
に相補的な核酸配列を持つアンチセンス分子を提供する。本発明の好ましい一具
体例において、アンチセンス配列はＴＣＬ−１ｂ遺伝子の５‘ノンコーディング
配列から誘導される。本発明の特に好ましい一具体例において、アンチセンス配
列は配列番号：９から誘導される。

【０１２１】リボザイムはＲＮＡの特定の分割を促進させることのできる酵素ＲＮＡ分子で
ある。リボザイム活動のメカニズムはリボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配
列特異なハイブリダイゼーションに関係し、その後に塩基配列特異的な分割が起
こる。本発明の範囲に属するのは、Ｔｃｌ−１ｂＲＮＡ配列の塩基配列特異的
な分割を特異にそして効率的に促進させるハンマーヘッドモチーフリボザイム分
子である。

【０１２２】任意の潜在ＲＮＡ標的内の特定なリボザイム分割部位は、最初、ＧＵＡ、ＧＵ
Ｕ、そしてＧＵＣの配列を含むリボザイム分割部位を求めて標識分子をスキャン
することによって同定される。同定したら、分割部位を含む標的遺伝子の領域に
対応する１５から２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、そのオリゴヌク
レオチド配列を不適切なものとし得る二次構造のような予測された構造に関して
評価する。標的候補の適切性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使って、
その候補の相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近可能
性を検査することによっても評価できる。

【０１２３】本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子またリボザイムはどちらもＲＮ
Ａ分子合成法としてその技術において公知の任意の方法で調製される。これらに
はその技術において公知の固相フォスフォラミジト化学合成のようなオリゴデオ
キシリボヌクレオチドを化学合成する技法が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は
アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転
写によって生成される。このＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモ
ーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り入れる多種多様な
ベクターに取り入れられる。あるいは、使われるプロモーターによって、アンチ
センスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が細
胞系に安定して導入される。

【０１２４】細胞内安定性および半減期を増加させる手段として種々のＤＮＡ分子修飾が導
入される。修飾の例には、リボまたはデオキシヌクレオチドの側防配列の分子の
５’および／または３’末端への追加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド
バックボーン内でのフォスフォジエステラーゼ連鎖に代わるフォスフォロチオア
ートまたは２’Ｏ−メチル連鎖の使用が含まれるが、これらに限られない。

【０１２５】核酸を細胞または組織内に導入する方法には、裸核酸の挿入、つまり組織内へ
の注射のような核酸のインビトロ導入法、核酸の細胞へのエクスビトロ導入法、
ウイルス、レトロウイルス、ファージまたは原形質等のベクターの使用、または
インビボまたはエクスビボで使われる電気穿孔法のような技法を含む。

【０１２６】その他の方法はその技術の専門家に公知であり、本発明の範囲に属するもので
ある。

【０１２７】治療または予防用途の供覧本発明のＴＣＬ−１ｂポリヌクレオチド、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質生成物、その誘
導体および類似体、そしてそれへの抗体は好ましい治療または予防活動に関して
インビボに検査される。例えば、これらの化合物は人間において検査する前に、
ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む、しかしこれらに限ら
れない適切な動物モデル系において検査される。インビボ検査では、人間への投
与の前にその技術で公知の任意の動物モデル系が使われる。

【０１２８】治療／予防方法および組成物本発明は、被験者への有効量の治療薬、つまり本発明のＴＣＬ−１ｂポリヌク
レオチド、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質、その誘導体または類似体、またはそれへの抗体
の投与によって治療および予防法を提供する。好ましい一面において、その治療
剤は実質的に精製されている。被験者は好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ニ
ワトリ等の動物を含むが、それらに限られない。また、好ましくは哺乳類であり
、もっとも好ましくは人間である。

