CN101296702B - 用于诊断或治疗bcl2相关癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中与BCL2基因和/或基因产物的过度表达相关的癌症的方法和组合物以及用于改进抗癌疗法例如化学疗法和放射疗法的方法和组合物。本发明还包括用于确定癌症疗法在受试者中的功效的方法和诱导细胞的凋亡的方法。

Description

用于诊断或治疗BCL2相关癌症的组合物和方法
发明者：Carlo M.Croce和George A.Calin
政府资助
本发明全部或部分由来自国家癌症研究所的基金号P01CA76259、P01CA81534和P30CA56036资助。政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及癌症的诊断特别是BCL2相关癌症的诊断。本发明还包括用于治疗与BCL2基因和/或基因产物的过度表达相关的癌症的方法和组合物。本发明还提供了用于改进抗癌疗法例如化学疗法和其他常规癌症疗法的新的方法和组合物。
发明背景
在一百多种不同的生物(包括果蝇、线虫和人)中发现MicroRNA(miRNA，miR)。据认为miRNA在这些生物中参与许多调节发育的过程。miRNA通常从60至70个核苷酸的折叠RNA前体结构加工而来，所述前体从miRNA基因转录而来。RNA前体或加工的miRNA产物可容易被检测到，并且这些分子的缺乏可表明相应的miRNA基因的功能的缺失或丢失。
癌症是美国和全世界死亡率和发病率的重要来源。特别地，慢性淋巴细胞性白血病(“CLL”)和其他BCL2相关癌症(例如，急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤(例如，滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤)、癌(例如，脑癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、肾癌、肝细胞癌和胃癌)、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病)是成年人的临床上重要的肿瘤性疾病(neoplastic disease)。例如，CLL是西方国家中成年人白血病的最常见形式，在美国前列腺癌的年龄校正的发病率现在超过男性中所有其他癌症的年龄校正的发病率，并且，排在肺癌之后，为该国男性癌症死亡的第二大病因。
在超过一半的报导的CLL病例中发生在13q14上的半合子和/纯合子丢失，其构成了CLL中最常见的染色体异常。经鉴定来自CLL患者的组织样品的核型具有相对少量的染色体异常，这表明观察到的13q14上的缺失的特异性和频率具有病理显著性。此外，13q14缺失也在60％的前列腺癌中发生，这表明位于13q14的一种或更多种肿瘤抑制基因参与CLL和前列腺癌的发病机理。
CLL和前列腺癌中13q14缺失的克隆纯合型和杂合型缺失的存在和非常高的频率表明该区域中的缺失与某些癌症类型的病因学相关。为了鉴定缺失区域中的基因，已对几个组使用了定位克隆。迄今为止，已就DNA和/或RNA水平上的改变在CLL的偶发性和家族性病例中鉴定和筛选了来自13q14的删除区域的总共8个基因：Leu1(BCMS或EST70/Leu1)、Leu 2(ALT1或1B4/Leu2)、Leu 5(CAR)、CLLD6、KPNA3、CLLD7、LOC51131(假定的锌指蛋白NY-REN-34抗原)和CLLD8。然而，详细的基因分析，包括详尽的杂合子丢失(LOH)、突变和表达的研究，未能证明这些基因中任何基因在致癌作用中是固有涉及的。
CLL的恶性的、大部分非分裂的B细胞过度表达Bcl2基因(Kitada，S.，等人，Blood 91：3379-3389(1998))，在通过抑制细胞死亡而促进真核细胞的存活中起着中心作用的凋亡抑制因子(Cory，S.，和Adams，J.M.，Nature Reviews 2：647-656(2002))。Bcl2的过度表达与许多类型的人癌症包括白血病、淋巴瘤和癌相关(Sanchez-Beato，M.，等人，Blood 101：1220-1235(2003))。在滤泡性淋巴瘤中和部分弥漫性B细胞淋巴淋中，发现BCL2的活化机制是染色体易位t(14；18)(q32；q21)，该易位将BCL2基因置于免疫球蛋白重链增强子的控制之下，这导致该基因的表达脱离控制(Tsujimoto，Y.，等人，Science 226：1097-1099(1984)；Tsujimoto，Y.，等人，Science 228：1440-1443(1985))。然而，BCL2基因在低于5％的CLL病例中与免疫球蛋白基因座紧靠(Adach i，M.，等人，J.Exp.Med.171：559-564(1990))，BCL2在大部分CLL癌症中的过度表达的机制仍然未知。
目前对CLL的治疗通常包括化学疗法，单独地或与自体骨髓移植一起施用的化学疗法。使用的化学治疗剂通常对于患者是有毒性的，通常在相对大部分的患者只导致部分缓解。用于BCL2相关癌症的疗法也可包括化学疗法，通常在肿瘤的手术切除后进行。然而，对于CLL，化学治疗剂的治疗特征(在进行或不进行手术的情况下)是有限的。
单独使用化疗的治疗是有限的，因为癌细胞通常变得对广谱的结构上不相关的化学治疗剂具有抗性。该抗性，称为“多抗药性(multidrug resistance)”(MDR)，是治疗癌症患者中面临的共同问题，肿瘤细胞对化疗药物的抗性代表了临床肿瘤学中的主要问题。
凋亡是事件顺序的重要组成部分，在所述事件顺序期间，化疗药物诱导抗肿瘤反应，并且研究已表明Bcl2在抗癌药物诱导的凋亡中具有至关重要的作用(Kim，R等人，Cancer 101(11)：2491-2502(2004))。此外，经工程改造过度表达Bcl2的肿瘤细胞产生对许多不同药物的细胞毒性效应的抗性(Kamesaki等人，Cancer Res.53：4251-4256(1993)；Miyashita and Reed，Blood 81：151-157(1993))。
存在对用于CLL和其他BCL2相关癌症的快速、经济和准确的诊断的需要。也存在用于BCL2相关癌症例如CLL的经济、有效的对患者没有显著负影响的疗法的需要。还存在针对抑制Bcl2的表达的新的抗癌疗法的需要，只要广泛的普通癌症与Bcl2蛋白的过度表达相关。此外，存在对相对于其他常规抗癌疗法展示增加的功效的改进的抗癌疗法的需要。此外，存在对鉴定可增加癌细胞对抗癌剂的细胞毒性效应的敏感性从而改进癌症疗法的试剂和方法的需要。还存在对在过度表达抗凋亡蛋白例如Bcl2的细胞中诱导凋亡的方法的需要。
发明概述
现已发现，某些具有与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的序列的microRNA在过度表达Bcl2蛋白的癌细胞中摆脱了控制。
因此，本发明提供了在需要该治疗的受试者中预防癌症或治疗与BCL2基因或基因产物(例如，RNA、蛋白质)过度表达相关的癌症的方法，其包括施用有效量的至少一种miR基因产物。如此处所用的，术语“BCL2”是指BCL2核酸(例如，BCL2基因、cDNA、RNA转录物、DNA构建体)，而“Bcl2”是指Bcl2蛋白质产物。在特定的实施方案中，至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在特定的实施方案中，至少一种miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741至3749互补的核苷酸序列。此类miR基因产物的实例包括但不限于miR15、miR16、miR-15b和miR-16-2。miR15和miR16基因位于13q14，通常分别称为mir-15a和miR-16-1。如此处所用的，术语“miR15”和“miR-15a”可互换使用，对于术语“miR16”和“miR-16-1”亦如此。在其他实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在特定的实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
本发明还提供了用于治疗患有与Bcl2过度表达相关的癌症的受试者的药物组合物，其包含至少一种化学治疗剂和至少一种miR基因产物，其中所述至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在特定的实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
本发明还包括确定在具有BCL2相关癌症的受试者中癌症疗法的功效的方法，其包括对受试者施用至少一种药物，然后测量包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因产物的表达。在特定的实施方案中，在施用试剂后，miR基因产物的表达的增加表明成功的治疗。在一个实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在特定的实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
本发明还提供了用于增加抗癌疗法(例如，化学疗法、放射疗法)的功效的方法，其包括与至少一种抗癌疗法一起对肿瘤细胞提供至少一种miR基因产物。在特定的实施方案中，至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在其他实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在某些实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
本发明还提供了增加癌细胞对抗癌剂的细胞毒性的敏感性的方法，其包括对癌细胞提供至少一种miR基因产物，其中所述至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在某些实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。在特定的实施方案中，抗癌剂是化疗剂。在另一个实施方案中，抗癌剂是辐照处理。
本发明还包括诱导细胞的凋亡的方法，其包括将细胞与至少一种包含与BCL2基因转录物的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因产物接触。在特定的实施方案中，miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在某些实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。用于这些方法的合适的细胞包括，但不限于，表达Bcl2蛋白的癌细胞和其他细胞。
本发明还提供了在受试者中诊断BCL2相关癌症的方法，其包括确定相对于对照样品中相应的miR基因产物的水平，来自受试者的样品中的至少一种miR基因产物的水平，其中miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在特定的实施方案中，miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，至少一种miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217、miR-186和其组合。在另一个实施方案中，miR基因产物选自miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195和其组合。在某些实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
附图概述
本专利或申请文件包含至少一份彩色绘制的附图。在要求和支付必要的费用后由办公室提供具有彩色附图的本申请或专利申请出版物的拷贝。
图1A和1B分别是预测的miR15和miR16前体RNA的二级结构的图示。使用Matthews，等人，J.Mol.Biol.288：911-940(1999)的“mfold”程序(版本3.1)进行RNA二级结构预测，并进行手工加工以在螺旋片段中容纳G/U摆动碱基配对。经过加工的miR15和miR16miRNA的序列以下划线标示。改编自Lagos-Quintana，等人，Science294：853-858(2001)。
图2A是CLL中13q14肿瘤抑制基因基因座内的基因图，该基因图显示miR15/16基因簇的定位。在图中显示了遗传标记的位置和基因的位置。
图2B是由水平条纹框标记的之前报导的13q14缺失。
图2C是D13S1150和D13S272标记之间的基因座的图。基因名称下面的箭头标示该基因座中各基因的方向，垂直条块标示与各基因相应的相应的外显子的位置。
图2D是Alu 18和D13S272标记之间的基因座的图。条块和框标示LEU2/ALT1和LEU1的外显子的位置。短的垂直箭头标示miR15和miR16基因的位置。圆圈标示用于筛选来源于两个独立的白血病病例(CLL-A和CLL-B)的融合的体细胞杂交克隆的PCR引物的位置。加阴影线的框代表存在于杂种中的染色体13的位置。“←～31.4kb→”表示克隆CLL-A中大约31.4kb的缺失区域，其来源于具有CLL(具有t(2；13)(q12；q13)易位)、双侧性视网膜母细胞瘤(bilateralretinoblastoma)和溃疡性结肠炎的患者。长垂直箭头表示具有t(2；13)(q32；q14)易位的克隆CLL-B中的断裂点，“←～29kb→”表示来自该CLL克隆的大约29kb的缺失区域。
图3A是正常人肾、前列腺、肝、胰腺癌、骨骼肌(“Sk肌”)、睾丸、CD5+B细胞(CD5+)、白血病细胞(“Per B1 Leuk”)和骨髓(“BM”)中的miR15和miR16基因表达的Northern印迹分析。
图3B是18个CLL患者中微卫星标记D13S272和D13S272的杂合子(“LOH”)丢失分析。来自正常人CD5+细胞的DNA用作对照。样品的LOH状态表示为“+/+”、“+/-”、“-/-、“NI”(未提供资料)、“？”(无足够的材料)和“ND”(未进行)。溴化乙锭染色的Northern印迹凝胶用作标准化的对照。
图4A描述了人miRNA(miR-15a(Hsa_miR-15；SEQ ID NO：58)或miR-16-1(Hsa_miR-16；SEQ ID NO：59))和人BCL2 cDNA(Hsa_BCL2；SEQ ID NO：57))以及小鼠miRNA(miR-15a(Mmu_miR-15；SEQ ID NO：61)或miR-16-1(Mmu_miR-16；SEQ ID NO：62))与小鼠BCL2 cDNA(Mmu_BCL2；SEQ ID NO：60)之间的miR::mRNA互补区(红色核苷酸)。标示两种不同的3′UTR突变型构建体：3′M1(其缺少负责miRNA::mRNA相互作用的所有9个bp)和3′M2(其缺少互补区域中的前5个bp)的miR-15a和miR-16-1中的被靶向的缺失的位点。
图4B是描述5种不同的CLL样品(CLL)的每一种中以及来自正常患者的CD5阳性B淋巴细胞的混合样品(CD5混合物)中的Bcl2蛋白的水平的Western印迹。Jurkat细胞(T细胞白血病细胞系)用作Bcl2蛋白表达的对照。β-肌动蛋白(肌动蛋白)的水平用于标准化。如通过微阵列信号强度所确定的，各样品中的miR-16-1和miR-15a microRNA的相对表达在下面相应的泳道中示于印迹下面。
图5A是描述未转染的MEG-01细胞(MEG-01 WT)以及用空载体(MEG-01-pRS-neo-GFP)转染的MEG-01细胞、用包含mir-15a/miR-16-1基因簇的载体(MEG-01-pRS-15a/16-1WT)转染的MEG-01细胞或用载体(所述载体包含在miR-16a前体的3′区域具有+7(C至T)置换的mir-15a/miR-16-1基因簇)(MEG-01-pRS-15a/16-1 MUT)转染的MEG-01细胞中，Bcl2蛋白水平以及不同凋亡活性剂(例如，APAF1、Pro-C9、C9、PARP和经切割的PARP)的全长和切割的形式水平的Western印迹。以一式两份的重复实验确认数据。pRS-15a/16-1WT转染的细胞显示APAF1(凋亡蛋白酶活化因子1、细胞色素C相互作用因子(interactor))、pro-半胱天东酶9(内源性凋亡途径)和多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP，不同的凋亡途径的终效应物)的断裂。肌动蛋白用作上样对照。
图5B是描述用miR-15a和/或miR-16-1有义(miR-15a，miR16-1)或miR-15a和/或miR-16-1反义(miR-15a_AS、miR16-1_AS)RNA寡核苷酸转染的MEG-01细胞中的Bcl2蛋白质水平的Western印迹(WB)。未转染的细胞用作对照(MEG-01-WT)。使用β肌动蛋白(肌动蛋白)的水平进行标准化。进行Northern印迹(NB)分析以估量miR-15有义和miR-16有义寡核苷酸的转染功效。RT-PCR产物代表了相同细胞中BCL2转录物的mRNA水平，将该水平针对β肌动蛋白(肌动蛋白)mRNA的水平(RT-PCR)标准化。
图6A是描述在用miR-15-a和/或miR-16-1有义RNA寡核苷酸(分别为miR15a S和miR-16-1 S)或miR-15-a和/或miR-16-1反义RNA寡核苷酸(分别为miR15a A和miR-16-1 A)转染的细胞中，相对肾荧光素酶转染对照标准化的荧火虫荧光素酶的表达的相对抑制(抑制倍数)的条形图。用空对照载体(pGL-3-Cont)或miR-15-a和/或miR-16-1有义或反义RNA寡核苷酸转染细胞。以一式三份重复(n＝6)进行所有实验2次。
图6B是描述相对肾荧光素酶转染对照标准化的荧火虫荧光素酶的表达的相对抑制的条形图。用空对照载体(pGL-3-Cont)、miR-15-a和miR-16-1有义RNA寡核苷酸(pSR-15a/16-1 S+3′UTR)或miR-15-a和miR-16-1反义RNA寡核苷酸(pSR-15a/16-1 A+3′UTR)RNA寡核苷酸转染细胞。3′UTR表示融合至野生型BCL2 3′UTR序列的荧光素酶报告基因。也转染两种不同的3′UTR突变体，一种缺乏miR-15-a和miR-16-1中的互补性miRNA::mRNA区域的所有9个bp(pSR-15a/16-1 S+3′M1)，另一个缺乏相同互补区域中的前5个bp(pSR-15a/16-1 S+3′M2)。以一式三份重复(n＝6)进行所有实验2次。
根据下列本发明的实施方案的更具体描述，本发明的前述目的和其他目的、特征和有利方面将很显然。
发明详述
本发明的优选的实施方案的描述如下。
当通过参考其优选实施方案，明确地显示和描述本发明时，本领域技术人员将理解此处可在形式和内容上进行不同的改变而不背离由所附权利要求包含的本发明的范围。
如此处可互换使用的，“miR基因产物”、“microRNA”、“miR”或“miRNA”是指来自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。因为miR基因产物不翻译成蛋白质，术语“miR基因产物”不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为“miR前体”，通常包含长度大约为70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过RNA酶(例如Dicer、Argonaut、RNAse III(例如，大肠杆菌RNA酶III))降解将miR前体加工成活性19-25个核苷酸的RNA分子。该活性19-25个核苷酸的RNA分子也称为“加工的”miR基因转录物或“成熟的”miRNA。
可通过天然加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer、Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得活性19-25个核苷酸的RNA分子。应理解为还可通过生物或化学合成产生活性的19-25个核苷酸的RNA分子而不必从miR前体加工。
表1中提供了大量miR基因产物的序列。所有核苷酸序列此处以5’至3’的方向给出。
表1-人miR基因产物的序列
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQIDNO：
  let-7a-1-prec CACTGTGGGATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGGGTCACACCCACCACTGGGAGATAACTATACAATCTACTGTCTTTCCTAACGTG 63
  let-7a-2-prec AGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCT 64
  let-7a-3-prec GGGTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGGGGCTCTGCCCTGCTATGGGATAACTATACAATCTACTGTCTTTCCT 65
  let-7a-4-prec GTGACTGCATGCTCCCAGGTTGAGGTAGTAGGTTGTA TAGTTTAGAATTACACAAGGGAGATAACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCTTGGGTCT TGCACTAAACAAC 66
  let-7b-prec GGCGGGGTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTTCAGGGCAGTGATGTTGCCCCTCGGAAGATAACTATACAACCTACTGCCTTCCCTG 67
  let-7c-prec GCATCCGGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATGGTTTAGAGTTACACCCTGGGAGTTAACTGTACAACCTTCTAGCTTTCCTTGGAGC 68
  let-7d-prec CCTAGGAAGAGGTAGTAGGTTGCATAGTTTTAGGGCAGGGATTTTGCCCACAAGGAGGTAACTATACGACCTGCTGCCTTTCTTAGG 69
  let-7d-v1-prec CTAGGAAGAGGTAGTAGTTTGCATAGTTTTAGGGCAAAGATTTTGCCCACAAGTAGTTAGCTATACGACCTGCAGCCTTTTGTAG 70
  let-7d-v2-prec CTGGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTTGGTCGGGTTGTGACATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGCGCAAGCTACTGCCTTGCTAG 71
  let-7e-prec CCCGGGCTGAGGTAGGAGGTTGTATAGTTGAGGAGGACACCCAAGGAGATCACTATACGGCCTCCTAGCTTTCCCCAGG 72
  let-7f-1-prec TCAGAGTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTGTGGGGTAGTGATTTTACCCTGTTCAGGAGATAACTATACAATCTATTGCCTTCCCTGA 73
  let-7f-2-prec-1 CTGTGGGATGAGGTAGTAGATTGTATAGTTGTGGGGTAGTGATTTTACCCTGTTCAGGAGATAACTATACAATCTATTGCCTTCCCTGA 74
  let-7f-2-prec-2 CTGTGGGATGAGGTAGTAGATTGTATAGTTTTAGGGTCATACCCCATCTTGGAGATAACTATACAGTCTACTGTCTTTCCCACGG 75
  let-7g-prec TTGCCTGATTCCAGGCTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTTGAGGGTCTATGATACCACCCGGTACAGGAGATAACTGTACAGGCCACTGCCTTGCCAGGAACAGCGCGC 76
  let-7i-prec CTGGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTTGGTCGGGTTGTGACATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGCGCAAGCTACTGCCTTGCTAG 77
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-001b-1-prec-1   ACCTACTCAGAGTACATACTTCTTTATGTACCCATATGAACATACAATGCTATGGAATGTAAAGAAGTATGTA TTTTTGGTAGGC 78
  mir-001b-1-prec-2   CAGCTAACAACTTAGTAATACCTACTCAGAGTACATACTTCTTTATGTACCCATATGAACATACAATGCTATGG AATGTAAAGAAGTATGTATTTTTGGTAGGCAATA 79
  mir-001b-2-prec   GCCTGCTTGGGAAACATACTTCTTTATATGCCCATATGGACCTGCTAAGCTATGGAATGTAAAGAAGTATGTATCTCAGGCCGGG 80
  mir-001b-prec   TGGGAAACATACTTCTTTATATGCCCATATGGACCTGCTAAGCTATGGAATGTAAAGAAGTATGTATCTCA 81
  mir-001d-prec   ACCTACTCAGAGTACATACTTCTTTATGTACCCATATGAACATACAATGCTATGGAATGTAAAGAAGTATGTA TTTTTGGTAGGC 82
