CN111850047B - 一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及两种小RNA miR‑16和miR‑30c联合用于调控神经干细胞增殖。本申请进行了（1）miR‑16和miR‑30c共同作用下使阿尔兹海默病小鼠海马成年神经干细胞数量增加了1.96倍，n=6，p<0.001；（2）miR‑16和miR‑30c过表达后阿尔兹海默病小鼠侧脑室室下区和海马齿状回部位成年神经发生分别增加了13.90，n=6，p<0.001和6.71，n=6，p<0.001。miR‑16和miR‑30c在调控成年阿尔兹海默病小鼠神经干细胞增殖上作用显著，有助于我们设计出阿尔兹海默病治疗的靶向药物，进而用于临床上阿尔兹海默病的治疗。

Description

一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，应用于治疗阿尔兹海默干细胞增殖或神经发生，属于生物医药领域。
背景技术
成年啮齿类和灵长类动物脑内绝大部分神经元没有再生能力，成年神经元发生能力仅局限于位于海马齿状回和侧脑室周围室下区的一部分干性细胞，并且随着年龄的增加，成年神经干细胞的增殖能力不断地降低，特别是近来的研究发现神经性疾病，特别是神经退行性疾病的发生与成年神经的发生能力紧密相关。增强神经发生能力在神经性疾病的诊治上具有重要的应用价值。
miR-16在多种肿瘤细胞中具有抑制增殖的作用，并且其还是早期凋亡的诱发因子，能引起细胞的凋亡。miR-30c对细胞增殖发挥正向作用，能够促进神经系统室下区和海马齿状回处的神经发生能力。
发明内容
本发明提供一种miR-16和miR-30c联合表达载体，通过miR-16和miR-30c作为调控神经干细胞增殖的方法，具体的：
本发明提供一种miR-16与miR-30c联合表达载体，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，所述的miR-30过表达序列miR-30c-OE，其编码序列依次为SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO: 2。
其中，所述的质粒载体为pLV-shRNA2载体；所述的表达载体为双启动子表达载体，具体为双启动子慢病毒载体。
所述的联合表达载体应用于促进神经干细胞增殖。
所述的联合表达载体应用于促进神经发生。
所述的联合表达载体作用的神经细胞为室下区神经细胞和海马神经细胞。
所述的联合表达载体应用于神经干细胞迁移药物的制备。
所述的联合表达载体应用于阿尔兹海默症早期检测试剂的应用。
所述的miR-16下调载体是一种与miR-16成熟序列互补的串联8次的海绵载体序列，其可以捕获细胞中成熟的miR-16序列；所述的miR-30c的过表达载体，是一种可以组成型表达的miR-30c的前体序列。
本发明有益效果
我们首次发现了miR-16和miR-30c随发育的进行而产生差异性表达，两者的表达与年龄呈负相关。构建miR-16下调载体和miR-30c的过表达载体,体外转导神经干细胞，发现miR-16下调和miR-30c过表达，神经干细胞增殖增加；
利用神经干细胞marker和神经前体marker进行标记，发现抑制miR-16的表达和促进miR-30c的表达可使干细胞保持干性，抑制其向神经前体分化。
通过构建能够同时表达miR-16下调序列和miR-30c过表达序列的双启动子慢病毒载体，利用脑立体定位向海马齿状回显微注射该双启动子慢病毒载体，发现室下区和海马齿状回处神经发生分别增加了13.90倍和6.71倍。
因此，通过调控miR-16和miR-30c表达情况，能够有效提高阿尔兹海默症小鼠神经干细胞增殖并阻止后续分化，同时，也能提高神经发生，对于早期检测和治疗阿尔兹海默症具有重要意义。
附图说明
图1 miR-16和miR-30c联合作用下，体外神经球的增殖直径检测
（a）DAPI染色，显示总体神经形态，标尺，50 μm。（b）统计学分析神经球的增殖直径。AD，阿尔兹海默症小鼠组；shRNA，miR-16和miR-30c联合作用组；t值检验，p< 0.0001，n=10。
图2 miR-16和miR-30c联合作用下，体外神经干细胞检测
（a）利用GFAP和PH3标记神经干干细胞，进行免疫荧光检测，标尺，50 μm。（b）统计学分析体外神经干细胞的数量。 AD，阿尔兹海默症小鼠组；shRNA，miR-16和miR-30c联合作用组；t值检验，p= 0.023，n=10。
图3 miR-16和miR-30c联合作用下脑部室下区和海马神经增殖细胞明显增加
(a)海马齿状回处神经细胞增殖性检测。shRNA:显微注射有miR-16下调和miR-30c过表达的慢病毒组小鼠；AD，阿尔兹海默病组小鼠（4月龄）；ki67用于标记处于增殖期的细胞；GFAP，胶质纤维酸性蛋白，可以标记神经元干细胞和胶质细胞,标尺，50 μm。(b)海马齿状回处神经细胞增殖情况统计结果，t值检验。(c)侧脑室室下区神经细胞增殖性检测，DAPI标记细胞核，标尺，50 μm。(d)侧脑室神经细胞增殖情况统计结果，t值检验。p< 0.001，n=5。