【０１２９】本発明の治療剤の投与にあたって、種々の送出系が公知であり、使われる。例
えば、リポソーム内のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、組換え細胞によ
る発現、レセプター媒介エンドサイトーシス（参照例：ウーおよびウー、１９８
７、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ、２６２：４４２９―４４３２）、レトロウイルス性
またはその他のベクターの一部としての治療用核酸の構築等がある。導入法には
、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口経路が含まれるが
、これらに限られない。化合物は任意の便利な経路、例えば、注入または大量注
射、上皮または粘膜皮膚内層を通した吸収（例：口腔粘膜、直腸および腸管粘膜
等）で投与され、その他の生物学的活性剤と共に投与される。投与は全身性また
は局所性である。また、本発明の薬剤組成物は、心室内および髄腔内注射を含む
任意の適切な経路で中枢神経系に導入することが望ましい；心室内注射には例え
ばオマヤレザバーのようなレザバーに取り付けられた心室内カテーテルが役立つ
。

【０１３０】特定の一具体例において、本発明の薬剤組成物を治療を要する個所に局所的に
投与することが望ましい；これには、例えば、限定するわけではないが、手術中
の局所的注入、手術後の塗布、例えば、傷への包帯と共に行なうもの、注射、カ
テーテル、坐剤、または移殖によるものがあり、該移殖は多孔性、無孔性、また
はゲル状物質のもので、シアラスティック膜のような膜や繊維を含む。一具体例
において、投与は悪性腫瘍または腫瘍性または前腫瘍性組織の部位（または以前
の部位）に直接注射で行なわれる。

【０１３１】治療剤が蛋白質治療剤をコードする核酸である特定の一具体例において、その
核酸は、それを適当な核酸発現ベクターの部分として構築しそれが細胞内性にな
るように投与することによってそのコードされた蛋白質の発現を促進するように
、インビボで投与される。その方法の例としては、レトロウイルス性ベクターの
使用による（参照：米国特許番号４、９８０、２８６号）、または直接注射によ
る、または微粒子照射による（例：遺伝子銃；バイオリスティック、デュポン）
、またはリピドまたは細胞表面レセプターまたはトランスフェクティング剤でコ
ートすることによる、または核に入ると知られているホメオボックス風ペプチド
への結合において投与することによる（参照例：ジョリオット他、１９９１、Ｐ
ｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８８：１８６４―１８６８）等があ
る。あるいは、核酸治療剤は細胞内的に導入され、相同性組換えによって宿主細
胞ＤＮＡに発現のために取り入れられる。

【０１３２】本発明はまた薬剤組成物を提供する。この組成物は治療効果のある量の治療剤
と薬剤的に容認できる担体または医薬品添加物を含む。この担体は食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、そしてそれらの組み
合わせを含むがこれらに限られない。担体と組成物は無菌である。製剤は投与の
様式に適合しなければならない。

【０１３３】望むなら、この組成物は少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含む
ことができる。この組成物は液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、カプセル、持続放
出性製剤、または粉末である。この組成物はトリグリセリドのような従来の結合
剤および担体を使って坐剤に形成される。経口製剤には薬剤グレードのマニトー
ル、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム糖、セルロ
ース、炭酸カルシウム等の標準担体が含まれる。

【０１３４】好ましい一具体例において、この組成物は人間への静脈内投与に適応する薬剤
組成物として日常的手法に従って形成される。典型的に、静脈内投与用の組成物
は無菌等張性水様緩衝剤中の溶液である。必要な場合は、この組成物は可溶化剤
と、注射部位の痛みを和らげるためのリドカインのような局所麻酔も含む。概し
て、処方成分は別々にまたは混合して単位投与量ごとに、例えば、アンプルや活
性成分の量を示したプラスチック袋のような密封容器中に凍結乾燥粉末または無
水濃縮物として供給される。この組成物が注入によって投与されるときは、無菌
の薬剤グレードの水または食塩水をふくむ注入瓶に調剤される。この組成物を注
射で投与するときは、処方成分を投与前に混合されるようにアンプル入りの注射
用無菌水または食塩水を与える。

【０１３５】本発明の治療剤は中性または塩類の形で形成する。薬剤的に許容できる塩類に
は塩酸、燐酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるような遊離アミノ基、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニア、水酸化カルシウム、水
酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２―エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導されるような遊離カルボキシル基を使
って作るものが含まれる。