  mir-007-1 TGGATGTTGGCCTAGTTCTGTGTGGAAGACTAGTGAT TTTGTTGTTTTTAGATAACTAAATCGACAACAAATCACAGTCTGCCATATGGCACAGGCCATGCCTCTACA 83
  mir-007-1-prec TTGGATGTTGGCCTAGTTCTGTGTGGAAGACTAGTGA TTTTGTTGTTTTTAGATAACTAAATCGACAACAAATCACAGTCTGCCATATGGCACAGGCCATGCCTCTACAG 84
  mir-007-2-prec CTGGATACAGAGTGGACCGGCTGGCCCCATCTGGAAGA GACTAGTGATTTTGTTGTTGTCTTACTGCGCTCAACAACAAATCCCAGTCTACCTAATGGTGCCAGCCATCGCA 85
  mir-007-3-prec AGATTAGAGTGGCTGTGGTCTAGTGCTGTGTGGAAGA CTAGTGATTTTGTTGTTCTGATGTACTACGACAACAAGTCACAGCCGGCCTCATAGCGCAGACTCCCTTCGAC 86
  mir-009-1 CGGGGTTGGTTGTTATCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGGTGTGGAGTCTTCATAAAGCTAGATAACCGAAAGTAAAAATAACCCCA 87
  mir-009-2 GGAAGCGAGTTGTTATCTTTGGTTATCTAGCTGTATG AGTGTATTGGTCTTCATAAAGCTAGATAACCGAAAGT 88
  mir-009-3 GGAGGCCCGTTTCTCTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGCCACAGAGCCGTCATAAAGCTAGATAACCGAAAGTAGAAATGATTCTCA 89
  mir-010a-prec GATCTGTCTGTCTTCTGTATATACCCTGTAGATCCGA ATTTGTGTAAGGAATTTTGTGGTCACAAATTCGTATCTAGGGGAATATGTAGTTGACATAAACACTCCGCTCT 90
  mir-010b-prec   CCAGAGGTTGTAACGTTGTCTATATATACCCTGTAGA ACCGAATTTGTGTGGTATCCGTATAGTCACAGATTCGATTCTAGGGGAATATATGGTCA\GATGCAAAAACTTCA   91
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-015a-2-prec   GCGCGAATGTGTGTTTAAAAAAAATAAAACCTTGGAGTAAAGTAGCAGCACATAATGGTTTGTGGATTTTGAAAAGGGTGCAGGCCATATTGTGCTGCCTCAAAAATAC 92
  mir-015a-prec CCTTGGAGTAAAGTAGCAGCACATAATGGTTTGTGGATTTTGAAAAGGTGGAGGCCATATTGTGCTGCCTCAAAAATACAAGG 93
  mir-015b-prec-1   CTGTAGCAGCACATCATGGTTTACATGCTACAGTCAAGATGCGAATCATTATTTGCTGCTCTAG 94
  mir-015b-prec-2   TTGAGGCCTTAAAGTACTGTAGCAGCACATCATGGTT TACATGCTACAGTCAAGATGCGAATCATTATTTGCTGCTCTAGAAATTTAAGGAAATTCAT 95
  mir-016a-chr13 GTCAGCAGTGCCTTAGCAGCACGTAAATATTGGCGTTAAGATTCTAAAATTATCTCGAGTATTAACTGTGCTGCTGAAGTAAGGTTGAC 96
  mir-016b-chr3 GTTCCACTCTAGCAGCACGTA AATATTGGCGTAGTGAAATATATATTAAACACCAATATTACTGTGCTGCTTTAGTGTGAC 97
  mir-016-prec-13 GCAGTGCCTTAGCAGCACGTAAATATTGGCGTTAAGATTCTAAAATTATCTCCAGTATTAACTGTGCTGCTGAAGTAAGGT 98
  mir-017-prec   GTCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGAC 99
  mir-018-prec TGTTCTAAGGTGCATCTAGTGCAGATAGTGAAGTAGATTAGCATCTACTGCCCTAAGTGCTCCTTCTGGCA 100
  mir-018-prec-13 TTTTTGTTCTAAGGTGCATCTAGTGCAGATAGTGAAGTAGATTAGCATCTACTGCCCTAAGTGCTCCTTCTGGCATAAGAA 101
  mir-019a-prec   GCAGTCCTCTGTTAGTTTTGCATAGTTGCACTACAAGAAGAATGTAGTTGTGCAAATCTATGCAAAACTGATGGTGGCCTGC 102
  mir-019a-prec-13   CAGTCCTCTGTTAGTTTTGCATAGTTGCACTACAAGAAGAATGTAGTTGTGCAAATCTATGCAAAACTGATGGTGGCCTG 103
  mir-019b-1-prec   CACTGTTCTATGGTTAGTTTTGCAGGTTTGCATCCAGCTGTGTGATATTCTGCTGTGCAAATCCATGCAAAACTG ACTGTGGTAGTG 104
  mir-019b-2-prec   ACATTGCTACTTACAATTAGTTTTGCAGGTTTGCATTTCAGCGTATATATGTATATGTGGCTGTGCAAATCCATG CAAAACTGATTGTGATAATGT 105
  mir-019b-prec-13   TTCTATGGTTAGTTTTGCAGGTTTGCATCCAGCTGTGTGATATTCTGCTGTGCAAATCCATGCAAAACTGACTGTGGTAG 106
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-019b-prec-X   TTACAATTAGTTTTGCAGGTTTGCATTTCAGCGTATATATGTATATGTGGCTGTGCAAATCCATGCAAAACTGATTGTGAT 107
  mir-020-prec GTAGCACTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGTGTTTAGTTATCTACTGCATTATGAGCACTTAAAGTACTGC 108
  mir-021-prec TGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACA 109
  mir-021-prec-17 ACCTTGTCGGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGACTGTTGAATCTCATGGCAACACCAGTCGATGGGCTGTCTGACATTTTG 110
  mir-022-prec   GGCTGAGCCGCAGTAGTTCTTCAGTGGCAAGCTTTATGTCCTGACCCAGCTAAAGCTGCCAGTTGAAGAACTGTTGCCCTCTGCC 111
  mir-023a-prec   GGCCGGCTGGGGTTCCTGGGGATGGGATTTGCTTCCTGTCACAAATCACATTGCCAGGGATTTCCAACCGACC 112
  mir-023b-prec   CTCAGGTGCTCTGGCTGCTTGGGTTCCTGGCATGCTGATTTGTGACTTAAGATTAAAATCACATTGCCAGGGAT TACCACGCAACCACGACCTTGGC 113
  mir-023-prec-19   CCACGGCCGGCTGGGGTTCCTGGGGATGGGATTTGCTTCCTGTCACAAATCACATTGCCAGGGATTTCCAACCGACCCTGA 114
  mir-024-1-prec   CTCCGGTGCCTACTGAGCTGATATCAGTTCTCATTTTACACACTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAGGAG 115
  mir-024-2-prec   CTCTGCCTCCCGTGCCTACTGAGCTGAAACACAGTTGGTTTGTGTACACTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAGGG 116
  mmir-024-prec-19   CCCTGGGCTCTGCCTCCCGTGCCTACTGAGCTGAAACACAGTTGGTTTGTGTACACTGGCTCAGTTCAGCAGGA ACAGGGG 117
  mir-024-prec-9   CCCTCCGGTGCCTACTGAGCTGATATCAGTTCTCATTTTACACACTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAGCATC 118
  mir-025-prec   GGCCAGTGTTGAGAGGCGGAGACTTGGGCAATTGCTGGACGCTGCCCTGGGCATTGCACTTGTCTCGGTCTGACAGTGCCGGCC 119
  mir-026a-prec AGGCCGTGGCCTCGTTCAAGTAATCCAGGATAGGCTGTGCAGGTCCCAATGGCCTATCTTGGTTACTTGCACGGGGACGCGGGCCT 120
  mir-026b-prec CCGGGACCCAGTTCAAGTAATTCAGGATAGGTTGTGTGCTGTCCAGCCTGTTCTCCATTACTTGGCTCGGGGACCGG 121
  mir-027a-prec   CTGAGGAGCAGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCAGGGTCCACACCAAGTCGTGTTCACAGTGGCTAAGTTCCGCCCCCCAG 122
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-027b-prec-1   AGGTGCAGAGCTTAGCTGATTGGTGAACAGTGATTGGTTTCCGCTTTGTTCACAGTGGCTAAGTTCTGCACCT 123
  mir-027b-prec-2   ACCTCTCTAACAAGGTGCAGAGCTTAGCTGATTGGTGAACAGTGATTGGTTTCCGCTTTGTTCACAGTGGCTAA GTTCTGCACCTGAAGAGAAGGTG 124
  mir-027-prec-19   CCTGAGGAGCAGGGCTTAGCTGCTTGTGAGCAGGGTCCACACCAAGTCGTGTTCACAGTGGCTAAGTTCCGCCCCCCAGG 125
  mir-028-prec GGTCCTTGCCCTCAAGGAGCTCACAGTCTATTGAGTTACCTTTCTGACTTTCCCACTAGATTGTGAGCTCCTGGAGGGCAGGCACT 126
  mir-029a-2   CCTTCTGTGACCCCTTAGAGGATGACTGATTTCTTTTGGTGTTCAGAGTCAATATAATTTTCTAGCACCATCTGA AATCGGTTATAATGATTGGGGAAGAGCACCATG 127
  mir-029a-prec   ATGACTGATTTCTTTTGGTGTTCAGAGTCAATATAATTTTCTAGCACCATCTGAAATCGGTTAT 128
  mir-029c-prec   ACCACTGGCCCATCTCTTACACAGGCTGACCGATTTCTCCTGGTGTTCAGAGTCTGTTTTTGTCTAGCACCATTT GAAATCGGTTATGATGTAGGGGGAAAAGCAGCAGC 129
  mir-030a-prec   GCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGC 130
  mir-030b-prec-1   ATGTAAACATCCTACACTCAGCTGTAATACATGGATTGGCTGGGAGGTGGATGTTTACGT 131
  mir-030b-prec-2 ACCAAGTTTCAGTTCATGTAAACATCCTACACTCAGCTGTAATACATGGATTGGCTGGGAGGTGGATGTTTACTTCAGCTGACTTGGA 132
  mir-030c-prec AGATACTGTAAACATCCTACACTCTCAGCTGTGGAAAGTAAGAAAGCTGGGAGAAGGCTGTTTACTCTTTCT 133
  mir-030d-prec GTTGTTGTAAACATCCCCGACTGGAAGCTGTAAGACACAGCTAAGCTTTCAGTCAGATGTTTGCTGCTAC 134
  mir-031-prec GGAGAGGAGGCAAGATGCTGGCATAGCTGTTGAACTGGGAACCTGCTATGCCAACATATTGCCATCTTTCC 135
  mir-032-prec GGAGATATTGCACATTACTAAGTTGCATGTTGTCACGGCCTCAATGCAATTTAGTGTGTGTGATATTTTC 136
  mir-033b-prec GGGGGCCGAGAGAGGCGGGCGGCCCCGCGGTGCATT GCTGTTGCATTGCACGTGTGTGAGGCGGGTGCAGTGCCTCGGCAGTGCAGCCCGGAGCCGGCCCCTGGCACCAC 137
  mir-033-prec   CTGTGGTGCATTGTAGTTGCATTGCATGTTCTGGTGGTACCCATGCAATGTTTCCACAGTGCATCACAG 138
  mir-034-prec GGCCAGCTGTGAGTGTTTCTTTGGCAGTGTCTTAGCT GGTTGTTGTGAGCAATAGTAAGGAAGCAATCAGCAAGTATACTGCCCTAGAAGTTGCTGCAGGTTGTGGGGCCC 139
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-091-prec-13 TCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGA 140
  mir-092-prec-13＝092-1   CTTTCTACACAGGTTGGGATCGGTTGCAATGCTGTGTTTCTGTATGGTATTGCACTTGTCCCGGCCTGTTGAGTTTGG 141
  mir-092-prec-X＝092-2   TCATCCCTGGGTGGGGATTTGTTGCATTACTTGTGTTCTATATAAAGTATTGCACTTGTCCCGGCCTGTGGAAGA 142
  mir-093-prec-7.1＝093-1(mir-093-prec-7.2＝093-2) CTGGGGGCTCCAAAGTGCTGTTCGTGCAGGTAGTGTGATTACCCAACCTACTGCTGAGCTAGCACTTCCCGAGCCCCCGG 143
  mir-095-prec-4   AACACAGTGGGCACTCAATAAATGTCTGTTGAATTGAAATGCGTTACATTCAACGGGTATTTATTGAGCACCCACTCTGTG 144
  mir-096-prec-7 TGGCCGATTTTGGCACTAGCACATTTTTGCTTGTGTCTCTCCGCTCTGAGCAATCATGTGCAGTGCCAATATGGGAAA 145
  mir-098-prec-X GTGAGGTAGTAAGTTGTATTGTTGTGGGGTAGGGATATTAGGCCCCAATTAGAAGATAACTATACAACTTACTACTTTCC 146
  mir-099b-prec-19 GGCACCCACCCGTAGAACCGACCTTGCGGGGCCTTCGCCGCACACAAGCTCGTGTCTGTGGGTCCGTGTC 147
  mir-099-prec-21 CCCATTGGCATAAACCCGTAGATCCGATCTTGTGGTGAAGTGGACCGCACAAGCTCGCTTCTATGGGTCTGTGTCAGTGTG 148
  mir-100-1/2-prec AAGAGAGAAGATATTGAGGCCTGTTGCCACAAACCC GTAGATCCGAACTTGTGGTATTAGTCCGCACAAGCTTGTATCTATAGGTATGTGTCTGTTAGGCAATCTCAC 149
  mir-100-prec-11 CCTGTTGCCACAAACCCGTAGATCCGAACTTGTGGTATTAGTCCGCACAAGCTTGTATCTATAGGTATGTGTCTGTTAGG 150
  mir-101-1/2-prec   AGGCTGCCCTGGCTCAGTTATCACAGTGCTGATGCTGTCTATTCTAAAGGTACAGTACTGTGATAACTGAAGGATGGCAGCCATCTTACCTTCCATCAGAGGAGCCTCAC 151
  mir-101-prec   TCAGTTATCACAGTGCTGATGCTGTCCATTCTAAAGGTACAGTACTGTGATAACTGA 152
  mir-101-prec-1   TGCCCTGGCTCAGTTATCACAGTGCTGATGCTGTCTATTCTAAAGGTACAGTACTGTGATAACTGAAGGATGGCA 153
  mir-101-prec-9   TGTCCTTTTTCGGTTATCATGGTACCGATGCTGTATATCTGAAAGGTACAGTACTGTGATAACTGAAGAATGGTG 154
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-102-prec-1   CTTCTGGAAGCTGGTTTCACATGGTGGCTTAGATTTTTCCATCTTTGTATCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTTTAGGAG 155
  mir-102-prec-7.1(mir-102-prec-7.2)   CTTCAGGAAGCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTCTTGGGGG 156
  mir-103-2-prec(mir-103-prec-20)   TTGTGCTTTCAGCTTCTTTACAGTGCTGCCTTGTAGCATTCAGGTCAAGCAACATTGTACAGGGCTATGAAAGAACCA 157
  mir-103-prec-5＝103-1   TACTGCCCTCGGCTTCTTTACAGTGCTGCCTTGTTGCATATGGATCAAGCAGCATTGTACAGGGCTATGAAGGCATTG 158
  mir-104-prec-17   AAATGTCAGACAGCCCATCGACTGGTGTTGCCATGAGATTCAACAGTCAACATCAGTCTGATAAGCTACCCGACAAGG 159
  mir-105-prec-X.1(mir-105-1；mir-105-prec-X.2；mir-105-2) TGTGCATCGTGGTCAAATGCTCAGACTCCTGTGGTGGCTGCTCATGCACCACGGATGTTTGAGCATGTGCTACGGTGTCTA 160
  mir-106-prec-X CCTTGGCCATGTAAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGCTTTTTGAGATCTACTGCAATGTAAGCACTTCTTACATTACCATGG 161
  mir-107-prec-10   CTCTCTGCTTTCAGCTTCTTTACAGTGTTGCCTTGTGGCATGGAGTTCAAGCAGCATTGTACAGGGCTATCAAAGCACAGA 162
  mir-122a-prec-1 CCTTAGCAGAGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCTAAACTATCAAACGCCATTATCACACTAAATAGCTACTGCTAGGC 163
  mir-122a-prec-2   AGCTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTGTCCAAACTATCAAACGCCATTATCACACTAAATAGCT 164
  mir-123-prec   ACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGC 165
  mir-124a-1-prec-1   tccttcctCAGGAGAAAGGCCTCTCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCT 166
  mir-124a-1-prec-2   AGGCCTCTCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAATGTCCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAATGGGGCTG 167
  mir-124a-2-prec   ATCAAGATTAGAGGCTCTGCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAGCGGAGCCTACGGCTGCACTTGAAG 168
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-124a-3-prec-1   CCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTT 169
  mir-124a-3-prec-2   TGAGGGCCCCTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAGAGGCGCCTCC 170
  mir-124a-prec   CTCTGCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCTATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAG 171
  mir-124b-prec   CTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAATGTCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAG 172
  mir-125a-prec-1   TGCCAGTCTCTAGGTCCCTGAGACCCTTTAACCTGTGAGGACATCCAGGGTCACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCCTGGCGTCTGGCC 173
  mir-125a-prec-2   GGTCCCTGAGACCCTTTAACCTGTGAGGACATCCAGGGTCACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCCTGG 174
  mir-125b-1-1   ACATTGTTGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGATGTTTACCGTTTAAATCCACGGGTTAGGCTCTTGGGAGCTGCGAGTCGTGCTTTTGCATCCTGGA 175
  mir-125b-1-2   TGCGCTCCTCTCAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGATGTTTACCGTTTAAATCCACGGGTTAGGCTCTTGGGAGCTGCGAGTCGTGCT 176
  mir-125b-2-prec-1   ACCAGACTTTTCCTAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGAGGTATTTTAGTAACATCACAAGTCAGGCTCTTGGGACCTAGGCGGAGGGGA 177
  mir-125b-2-prec-2   CCTAGTCCCTGAGACCCTAACTTGTGAGGTATTTTAGTAACATCACAAGTCAGGCTCTTGGGACCTAGGC 178
  mir-126-prec-1   CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCA 179
  mir-126-prec-2   ACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGC 180
  mir-127-prec-1   TGTGATCACTGTCTCCAGCCTGCTGAAGCTCAGAGGGCTCTGATTCAGAAAGATCATCGGATCCGTCTGAGCTTGGCTGGTCGGAAGTCTCATCATC 181