【０１３６】本発明の治療剤の特定の障害または容態の治療に有効な量はその障害または容
態の性質に依り、標準的臨床技法で決められる。またインビトロアッセイも最適
投与量範囲の同定のために使われる。製剤に使われる精密な投与量はまた投与の
経路および疾患または障害の状態レベルにも依存し、担当医師の判断およびそれ
ぞれの患者の状況によって決定するべきである。しかし、静脈内投与の適切な用
量範囲はふつう体重１キログラムあたり２０―５００マイクログラムの活性化合
物である。鼻腔内投与の適切な投与量は体重１キログラムあたり０．０１ｐｇか
ら１ｍｇである。効果的用量はインビトロまたは動物モデル検査系から誘導した
用量反応曲線から推定する。

【０１３７】坐剤は概して体重１０キロに対して０．５％の範囲の活性成分を含む。経口製
剤は好ましくは１０％から９５％の活性成分を含む。

【０１３８】本発明はまた本発明の薬剤組成物の単一または複数の成分を詰めた単一または
複数の容器を含む薬剤パックまたはキットを提供する。選択的にこの容器に関連
するのは薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を制御する政府担当局
によって決められた型の通知であり、この通知は人間への投与用としての製造、
使用または販売を承認するものである。

【０１３９】ＴＣＬ−１ｂ遺伝子発現のアンチセンス調節本発明はＴＣＬ−１ｂ遺伝子（配列番号：１１）またはｃＤＮＡ（配列番号
：９）コードされるＴｃｌ−１ｂ蛋白質またはその一部にアンチセンスである少
なくとも六個のヌクレオチドの核酸の治療または予防用途における使用を提供す
る。このアンチセンス核酸は本発明の拮抗薬治療剤としての有用性があり、例え
ば上述のＴ細胞悪性腫瘍のような障害の治療または予防に使われる。

【０１４０】本発明のアンチセンス核酸は二本鎖または一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそ
れらの修飾体または誘導体であるオリゴヌクレオチドであり、細胞に直接投与可
能であり、または外因性誘導配列の転写によって細胞内で生成される。

【０１４１】特定の一具体例において、現在の発明によって提供されるＴＣＬ−１ｂアンチ
センスポリヌクレオチドは特に１４ｑ３２．１における１４番染色体異常に関連
した疾患状態の治療に使うことができ、その時その疾患状態がＴＣＬ−１ｂ遺伝
子を発現することを供覧する（インビトロまたはインビボ）ことができる。この
供覧はＴＣＬ−１ｂＲＮＡまたはＴｃｌ−１ｂ蛋白質の検出によって行なうこ
とができる。

【０１４２】本発明はまた上述のように薬剤的に許容される担体中における効果的用量の本
発明のＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸を含む薬剤組成物を提供する。Ｔ細胞悪性
腫瘍のような１４番染色体関連疾患状態の、本発明の薬剤組成物投与を含む治療
法および予防法もまた提供する。

【０１４３】別の一具体例において、本発明は、その細胞に有効量の本発明のアンチセンス
ＴＣＬ−１ｂ核酸を含む組成物を与えることによって、原核細胞または真核細胞
におけるＴＣＬ−１ｂ核酸配列の発現を抑制する方法に向けられている。

【０１４４】ＴＣＬ−１ｂアンチセンスポリヌクレオチドは少なくとも６のヌクレオチド、
好ましくはオリゴヌクレオチド（６から５０のオリゴヌクレオチドの範囲）から
なるものである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０の
ヌクレオチド、少なくとも２０のヌクレオチド、少なくとも３０のヌクレオチド
、または少なくとも４００のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは一本鎖
または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物または誘導体または修飾
版である。オリゴヌクレオチドは基部、糖部、または燐酸塩のバックボーンで修
飾される。オリゴヌクレオチドには、ペプチド、または細胞膜を越えた輸送の促
進剤（参照例：レッツィンガー他、１９８９、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳ
ｃｉＵＳＡ、８６：６５５３―６５５６；レメトリ他、１９８７、ＰｒｏｃＮ
ａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８４：６４８―６５２；ＰＣＴＰｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ８８／０９８１０、１９８８年１２月１５日発行）ま
たは血液脳関門（参照例：ＰＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＮｏ．ＷＯ８９／
１０１３４、１９８８年４月２５日発行）、ハイブリダイゼーション誘発式分割
剤（参照例：クロール他、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５
８―９７６）または化学架橋形成剤（参照例：ゾン、１９８８、ＰｈａｒｍＲｅ
ｓ、５：５３９−５４９）等、その他の付属基を含むこともある。

【０１４５】オリゴヌクレオチドは別の一分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーショ
ン誘発式架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発式分割剤等に接合する。

【０１４６】本発明のオリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成装置（バイオサーチ
、アプライドバイオシステムズ等から市販されているようなもの）のようなその
技術で公知の標準法で合成される。例として、フォスフォロチオアートオリゴは
スタイン他（１９８８、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ. １６：３２０９）の方
法で合成され、メチルフォスフォネートオリゴは制御細孔グラスポリマーサポー
ト（サリン他、１９８８、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、８５：
７４４８−７４５１）を使って調製される。

【０１４７】特定の一具体例において、Ｔｃｌ−１ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドは触
媒ＲＮＡ、またはリボザイム（参照例：ＰＣＴＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰ
ｕｂｌｉｃａｔｉｏｎＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４日発行；サ
ーバー他、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５）を含む。
別の一具体例において、オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチ
ド（井上他、１９８７、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：６１３１−６１
４８）、またはキメラＲＮＡ-ＤＮＡ類似体（井上他、１９８７、ＦＥＢＳＬｅ
ｔｔ、２１５：３２７−３３０）である。

【０１４８】代替的一具体例において、本発明のＴｃｌ−１ｂアンチセンス核酸は細胞内で
外因配列からの転写によって生成される。例えば、ベクターをインビボに導入し
て細胞に取り入れ、その細胞内においてそのベクターまたはその一部が転写され
、よって本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このベクターはＴ
ｃｌ−１ｂアンチセンス核酸をコードする配列を含んでいるものである。このベ
クターは、望ましいアンチセンスＲＮＡを生成するように転写される限り、エピ
ソームのままでいてもよいし、または染色体統合をしてもよい。このベクターは
その技術で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築される。ベクターは哺乳類
の細胞での複製および出現に使われるプラスミド、ウイルス、またはその技術で
公知のその他のものである。Ｔｃｌ−１ｂアンチセンスＲＮＡをコードする配列
の発現は、その技術で哺乳類、好ましくはヒト細胞での活動が公知の任意のプロ
モーターによって行なわれる。このプロモーターは包括的または構成的なもので
ある。このプロモーターには、ＳＶ４０早期プロモーター領域（バーノイストお
よびチャムボン、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）、３’長ラ
ウス肉腫ウイルス末端重複に含まれるプロモーター（山本他、１９８０、Ｃｅｌ
ｌ、２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ワグナ
ー他、１９８１、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ、７８：１４４１−
１４４５）、メタロチオネイン遺伝子調節配列（ブリンスター他、１９８２、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２９６：３９４２）等があるが、これらに限られない。

【０１４９】本発明のアンチセンス核酸は少なくともＴＣＬ−１ｂ遺伝子、好ましくはヒト
ＴＣＬ−１ｂ遺伝子のＲＮＡ転写の一部に相補的な配列を含む。しかし、絶対相
補性は、好ましいが、要求されない。ここで言う「少なくともＲＮＡの一部に相
補的」な配列とは、ＲＮＡと交雑して安定二重鎖を形成するに充分な相補性を持
つ配列を意味する；二本鎖ＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡ
の一本鎖がそのために検査されるか、または三重形成がアッセイされる。交雑能
力は相補性の度合いとアンチセンス核酸の長さの両方に依存することになる。概
して、ハイブリダイズする核酸が長いほどＴＣＬ−１ｂＲＮＡとのベースミス
マッチも多いが、それでも安定二重鎖（または、場合によって、三重鎖）を形成
する。当業者は交雑複合体の融点を測定する標準手法を用いてミスマッチの許容
度を確認することができる。