  mir-127-prec-2   CCAGCCTGCTGAAGCTCAGAGGGCTCTGATTCAGAAAGATCATCGGATCCGTCTGAGCTTGGCTGGTCGG 182
  mir-128a-prec   TGAGCTGTTGGATTCGGGGCCGTAGCACTGTCTGAGAGGTTTACATTTCTCACAGTGAACCGGTCTCTTTTTCAGCTGCTTC 183
  mir-128b-prec   GCCCGGCAGCCACTGTGCAGTGGGAAGGGGGGCCGATACACTGTACGAGAGTGAGTAGCAGGTCTCACAGTGAACCGGTCTCTTTCCCTACTGTGTCACACTCCTAATGG 184
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-128-prec   GTTGGATTCGGGGCCGTAGCACTGTCTGAGAGGTTTACATTTCTCACAGTGAACCGGTCTCTTTTTCAGC 185
  mir-129-prec TGGATCTTTTTGCGGTCTGGGCTTGCTGTTCCTCTCAACAGTAGTCAGGAAGCCCTTACCCCAAAAAGTATCTA 186
  mir-130a-prec   TGCTGCTGGCCAGAGCTCTTTTCACATTGTGCTACTGTCTGCACCTGTCACTAGCAGTGCAATGTTAAAAGGGCATTGGCCGTGTAGTG 187
  mir-131-1-prec   gccaggaggcggGGTTGGTTGTTATCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGGTGTGGAGTCTTCATAAAGCTAGATAAC CGAAAGTAAAAATAACCCCATACACTGCGCAG 188
  mir-131-3-prec   CACGGCGCGGCAGCGGCACTGGCTAAGGGAGGCCCGTTTCTCTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGCCACAGAGCCGTCATAAAGCTAGATAACCGAAAGTAGAAATG 189
  mir-131-prec   GTTGTTATCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGTATTGGTCTTCATAAAGCTAGATAACCGAAAGTAAAAAC 190
  mir-132-prec-1   CCGCCCCCGCGTCTCCAGGGCAACCGTGGCTTTCGATTGTTACTGTGGGAACTGGAGGTAACAGTCTACAGCCA TGGTCGCCCCGCAGCACGCCCACGCGC 191
  mir-132-prec-2   GGGCAACCGTGGCTTTCGATTGTTACTGTGGGAACTGGAGGTAACAGTCTACAGCCATGGTCGCCC 192
  mir-133a-1   ACAATGCTTTGCTAGAGCTGGTAAAATGGAACCAAATCGCCTCTTCAATGGATTTGGTCCCCTTCAACCAGCT GTAGCTATGCATTGA 193
  mir-133a-2   GGGAGCCAAATGCTTTGCTAGAGCTGGTAAAATGGAACCAAATCGACTGTCCAATGGATTTGGTCCCCTTCAA CCAGCTGTAGCTGTGCATTGATGGCGCCG 194
  mir-133-prec   GCTAGAGCTGGTAAAATGGAACCAAATCGCCTCTTCAATGGATTTGGTCCCCTTCAACCAGCTGTAGC 195
  mir-134-prec-1 CAGGGTGTGTGACTGGTTGACCAGAGGGGCATGCACTGTGTTCACCCTGTGGGCCACCTAGTCACCAACCCTC 196
  mir-134-prec-2 AGGGTGTGTGACTGGTTGACCAGAGGGGCATGCACTGTGTTCACCCTGTGGGCCACCTAGTCACCAACCCT 197
  mir-135-1-prec   AGGCCTCGCTGTTCTCTATGGCTTTTTATTCCTATGTG ATTCTACTGCTCACTCATATAGGGATTGGAGCCGTGGCGCACGGCGGGGACA 198
  mir-135-2-prec   AGATAAATTCACTCTAGTGCTTTATGGCTTTTTATTCC TATGTGATAGTAATAAAGTCTCATGTAGGGATGGAAGCCATGAAATACATTGTGAAAAATCA 199
  mir-135-prec   CTATGGCTTTTTATTCCTATGTGATTCTACTGCTCACTCATATAGGGATTGGAGCCGTGG 200
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-136-prec-1 TGAGCCCTCGGAGGACTCCATTTGTTTTGATGATGGATTCTTATGCTCCATCATCGTCTCAAATGAGTCTTCAGAGGGTTCT 201
  mir-136-prec-2   GAGGACTCCATTTGTTTGATGATGGATTCTTATGCTCCATCATCGTCTCAAATGAGTCTTC 202
  mir-137-prec   CTTCGGTGACGGGTATTCTTGGGTGGATAATACGGATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGG 203
  mir-138-1-prec   CCCTGGCATGGTGTGGTGGGGCAGCTGGTGTTGTGAA TCAGGCCGTTGCCAATCAGAGAACGGCTACTTCACAACACCAGGGCCACACCACACTACAGG 204
  mir-138-2-prec CGTTGCTGCAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGACGAGCAGCGCATCCTCTTACCCGGCTATTTCACGACACCAGGGTTGCATCA 205
  mir-138-prec CAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGACGAGCAGCGCATCCTCTTACCCGGCTATTTCACGACACCAGGGTTG 206
  mir-139-prec   GTGTATTCTACAGTGCACGTGTCTCCAGTGTGGCTCGGAGGCTGGAGACGCGGCCCTGTTGGAGTAAC 207
  mir-140   TGTGTCTCTCTCTGTGTCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACGTCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGA ACCACGGACAGGATACCGGGGCACC 208
  mir-140as-prec   TCCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACGTCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGGA 209
  mir-140s-prec   CCTGCCAGTGGTTTTACCCTATGGTAGGTTACGTCATGCTGTTCTACCACAGGGTAGAACCACGGACAGG 210
  mir-141-prec-1   CGGCCGGCCCTGGGTCCATCTTCCAGTACAGTGTTGGATGGTCTAATTGTGAAGCTCCTAACACTGTCTGGTAA AGATGGCTCCCGGGTGGGTTC 211
  mir-141-prec-2   GGGTCCATCTTCCAGTACAGTGTTGGATGGTCTAATTGTGAAGCTCCTAACACTGTCTGGTAAAGATGGCCC 212
  mir-142as-prec(mir-142s-prec)   ACCCATAAAGTAGA AAGCACTACTAACAGCACTGGAGGGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGATG 213
  mir-142s-pres   ACCCATAAAGTAGAAAGCACTACTAACAGCACTGGAGGGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGATG 214
  mir-143-prec-1   GCGCAGCGCCCTGTCTCCCAGCCTGAGGTGCAGTGCTGCATCTCTGGTCAGTTGGGAGTCTGAGATGAAGCACT GTAGCTCAGGAAGAGAGAAGTTGTTCTGCAGC 215
  mir-143-prec-2   CCTGAGGTGCAGTGCTGCATCTCTGGTCAGTTGGGAGTCTGAGATGAAGCACTGTAGCTCAGG 216
  mir-144-prec-1   TGGGGCCCTGGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGCGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTCCGGGCACCCCC 217
  mir-144-prec-2   GGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGCGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTC 218
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQIDNO：
  mir-145-prec-1   CACCTTGTCCTCACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCC TTAGATGCTAAGATGGGGATTCCTGGAAATACTGTTCTTGAGGTCATGGTT 219
  mir-145-prec-2 CTCACGGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCTTAGATGCTAAGATGGGGATTCCTGGAAATACTGTTCTTGAG 220
  mir-146-prec-1   CCGATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGAATTCCAT GGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGT 221
  mir-146-prec-2   AGCTTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTGTGAAATTCAGTTCTTCAGCT 222
  mir-147-prec   AATCTAAAGACAACATTTCTGCACACACACCAGACTATGGAAGCCAGTGTGTGGAAATGCTTCTGCTAGATT 223
  mir-148-prec   GAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATAGAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGTCTC 224
  mir-149-prec-1 GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTCCGTGTCTTCACTCCCGTGCTTGTCCGAGGAGGGAGGGAGGGACGGGGGCTGTGCTGGGGCAGCTGGA 225
  mir-149-prec-2   GCTCTGGCTCCGTGTCTTCACTCCCGTGCTTGTCCGAGGAGG-GAGGGAGGGAC 226
  mir-150-prec-1 CTCCCCATGGCCCTGTCTCCCAACCCTTGTACCAGTGCTGGGCTCAGACCCTGGTACAGGCCTGGGGGACAGGGACCTGGGGAC 227
  mir-150-prec-2   CCCTGTCTCCCAACCCTTGTTACCAGTGCTGGGCTCAGACCCTGGTACAGGCCTGGGGGACAGGG 228
  mir-151-prec   CCTGCCCTCGAGGAGCTCACAGTCTAGTATGTCTCATCCCCTACTAGACTGAAGCTCCTTGAGGACAGG 229
  mir-152-prec-1   TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTG GGCCCGGAAGGACC 230
  mir-152-prec-2   GGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGCTCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCCGG 231
  mir-153-1-prec-1   CTCACAGCTGCCAGTGTCATTTTTGTGATCTGCAGCTAGTATTCTCACTCCAGTTGCATAGTCACAAAAGTGATCATTGGCAGGTGTGGC 232
  mir-153-1-prec-2   tctctctctccctcACAGCTGCCAGTGTCATTGTCACAAAAGT GATCATTGGCAGGTGTGGCTGCTGCATG 233
  mir-153-2-prec-1   AGCGGTGGCCAGTGTCATTTTTGTGATGTTGCAGCTAGTAATATGAGCCCAGTTGCATAGTCACAAAAGTGATCATTGGAAACTGTG 234
  mir-153-2-prec-2   CAGTGTCATTTTTGTGATGTTGCAGCTAGTAATATGAGCCCAGTTGCATAGTCACAAAAGTGATCATTG 235
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-154-prec-1 GTGGTA0TTGAAGATAGGTTATCCGTGTTTGCCTTCGGCTTTATTTGTGACGAATCATACACGGTTGACCTATTTTTCAGTACCAA 236
  mir-154-prec-2   GAAGATAGGTTATCCGTGTTGCCTTCCGCTTTATTTGTGACGAATCATACACGGTTGACCTATTTTT 237
  mir-155-prec   CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTAACAG 238
  mir-16-2-prec   CAATGTCAGCAGTGCCTTAGCAGCACGTAAATATTGG CCGTTAAGATTCTAAAATTATCTCCAGTATTAACTGTGCTGCTGAAGTAAGGTTGACCATACTCTACAGTTG 239
  mir-181a-prec   AGAAGGGCTATCAGGCCAGCCTTCAGAGGACTCCAAGGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGGATTTGAAAAAACCACTGACCGTTGACTGTACCTTGGGGTCCTTA 240
  mir-181b-prec TGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTG TCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCCA 241
  mir-181c-prec CGGAAAATTTGCCAAGGGTTTGGGGGAACATTCAAC CTGTCGGTGAGTTTGGGCAGCTCAGGCAAACCATCGACCGTTGAGTGGACCCTGAGGCCTGGAATTGCCATCCT 242
  mir-182-as-prec GAGCTGCTTGCCTCCCCCCGTTTTTGGCAATGGTAGA ACTCACACTGGTGAGGTAACAGGATCCGGTGGTTCTAGACTTGCCAACTATGGGGCGAGGACTCAGCCGGCAC 243
  mir-182-prec TTTTTGGCAATGGTAGAACTCACACTGGTGAGGTAACAGGATCCGGTGGTTCTAGACTTGCCAACTATGG 244
  mir-183-prec CCGCAGAGTGTGACTCCTGTTCTGTGTATGGCACTGG TAGAATTCACTGTGAACAGTCTCAGTCAGTGAATTACCGAAGGGCCATAAACAGAGCAGAGACAGATCCACGA 245
  mir-184-prec-1   CCAGTCACGTCCCCTTATCACTTTTCCAGCCCAGCTTTGTGACTGTAAGTGTTGGACGGAGAACTGATAAGGGTTAGGTGATTGA 246
  mir-184-prec-2   CCTTATCACTTTTCCAGCCCAGCTTTGTGACTGTAAGTGTTGGACGGAGAACTGATAAGGGTAGG 247
  mir-185-prec-1 AGGGGGCGAGGGATTGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGATGGTCCCCTCCCCAGGGGCTGGCTTTCCTCTGGTCCTTCCCTCCCA 248
  mir-185-prec-2   AGGGATTGGGAGAGAAAGGCAGTTCCTGATGGTCCCCTCCCCAGGGGCTGGCTTTCCTCTGGTCCTT 249
  mir-186-prec-1 TGCTTGTAACTTTCCAAAGAATTCTCCTTTTGGGCTTTCTGGTTTTATTTTAAGCCCAAAGGTGAATTTTTTGGGAAGTTTGAGCT 250
  mir-186-prec-2 ACTTTCCAAAGAATTCTCCTTTTGGGCTTTCTGGTTTTATTTTAAGCCCAAAGGTGAATTTTTTGGGAAGT 251
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQIDNO：
  mir-187-prec   GGTCGGGCTCACCATGACACAGTGTGAGACTCGGGCTACAACACAGGACCCGGGGCGCTGCTCTGACCCCTCG TGTCTTGTGTTGCAGCCGGAGGGACGCAGGTCCGCA 252
  mir-188-prec-1 TGCTCCCTCTCTCACATCCCTTGCATGGTGGAGGTGAGCTTTCTGAAAACCCCTCCCACATGCAGGGTTTGCAGGATGGCGAGCC 253
  mir-188-prec-2   TCTCACATCCCTTGCATGGTGGAGGGTTGAGCTTTCTGAAAACCCCTCCCACATGCAGGGTTTGCAGGA 254
  mir-189-prec-1   CTGTCGATTGGACCCGCCCTCCGGGTGCCTACTGAGCT GATATCAGTTCTCATTTTACACACTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAGGAGTCGAGCCCTTGAGCAA 255
  mir-189-prec-2   CTCCGGTGCCTACTGAGCTGATATCAGTTCTCATTTTACACACTGGCTCAGTTCAGCAGGAACAGGAG 256
  mir-190-prec-1 TGCAGGCCTCTGTGTGATATGTTTGATATATTAGGTTGTTATTTAATCCAACTATATATCAAACATATTCCTACAGTGTCTTGCC 257
  mir-190-prec-2   CTGTGTGATATGTTTGATATATTAGGTTGTTATTTAATCCAACTATATATCAAACATATTCCTACAG 258
  mir-191-prec-1   CGGCTGGACAGCGGGCAACGGAATCCCAAAAGCAGC TGTTGTCTCCAGAGCATTCCAGCTGCGCTTGGATTTCGTCCCCTGCTCTCCTGCCT 259
  mir-191-prec-2 AGCCGGCAACGGAATCCCAAAAGCAGCTGTTGTCTCCAGAGCATTCCAGCTGCGCTTGGATTTCGTCCCCTGCT 260
  mir-192-2/3 CCGAGACCGAGTGCACAGGGCTCTGACCTATGAATT GACAGCCAGTGCTCTCTCGTCTCCCCTCTGGCTGCCAATTCCATAGGTCACAGGTATGTTCGCCTCAATGCCAG 261
  mir-192-prec GCCGAGACCGAGTGCACAGGGCTCTGACCTATGAAT TGACAGCCAGTGCTCTCGTCTCCCCTCTGGCTGCCAATTCCATAGGTCACAGGTATGTTCGCCTCAATGCCAGC 262
  mir-193-prec-1   CGAGGATGGGAGCTGAGGGCTGGGTCTTTGCGGGCGAGATGAGGGTGTCGGATCAACTGGCCTACAAAGTCC 263
  mir-193-prec-2   GCTGGGTCTTTGCGGGCGAGATGAGGGTGTCGGATCAACTGGCCTACAAAGTCCCAGT 264
  mir-194-prec-1 ATGGTGTTATCAAGTGTAACAGCAACTCCATGTGGACTGTGTACCAATTTCCAGTGGAGATGCTGTTACTTTTGATGGTTACCAA 265
  mir-194-prec-2   GTGTAACAGCAACTCCATGTGGACTGTGTACCAATTTCCAGTGGAGATGCTGTTACTTTTGAT 266
  mir-195-prec-1 AGCTTCCCTGGCTCTAGCAGCACAGAAATATTGGCACAGGGAAGCGAGTCTGCCAATATTGGCTGTGCTGCTCCAGGCAGGGTGGTG
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQIDNO：
  mir-195-prec-2   TAGCAGCACAGAAATATTTGGCACAGGGAAGCGAGTC TGCCAATATTGGCTGTGCTGCT 268
  mir-196-1-prec CTAGAGCTTGAATTGGAACTGCTGAGTGAATTAGGTA GTTTCATGTTGTTGGCCTGGGTTTCTGAACACAACAACATTAAACCACCCGATTCACGGCAGTTACTGCTCC 269
  mir-196-1-prec GTGAATTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGCCTGGGTTTCTGAACACAACAACATTAAACCACCCGATTCAC 270
  mir-196-2-prec TGCTCGCTCAGCTGATCTGTGGCTTAGGTAGTTTCAT GTTGTTGGGATTGAGTTTTGAACTCGGCAACAAGAAACTGAACACAACAACATTAAACCACCCGATTCAC 271
  mir-196-prec GTGAATTAGGTAGTTTCATGTTGTTGGGCCTGGGTTT CTGAACACAACAACATTAAACCACCCGATTCAC 272
  mir-197-PREC   GGCTGTGCCGGGTAGAGAGGGCAGTGGGAGGTAAGAGCTCTTCACCCTTCACCACCTTCTCCACCCAGCATGGCC 273
  mir-198-prec   TCATTGGTCCAGAGGGGAGATAGGTTCCTGTGATTTTTCCTTCTTCTCTATAGAATAAATGA 274
  mir-199a-1-prec GCCAACCCAGTGTTCAGACTACCTGTTCAGGAGGCTCTCAATGTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGC 275
  mir-199a-2-prec AGGAAGCTTCTGGAGATCCTGCTCCGTCGCCCCAGTG TTCAGACTACCTGTTCAGGACAATGCCGTTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGACTGGGCAAGGGAGAGCA 276
  mir-199b-prec CCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAG ACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGG 277
  mir-200a-prec   GCCAACCCAGTGTTCAGACTACCTGTTCAGGAGGCTCTCAATGTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGC 278
  mir-200b-prec   GCCGTGGCCATCTTACTGGGCAGCATTGGATGGAGTCAGGTCTCTAATACTGCCTGGTAATGATGACGGC 279