【０１５０】ＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸はＴＣＬ−１ｂＲＮＡを発現すると示された
細胞型のＴ細胞悪性腫瘍を治療（または予防）するために使われる。この発現に
関して検査された悪性、腫瘍性、そして前腫瘍性細胞は、上述のものを含むが、
これに限られない。好ましい一具体例において、一本鎖ＤＮＡアンチセンスＴＣ
Ｌ−１ｂオリゴヌクレオチドが使われる。

【０１５１】ＴＣＬ−１ｂＲＮＡを発現する悪性（特に腫瘍）細胞型は、その技術で公知
の種々の方法で同定される。この方法には、ＴＣＬ−１ｂ特異核酸を使ったハイ
ブリダイゼーション（例：ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハ
イブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーションによるもの）、
インビトロでＴＣＬ−１ｂに翻訳される細胞型からのＲＮＡの能力観察等がある
が、これらに限られない。好ましい一面において、治療の前に、患者からの一次
腫瘍組織がＴＣＬ−１ｂ発現に関してアッセイされる。

【０１５２】薬剤的に許容される担体中に有効量のＴＣＬ-1ｂアンチセンス核酸を含む本発
明の薬剤組成物はＴＣＬ−１ｂＲＮＡを発現する型の悪性腫瘍を持つ患者に投
与される。

【０１５３】特定の疾患状態または容態の治療に効果的なＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸の
量はその疾患状態または容態の性質に依存し、標準臨床技法で決定される。可能
なら、治療する腫瘍型のアンチセンス細胞毒性をインビトロに、そして有用な動
物系で、人間における検査や使用の前に決定しておくことが望ましい。

【０１５４】特定の一具体例において、ＴＣＬｌ−１ｂアンチセンス核酸を含む薬剤組成物
はリポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルを用いて投与される。本発明の
種々の具体例において、これらの組成物を、ＴＣＬ−１ｂアンチセンス核酸の持
続放出性を実現するために使用することが、有用である。特定の一具体例におい
て、抗体を用いて特定の同定可能腫瘍抗原に標的を合わせたリポソームを使用す
ることが望ましい（レオネッティ他、１９９０、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
ＳｃｉＵＳＡ、８７：２４４８−２４５１；レネイセン他、１９９０、ＪＢｉ
ｏｌＣｈｅｍ、２６５：１６３３７―１６３４２）。

【０１５５】

【配列表】

【化１】

【０１５６】

【化２】

【０１５７】

【化３】

【０１５８】

【化４】

【０１５９】

【化５】

【０１６０】

【化６】

【０１６１】

【化７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｔｃｌ1、Ｔｃｌ−１ｂおよびＭｔｃｐ１の配列比較。同一性は黒
い四角、類似性は灰色の四角で示されている。ＴＣＬ１とＭｃｔｐのＧｅｎＢａ
ｎｋのアクセス番号はそれぞれX82240とZ24459である。

【図２】ＴＣＬ１およびＴＣＬ１ｂ遺伝子のゲノム構成。縦の矢印はクロー
ン化された１４ｑ３２．１の切断点を示す。BssHII (B)、ClaI (C)、EagI (E)、
SfiI (F)、KspI (K)、MluI (M)、NotI (N)、Nrul (R)およびSalI (S)には制限部
位がある。黒い長方形はＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂのエクソンを示す。

【図３】ＴＣＬ１およびＴＣＬ１ｂ遺伝子のノーザン分析。（Ａ）ヒト免疫
系ノーザン法。レーン1-6：脾臓；リンパ節；胸腺；末梢血白血球；骨髄；胎児
肝臓。（Ｂ）ヒト癌細胞系ノーザン法。レーン1-8：前骨髄球白血病、HL-60；ヒ
ーラ細胞；慢性骨髄性白血病、K-562；Ｔリンパ芽球性白血病、MOLT-4；バーキッ
トリンパ腫ラージ；結腸直腸腺癌、SW480；肺癌、A549；メラノーム、G361。（Ｃ
）レーン1-6：バーキットリンパ腫ラージ；バーキットリンパ腫ドーディ；バー
キットリンパ腫CA-46；SupT11；骨髄；胎盤。（Ｄ）レーン1：骨髄；レーン2-7
、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞系：Ado-１４71; Ado-１４76; Ado-1701; Ado-
1727; Ado-2069; Ado-2199; レーン8：CA-46。（Ａ-Ｄ）。上、ＴＣＬ１ｂプロ
ーブ；中、Ｔｃｌ1 プローブ；下、アクチンプローブ。