  mir-200b-prec   CCAGCTCGGGCAGCCGTGGCCATCTTACTGGGCAGCATTGGATGGAGTCAGGTCTCTAATACTGCCTGGTAATG ATGACGGCGGAGCCCTGCACG 280
  mir-202-prec   GTTCCTTTTTCCTATGCATATACTTCTTTGAGGATCTGGCCTAAAGAGGTATAGGGCATGGGAAGATGGAGC 281
  mir-203-prec   GTGTTGGGGACTCGCGCGCTGGGTCCAGTGGTTCTTAACAGTTCAACAGTTCTGTAGCGCAATTGTGAAATGTT TAGGACCACTAGACCCGGCGGGCGCGGCGACAGCGA 282
  mir-204-prec GGCTACAGTCTTTCTTCATGTGACTCGTGGACTTCCCT TTGTCATCCTATGCCTGAGAATATATGAAGGAGGCTGGGAAGGCAAAGGGACGTTCAATTGTCATCACTGGC 283
  mir-205-prec AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCT TCATTCCACCGGAGTCTGTCTCATACCCAACCAGATTTCAGTGGAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA 284
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQ IDNO：
  mir-206-prec-1   TGCTTCCCGAGGCCACATGCTTCTTTATATCCCCATATGGATTACTTTGCTATGGAATGTAAGGGAAGTGTGTGGTTTCGGCAAGTG 285
  mir-206-prec-2   AGGCCACATGCTTCTTTATATCCCCATATGGATTACTTTGCTATGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGTTTT 286
  mir-208-prec   TGACGGGCGAGCTTTTGGCCCGGGTTATACCTGATGCTCACGTATAAGACGAGCAAAAAGCTTGTTGGTCA 287
  mir-210-prec   ACCCGGCAGTGCCTCCAGGCGCAGGGCAGCCCCTGCCCACCGCACACTGCGCTGCCCCAGACCCACTGTGCGT GTGACAGCGGCTGATCTGTGCCTGGGCAGCGCGACCC 288
  mir-211-prec TCACCTGGCCATGTGACTTGTGGGCTTCCCTTTGTCAT CCTTCGCCTAGGGCTCTGAGCAGGGCAGGGACAGCAAAGGGGTGCTCAGTTGTCACTTCCCACAGCACGGAG 289
  mir-212-prec   CGGGGCACCCCGCCCGGACAGCGCGCCGGCACCTTGGCTCTAGACTGCTTACTGCCCGGGCCGCCCTCAGTAA CAGTCTCCAGTCACGGCCACCGACGCCTGGCCCCGCC 290
  mir-213-prec CCTGTGCAGAGATTATTTTTTAAAAGGTCACAATCAA CATTCATTGCTGTCGGTGGGTTGAACTGTGTGGACAAGCTCACTGAACAATGAATGCAACTGTGGCCCCGCTT 291
  mir-213-prec-LIM   GAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGT TGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCC 292
  mir-214-prec   GGCCTGGCTGGACAGAGTTGTCATGTGTCTGCCTGTCTACACTTGCTGTGCAGAACATCCGCTCACCTGTACAG CAGGCACAGACAGGCAGTCACATGACAACCCAGCCT 293
  mir-215-prec ATCATTCAGAAATGGTATACAGGAAAATGACCTATG AATTGACAGACAATATAGCTGAGTTTGTCTGTCATTTCTTTAGGCCAATATTCTGTATGACTGTGCTACTTCAA 294
  mir-216-prec GATGGCTGTGAGTTGGCTTAATCTCAGCTGGCAACTG TGAGATGTTCATACAATCCCTCACAGTGGTCTCTGGGATTATGCTAAACAGAGCAATTTCCTAGCCCTCACGA 295
  mir-217-prec AGTATAATTATTACATAGTTTTTGATGTCGCAGATAC TGCATCAGGAACTGATTGGATAAGAATCAGTCACCATCAGTTCCTAATGCATTGCCTTCAGCATCTAAACAAG 296
  mir-218-1-prec GTGATAATGTAGCGAGATTTTCTGTTGTGCTTGATCT AACCATGTGGTTGCGAGGTATGAGTAAAACATGGTTCCGTCAAGCACCATGGAACGTCACGCAGCTTTCTACA 297
  mir-218-2-prec GACCAGTCGCTGCGGGGCTTTCCTTTGTGCTTGATCT AACCATGTGGTGGAACGATGGAAACGGAACATGGTTCTGTCAAGCACCGCGGAAAGCACCGTGCTCTCCTGCA 298
  名称   前体序列(5’至3’)*   SEQIDNO：
  mir-219-prec CCGCCCCGGGCCGCGGCTCCTGATTGTCCAAACGCAA TTCTCGAGTCTATGGCTCCGGCCGAGAGTTGAGTCTGGACGTCCCGAGCCGCCGCCCCCAAACCTCGAGCGGG 299
  mir-220-prec GACAGTGTGGCATTGTAGGGCTCCACACCGTATCTGA CACTTTGGGCGAGGGCACCATGCTGAAGGTGTTCATGATGCGGTCTGGGAACTCCTCACGGATCTTACTGATG 300
  mir-221-prec   TGAACATCCAGGTCTGGGGCATGAACCTGGCATACAATGTAGATTTCTGTGTTCGTTAGGCAACAGCTACATT GTCTGCTGGGTTTCAGGCTACCTGGAAACATGTTCTC 301
  mir-222-prec   GCTGCTGGAAGGTGTAGGTACCCTCAATGGCTCAGTAGCCAGTGTAGATCCTGTCTTTCGTAATCAGCAGCTAC ATCTGGCTACTGGGTCTCTGATGGCATCTTCTAGCT 302
  mir-223-prec   CCTGGCCTCCTGCAGTGCCACGCTCCGTGTATTTGACAAGCTGAGTTGGACACTCCATGTGGTAGAGTGTCAGT TTGTCAAATACCCCAAGTGCGGCACATGCTTACCAG 303
  mir-224-prec GGGCTTTCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAGTAGATGATTGTGCATTGTTTCAAATGGTGCCCTAGTGACTACAAAGCCC 304
  mir-29b-1＝102-prec1   CTTCTGGAAGCTGGTTTCACATGGTGGCTTAGATTTTTCCATCTTTGTATCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTTTAGGAG 305
  mir-29b-2(miR-29b-3)＝102prec 7.1＝7.2   CTTCAGGAAGCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTCTTGGGGG 306
  mir-30*＝mir-097-prec-6 GTGAGCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGCCTACT 307
  mir-033b ACCAAGTTTCAGTTCATGTAAACATCCTACACTCAGCTGTAATACATGGATTGGCTGGGAGGTGGATGTTTACTTCAGCTGACTTGGA 308
  mir-101-precursor-9(mir-101-3)   TGCCCTGGCTCAGTTATCACAGTGCTGATGCTGTCTATTCTAAAGGTACAGTACTGTGATAACTGAAGGATGGCA 309
  mir-108-1-small   ACACTGCAAGAACAATAAGGATTTTTAGGGGCATTATGACTGAGTCAGAAAACACAGCTGCCCCTGAAAGTCCCTCATTTTTCTTGCTGT 310
  mir-108-2-small   ACTGCAAGAGCAATAAGGATTTTTAGGGGCATTATGATAGTGGAATGGAAACACATCTGCCCCCAAAAGTCCCTCATTTT 311
  mir-123-prec-1(mir-126-prec-1)   CGCTGGCGACGGGACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGCCGTCCACGGCA 312
  mir-123-prec-2(mir-126-prec-2)   ACATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCGC 313
  mir-129-1-prec TGGATCTTTTTGCGGTCTGGGCTTGCTGTTCCTCTCAACAGTAGTCAGGAAGCCCTTACCCCAAAAAGTATCTA 314
  mir-129-2   TGCCCTTCGCGAATCTTTTTGCGGTCTGGGCTTGCTGTACATAACTCAATAGCCGGAAGCCCTTACCCCAAAAAGCATTTGCGGAGGGCG 315
  mir-133b-small   GCCCCCTGCTCTGGCTGGTCAAACGGAACCAAGTCCGTCTTCCTGAGAGGTTTGGTCCCCTTCAACCAGCTACAGCAGGG 316
  mir-135-small-2   AGATAAATTCACTCTAGTGCTTTTATGGCTTTTTATTCC TATGTGATAGTAATAAAGTCTCATGTAGGGATGGAAGCCATGAAATACATTGTGAAAAATCA 317
  mir-148b-small   AAGCACGATTAGCATTTGAGGTGAAGTTCTGTTATACACTCAGGCTGTGGCTCTCTGAAAGTCAGTGCAT   318
  mir-151-prec   CCTGTCCTCAAGGAGCTTCAGTCTAGTAGGGGATGAGACATACTAGACTGTGAGCTCCTCGAGGGCAGG 319
  mir-155-prec(BIC)   CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTAACAG 320
  mir-156＝mir-157＝overlapmir-141   CCTAACACTGTCTGGTAAAGATGGCTCCCGGGTGGGTTCTCTCGGCAGTAACCTTCAGGGAGCCCTGAAGACCATGGAGGAC 321
  mir-158-small＝mir-192 GCCGAGACCGAGTGCACAGGGCTCTGACCTATGAAT TGACAGCCAGTGCTCTCGTCTCCCCTCTGGCTGCCAATTCCATAGGTCACAGGTATGTTCGCCTCAATGCCAGC 322
  mir-159-1-small   TCCCGCCCCCTGTAACAGCAACTCCATGTGGAAGTGCCCACTGGTTCCAGTGGGGCTGCTGTTATCTGGGGCGAGGGCCA 323
  mir-161-small   AAAGCTGGGTTGAGAGGGCGAAAAAGGATGAGGTGACTGGTCTGGGCTACGCTATGCTGCGGCGCTCGGG   324
  mir-163-1b-small   CATTGGCCTCCTAAGCCAGGGATTGTGGGTTCGAGTCCCACCCGGGGTAAAGAAAGGCCGAATT   325
  mir-163-3-small   CCTAAGCCAGGGATTGTGGGTTCGAGTCCCACCTGGGGTAGAGGTGAAAGTTCCTTTTACGGAATTTTTT 326
  mir-175-small＝mir-224   GGGCTTTCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAGTAGATGATTGTGCATTGTTTCAAAATGGTGCCCTAGTGACTACAAAGCCC 327
  mir-177-small   ACGCAAGTGTCCTAAGGTGAGCTCAGGGAGCACAGAAACCTCCAGTGGAACAGAAGGGCAAAAGCTCATT 328
  mir-180-small   CATGTGTCACTTTCAGGTGGAGTTTCAAGAGTCCCTTCCTGGTTCACCGTCTCCTTTGCTCTTCCACAAC 329
  mir-187-prec   GGTCGGGCTCACCATGACACAGTGTGAGACTCGGGCTACAACACAGGACCCGGGGCGCTGCTCTGACCCCTCG TGTCTTGTGTTGCAGCCGGAGGGACGCAGGTCCGCA 330
  mir-188-prec TGCTCCCTCTCTCACATCCCTTGCATGGGTGGAGGGTGAGCTTTCTGAAAACCCCTCCCACATGCAGGGTTTGCAGGATGGCGAGCC 331
  mir-190-prec TGCAGGCCTCTGTGTGATATGTTTGATATATTAGGTTGTTATTTAATCCAACTATATATCAAACATATTCCTACAGTGTCTTGCC 332
  mir-197-2   GTGCATGTGTATGTATGTGTGCATGTGCATGTGTATGTGTATGAGTGCATGCGTGTGTGC 333
  mir-197-prec   GGCTGTGCCGGGTAGAGAGGGCAGTGGGAGGTAAGAGCTCTTCACCCTTCACCACCTTCTCCACCCAGCATGGCC 334
  mir-202-prec   GTTCCTTTTTCCTATGCATATACTTCTTTGAGGATCTGGCCTAAAGAGGTATAGGGCATGGGAAGATGGAGC 335
  mir-294-1(chr16)   CAATCTTCCTTTATCATGGTATTGATTTTTCAGTGCTTCCCTTTTGTGTGAGAGAAGATA 336
  mir-hes1   ATGGAGCTGCTCACCCTGTGGGCCTCAAATGTGGAGGAACTATTCTGATGTCCAAGTGGAAAGTGCTGCGACATTTGAGCGTCACCGGTGACGCCCATATCA 337
  mir-hes2   GCATCCCCTCAGCCTGTGGCACTCAAACTGTGGGGGCACTTTCTGCTCTCTGGTGAAAGTGCCGCCATCTTTTGAGTGTTACCGCTTGAGAAGACTCAACC 338
  mir-hes3   CGAGGAGCTCATACTGGGATACTCAAAATGGGGGCGCTTTCCTTTTTGTCTGTTACTGGGAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGTCCCTGTTTGAGTAGGGCATC 339
  mir-29b-1   CTTCAGGAAGCTGGTTTCATATGGTGGTTTAGATTTAAATAGTGATTGTCTAGCACCATTTGAAATCAGTGTTCTTGGGGG   340
*前体序列内下划线标示的序列表示经加工的miR转录物(成熟的microRNA)。所有序列是人的序列。
诊断和预后方法
根据本发明，可通过检测相对于对照样品，样品中的miR基因产物的量的减少、miR基因拷贝数的减少或通过检测一个或更多个拷贝的miR基因的突变来诊断或预示BCL2相关癌症，其中miR基因包含与BCL2基因转录物(例如，如此处所描述的)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因的miR基因拷贝数目从二倍体至单倍体或至无拷贝的减少诊断或预示BCL2相关癌症。同样，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因的一个或两个拷贝的突变意味着基因功能的丢失，且是BCL2相关癌症的诊断或预示。
如此处所用的，“CLL细胞”可以是来自具有或怀疑具有CLL的受试者的淋巴细胞，其中淋巴细胞具有至少为4的“CLL评分”，如根据Matutes等人，Leukemia 8(10)：1640-1645(1994)(其全部分公开内容在此引用作为参考)的评分系统所确定的。如此处所用的，“前列腺癌细胞”可以是前列腺来源的赘生性细胞或肿瘤细胞，无论其是否位于前列腺。其他BCL2相关癌细胞对于本领域技术人员来说是已知的，并且在此进行了描述。
miR15和miR16基因的核酸序列包含在克隆317g11内，在GenBank目录号：AC069475中给出了其核苷酸序列。GenBank目录号AC069475的全部公开内容在此引用作为参考。这样检测包含与BCL2基因产物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因的缺失或突变，即通过确定来自怀疑具有BCL2相关癌症(例如，CLL、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌)的受试者的组织中的基因的结构或序列，然后将其与来自受试者的未受影响的组织的样品中或来自正常对照的组织的样品中的这些基因的结构或序列进行比较来进行检测。可使用任何合适的技术(例如，此处描述的技术)进行该比较。
在一个实施方案中，为诊断BCL2相关癌症，组织样品来源于受试者。然后制备样品以确定miR基因产物的表达或一个或更多个miR基因的缺失或突变。合适的组织样品包括但不限于目标活检组织以及血液和/或液体样品。
如此处所用的，“BCL2相关癌症”是与BCL2基因或基因产物的过度表达相关的癌症，其可以是表征为相对于合适的对照细胞表达更高水平的一种或多种BCL2基因产物的细胞的任何癌症。根据本发明的方法，合适的对照细胞可以是来自未受过度表达Bcl2的癌症影响的个体，或它们可以是来自危难中的受试者的非癌细胞，或其可以是来自受过度表达Bcl2的癌症的影响的另一个个体的非癌细胞。
可使用miR基因的探针(例如，如此处描述的)通过来自受试者的基因组DNA的Southern印迹杂交来检测miR基因缺失或突变的存在。例如，可使用常规活组织检查技术从怀疑具有BCL2相关癌症的受试者取出组织样品。可选择地，可从怀疑具有BCL2相关癌症的受试者取出血液样品，然后分离白细胞以进行DNA提取。可在开始放射疗法或化学疗法之前从患者获取血液或组织样品。可从受试者的未受影响的组织或从正常人个体获得用作对照的相应的组织或血液样品。
Southern印迹杂交技术在本领域的技术范围之内。例如，可用限制性内切酶降解从来自怀疑具有BCL2相关癌症的受试者的组织或液体(例如，血液)分离的基因组DNA。该降解产生可通过电泳在例如琼脂糖凝胶上分离的基因组DNA的限制性片段。然后将限制性片段转印至杂交膜(例如，硝酸纤维素膜、尼龙膜)上，然后用对于一种或更多种miR基因(例如，包含与BCL2基因的转录物的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)是特异性的探针进行杂交。与对照DNA样品(所述对照DNA样品接受与来自受试者的DNA样品完全相同的处理)相比，杂交膜上的限制性片段模式的改变表明一个或更多个基因的缺失或突变。可由本领域普通技术人员容易地确定用于检测miR基因拷贝数目或miR基因内的突变的探针标记和杂交的条件。如此处所用的术语“缺失”是指基因的部分缺失或整个基因的缺失。
例如，可基于miR-15a和miR-16-1 microRNA的公开的序列设计用于Southern印迹杂交的miR-15a和miR-16-1核酸探针，如在Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858(2001)中所描述，其全部公开内容在此引用作为参考。miR-15a microRNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQ ID NO：3)。miR-16-1 microRNA的核苷酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQ ID NO：4)。用于检测miR-15a和miR-16-1 DNA的合适的探针分别是：
CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO：5)
GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO：6)
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的互补序列还可用于探测miR-15a和miR-16-1 DNA。可由本领域技术人员容易地确定用于检测miR-15a、miR-16-1或其他miR基因(例如，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)的其他合适的探针。
在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第10和11章(其公开内容在此引用作为参考)中描述了用于制备标记的DNA和RNA探针的方法和其杂交的条件。
例如，可用放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S；重金属；或能够用作标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)、荧光分子、化学发光分子和酶等来标记核酸探针。
可通过Rigby等人，J.Mol.Biol.113：237-251(1977)的缺口平移法或Fienberg等人，Anal.Biochem.132：6-13(1983)的随机引物法将探针标记至高比放射性，所述两篇文献的全部公开内容在此引用作为参考。后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P标记的探针的方法。例如，按照缺口平移法用高放射性核苷酸取代预先存在的核苷酸，可能制备具有超过108cpm/微克的比放射性的32P标记的核酸探针。然后通过将杂交滤膜(hybridized filter)暴露于照相胶片进行杂交的放射自显影检测。通过杂交滤膜暴光的照片胶片的光密度扫描提供了miR15或miR16基因拷贝数目的精确测量。可选择地，可用计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences，Piscataway，NJ商购获得的Molecular Dynamics 400-B 2DPhosphorimager定量miR15或miR16基因拷贝数。
当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将核苷酸类似物(例如，dTTP类似物、5-(N-(N-生物素基-ε-氨己酰基)-3-氨丙酰基)脱氧尿苷三磷酸)整合入探针分子。可通过与偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的、生物素结合蛋白例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或抗生物素抗体反应来检测生物素化探针寡核苷酸。
还可通过使用聚合酶链式反应(PCR)扩增这些基因的片段，然后通过测序或通过电泳分析扩增的片段以确定来自受试者的DNA样品的扩增的片段的序列和/或长度是否与对照DNA样品的扩增片段不同来检测miR基因的缺失或突变。可由本领域技术人员容易地确定用于DNA片段的PCR扩增的合适的反应和循环条件。在下列的实施例中描述的方法中提供了示例性PCR反应和循环条件。
可通过检测miR基因(例如，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)的缺失来进行BCL2相关癌症的诊断。例如，不同染色体标记例如图2A-2D中标示的标记之间的miR的缺失。例如，包含miR-15a和miR-16-1的微卫星(小随体)标记D13S272和D13S273之间的13q14区域中的缺失可表明存在BCL2相关癌症。此外，当13q14中的缺失在其中缺失miR15或miR16的微卫星标记D13S1150和D13S272之间或在基因座Alu18和微卫星标记D13S272之间时，可表明存在BCL2相关癌症。
确定组织样品中每双倍体基因组的包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因(例如，miR-15a或miR-16-1基因)的拷贝数的可选择的方法依赖于这样的事实，即miR-15a/miR-16-1基因簇位于13q14，并且与标记D13S272和D13S273连接。在与D13S272和D13S273标记连接的基因座上为杂合的个体中的miR-15a或miR-16-1的拷贝的丢失可从这些基因的杂合性丢失推断出来。用于确定染色体标记的杂合性丢失的方法在本领域技术人员的能力范围之内。下面的实施例3中描述了示例性杂交性丢失研究。
用于研究怀疑具有BCL2相关癌症的受试者中一个或更多个miR基因是否突变的另一个技术是例如Orita，等人，Genomics 5：874-879(1989)和Hayashi，PCR Methods and Applic.1：34-38(1991)中描述的单链构象多态性(single strand conformationalpolymorphism)(SSCP)，所述参考文献的全部公开内容在此引用作为参考。SSCP技术由：通过PCR扩增目标基因(例如，miR基因)的片段；使片段变性并在非变性条件下对两个变性的单链进行电泳组成。单链呈现影响链电泳迁移率的复杂序列依赖性链内二级结构。
一种或更多种miR基因的缺失或突变也可使这些miR基因的表达减少。因此，也可通过检测从一种或更多种miR基因(例如，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)产生的RNA的表达水平来诊断BCL2相关癌症，其中miR基因表达的减少是BCL2相关癌症的诊断。
转录miR基因以产生形成茎-环结构的前体RNA。前体RNA不翻译成蛋白质，但加工成被认为是功能基因产物的“micro RNA”或“miRNA”。
如此处所用的，“miR基因产物”意指来自miR基因的加工的或未加工的RNA转录物，如下面更详细描述的。术语“RNA”、“RNA转录物”和“基因产物”此处在miR基因表达的上下文中可互换使用。
例如，在Lagos-Quintana，等人，Science 294，853-858(2001)中描述miR-15a和miR-16-1前体RNA。miR-15a和miR-16-1前体RNA的序列表示为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。预测的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的茎-环结构分别示于图1A和1B中。
[SEQ ID NO：1]：
ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcug ccucaaaaauacaagg
[SEQ ID NO：2]：
gucagcagugccuuagcagcacguaaauauuggcguuaagauucuaaaauuaucuccaguauuaacug ugcugcugaaguaagguugac
不希望受限于任何理论，据认为miR-15a和miR16-1前体RNA从miR-15a/miR-16-1基因簇共表达，并且由Dicer/Argonaute复合物加工成功能性miRNA产物。参见，例如，Lee等人，Science 294：862(2001)。来自这些基因的两种功能性miRNA产物是长度为22个核苷酸的单链RNA分子，其具有5′末端单磷酸和3′末端羟基。加工的miR-15amicroRNA的核苷酸序列是uagcagcacauaaugguuugug(SEQ ID NO：3)。加工的miR-16-1 microRNA的核苷酸序列是uagcagcacguaaauauuggcg(SEQ ID NO：4)。在本发明的实践中，可检测从miR-15a或miR-16-1基因产生的60-70 nt的RNA前体分子。可选择地，可检测通过Dicer和Argonaute蛋白加工前体RNA产生的更短的miR-15a和miR-16-1microRNA基因产物。
用于确定RNA表达水平的方法在本领域技术人员的水平之内。例如，如此处所述从怀疑具有BCL2相关癌症的受试者获得组织或血液样品。作为对照，如此处所描述的，可从受试者的未受影响的组织或从正常人个体获得相应的组织或血液样品。然后随同来自受试者的样品一起处理对照组织或血液样。然后可将受试者中的miR基因(例如，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)表达的水平与来自受试者的未受影响的组织的miR基因的表达水平比较，或与来自正常对照的组织或血液中的miR表达水平比较。例如，常规地就一个或多个标准确定BCL2相关癌症细胞中的相对miR表达水平。所述标准可包括，例如，一方面零表达水平和另一方面相同患者的正常组织中的基因的表达水平或正常对照组的组织中的表达水平。标准也可包括标准细胞系中的miR表达水平。在一个实施方案中，与正常表达水平相比，miR表达减少的强度表示治疗后将来的临床结果。
可选择地，可将怀疑具有BCL2相关癌症的受试者中的miR基因表达(例如，包含与BCL2基因转录物中核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)的水平与之前获得的正常人对照群体的miR基因表达的平均水平比较。
用于确定细胞中特定基因的RNA转录物的水平的合适技术对于本领域技术人员来说是熟知的。根据一个这样的方法，可通过在核酸提取缓冲液存在的情况下匀浆，然后离心来从细胞纯化总RNA。沉淀核酸，然后用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离RNA分子，然后使用例如所谓的“Northern”印迹技术将其转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热将RNA固定在滤膜上。使用合适的与所述RNA互补的标记的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，第7章，其全部公开内容在此引用作为参考。用于miR-15a或miR-16-1 RNA的Northern印迹杂交的合适的探针包括，例如，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
可通过将杂交滤膜暴露于照相胶片来进行探针对miR RNA的杂交的放射自显影检测。接受杂交滤膜暴光的照相胶片的光密度扫描提供了RNA转录物水平的精确测量。可选择地，可使用例如可从AmershamBiosciences，Piscataway，NJ商购获得的Molecular Dynamics 400-B2D Phosphorimager通过杂交印迹的计算机化成像来定量RNA转录物的水平。
除了Northern和其他RNA印迹杂交技术外，可按照原位杂交的技术进行RNA转录水平的定量。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞沉积在显微镜盖玻片上，然后用含有放射性标记或其他标记的寡核苷酸(例如，cDNA或cRNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该技术特别适合分析来自怀疑具有BCL2相关癌症(例如，CLL、前列腺癌)的受试者的组织活检样品。在美国专利号5,427,916(其全部公开内容在此引用作为参考)中更详细地描述了原位杂交技术的实施。用于miR-15a或miR-16-1 RNA的原位杂交的合适的探针包括例如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
还可通过miR转录物的反转录，然后在聚合酶链式反应(RT-PCR)中进行扩增来确定特定miR转录物的相对数目。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“管家”基因的mRNA的水平比较来确定miR转录物的水平。用作内部标准的合适的“管家”基因包括，例如，肌球蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR和其变化形式的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
用于测量miR基因转录物的表达的其他方法对于本领域技术人员来说也是已知的，包括用于测量RNA转录和降解率的各种方法。
治疗法
可通过对BCL2相关癌细胞单独地或联合施用一种或更多种miR基因(例如，包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)的分离的基因产物来治疗BCL2相关癌症。不希望受限于任何理论，据认为miR基因产物抑制此类癌细胞的赘生性或致瘤性生长。
特别地，可通过对癌细胞单独地或联合施用一种或更多种miR基因的分离的基因产物来治疗BCL2相关癌症。
如此处所用的，“BCL2相关癌细胞”是可从遭受BCL2相关癌症的受试者分离的肿瘤细胞或赘生性细胞。可通过检测相对于正常对照细胞，细胞中的BCL2基因产物的表达水平的增加或通过检测细胞中的癌性或赘生性表型来鉴定BCL2相关癌细胞。本领域技术人员可容易地鉴定具有癌性或赘生性表型的细胞。例如，此类细胞在培养中对接触诱导的生长抑制不敏感，当长期培养时可形成病灶集中点(foci)。癌细胞或赘生性细胞还展示独特的形态学变化，集落生长的无组织模式和非停泊性生长(anchorage-independent growth)的获得。癌细胞或赘生性细胞还具有在易感动物中形成侵袭性肿瘤的能力，可使用本领域技术人员的能力范围内的技术将细胞注射入例如无胸腺小鼠来估量该能力。
如此处所用的，“分离的”基因产物是通过人工干预从天然状态改变或取出的基因产物。例如，天然地存在于活的动物中的RNA不是“分离的”。合成的RNA或者部分或完全从其天然状态的共存在的材料分离的RNA是“分离的”。分离的RNA可大体上以纯化的形式存在，或可存在于已将该RNA递送入其中的细胞中。因此，有意递送至细胞或在细胞(例如，BCL2相关癌症细胞)中表达的miR基因产物被认为是“分离的”基因产物。
可使用许多标准的技术获得miR基因产物。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生基因产物。在一个实施方案中，使用合适地保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成RNA产物。合成的RNA分子或合成试剂的商业提供商包括例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，USA)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，USA)、Glen Research(Sterling，VA，USA)、ChemGenes(Ashland，MA，USA)和Cruachem(Glasgow，UK)。
可选择地，可使用任何合适的启动子从重组的环状或线状DNA质粒表达一种或更多种miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括U6或H1 RNA pol III启动子序列或细胞巨化病毒(CMV)启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力范围之内。此类重组质粒还可包含用于在细胞(例如，BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺癌细胞、其他癌细胞))中表达一种或更多种miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可使用标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至和直接在癌细胞(例如，BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺癌细胞、其他癌细胞))中表达。在下面更详细地讨论重组质粒用于将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
可从分开的重组质粒表达多种miR基因产物，或可从相同的重组质粒表达多种miR基因产物。在一个实施方案中，一种或多种miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后使用合适的加工系统将所述前体分子加工成功能性miRNA分子。合适的加工系统包括，例如，Tuschl等人的美国公开申请号2002/0086356(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述的体外果蝇细胞裂解系统。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将表达miR基因产物的核酸序列插入质粒的方法和将重组质粒递送至目标细胞的方法在本领域技术人员的能力范围之内。参见，例如，Zeng，等人，MolecularCell 9：1327-1333(2002)；Tuschl，Nat.Biotechnol，20：446-448(2002)；Brummelkamp，等人，Science 296：550-553(2002)；Miyagishi，等人，Nat.Biotechnol.20：497-500(2002)；Paddison，等人，Genes Dev.16：948-958(2002)；Lee，等人，Nat.Biotechnol.20：500-505(2002)；和Paul，等人，Nat.Biotechnol.20：505-508(2002)，其全部公开内容在此引用作为参考。
在特定的实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子控制之下的编码miR前体RNA的序列。如此处所用的，“在启动子的控制之下”意指编码miRNA产物的核酸序列位于启动子的3′，这样启动子才可以起始miRNA编码序列的转录。
还可从重组病毒载体表达miR基因产物。涉及到，可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达miR基因产物。可使用标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA，或可在BCL2相关癌细胞中直接表达。在下面更详细地描述重组病毒载体用于将miR基因产物递送至BCL-2相关癌细胞的用途。
本发明的重组病毒载体包含编码一种或多种miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适启动子。如此处所描述的，合适的启动子包括，例如，U6或H1RNA pol III启动子序列，或细胞巨化病毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力范围之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在BCL2相关癌细胞中表达一种或更多种miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可使用能够接受编码miR基因产物的核苷酸序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。还可通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原假型化(pseudotyping)载体来修饰病毒载体的向性。例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola病毒等的表面蛋白假型化本发明的AAV载体。适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将表达RNA的核酸序列插入质粒的方法、将病毒载体递送至目标细胞和回收表达的RNA产物的方法均在本领域技术人员的能力范围之内。参见，例如，Dornburg，Gene Therap.2：301-310(1995)；Eglitis，Biotechniques 6：608-614(1988)；Miller，Hum.Gene Therap.1：5-14(1990)；和Anderson，Nature 392：25-30(1998)，其全部公开内容在此引用作为参考。
优选病毒载体是来源于AV和AAV的病毒载体。在Xia，等人，Nat.Biotech.20：1006-1010(2002)(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述了用于表达本发明的miRNA的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于将载体递送至靶细胞的方法。在Samulski，等人，J.Virol.61：3096-3101(1987)、Fisher，等人，J.Virol.，70：520-532(1996)、Samulski，等人，J.Virol.63：3822-3826(1989)、美国专利号：5,252,479、美国专利号：5,139,941、国际专利申请号：WO 94/13788、和国际专利申请号：WO 93/24641(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述了用于表达本发明的miRNA的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法和用于将载体递送至靶细胞的方法。在特定的实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达一种或更多种miR基因产物。
在一个实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6 RNA启动子控制下的编码与polyT终止序列有效连接的miR前体RNA的核酸序列。如此处所用的，“与polyT终止序列有效连接的”意指编码有义或反义链的核酸序列在5′方向紧邻polyT终止信号。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
在特定的实施方案中，将一种或更多种miR基因产物用于抑制BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺癌细胞、其他癌细胞)的赘生性生长或致瘤性生长。不希望受限于任何一种理论，据认为经加工的miRNA结合在一种或更多种启动和/或保持这些细胞的赘生性生长或致瘤性生长所必需的靶mRNA中的互补序列。因此，本发明提供了在需要该治疗的受试者中治疗BCL2相关癌症例如CLL、急性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌的方法。方法包括对受试者施用有效量的一种或更多种miR基因产物，这样就抑制了BCL2相关癌细胞的增殖。在一个实施方案中，一种或更多miR基因产物包含与BCL2转录物内的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
例如，可在来自至少下列组织亚型的癌症的原发性肿瘤或转移瘤或赘生性细胞中减少一种或更多种miR基因的表达或使其表达不存在，所述组织亚型的癌症为：肉瘤(中胚层来源的结缔组织和其他组织的癌症)；黑色素瘤(来源于色素黑色素细胞的癌症)；癌瘤(上皮细胞来源的癌症)；腺癌(腺上皮来源的癌症)；神经来源的癌症(神经胶质瘤/胶质母细胞瘤和星形细胞瘤)；和血液瘤形成(hematologicalneoplasias)例如白血病和淋巴瘤(例如，急性成淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病CLL)。
也可在其来源至少为下列器官或组织(无论什么组织学亚型)的癌症中减少一种或更多种miR基因的表达或使其表达不存在，所述器官或组织是：乳腺、男性和女性泌尿生殖系统的组织(例如，输尿管、膀胱、前列腺、睾丸、卵巢、子宫颈、子宫、阴道)、肺、胃肠系统的组织(例如，胃、大肠和小肠、结肠、直肠)、外分泌腺例如胰腺和肾上腺、口和食道的组织、脑和脊髓、肾(肾脏)、胰腺、肝胆管系统(例如，肝、胆囊)、淋巴系统、平滑肌和横纹肌、骨和骨髓、皮肤以及眼的组织。
例如通过“总体分期分类(Overall Stage Grouping)”(也称为“罗马计数(Roman Numeral)”)或“肿瘤、结节和转移灶”(TNM)分期系统所测量的，发展的任何预后阶段的癌症或肿瘤中也可以减少一种或更多种miR基因的表达或使所述基因的表达不存在。给定的癌症的合适的预后分期系统和分期描述在本领域内是已知的，例如，如国立癌症研究所的“CancerNet”互联网站中所描述的。
可通过从受试者获得肿瘤细胞或赘生性细胞(或怀疑为肿瘤或赘生性的细胞)，然后确定与来自获自受试者的正常组织的细胞(例如，对照细胞)相比，一种或更多种miR基因(例如，包含与BCL2转录物内核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因)的表达在至少部分细胞中是否减少或不存在来鉴定需要治疗BCL2相关癌症的受试者。用于检测细胞中miR基因的表达水平的方法在本领域技术人员的能力范围之内并且在此处进行了描述。可选择地，可将从受试者获得的细胞中的一种或更多种miR基因产物的表达与从正常受试者的群体获得的细胞中的这些基因的平均表达水平比较。可由医生使用标准的诊断技术容易地鉴定需要BCL2相关癌症的治疗的受试者。参见，例如，“Chroniclymphocyticl eukemia：recommendations for diagnosis，staging，and response criteria.International Workshop on ChronicLymphocytic Leukemia，”(1989)Annals of Internal Medicine110(3)：236-238，其全部分公开内容在此引用作为参考。例如，具有CLL的受试者展示循环的CLL细胞、淋巴细胞增多(即，血液中淋巴细胞计数等于或高于每立方毫米10,000个细胞)和CLL细胞在骨髓和淋巴组织中的累进积累。
可通过血液样品的直接目视观察和/或在CLL的情况下通过确定淋巴细胞的“CLL评分”来确认受试者的血液或其他组织中BCL2相关癌细胞的鉴定。CLL评分表明CLL细胞的5种淋巴细胞表面标记特征：CD5+、CD23+、FMC7-和表面免疫球蛋白(SmIg)和CD22的弱表达(+/-)的存在或不存在。根据其对于CLL是典型的还是非典型的，该评分系统对这5个标记的各标记给出1或0的值。CLL细胞具有4或5的CLL评分，而来自其他白血病的淋巴细胞具有小于1至3的CLL评分。参见Matutes，等人，Leukemia 8(10)：1640-1645(1994)和Moreau，等人，American Journal of Clinical Pathology，108：378-82(1997)，其完整公开内容在此引用作为参考。CLL细胞还具有与正常的外周血B细胞相比相对低水平的表面膜免疫球蛋白。可按照标准的技术容易地检测淋巴细胞上的表面膜免疫球蛋白的水平；参见，例如，Rozman，等人，New England Journal of Medicine 333：1052-1057 1995)，其完整公开内容在此引用作为参考。
如此处所用的，miR基因产物的“有效量”是足以抑制遭受BCL2相关癌症的受试者中的BCL2相关癌细胞的增殖的量。如此处所用的，“抑制BCL2相关癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久地或暂时性地阻止细胞的生长。如果受试者中此类细胞的数目在施用miR基因产物后保持恒定或减少那么可推断出抑制BCL2相关癌细胞。如果此类细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速率减小也可推断出BCL2相关癌细胞增殖的抑制。
可通过直接测量或根据原发性肿瘤或转移瘤的质量估量来确定受试者体内BCL2相关癌细胞的数目。
例如，可使用全血或白细胞计数来容易地确定受试者中BCL2相关癌细胞的数目。还可使用设计用于检测BCL2相关癌细胞的特征表面标记的免疫组织学方法、流式细胞计量术或其他技术容易地确定BCL2相关癌细胞的数目。
可通过直接的目视观察或通过诊断性影像学方法例如X射线、磁共振影像学(MRI)、超声和闪烁照相术(scintigraphy)确定肿瘤块的大小。用于确定肿瘤块的大小的诊断性影像学如本领域内已知的，可采用或不采用照影剂。还可通过物理方法例如组织块的触诊或使用测量仪器例如测径器进行的组织块测量来确定肿瘤块的大小。
通过考虑因素例如受试者的身材大小和重量、疾病侵袭的程度、受试者的年龄、健康状况和性别、给药途径和施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的一种或更多种miR基因产物的有效量。
例如，miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的近似重量。可通过计算肿瘤块的近似体积来确定肿瘤块的近似重量，其中1立方厘米的体积大约等于1克。基于肿瘤块的重量，一种或更多种miR基因产物的有效量可以是至少大约10微克/克肿瘤块，和可以是大约10至500微克/克肿瘤块。此外，有效量可以是至少大约60微克/克肿瘤块或至少大约100微克/克肿瘤块。在特定的实施方案中，将基于肿瘤块的重量有效量直接注射入肿瘤。
一种或更多种miR基因产物的有效量也可基于待治疗的受试者的近似或估计的体重。在一个实施方案中，如此处所描述的，胃肠外或肠内施用该有效量。例如，对受试者施用的一种或更多种miR基因产物的有效量可以在大约5至3000微克/kg体重的范围内变化，和可在大约700至1000微克/kg的体重之间，也可大于约1000微克/kg体重。
本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用一种或更多种miR基因产物的合适的剂量方案。例如，可对受试者施用一种或更多种miR基因产物一次(例如，单次注射或沉积)。可选择地，可在从大约3至大约28天，更优选从大约7至大约10天的时期内每天1次或2次对受试者施用一种或更多种miR基因产物。在特定的剂量方案中，每天1次施用一种或更多种miR基因产物，进行7天。当剂量方案包含多次施用时，要理解对受试者施用的一种或更多种miR基因的有效量可包括在整个剂量方案中施用的基因产物的总量。