【図４】ＴＣＬ１とＴＣＬ１ｂ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ａ）正常なヒ
ト組織。レーン1-23：心臓；肝臓；脳；筋肉；胎盤；腎臓；肺；膵臓；脾臓；リ
ンパ節；胸腺；扁桃腺；末梢血白血球（PBL）；胎児肝臓；胎児脳；胎児肺；胎
児腎臓；胎児心臓；胎児骨格筋；胎児脾臓；胎児胸腺；陰性対照。（Ｂ）レーン
1-4、Ｔ細胞PLL試料：3047; 3046; 3050; 3048。レーン5-6：骨髄；PBL。（Ａ−
Ｂ）。上、ＴＣＬ１ｂプライマー；中、ＴＣＬ１プライマー；下、対照G3PDHプ
ライマー。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 35/02 ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６Ａ６１Ｐ 35/02 16/18 ４Ｃ０８７Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 ４Ｈ０４５ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者ピカースキー、ユリアメリカ合衆国、19111 ペンシルベニア州、フィラデルフィア、ヴェリーロード 8110、アパートエー307 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 BA45 CA04 EA04 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ43 QR55 QR62 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA21 CA53 NA14 ZB272 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB27 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA14 ZB27 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 CA41 DA76 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、前
記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列である分離核酸。
【請求項２】前記ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列配列番号：１０のアミ
ノ酸番号１〜１２８番目を持つヒトＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードする請求項１記
載の分離核酸。
【請求項３】少なくともＴｃｌ−１ｂ蛋白質フラグメントをコードする１８
ヌクレオチド部を含む５０キロベース以下の分離核酸。
【請求項４】少なくとも配列番号：１１に描写された配列の１８ヌクレオチ
ド部を含む５０キロベース以下の分離核酸。
【請求項５】ヌクレオチド配列配列番号：９の核酸番号１から１１５２番目
を含む請求項１記載の分離核酸。
【請求項６】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質。
【請求項７】アミノ酸配列配列番号：１０のアミノ酸１−１２８を含む請求
項６記載の分離Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質。
【請求項８】アミノ配列配列番号：１０のアミノ酸番号１から１２８番目を
持つ蛋白質のフラグメントをコードする配列を含み、そのフラグメントは抗体に
よってＴｃｌ−１ｂ蛋白質に特異的に結合できる分離核酸。
【請求項９】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含み、そ
のヌクレオチド配列はｃＤＮＡ配列である組換えＤＮＡベクター。
【請求項１０】請求項７記述の組換えＤＮＡベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】ヌクレオチド配列がアミノ配列配列番号：１０のアミノ酸番
号１から１２８番目を持つヒトＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードする請求項7記載の
組換えＤＮＡベクター。
【請求項１２】少なくとも配列番号：１１の５０ヌクレオチド部を含む５０
キロベース以下の分離核酸。
【請求項１３】ｃＤＮＡ配列配列番号：９に相補的なヌクレオチド配列に厳
しい条件下で交雑可能な分離核酸であり、前記核酸は少なくとも配列番号：９の
２５ヌクレオチド部を含む分離核酸。