可使用适合将基因产物递送至受试者的细胞例如造血干细胞(HSC)和/或BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺癌细胞、其他癌细胞))的任何方法对受试者施用一种或更多种miR基因产物。例如，可使用适合用miR基因产物或用包含编码miR基因产物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法施用一种或更多种miR基因。可直接用一种或更多种miR基因产物(当这些产物是核酸时)直接转染细胞，或用包含编码一种或更多种miR基因产物的序列的核酸转染所述细胞。在一个实施方案中，用包含编码此处描述的一种或更多种miR基因产物的质粒或病毒载体转染细胞。
用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，其包括核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、基因枪(bioballistic)或粒子加速、磷酸钙沉淀和病毒载体介导的转染。
例如，可用脂质体转移化合物例如DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN转染细胞。使用的核酸的量对于本发明的实践不是至关重要的；可用0.1-100微克的核酸/105个细胞获得可接受的结果。例如，可使用每105个细胞大约0.5微克质粒载体(于大约3微克DOTAP中)。
在一个实施方案中，从受试者分离BCL2相关癌细胞例如CLL或前列腺癌细胞，用编码miR基因产物的核酸将其转染，然后再导入受试者。在特定的实施方案中，转染的和再植的细胞是CLL细胞。在另一个实施方案中，转染的和再植的细胞是来自已诊断具有BCL2相关癌症的受试者的HSC。
用于从受试者分离BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞)的技术在本领域技术人员的能力范围之内，例如，如下面的实施例中所描述的。用于从受试者分离、鉴定、分开和培养HSC的技术也在本领域技术人员的能力范围之内，例如，如在美国专利号Nos.5,635,387和5,643,741，以及Campana，等人，Blood 85：1416-1434(1995)中所公开的，所述参考资料的全部公开内容在此引用作为参考。在一个实施方案中，在HSC的转染之前，从收获的骨髓中清除肿瘤细胞或赘生性细胞。合适的清除技术包括，例如，动员的外周血细胞的白细胞清除术、肿瘤细胞的基于免疫亲和力的选择或杀死肿瘤细胞或使用细胞毒性剂或光敏化剂以选择性杀死肿瘤细胞，这在本领域内是已知的。参见，例如，Bone Marrow Processing and Purging，Part 5(A.Gee，ed.)，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1991；Lydaki，等人，J.Photochem.and Photobiol.32：27-32(1996)；和Gazitt，等人，Blood86：381-389(1995)，其全部公开内容在此引用作为参考。
可使用此处讨论的任何合适的技术转染分离的细胞(例如，HSC细胞、BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺癌细胞、其他癌细胞))。在转染后，可检查部分细胞以确认基因产物存在的合适的表达水平。在确认miR基因产物的合适的表达后，其余转染的细胞则可再导入受试者。可通过胃肠外方法包括静脉内输注或直接注射入骨髓将转染的细胞再导入受试者。优选在盐水溶液中或其他药学上可接受的载体中将转染的细胞再导入受试者。用于再导入的转染的细胞的合适数目是每千克受试者体重大约105至大约108个细胞。可通过在转染前扩增细胞来增加可获得的用于再导入的转染的细胞的数目。
在一个实施方案中，用包含编码miR基因产物的序列的核酸例如质粒表达载体转染细胞(例如，HSC细胞、BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺细胞、其他癌细胞))的基因组，所述质粒表达载体稳定地整合入细胞的基因组以提供miR的长期表达。可使用本领域内已知的技术例如使用miR基因cDNA(或其片段)作为探针的基因组DNA的Southern印迹分析确认稳定的整合和表达。还可使用标准的Northern印迹技术检测miR基因产物的表达。用编码miR基因产物的序列稳定转染的细胞在其重植入受试者后持续地表达miR基因产物。在下面的实施例中描述了从受试者分离HSC，用表达一种或更多种miR基因产物的质粒将其转染，然后将转染的HSC再植入受试者的示例性方法。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外给药途径对受试者施用miR基因产物。用于本方法的合适的肠内给药途径包括口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外给药途径包括血管内给药(例如，静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和至脉管系统的导管滴注)、组织边缘和组织内注射(peri-and intra-tissue injection)(例如，肿瘤边缘注射和瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)、皮下注射或沉积包括皮下输注(例如通过渗透泵)、对目标组织的直接施用(例如，通过导管或其他配置装置(例如，视黄醛片剂或栓剂或包含多孔的、无孔的或胶状材料的植入体)进行的)和吸入。在一个实施方案中，通过注射或输注施用miR基因产物。为了治疗包括实体瘤的BCL2相关癌症，可通过直接注射入肿瘤来施用miR基因产物。
在本方法中，可以裸露的RNA形式与递送试剂一起或以包含表达基因产物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形式对受试者施用miR基因产物。用于施用miR基因产物的合适的递送试剂包括例如Mirus TTansit TKO亲脂试剂、脂质转染试剂(lipofectin)、lipofectamine、cellfectin、多聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。
此处讨论包含表达miR基因产物的序列的重组质粒。此处讨论包含表达miR基因产物序列的重组病毒载体，用于将此类载体递送至受试者的细胞(例如，HSC细胞、BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、前列腺细胞、其他癌细胞))的方法在本领域技术人员的范围之内。
在特定的实施方案中，使用脂质体将miR基因产物或包含编码miR基因产物的序列的核酸递送至受试者。脂质体还可增加miR基因产物或核酸的血液半衰期。在本实施方案的实践中，在对受试者施用之前，将miR基因产物或包含编码miR基因产物的序列的核酸封装在脂质体内。
可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成适合用于本发明的脂质体。通常通过考虑因素例如希望的脂质体的大小和脂质体在血流中的半衰期来指导脂质的选择。用于制备脂质体的许多方法是已知的，如在Szoka，等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容在此引用作为参考)中所描述的方法。
封装miR基因产物或包含编码miR基因产物序列的核酸的脂质体可包含将脂质体靶向BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞、HSC细胞、前列腺癌细胞、另一种癌细胞)的配体分子。在一个实施方案中，使用结合在此类癌细胞中广泛存在的受体的配体(例如，结合肿瘤细胞抗原或癌细胞表面标记的单克隆抗体)。
还可修饰封装miR基因产物或包含编码miR基因产物的序列的核酸的脂质体以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类修饰的脂质体可具有表面上的或被整合入脂质体结构的调理作用抑制部分。在一个实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用抑制部分和配体。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常为典型的大的、结合脂质体膜的亲脂聚合物。如此处所用的，当其本身通过脂溶性的锚嵌入膜或通过直接结合膜脂质的活性基团而化学地或物理学地附着至膜时，调理作用抑制部分“结合”至脂质体膜。此类调理作用抑制亲水聚合物形成显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护性表面层(例如，如美国专利号：4,920,016中所描述的，其全部分公开内容在此引用作为参考)。
适合用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有大约500至大约40,000道尔顿，更优选大约2,000至大约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的或树枝状(dendrimeric)聚二胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇例如羧基或氨基化学与之连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG的共聚物或其衍生物也是合适的。此外，调理作用抑制聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚二胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶的天然多糖、氨化多糖(aminated polysaccharide)或寡聚糖(线性的或分支的)或羧化多糖或低聚糖(例如与碳酸的衍生物反应产生羧基的连接)。在一个实施方案中，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
可使用许多熟知的技术中的任一技术将调理作用抑制部分与脂质体膜结合。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可在60℃下使用Na(CN)BH3和溶剂混合物例如以30∶12比例的四氢呋喃和水通过还原性胺化作用用硬脂酰胺脂溶性锚衍生葡聚糖聚合物。
用调理抑制部分修饰的脂质体比未修饰的脂质体在循环中保持更长的时间。因此，此类脂质体有时称为“隐秘(stealth)”脂质体。已知隐秘脂质体在通过多孔的或“渗漏的”微血管滋养的组织中累积。因此，表征为这样的微血管缺陷的组织例如实体瘤将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，18：6949-53(1988)。此外，减少的被RES的吸收通过防止脂质体在肝和脾中的大量累积降低了隐秘脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的脂质体特别地适合用于将miR基因产物或包含编码所述基因产物的序列的核酸递送至肿瘤细胞。
如此处所用的，在一个实施方案中，本发明是在需要该治疗的受试者中预防或治疗与BCL2基因或基因产物(例如，RNA、蛋白质)的过度表达相关的癌症的方法，其包括对受试者施用有效量的至少一种miR基因产物。在Cory，S.，和Adams，J.M.，Nature Reviews 2：647-656(2002)和Sanchez-Beato，M.，等人，Blood 101：1220-1235(2003)(其内容在此引用作为参考)中描述了Bcl2蛋白和Bcl2家族的成员以及它们在癌症中的作用。人BCL2 cDNA和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列示于表2中。
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表2.BCL2 cDNA和蛋白质的序列
Figure S2006800397768D00491
Figure S2006800397768D00501
Figure S2006800397768D00511
用于检测BCL2基因产物的表达水平的方法在本领域内是熟知的。例如，可使用此处已描述的技术(例如Northern印迹、原位杂交、RT-PCR)检测细胞样品中BCL2基因转录物的表达水平。可使用通常使用的技术例如免疫染色或Western印迹检测Bcl2蛋白的表达水平，所述技术描述于Current Protocolsin Molecular Biology，F.Ausubel等人，eds.，第2卷，John Wiley and Sons，Inc.，1998，第10章。
过度表达Bcl2的癌症对于本领域技术人员来说是熟知的，包括，但不限于，白血病、淋巴瘤和癌(参见Kim，R.，等人，Cancer 101(11)：2491-2502(2004)；美国专利号5,789,389；和美国专利号：6,800,639，其内容在此引用作为参考)。已知与Bcl2的过度表达相关的特定的癌症包括，除其他以外，CLL、急性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌。
在特定的实施方案中，对需要治疗的受试者施用的至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
如此处所用的，术语“互补核苷酸序列”是指能够通过氢键与另一个与其互补的核苷酸序列形成碱基对的多核苷酸序列。嘌呤和嘧啶之间(例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶之间，鸟嘌呤和胞嘧啶之间)通过标准的Watson-Crick碱基对形成所述氢键。如此处所用的，“Watson-Crick碱基对”是指核酸的相对反向平行链上的成对的通过氢键结合的碱基。首先由Watson和Crick建立的碱基配对法则对于本领域技术人员来说是熟知的。例如，这些法则要求腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对，互补链相互之间反向平行。如此处所用的，术语“Watson-Crick碱基对”不仅包括标准的AT、AU或GC碱基对，还包括能够与标准碱基或另一种互补的非标准碱基氢链键合的核苷酸类似物的非标准或经修饰的碱基之间形成的碱基对。这样的非标准Watson-Crick碱基配对的一个实例是包括核苷酸类似物肌苷的碱基配对，其中其次黄嘌呤碱基可与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶形成两个氢键。
在一个实施方案中，至少一个miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列100％互补(即，完全互补)的核苷酸序列。在其他实施方案中，至少一个miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％、至少大约95％或、至少大约99％互补的核苷酸序列。互补区域长度可以是大约5至大约25个核苷酸，长度大约5至大约15个核苷酸，或更特别地，长度大约7至大约12个核苷酸。与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的miR基因产物的实例包括，但不限于，miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(参见，例如，表5)。在一个实施方案中，miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。此类miR基因产物的实例包括但不限于miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在特定的实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。用于对受试者施用miR基因产物的方法(此处描述了其中的几种方法)在本领域内是熟知的。
本发明还包括用于在具有癌症的受试者中增加抗癌疗法的功效的方法，其包括对受试者施用至少一种包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因产物，和额外地对受试者施用至少一种抗癌疗法。根据本发明，抗癌疗法可以是本领域技术人员已知的任何抗癌疗法。合适的抗癌疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法和其组合(例如，化学放射)。本发明还涉及增加非常规癌症疗法的功效的方法。
如此处所用的，化疗法是指施用一种或更多种化学物质或药物来治疗癌症。用于本发明的方法的合适的化学治疗剂可以是已知用于治疗癌症的任何化学物质，例如，DNA-烷化剂、抗肿瘤抗生素药物、抗代谢药物、微管蛋白稳定剂、微管蛋白去稳定剂、激素拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、HMG-CoA抑制剂、CDK抑制剂、细胞周期蛋白抑制剂、半胱天东酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、反义核酸、三螺旋DNA、核酸适体和经分子经修饰的病毒(molecularly-modifiedviral)试剂、细菌或外毒素试剂(bacterial or exotoxic agent)。用于本发明的方法的特别合适的试剂的实例包括但不限于胞二磷胆碱、阿糖胞苷、甲氨喋呤、长春新碱、依托泊甙(etoposide)(VP-16)、阿得利亚霉素(阿霉素)、顺铂(CDDP)、地塞米松、arglabin、环磷酰胺、溶肉瘤素、甲基亚硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、长春碱、喜树碱、放线菌素D、丝裂霉素C、过氧化氢、奥沙利铂、依立替康、托泊替康、甲酰四氢叶酸、卡莫司汀、链脲菌素、CPT-11、泰素和其衍生物、它莫西芬、达卡巴嗪、利妥昔单抗、柔红霉素、1-β-D-阿糖呋喃糖胞嘧啶、伊马替尼、氟达拉滨、多西他奇和FOLFOX4。
如此处所用的，放射疗法是指使用高能辐射进行癌症的治疗。除其他以外，可由X射线、γ放射和中子提供用于放射疗法的高能辐射。不同的放射疗法在本领域内是熟知的并且适合用于本发明的方法。这些方法包括但不限于外照射放疗(external beamradiation)、近距离放射疗法(brachytherapy)、强度调控放射治疗(intensity-modulated radiotherapy)(IMRT)、植入放射(implantradiation)、全身性放射(systemic radiation)和立体定向放射治疗(stereotactic radiotherapy)。
术语“受试者”、“个体”和“患者”此处定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛、羊、马、犬、猫、啮齿目动物或鼠类物种。在优选的实施方案中，动物是人。在一个实施方案中，受试者是遭受一种或更多种BCL2相关癌症的哺乳动物(例如，人)。如此处所描述的，除其他以外，由本发明的方法治疗的合适的BCL2相关癌症包括淋巴瘤、癌和白血病。在特定的实施方案中，BCL2相关癌症是表征为BCL2基因或基因产物(例如，RNA、蛋白质)的增加的表达(例如，过度表达、上调)的癌症。特别合适的BCL2相关癌症的实例包括，除其他以外，CLL、急性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌。在一个实施方案中，癌症是CLL。在另一个实施方案中癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症是肺癌。在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌。
根据本发明的该实施方案的方法，通过对受试者施用至少一种miR基因产物来增加癌症治疗的功效。可将miR基因产物与化学治疗剂共施用(即，同时施用)，或可将其分开施用。在一个实施方案中，miR基因产物与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补。此类miR基因产物的实施例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(参见表5)。在其他实施方案中，miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741至3749互补的核苷酸序列，例如miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在-个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
可通过相对于合适的对照受试者中癌症的增加的好转来证明抗癌疗法的功效的增加。可根据接受的临床标准例如受试者中癌细胞数目的减少和/或肿瘤质量和/或大小的减少来确定癌症的好转。可通过直接测量或通过根据原发性肿瘤块或转移瘤块的大小估量来确定BCL2相关癌细胞的数目。
本发明还提供了增加癌细胞对抗癌剂的细胞毒性效应的敏感性的方法，其包括为细胞提供至少一种包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列的miR基因产物。通过对细胞提供至少一种miR基因产物，增加细胞对抗癌剂的敏感性。
在一个实施方案中，本发明是增加癌细胞对抗癌剂的细胞毒性效应的敏感性的方法，其包括对癌细胞提供至少一种抗癌剂并且额外地对癌细胞提供至少一种miR基因产物，其中所述至少一种miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。抗癌剂可以是已知用于治疗癌症的任何试剂。此类试剂包括但限于化学治疗剂和辐射照射。在下文中描述合适的试剂的实例。
如此处所用的，短语“抗癌剂的细胞毒性效应”是指由于试剂的施用导致的任何细胞损伤和/或死亡。相对于其中只提供抗癌剂的对照细胞，可通过由施用至少一种抗癌剂和至少一种miR基因产物导致的细胞损伤的严重度的增加和/或细胞死亡的数量或比率的增加来证明癌细胞对抗癌剂的细胞毒性效应的敏感性的增加。用于评估细胞毒性(例如，细胞损伤和/或死亡)的技术在本领域内是熟知，其包括但不限于监控细胞增殖、细胞生长和细胞死亡(例如，凋亡、坏死)的测定法。
用于本发明的该实施方案的合适的细胞包括癌细胞。在特定的实施方案中，癌细胞过度表达BCL2基因产物(例如，RNA、蛋白质)。在一个实施方案中，癌细胞是体内细胞(例如，哺乳动物(例如，人)中的BCL2相关癌细胞)。在另一个实施方案中，癌细胞获自患者样品(例如，活检组织、血液)或其可获自己建立的癌细胞系或来源于患者样品的癌细胞的细胞系。在某些实施方案中，癌细胞来自从具有与Bcl2的过度表达相关的癌症的受试者获得的患者样品。此类癌症的实例包括，除其他以外，CLL、急性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、非小细胞肺癌、血液的恶性肿瘤、实体瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌。在一个实施方案中，癌症是CLL。在另一个实施方案中癌症是淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症是肺癌。
根据本发明的方法，通过对癌细胞提供至少一种miR基因产物来增加癌细胞对化疗治疗剂的细胞毒性效应的敏感性。在特定的实施方案中，miR基因产物与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补。此类miR基因产物的实例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(参见表5)。在其他实施方案中，miR基因产物包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741至3749互补的核苷酸序列，例如，miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在另一个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
在对受试者施用之前，按照本领域内已知的技术将用于本发明的方法的miR基因产物优选配制为药物组合物。因此，本发明包括包含至少一种miR基因产物的药物组合物。在一个实施方案中，miR基因产物是miR15或miR16(例如，miR-15a或miR-16-1)。在其他实施方案中，miR基因产物包含与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。用于本发明的方法的合适的miR基因产物的实例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(参见表5)。在一个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
在相关实施方案中，本发明的组合物还包含至少一种化学治疗剂。用于治疗癌症的许多化学治疗剂在本领域内是熟知的。此处描述了用于本发明的组合物的合适的化学治疗剂。在某些实施方案中，每剂量化学治疗剂的量为大约0.0001至1000mg/kg、大约0.5至70mg/kg或大约1至50mg/kg。
本发明的药物组合物表征为无菌的和无热原的。如此处所用的，“药物组合物”包括用于人和兽医学用途的组合物。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的能力范围之内，例如，如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，ed.，MackPublishing Company，Easton，Pa.(1985)(其全部公开内容在此引用作为参考)中所描述的。
在一个实施方案中，本药物组合物包含与药学上可接受的载体混合的miR基因产物或包含编码该基因产物的序列的核酸(例如，按重量计算0.1至90％)或其生理上可接受的盐。本发明的药物组合物还可包含用脂质体封装的miR基因产物或包含编码该基因产物的序列的核酸以及药学上可接受的载体。
优选药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
在优选实施方案中，本发明的药物组合物可包含抗核酸酶降解的miR基因产物。本领域技术人员可通过例如将一个或多个在2′位置修饰的核糖核苷酸整合入miR基因产物容易地合成抗核酸酶的miR基因产物。合适的2′-修饰的核糖核苷酸包括在2′-位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。
例如，本发明的药物组合物包含整合一个或更多个式2′AR-核苷酸的2′-修饰的核苷酸的miR基因产物，其中：
A是氧或氢(优选氟、氯或溴)；和
R是氢或直链或支链C1-6烷基；
假定当A是卤素时，则省略R。优选的修饰的2-核糖核苷酸是2′-O甲基核糖核苷酸。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含其中各核糖核苷酸是2′-修饰的核糖核苷酸的miR基因产物。
本发明的药物组合物还可包含常规的药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括生理上生物相容的缓冲剂(例如，盐酸氨基丁三醇(tromethamine hydrochloride))、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙离子螯合复合物(calcium chelate complexes)(例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)或任意地钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。可包装本发明的药物组合物从而以液体的形式进行使用，或可将其冻干。
对于本发明的固体药物组合物，可使用常规的无毒固体的药学上可接受的载体；例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服给药的固体药物组合物可包含上面所列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的miR基因产物。用于喷雾(吸入)给药的药物组合物可包含按重量计算0.01-20％，优选按重量计算1％-10％的如上所述封装在脂质体中的miR基因产物和喷射剂。如果想要还可使用载体例如用于鼻内给药的卵磷脂。
本发明还包括用于确定受试者中癌症疗法的功效的方法，其包括对受试者施用至少一种受试试剂，然后测量来自受试者的样品中的mi R基因产物的表达。在一个实施方案中，miR基因产物与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补。该miR基因产物的实例包括但不限于miR-182、miR-181、miR-30、miR-15a、miR-16-1、miR-15b、miR-16-2、miR-195、miR-34、miR-153、miR-21、miR-217、miR-205、miR-204、miR-211、miR-143、miR-96、miR-103、miR-107、miR-129、miR-9、miR-137、miR-217和miR-186(参见表5)。在进一步的实施方案中，miR基因产物包含与核苷酸SEQ ID NO：55的核苷酸3741至3749互补的核苷酸序列，例如，miR-15a、miR-16-1、miR-15b和miR-16-2。在另一个实施方案中，miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。
在特定的实施方案中，在施用试剂后，与BCL2基因转录物中的核苷酸序列互补的miR基因产物的表达的增加表明对治疗的有利反应。用于检测miR基因产物的表达水平的方法在本领域内是熟知的，其包括但不限于此类技术如下文中描述的技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)。被检测的合适试剂包括，除其他以外，小有机分子、肽和天然发生的生物大分子。特别合适的受试者包括遭受一种或更多种与Bcl2过度表达相关的癌症的个体。
通过下列非限定性实施例举例说明本发明。
实施例
在实施例1至4中使用下列技术：
患者样品和细胞系
在CLL科研联合体研究所(CLL Research Consortiuminstitutions)，征得经诊断具有CLL的患者同意后获得患者的样品。简而言之，从CLL患者获得外周血，之后通过聚蔗糖—泛影钠密度梯度离心法(Ficoll-Hypaque gradient centrifugation)(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分离单核细胞，然后按照Sambrook，J.，等人(1989)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述的标准方案处理所述细胞以进行RNA和DNA提取。作为LOH研究的正常对照，将来自相应患者的颊粘膜的DNA放入小(1-2mm2)纸片上。
从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得30个人细胞系并按照ATCC的说明进行保持。这些细胞系是AS283、BL2、Bla、BJAB、CA46、Namalva、P3HRI、PAPB 682、PABm、Raji(伯基特淋巴瘤)、Del1、SKDHL、ST486(T细胞淋巴瘤)、JM(免疫母细胞性B细胞淋巴瘤)、MC116(未分化的淋巴瘤)、Molt3、Supt 11(T-ALL)、U266(多发性骨髓瘤)、A549、H1299(肺癌)、TE2、TE10(食道癌)、HeLa(宫颈癌)、RC48(肾癌)和2220、2221、11609、11611、LNCAP、TSUR(前列腺癌)。
CD5+B细胞的分离
从经历常规扁桃体切除术的儿科年龄组(3-9岁)中的患者获得扁桃体。通过用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞簇簇生化(rosetting)单核细胞来获得纯化的B细胞。通过Dono，M.，等人，J.Immunol.164：5596-5604(2000)(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述的不连续Percoll梯度法(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进一步分级分离B细胞。将从50％Percoll级分收集的B细胞与抗CD5mAb一起温育，然后再与缀合有磁性微珠的山羊抗小鼠Ig一起温育。通过使用MiniMACS系统(Miltenyi Biotec)收集磁性柱子MS上保留的细胞进行正选择(positive selection)来获得CD5+B细胞。
体细胞杂种
按照常规方法产生体细胞杂种，然后在Negrini，M.，等人，Cancer Res.54：1818-1824(1994)(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述的次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基中进行选择。使用DNeasy tissue试剂盒(Qiagen)分离来源于单个细胞克隆和亚克隆的DNA，并就染色体13和染色体2标记的存在或不存在对其进行PCR筛选(关于引物序列参见表3)。从具有t(2；13)(q32；q14)易位的CLL病例(CLL-B)的融合物分离15个克隆，从具有t(2；13)(q12；q13)易位的另一个CLL病例(CLL-A)的融合物中分离1个克隆。12个CLL-B来源的克隆具有染色体13和2的完全互补物，然而3个具有del(13q)和染色体2的完全互补物。来自CLL-A的单个克隆具有染色体13，所述染色体13在13q14具有小的缺失的染色体13但无染色体2的部分。
Northern印迹法
使用Tri-Reagent方案(Molecular Research Center，Inc)进行总RNA的分离。将RNA样品(各自30μg)在15％的丙烯酰胺变性(尿素)标准预制凝胶(Criterion precast gel)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上跑胶，然后转移至Hybond-N+膜(AmershamPharmacia Biotech)。在42℃下于7％SDS，0.2M Na2PO4 pH 7.0中进行使用α-32P ATP的杂交，进行过夜。在42℃下，在2x SSPE，0.1％SDS中洗涤膜2次，然后用0.5x SSPE，0.1％SDS洗涤2次。用于检测miR15和miR16 RNA的探针分别是：
CACAAACCATTATGTGCTTGCTA(SEQ ID NO：5)；和
GCCAATATTTACGTGCTGCTA(SEQ ID NO：6)
通过在0.1％SDS/0.1x SSC水溶液中煮沸10分钟来剥离印迹，再探测印迹数次。作为上样对照，使用用溴化乙锭染色的5S rRNA。
逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)
进行RT-PCR以分析正常CD5+细胞和23B-CLL样品中的基因表达水平。对于使用Advantage2 PCR试剂盒(Clontech)的各扩增反应，使用1微升的cDNA，使用10pmol的各基因特异性引物进行35个循环：94℃下进行20秒，65℃下进行30秒，68℃下进行1分钟(关于使用的引物列表，参见下面的表3)。为了确保RNA对于RT-PCR是足够纯的，使用利用对于PCR G3PDH cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)是特异性的引物进行的PCR测定。按照Sambrook，J.，等人(1989)，(同上)中描述的标准方法通过琼脂糖凝胶电泳分离RT-PCR产物。
Western印迹法
用GST-SLUG Middle抗体(来自Dr.Thomas Look-Harvard，MA的赠品)和SNX2(N17)抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA)探测来自9个B-CLL患者的细胞裂解物的SDS/PAGE凝胶。按照厂商说明书使用ECL Western印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia，UK)进行检测。
数据分析
使用通过由美国国立卫生研究院和国立医学图书馆维持的美国国家生物技术信息中心网站获得的BLAST比对工具进行对“nr”和“dbEST”数据库的搜索和针对短的、几乎完全的配对的搜索。也参见Altschul，等人，J.Mol.Biol.215：403-10(1990)和Altschul，等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)，其全部公开内容在此引用作为参考。也使用由Biology workBench网站提供的FASTA比对工具进行对短序列的同源性的搜索。
表3用于筛选体细胞杂种的引物
  名称 引物序列      SEQ ID No：
  D2S396L ATA CAC CTC TAA ATA TCT GTT CCA G 7
  D2S396R AAG TAG GAC CAT TCT AAT AGC C     8
  D2S112L GAG TGG CGG TGA GAA GGT AT      9
  D2S112R AGC CAT TGC TAT CTT TGA GG      10
  D2S2243L TGG GAT ATG CTT CAG GGA C      11
  D2S2243R AGC TGA CCT TGG AAT CTG GTT      12
  D13S260L AGA TAT TGT CTC CGT TCC ATG A     13
  D13S260R CCC AGA TAT AAG TGA CCT GGC TA    14
  D13S263L CCT GGC CTG TTA GTT TTT ATT GTT A 15
  D13S263R CCC AGT CTT GGG TAT GTT TTT A   16
  D13S165L GTT TCG CCA AGC CTG TT   17
  D13S165R GTT GAC AAT AAA ATA CGC CAC A   18
  D13S273L CTG NGG CAA AAA CAA CTC TT   19
  D13S273R ATC TGT ATG TCC TCC TTT CAA TG   20
  D13S1168L AAC CTC ATT TAA ATG TAA AGC ATC A   21
  D13S1168R GTA ATG TCA TTG CTT TTG ATT TGC   22
  D13S1150L CTC TTG AGG GAA AAA AAA AAT CA   23
  D13S1150R CCA GGC AAC CAA CCA GTC   24
  D13S272L ATA CAG ACT TCC CAG TGG CT   25
  D13S272R AGC TAT TAA AGT TCC CTG GAT AAA T   26
  GCT16C05L AAG GAA TCA GAG AAA TGG GG   27
  GCT16C05R GCT GAG TCA GAG GGA TTT GA   28
  D13S25FOR AGA GGT AAA CAA ACC AAA CCC   29
  D13S25REV GCT GAC AAT CAA GAG AAG ATG   30
  D13S284L AAA ATC AGG TGG AAA CAG AAT   31
  D13S284R AAA GGC TAA CAT CGA AGG GA   32
  01ALU18 CAG AAC CAG AGA AACAGC   33
  02ALU18 ATG GCA CAA CAG CTT AAC   34
  AFMA301WB5 GAA TGC AGG TGT ACC TAT CAA C   35
  AFMA301WB5 ACT GAG TGA CTG CTA CCC AG   36
  D13S272L1 AGC TAG CCC TAT CAG GGT   37
  D13S272R1 GTA AGT GGA GGT TAC CTG   38
  5279F GAA TCA TTC GTG CTA AGT GGA T   39
  5451R TGC CAA CTG CTT GAA GAA TCT C   40
  7130F ACA CCT AAC TCC TGG GTT GTT C   41
  7371R ACT AAA TGC CAG CGT TTG CAT G      42
  9530F GGT CTT ACT CTG GTT AAA TCT      43
  9757R CAT TGG TAG CTA AGG AAA CAC      44
  11521F CCA TTC AAG CCT GGA CAA TCT T      45
  11802R GAA ACT TGA GAC AAT AAG GAG C      46
  12440F CAT GTA ACC AAG ATA AAT CCG T      47
  12558R CTG GAA AAT GTA TGT GAT GAG G      48
  17261F CTG TTG CTA TCT GTA ATA ACA C      49
  17494R CTT GGA ATT TTC CAC TGA ATC      50
  18701R TCA TCA GAA GAA ATC AAG GCA G      51
  18560F CAG TGT TAG GAA TAC GCA TTC A      52
  GSP2F4 CCT TGC CAG TAC GCC CAC AAG CTG     53
  GSP1R1 CCC CAC CTA TGG TTG TAG TGA GCA TCC 54
实施例1：CLL患者的体细胞杂种中的30kb缺失区域
CLL患者中13q14上的最小丢失区域一直不清楚。之前，在CLL中已描述13q14中缺失的不同的和相对大(130至550kb之间)的区域(参见图2B)。使用LOH和Southern印迹分析鉴定Alu18基因座上的纯合子丢失的着丝粒边界(图2D)，该丢失位于D13S1150和D13S272之间，与LEU2基因的外显子5相距少于65kb的centromeric。然而，没有发现允许靶肿瘤抑制基因的更好的定位的小的或重叠的纯合子缺失。
为更好地确定CLL中的丢失区域，产生小鼠LM-TK-与具有13q14易位和/或缺失的CLL细胞的体细胞杂种。所得的杂种克隆的PCR筛选允许分离存在于肿瘤中的染色体13的两个拷贝。如此，在一个案例中鉴定了31.4kb缺失，在另一个案例中精确地定位了染色体断裂点(图2D)。这些结果表明13q14肿瘤抑制基因位于LEU2基因的外显子2和5之间的29kb区域内。表3中提供了用于筛选体细胞杂种的引物。
如图2中所示，体细胞杂种中的缺失的区域与所有报导的丢失区域一致，包括Liu，等人，Oncogene 15：2463-2473(1997)几年前报导的10kb区域。LEU2的外显子1和2也存在于该区域内，并且存在于此处定义的区域内。然而，已排除LEU2作为B-CLL的可能的候选肿瘤抑制基因(参见Bullrich，等人，Cancer Res.61：6640-6648(2001)；Migliazza，等人，Blood 97：2098-2104(2001)；Wolf，等人，Hum.Mol.Genet.10：1275-1285(2001)；和Mertens，等人，Blood99：4116-4121(2002))。
实施例2：miR15和miR16基因位于染色体13的最低限度缺失区域并 且在CD5+细胞中高度表达
就13q14上最小的丢失区域中的新的调控基因筛选公共可获得的序列信息和数据库。两个最近克隆的miRNA基因miR15和miR16的基因簇恰好位于缺失的区域(图2A)。为估量正常组织中miR15和miR16的表达水平，在系列正常组织(包括从正常个体的扁桃体分离的CD5+B细胞)上进行miR15和miR16RNA的Northern印迹分析(图3A)。CD5+B细胞用作对照，因为B-CLL的特征在于CD5+B-淋巴细胞的累进积累。发现miR15和miR16基因的表达普遍存在，在正常CD5+淋巴细胞中具有最高水平。此外，在正常组织中，miR16始终以高于miR15的水平表达。这些数据表明miR15和miR16基因在正常CD5+B-细胞动态平衡中起着重要作用。
实施例3：miR15和miR16基因经常缺失或在于13q14上具有缺失的 CLL样品中下调
为调查miR15和miR16基因是否参与CLL的发病机理，使用Northern印迹法就miR15和miR16的表达对60个CLL样品和30个人癌细胞系进行分析(图3B)。68％的CLL患者(41/60)以及6个分析的前列腺癌细胞系中的5个显示当与其正常的组织对应物比较时，表达显著减少。这些发现证明miR15和miR16基因在大部分受试B-CLL和前列腺癌病例中下调。
此外，60个CLL样品中的23个(38％)提供了代表miR15前体RNA的大约70nt的清晰可鉴定的条带。在除了骨髓外的任何分析的正常组织中未发现该70nt miR15条带(图3A)，这表明miR15前体RNA在CLL中不能被有效地加工。
为确定CLL中观察到的表达的下调是否与等位基因丢失相关，使用微卫星标记D13S272和D13S273对46个可从其获得正常DNA的CLL患者进行LOH研究(图3B)。我们发现68％的提供信息的样品在至少一个标记上展示LOH(35个案例中的24个)。在几乎4个样品(75％)中，miR15/16基因产物的表达被减少。对于12个样品，由于起始材料的较差的质量导致未获得重现性结果。此外，在11个案例中的6个案例(55％)中，表达水平减少而无显著的LOH。在这些情况下，缺失可能太小以至于不能用分析的标记检测。
Northern印迹分析显示在存在已知的13q14上的大纯合子缺失的情况下和在低于5％的正常细胞中miR15和miR16基因产物都表达，表明其他高度相似的大RNA基因存在于基因组中。事实上，已报导与miR15/miR16基因簇非常相似(但具有不同的前体)的基因簇在染色体3q25-26.1上(参见Lagos-Quintana，等人，Curr.Biol.12：735-739(2002))。为了显示miR15/16基因表达的变化与染色体13q上的缺失严格相关，设计和使用对于染色体13上的miR16前体RNA和从染色体3上的基因产生的miRNA前体RNA是特异性的探针来探测Northern印迹。
尽管在较低的水平上检测到来自染色体13的miR16前体RNA，但在相同的样品中未发现与染色体3的探针的特异性杂交。此外，使用两个横跨紧靠着丝粒的2Mb的区域的微卫星标记对该基因簇进行LOH研究。17个提供信息的样品中的4个在至少一个标记中显示了LOH，未发现与miR15/16的表达水平的相关性。这些数据清楚地证明CLL中miR15和miR16基因表达的下调与13q14上的等位基因丢失相关，从而提供了miR15和miR16基因产物在CLL发病机理中的作用的证据。
实施例4：miR15和miR16也参与小鼠中的CLL发病机理
为进一步调查miR15和miR16基因是否参与CLL发病机理，将研究扩展至发生CLL的Eμ-TCL1转基因小鼠(Bichi，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(10)：6955-6960(2002))。在Eμ-TCL1转基因小鼠中检查细胞遗传和遗传改变。如上所述进行Northern印迹分析(参见实施例-“Northern印迹法”，和实施例3)。
在大约80％的转基因小鼠中，与正常小鼠脾淋巴细胞相比，在CLL细胞中miR15和miR16的小鼠同源物的表达减少。这些结果与实施例3中关于miR15和miR16在人CLL和正常样品中的表达所描述的结果相似。
在小鼠染色体15和人染色体12之间进行比较。转基因小鼠白血病的对比基因杂交技术(Comparative gene hybridization)(CGH)显示大约35％具有小鼠染色体15的区域(其相应于人染色体12的区域)的扩增。这些小鼠白血病的细胞遗传学分析也显示小鼠染色体15的三体性或四体性。已知染色体12的三体性在大约25％的人CLL中发生。
对比基因杂交也显示相应于人中的区域13q14的小鼠染色14的区域(51.6-78.5Mb)的丢失。
研究结果显示CLL小鼠模型概述了在人CLL的发病机理中发生的事件。
总体来说，实施例1至4中提供的数据提供了miR15和miR16在哺乳动物的CLL发病机理中的作用的证据。
实施例5-8中使用下列技术：
患者样品
在征得同意后，在CLL研究联合体研究所从诊断具有CLL的受试者获得26个CLL样品。简而言之，从CLL患者获得血液，通过聚蔗糖/泛影钠梯度离心(Amersham Pharmacia Biotech)分离单核细胞，按照所描述的方案(Sambrook J.，等人Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Lab，Press，Plainview，NY(1989)处理所述细胞以进行RNA提取。将包含来自两个不同的正常个体的各个体的CD5阳性细胞的正常混合物用作对照。从扁桃体淋巴细胞制备CD5+B细胞。简而言之，在征得同意后，从经历常规扁桃体切除术的儿科年龄组(小于18岁)的患者获得扁桃体。通过用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞(SRBC)簇生化来自单核细胞(MNCs)的T细胞来制备纯化的B细胞群体。为了获得CD5+B细胞，如所描述的，将纯化的B细胞与抗CD5单克降抗体(mAb)一起温育，然后与缀合磁性微珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)的山羊抗小鼠Ig一起温育。通过使用Mini MACS系统(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)收集保留在磁性柱子MS上的细胞来正选择CD5+B细胞。如由流式细胞计量术所估量的，细胞群体的纯化程度高于95％。
BCL2的Western印迹
使用小鼠单克隆抗BCL2抗体(Dako)定量BCL2蛋白的水平，然后使用用于Western印迹的标准方法(Sambrook，J.，等人MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab，Press，Plainview，NY(1989))利用第二小鼠单克隆抗BCL2抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)进行确认。使用小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体(Sigma)进行标准化。使用ImageQuant TL(NonlinearDynamics Ltd.)定量条件强度。
RNA提取、Northern印迹和miRNACHIP实验
如(Calin，G.A.，等人Proc.Natl.A cad.Sci.U.S.A.99：15524-15529(2002)；Liu，C.G.，等人，Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.101：9740-9744(2004)；Calin，G.A.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：11755-11760(2004))中所述进行方法。简而言之，将来自5μg总RNA的标记的靶用于在各miRNACHIP微阵列芯片上进行杂交，所述miRNACHIP微阵列芯片以一式三份重复包含相应于245个人和小鼠miRNA基因的368个探针。在
Figure S2006800397768D00691
软件版本7.2(SiliconGenetics，Redwood City，CA)中标准化和分析原始数据。使用Bioconductor package(www.bioconductor.org)的