【請求項１４】Ｔｃｌ−１ｂ核酸をコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌク
レオチド配列に厳しい条件下で交雑可能な分離核酸であり、その蛋白質はアミノ
酸配列配列番号：１０を持ち、前記核酸は少なくとも配列番号：９の２５ヌクレ
オチド部を含む分離核酸。
【請求項１５】少なくともＴｃｌ−１ｂ蛋白質のコード配列の一部に相補的
なヌクレオチド配列を含み、Ｔｃｌ−１ｂｍＲＮＡに交雑可能なアンチセンス分
子。
【請求項１６】前記ヌクレオチド配列は少なくとも配列番号：９に描写され
た配列の一部に相補的な請求項１５記載のアンチセンス分子。
【請求項１７】少なくとも非Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質配列に連鎖する１０アミノ
酸のＴｃｌ−１ｂ蛋白質配列を含む融合蛋白質。
【請求項１８】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質のエピトープに結合する抗体。
【請求項１９】少なくとも２５アミノ酸の近接配列の上に、配列番号：１０
に描写されたアミノ酸配列に少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を持つアミ
ノ酸配列を含む分離蛋白質。
【請求項２０】試料における１４番染色体異常を示す標的配列を検出する方
法であり、 a）ヌクレオチド配列配列番号：９に相補的な１８から２５分子の第一プライマ
ー、および好ましくはＴ細胞レセプターα／δ遺伝子座からの、前記ＴＣＬ−１
ｂ遺伝子にテロメアまたはセントロメアの領域に相補的な第二プライマーを使っ
て前記標的配列を増幅する；および b）前記増幅標的配列の存在が前記１４番染色体異常を指摘するような結果とし
て生じる標的配列を検出する段階を含む方法。
【請求項２１】前記１４番染色体異常はＴＣＬ−１ｂ遺伝子座にあり、ｔ（
１４:１４）（ｑ１１：ｑ３２）転座またはｉｎｖ（１４）（ｑ１１：ｑ３２）
逆位を含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】アミノ酸配列配列番号：１０のアミノ酸番号１から１２０番
目を持つヒトＴｃｌ−１ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を含む組換えベクタ
ーを含む宿主細胞。
【請求項２３】Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌ
クレオチド配列に厳しい条件下で交雑可能な核酸を含む組換えベクターを含む宿
主細胞であって、その蛋白質はアミノ酸配列配列番号：１０を持ち、前記核酸は
少なくとも配列番号：９の２５ヌクレオチド部を含む宿主細胞。
【請求項２４】
【請求項２５】薬剤的に許容可能な担体中に請求項１５および１６記載の前
記アンチセンス分子を含む薬剤組成物。
【請求項２６】薬剤的に許容可能な担体中に請求項１８記載の前記抗体を含
む薬剤組成物。
【請求項２７】核酸試料における１４番染色体異常を示す標的ヌクレオチド
配列を検出する方法であり、ａ）前記試料を前記ヌクレオチド配列配列番号：９に相補的な１５−１１５２ヌ
クレオチド範囲からなる１０キロベース以下の核酸プローブと交雑する；およびｂ）前記試料内における、結果として生じる前記プローブと前記標的配列との間
のハイブリダイゼーションを検出または測定する段階を含む方法。
【請求項２８】前記１４番染色体異常はＴＣＬ−１ｂ遺伝子座にあり、ｔ（
１４:１４）（ｑ１１：ｑ３２）転座またはｉｎｖ（１４）（ｑ１１：ｑ３２）
逆位を含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】患者試料、好ましくは人間の試料中に、Ｔｃｌ−１ｂ蛋白質
を検出する方法であって、ａ）免疫特異結合が起こるような条件下において前記患者試料に抗ＴＣＬ−１ｂ
抗体を持って接触し、ｂ）前記抗体による免疫特異結合の量をすべて検出または測定することを含む方法。
【請求項３０】それぞれ少なくとも１５−２５のヌクレオチドを持つ一対の
プライマーを一またはそれ以上の容器中に含む診断キットであって、少なくとも
前記プライマーの一つは配列番号：９またはその相補体に交雑可能で、前記プラ
イマーは核酸増幅反応におけるＤＮＡ合成をプライムできる診断キット。
【請求項３１】１４番染色体異常関連疾患状態を患う哺乳類、好ましくは人
間における前記１４番染色体異常関連疾患状態を治療する方法であり、前記哺乳
類に治療効果のある量のＴｃｌ−１ｂアンチセンス分子または抗ＴＣＬ−１ｂ抗
体を投与することを含む方法。
【請求項３２】前記疾患状態はＴ細胞白血病またはリンパ腫を含み、前記１
４番染色体異常はｔ（１４:１４）（ｑ１１：ｑ３２）転座またはｉｎｖ（１４
）（ｑ１１：ｑ３２）逆位を含む請求項３１記載の方法。