Figure S2006800397768D00701
normalization option或Global Median normalization使表达数据以中位数为中心(median centered)不存在任何本质差异。使用
Figure S2006800397768D00702
ANOVA工具和SAM软件(Significance Analysis ofMicroarray，wwwstat.stanford.edu/～tibs/SAM/index.html)进行统计比较。如Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：11755-11760(2004)中所报导的，使用Northern印迹法就mir-16-1和mir-15a验证微阵列数据。
mir-16-1/mir-15a表达载体
通过将相关的读框以有义方向连接入哺乳动物的表达载体pSR-GFP-Neo(OligoEngine，Seattle，WA)来构建野生型(mir-16-1-WT)和突变型(mir-16-1-MUT)mir-16-1/mir-15a表达载体。各构建体包含含有mir-16-1和mir-15a的832bp的基因组序列。突变型构建体在mir-16-1的3′区域中的+7碱基对上包含C至T的置换。在通过测序确认后，按照厂商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用Lipofectamine2000将各构建体转染入293个细胞中。如实施例5中所述，通过Northern印迹分析估量两种构建体的表达。GFP水平的Western印迹分析用于显示野生型和突变型pRS-neo-GFP构建体以相同的功效进行转染。
转染测定法
在37℃下，在含有5％CO2的潮湿气氛中，在10％FBS(于补充以1X非必需氨基酸和1mmol丙酮酸钠的RPMI-1640培养基中)中培养人巨核细胞(MEG-01)。按照厂商的说明书使用siPORT neoFX(Ambion)，用0.4μg荧火虫荧光素酶报告基因载体(Promega)和0.08μg包含肾荧光素酶的对照载体pRLTK(Promega)在12孔板中共转染细胞。对于各细胞，使用10nM的mir-16-1-有义(5′-uagcagcacguaaauauuggcg-3′；SEQID NO：341)和/或mir-15a有义(5′-uagcagcacauaaugguuugug-3′；SEQID NO：342)(Dharmacon)或miR-15a反义和/或miR-16-1反义前体miRNA抑制剂(Ambion)。在转染后24小时，使用Dua1-荧光素酶测定(Promega)连续测量荧光虫荧光素酶和肾萤光素酶的活性。
荧光素酶报告基因实验
为了产物荧光素报告基因构建体，通过PCR从人基因组DNA扩增BCL2基因的3′UTR的546个碱基对的片段，其然后使用紧接荧光素酶的终止密码子下游的XbaI位点将其插入pGL3对照载体(Promega)。下列引物组用于产生特定片段：
BCL2-UTRF2
5′-CTAGTCTAGAGCCTCAGGGAACAGAATGATCAG-3′(SEQ ID NO：343)；和
BCL2-UTRR2
(5′-CTAGTCTAGAAAGCGTCCACGTTCTTCATTG-3′；SEQ ID NO：344)。
也使用QuikChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene)产生分别从与miR-15a和miR-16-1互补的位置缺失5bp和9bp的两种BCL2插入物(图4A)。通过测序确认野生型和突变型插入物。
实施例5：miR-15a和miR-16-1展示与BCL2转录物的区域互补并 且显示与BCL2蛋白的表达模式反相关的表达模式
通过同源性检索将两种microRNA(mir-16-1和mir-15a)鉴定为具有对BCL2 mRNA序列的同源性。特别地，发现两种miRNA的5′末端上的前9个核苷酸与人Bcl2 cDNA克隆NM_000633的碱基3741至3749互补(图4A)。BCL2转录物中的该核苷酸区域在小鼠中是保守的(图4A)。miR-15b和miR-16-2，来自染色体3q26的第二基因簇的两个成员，都鉴定为具有对Bcl2转录物的相同区域的互补性。
为了估计mir-16-1和/或mir-15a miRNA是否与BCL2转录物相互作用，我们首先确定在CLL细胞和正常CD5阳性淋巴细胞中miR-15a/miR-16-1的表达水平和Bcl2蛋白的水平之间是否存在相关性。在正常CD5阳性B淋巴细胞中，来自染色体13q14的基因簇高度表达，然而miR-15b和miR-16-2前体几乎不能通过Northern印迹分析检测到(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：15524-15529(2002))。通过miRNACHIP分析和Western印迹法，分析成组的30个样品，包括26个CLL样品和4个来自未受影响的个体的扁桃体的正常CD5阳性淋巴细胞。在正常的CD5阳性淋巴细胞中，miR-15a和miR-16-1 miRNA的水平都很高。相反地，Bcl2蛋白以非常低的水平表达。然而，在大部分白血病细胞中，miR-15a和miR-16-1都以低水平表达，而Bcl2蛋白过度表达(图4B和表4)。此外，在所有被分析的白血病样品中，我们发现了miR-15a/miR-16-1的表达水平与Bcl2的表达水平之间的负相关性(表4)。因此，在CLL样品中，普遍观察到miR-15a和miR-16-1的表达水平的下调和Bcl2蛋白的过度表达。
表4在26个CLL样品与两个正常CD5细胞库*的组中，通过Western印迹产生的BCL2蛋白表达的标准化值和通过miRNACHIP产生的miR-15a和miR-16-1的表达的标准化值。
*-N1、N2、N3和N4＝正常CD5样品；CLL1-CLL26＝慢性淋巴细胞性白血病。以任意单位表示数据。以一式两份重复检测两种样品，例如，一种正常的混合物和样品CLL 8，以估量数据的重现性。使用ImageQuantTL(Nonlinear Dynamics Ltd.)定量Western印迹(WB)的条带强度。使用Bioconductor package(www.bioconductor.org)的GeneSpring normalization option和Global Median normalization使表达数据以中位数为中心不存在任何本质差异。
实施例6：microRNAs，miR-15a和miR-i6-1的表达减少了转染的 MEG-01细胞中的BCL2蛋白的表达
为调查表达包含miR-15a/miR-16-1的完全基因簇对Bcl2的表达的影响，使用MEG-01细胞，所述细胞是表达高水平的Bcl2但由于miR-15a/16-1基因座的一个等位基因的丢失和另一个等位基因的改变而不表达miR-15a或miR-16-1的急性白血病来源的细胞系。用pSR-miR-15/16-WT载体瞬时转染的MEG-01细胞与野生型MEG-01细胞(MEG-01WT)和用空载体转染的MEG-01(MEG-01-pRS-neo-GFP)相比，展示高度减少的Bcl2的水平(大约7％的标准化的表达)(图5A)。为确认该效应，转染包含miR-16-1中的+7(C至T)种系置换(germlinesubstitution)的相同表达载体(pSR-miR-15/16-MUT)，所述置换在家族CLL的情况下被检测到(Calin，G.C.，等人，N.Engl.J.Med.，已接受等待印刷出版)并且强烈地减少两种mi RNA的表达。如所预期的，Bcl2的水平与WT野生型细胞或用空载体转染的对照细胞中的Bcl2的水平相当(75％的标准化表达)(图5A)。此外，用pSR-miR-15a/16-1WT转染的细胞显示内源性凋亡途径的激活(如通过APAF1-半胱天东酶9-PARP途径的激活确定的)。对照样品包括用突变型构建体(pSR-miR-15/16-MUT)转染的细胞的样品都不显示这些促凋亡蛋白的水平的改变(图5A)。
为确定miR-15a和miR-16-1 miRNA是否都影响Bcl2蛋白的表达，我们将miR-15a和miR-16-1有义或反义寡核苷酸RNA瞬时转染入MEG-01细胞。如图5B中所示，miR-15a-有义和miR-16-1-反义寡核苷酸的分开的转染完全消除了Bcl2的表达，而两种miRNA的反义RNA的转染都不影响Bcl2的表达。当共转染两种有义RNA或两种反义RNA时获得相似的结果(图5B)，这确认了miR-15a和miR-16-1 miRNA都影响Bcl2蛋白的表达。
实施例7：microRNA，miR-15a和miR-16-1，与BCL2转录物的3′UTR 之间的直接相互作用的证据
可通过直接作用(即，miRNA通过miRNA::mRNA互补性直接对Bcl2转录物的杂交)或通过间接相互作用(即，miR-15a和miR-16-1与另一个靶的相互作用，从而导致Bcl2水平的下调)解释在miR-15a和miR-16-1表达后Bcl2蛋白的水平下调。为了区分这些可能性，将来自人Bcl2的3′UTR(SEQ ID NO：55的核苷酸3064至3599)的536bp的序列(所述序列显示与miR-15a和miR-16-1 microRNA的互补性)融合至荧光素酶报告基因。任一种miRNA和BCL2 mRNA之间的相互作用应当减少萤火虫荧光素酶的活性(其为相对转染对照质粒的Renilla荧光素活性标准化的活性)，同时任一种miRNA不能与BCL2 mRNA相互作用应当不影响报告基因的表达。图6A和6B中显示的数据符合miR-15a/miR-16-1 miRNA和BCL2转录物之间的直接相互作，因为与对照载体相比，在用任一种或两种microRNA转染后观察到荧光素活性的显著抑制。使用两种类型的突变的靶mRNA序列进行对照实验，所述靶mRNA缺少miR-15a和miR-16-1中与BCL2 cDNA互补的9个(3′M1)或5个(3′M2)碱基。如所预期的，两种突变体完全消除了miR-15a和miR-16-1与BCL2的3′UTR之间的相互作用(图6B)。这些数据表明miR-15a和miR-16-1 microRNA都直接与BCL2的3′UTR相互作用。
影响Bcl2基因的易位增加了两种信使RNA和蛋白质的水平(Tsujimoto，Y.，等人，Science 228：1440-1443(1985))。因为最近显示miRNA可通过影响mRNA翻译或mRNA的稳定性下调特定的靶(Lim，L.P.，等人，Nature 433：769-773(2005))，检测miR15a/16-1相互作用通过mRNA的稳定性下调BCL2的可能性。使用来自用pSR-miR-15/16-WT或特定的miR-15a和miR-16-1 RNA寡核苷酸转染的细胞的提取物通过RT-PCR扩增来估量BCL2 mRNA的水平。在对照细胞(例如，未转染的细胞或用空载体转染的细胞)和用这些载体中的任何载体转染的细胞之间没有观察到Bcl2表达水平的差异(图6A)。这些结果表明miR-15a和miR-16-1不影响mRNA的稳定性，但可能影响Bcl2mRNA的翻译。
实施例8：假定的microRNA/BCL2相互作用的鉴定
在人基因组中，存在miRNA的mir15/16家族的4个成员，其全都具有与Bcl2转录物的区域互补的相同的9bp序列。该功能冗余表明存在调节Bcl2表达的非常精细的机制。此外，通过使用靶预测软件(TargetScan(Lewis，B.P.，等人，Cell 120：15-20(2005))，BCL2鉴定为14种不同miRNA(包括mir15和mir16)的潜在的靶(表5)。这些发现表明其他microRNA可在不同细胞类型中调节Bcl2蛋白的表达。
表5.通过不同的靶预测程序预测的miRNA::BCL2相互作用。*
*注意：TargetScan(MIT)的网址为genes.mit.edu/targetscan/，PicTar(New Your University)的网址为pictar.bio.nyu.edu/和Miranda(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)网址为www.microrna.org/.N/A-预计不可获得的。
此处提供的数据表明作为microRNA(例如，miR-15a、miR-16-1)下调的结果Bcl2的过度表达是促成人B-CLL的发病机理的重要机制。值得注意的是，在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的情况下也报导了的miR-15a和miR-16-1下调(Eis，P.S.，等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 102：3627-3632(2005))。因此，作为microRNA(例如，miR-15a、miR-16-1)下调的结果的Bcl2的过度表达可能参与其他人恶性肿瘤。
实施例9：人细胞中miR基因产物的表达
按照Zeng，等人，Mol.Cell 9：1327-1333(2002)(其全部公开内容在此引用作为参考)的方法将编码一种或更多种完整的miR前体RNA的cDNA分别克隆入在细胞巨化病毒立即早期(CMV-IE)启动子的控制之下表达的不相关mRNA的背景。
简而言之，将Xho I连接体置于编码miR前体的双链cDNA序列的末端，然后分别将这些构建体克隆入存在于pBC12/CMV质粒中的XhoI位点。在Cullen，(1986)，Cell 46：973-982(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述了pBCl2/CMV质粒。包含miR前体RNA序列的质粒称为pCMV-miR(例如，用于miR-16-1的pCMV-miR16)。
使用FuGene 6试剂(Roche)通过标准技术将一种或更多种pCMV-miR构建体分别转染入培养的人293T细胞。如上所述提取总RNA，然后使用miR特异性探针通过Northern印迹分析检测加工的microRNA的存在。
也将一种或更多种pCMV-miR构建体分别转染入培养的人癌细胞系(例如，癌细胞系2220、2221、11609、11611、LNCAP、TSUR)。如上所述提取总RNA，然后使用miR特异性探针通过Northern印迹分析检测加工的microRNA在癌细胞中的存在。也就形态学的变化、克服接触抑制的能力和其他标志转化表型的标记评价转染的癌细胞。
实施例10：使用miR基因产物对BCL2相关癌细胞进行的转染
分离来自诊断患有BCL2相关癌症的受试者的BCL2相关癌细胞，然后如下用编码一种或更多种microRNA的质粒转化所述细胞。
如上所述分离CD5+B，通过目视检查(如果癌症是CLL，按照Matutes，等人，Leukemia 8(10)：1640-1645(1994)(其全部公开内容在此引用作为参考)的评分系统通过确定CLL评分)鉴定BCL2相关癌细胞(例如，CLL细胞)。具有至少4的CLL评分的CD5+B细胞被认为是CLL细胞。
通过标准技术用miR表达构建体(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)转染分离的BCL2相关癌细胞。如上所述提取总RNA，然后使用对于特定miR(例如，miR-15a、miR-16-1)是特异性的探针通过Northern印迹分析检测加工的microRNA的存在。也使用对于某些miR基因序列是特异性的探针通过Southern印迹杂交来确认miR基因序列的稳定整合。
实施例11：使用miR基因产物对造血干细胞进行的转染
如下从骨髓获得来自诊断具有BCL2相关癌症(例如，CLL)的受试者的造血干细胞(HSC)。
在手术室中使用标准的技术在全身麻醉的情况下从受试者的髂骨(iliac bone)获取骨髓。将多次抽吸总共大约750至1000ml的骨髓放入肝素化的注射器。立即将吸出的骨髓转移入包含每100ml运载液(transport medium)10,000个单位的无防腐剂的肝素的运载液(TC-199，Gibco，Grand Island，New York)。将吸出的骨髓通过3个逐渐变细的筛子进行过滤，从而获得不含细胞聚集体、碎片和骨颗粒的细胞悬浮液。然后将过滤的骨髓在自动化的细胞分离器(例如，Cobe 2991毛细腔式洗片器(Cell Processor))中进行进一步加工以获得“血沉棕黄层”(即，不含红细胞和血小板的白细胞)。
通过如下使用免疫磁珠(Dynal A.S.，Oslo，Norway)正选择CD34+细胞来就部分富造血干细胞(HSC)部分富集血沉棕黄层制剂。将血沉棕黄层制剂悬浮于补充的α培养基中，并在轻轻倒转试管的情况下，在4℃下与以1∶20稀释的小鼠抗HPCA-I抗体一起温育45分钟。在补充的α培养基中洗涤细胞3次，然后与用山羊抗小鼠IgG1的Fc片段包被的小珠一起温育(75μl免疫珠/107个CD34+细胞)。在4℃下温育45分钟后，按照厂商的指导。使用磁性颗粒浓缩器正选择附着至小珠的细胞。
在5ml聚丙烯试管(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)中，将2×104个来自就HSC富集的制剂的细胞在总共0.4ml的包含2％的人AB血清和10mM Hepes缓冲剂的Iscove’s modified Dulbecco’s培养基(IMDM)中进行温育，通过标准技术使用表达miR的构建体(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)进行转染。通过Northern印迹分析确认microRNA在部分转染的HSC中表达，通过Southern印迹分析确认miR基因序列稳定地整合在部分HSC中。按照标准的骨髓移植技术将大约4×108/kg体重至大约8×108/kg体重的其余的转染细胞再植入受试者。
重复实验，但在转染和移植之前用电离辐射从骨髓清除赘生性细胞。将血沉棕黄层制剂中的细胞在包含大约20％的自体血浆的TC-199中调节至大约2×107/ml的细胞浓度。向细胞悬浮液中加入重组人造血生长因子rH IL-3或rH GM-CSF以刺激造血赘生物的生长，从而增加它们对电离辐射的敏感性。然后将细胞暴露于5-10Gy的电离辐射，在4℃下在包含大约20％的自体血浆的TC-199中洗涤一次，然后如上用表达miR的构建体(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)进行转染。
实施例12：封装microRNA的脂质体的制备
脂质体制剂1-按照美国专利：4,235,871(其全部公开内容在此引用作为参考)中描述的反相蒸发法制备以1∶1∶4∶5的摩尔比的乳糖酰基脑苷脂、磷脂酰甘油、磷酸卵磷酯和胆固醇组成的脂质体。在100μg/ml加工的microRNA或500μg/ml(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16)的水溶液中制备脂质体。所制备的脂质体包含加工的microRNA(例如，miR-15a、miR-16-1 RNA)或表达microRNA(例如，pCMV-miR15、pCMV-miR16质粒)的构建体。
然后将脂质体通过0.4聚碳酸酯膜并且悬浮于盐溶液中，然后通过在135mM氯化钠，10mM磷酸钠pH 7.4中进行柱层析来将其与未封装的材料分离。使用脂质体而无需进一步修饰，或如下所述对其进行修饰。
将一些上面制备的脂质体装满合适的反应器，在搅拌的条件下向该反应器中加入20mM高碘酸钠、135mM氯化钠和10mM磷酸钠(pH 7.4)的溶液。将所得的混合物在20℃的温度下在黑暗处静置90分钟。通过反应混合物对250ml的缓冲盐溶液(135mM氯化钠、10mM磷酸钠，pH 7.4)透析进行2小时以除去过量的高碘酸盐。产物是具有通过将糖类羟基氧化成醛基修饰的表面的脂质体。通过这些醛基将靶向基团或调理作用抑制部分缀合致脂质体表面。
脂质体制剂2如下获得由顺丁烯酰胺苯甲酸(maleimidobenzoyl)-磷脂酰乙醇胺(MBPE)、磷酸卵磷酯和胆固醇组成的第二脂质体制剂。MBPE是用于将包含巯基的化合物包括蛋白质偶联至脂质体的活化的磷脂。
如Kitagawa，等人，J.Biochem.79：233-236(1976)(其全部公开内容在此引用作为参考)中所述，将十四酰基磷脂酰乙醇胺(Dimyristoylphosphatidylethanolamine)(DMPE)(100毫摩尔)溶解在5ml包含2当量的三乙胺和50mg顺丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的溶液中。然后在室温下在氮气氛下使所得的反应继续进行过夜，将所述反应物在氯仿/甲醇/水(65/25/4)中的硅胶H(Silicagel H)上进行薄层层析，这显示DMPE至更快速的迁移产物的定量转化。在减压的条件下除去甲醇，将产物重新溶解于氯仿中。用1％氯化钠和顺丁烯酰胺苯甲酸-磷脂酰乙醇胺(MBPE)洗涤氯仿相2次，用使用氯仿/甲醇(4/1)作为溶剂的硅酸层析纯化对其进行纯化。在纯化后，薄层层析显示单个的为水合茚三酮阴性的包含磷酸盐的斑点。
按照美国专利号4,235,871(同上)的反相蒸发法在100μg/ml加工的microRNA的水溶液中或编码microRNA的质粒的溶液中以1∶9∶8的摩尔比用MBPE、磷酸卵磷酯和胆固醇制备脂质体。通过在100mM氯化钠-2mM磷酸钠(pH 6.0)中进行柱层析来将脂质体与未封装的材料分离。
实施例13：抗CD5+或抗前列腺肿瘤抗体至封装miR基因产物的脂质体 的附着
用1.1ml(包含大约10毫摩尔)的具有醛基的脂质体制剂1或上述的脂质体制剂2装满合适的反应器。在搅拌的条件下将0.2ml 200mM氰基硼氢化钠溶液和1.0ml 3mg/ml针对CD5+细胞表面标记或前列腺肿瘤细胞抗原的单克隆抗体溶液加入制剂。在保持4℃的温度下使所得的反应混合物静置过夜。在Biogel A5M琼脂糖柱(Biorad，Richmond，Ca.；1.5×37cm)上分离反应混合物。
实施例14：miR基因产物在体内对人前列腺肿瘤生长的抑制
将人激素抵抗性前列腺腺癌细胞系(PC-3)接种入裸小鼠，并将小鼠分成治疗组和对照组。当小鼠中的肿瘤达到100至250立方毫米时，将一种或更多种封装在脂质体中的加工的microRNA(例如，miR-15a、miR-16-1)直接注射入对照组的肿瘤中。用只封装载体溶液的脂质体注射对照组的肿瘤。在整个研究中测量肿瘤的体积。如下，也在DunningR-3327大鼠前列腺模型中评估miR基因产物在抑制前列腺肿瘤生长中的功效。将Dunning R-3327前列腺腺癌细胞的高度转移和恶性的克隆(RT-3.1)接种入Copenhagen大鼠，然后将其分成治疗和对照组。两组大鼠在大约一周后都形成肿瘤块。然后每周2次用封装在脂质体中的加工的microRNA注射治疗组中的大鼠的肿瘤，进行5周。用只封装载体溶液的脂质体注射对照组的肿瘤。在整个研究过程中测量肿瘤的体积。
之前未引用作为参考的所有参考文献的相关教导在此引用作为参考。本领域技术人员将容易地认识到本发明特别适合进行目的和获得提及的结果和有利方面，以及其中固有的有利方面。本发明可以以其他特定的形式体现而不背离其精神或本质属性。

Claims (17)

1.至少一种miR基因产物在制备用于抑制表达BCL2的癌细胞中的BCL2的表达的试剂中的用途，其中所述至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1且包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。
2.权利要求1的用途，其中所述癌细胞相对于对照细胞展示增加的Bcl2蛋白的表达。
3.权利要求1的用途，其中所述癌细胞选自CLL细胞、肺癌细胞和淋巴瘤细胞。
4.权利要求3的用途，其中所述癌细胞是选自滤泡性淋巴瘤细胞、小细胞淋巴瘤细胞、大细胞淋巴瘤细胞和非何杰金淋巴瘤细胞的淋巴瘤细胞。
5.权利要求3的用途，其中所述癌细胞是肺癌细胞。
6.权利要求5的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌细胞。
7.权利要求1的用途，其中所述癌细胞是与选自急性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、血液的恶性肿瘤、结肠直肠癌、脑癌、乳腺癌、前列腺癌、EB病毒相关淋巴细胞增生性疾病、肾癌、肝细胞癌和胃癌的癌症相关的细胞。
8.权利要求1的用途，其中所述癌细胞存在于受试者中。
9.权利要求8的用途，其中所述受试者是人。
10.用于抑制表达BCL2的癌细胞中的BCL2的表达的药物组合物，其包含至少一种抗癌剂和至少一种miR基因产物，其中所述至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1且包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。
11.至少一种miR基因产物在制备用于确定抑制受试者中的表达BCL2的癌细胞的BCL2表达的功效的试剂中的用途，其中所述miR基因产物是miR-15a、miR-16-1且包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。
12.权利要求11的用途，其中所述受试者具有CLL。
13.权利要求11的用途，其中所述受试者具有与Bcl2蛋白的过度表达相关的癌症。
14.权利要求11的用途，其中相对于合适的对照miR基因产物的表达的增加表明成功的治疗。
15.至少一种miR基因产物在制备用于在受试者中诊断或预示BCL2相关癌症的试剂中的用途，所述试剂用于
i)确定来自受试者的样品中的至少一种miR基因产物的水平；
ii)将样品中所述至少一种miR基因产物的水平与对照相比较，其中相对于对照的miR基因产物的水平来自受试者的样品中的所述至少一种miR基因产物的水平的减少诊断或预示BCL2相关癌症，和
其中所述至少一种miR基因产物是miR-15a或miR-16-1且包含与SEQ ID NO：55的核苷酸3741-3749互补的核苷酸序列。
16.权利要求15的用途，其中所述对照是来自不具有BCL2相关癌症的受试者的所述至少一种miR基因产物的水平。
17.权利要求15的用途，其中所述对照是来自该受试者的非癌样品的所述至少一种miR基因产物的水平。
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