图4 miR-16和miR-30c联合作用下神经干细胞数量明显增加
(a)脑片免疫荧光检测神经干细胞数量变化，shRNA:显微注射有miR-16下调和miR-30c过表达的慢病毒组小鼠；AD，阿尔兹海默病组小鼠（4月龄）；白色箭头所示为神经干细胞。(b)神经干细胞统计学结果，t值检验，p<0.001，n=6。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明。以下实施方式将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1 miR-16和miR-30c联合表达载体的构建
实施例1-1 pLV-shRNA2双启动子载体的构建
（a）利用表1中的1st-forward primer和1st-reverse primer引物从pSUPER.retro-GFP/Neo载体中扩增H1启动子序列，且通过引物引入XhoI 和Xba I限制性酶切识别位点序列，扩增出的序列命名为XhoI-H1-XbaI（见表1)。
其中反应混合体系：LA Taq(5 U/μl)，2 μl，10×LA Taq buffer 2 μl，dNTP(2.5mM) 8 μl，pSUPER.retro-GFP/Neo质粒 500 ng，primer mix primer mixture (10 μM)1 μl，ddH2O补足至20 μl。热反应体系：95℃预变性5 min，94℃ 30 s，57.5℃ 40 s, 72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保温，60 min。
（b）利用表1中的2nd-forward primer和2nd-reverse primer引物，将上述XhoI-H1-Xba I序列两端加上BamH I和EcoR I的识别序列和保护碱基，扩增出的序列命名为BamHI-Xho I-H1-Xba I-EcoR I。其中反应混合体系：LA Taq(5 U/μl)，2 μl，10×LA Taqbuffer 2 μl，dNTP(2.5 mM) 8 μl，（a）扩增产物800 ng，primer mix primer mixture (10μM)1 μl，ddH2O补足至20 μl。热反应体系：95℃预变性5 min，95℃ 30 s，63.6℃ 40 s, 72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保温，60 min。
（c）BamH I and EcoR I 内切酶分别酶切pLVX-shRNA2和BamH I-Xho I-H1-XbaI-EcoR I，后在25℃，在T4连接酶过夜连接的作用下，将BamH I-Xho I-H1-Xba I-EcoR I序列插入到pLVX-shRNA2中，形成的载体成为pLV-shRNA2.
（d）将pLV-shRNA2转化DH5α感受态细胞及后续对克隆进行测序进行鉴定。
实施例1-2 miR-30c过表达序列的插入
（a）利用Trizol从阿尔兹海默病小鼠脑和腿部肌肉提取总RNA；
（b）利用miR-30c过表达引物序列进行反转录和扩增（引物见表2, 3）；
其中逆转录混合体系：dNTPs 0.25 μl，5×Reverse Transcription Buffer 1 μl, Reverse Transcription primer(2 nM) 0.5 μl, Total RNA (250 ng) 1.25 μl, M-MLV(40 U/μl) 0.5，RNase inhibitor 0.25 μl和RNase Free ddH2O 1.25 μl。
逆转录热反应体系：total RNA于70℃预变性10 min，以解除RNA二级结构，冰上冷却2 min，之后将反转录混合液于42℃反应1 h，并于70℃加热15 min以灭火反转录酶。
扩增反应混合体系：LA Taq (5 U/μl)，5 μl，10×LA Taq buffer 2.5 μl，dNTP(2.5 mM) 8 μl，反转录产物500 ng，primer mixture (10 μM)1 μl，ddH2O补足至25 μl。
热反应条件如下：
94℃预变性3 min，94℃ 30 s，55℃ 40 s, 72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保温，60 min。
（c）利用BamH I and Xho I 内切酶将miR-30c过表达序列以及载体pLV-shRNA2进行酶切和割胶回收酶切产物。
（d）用T4DNA酶将其连接到pLV-shRNA2载体中，此载体命名为pLV- U6-miR-30c-OE-ZsGreen1。
（e）将pLV-U6-miR-30c-OE-ZsGreen1转化DH5α感受态细胞及后续对克隆进行测序进行鉴定。
实施例1-3 miR-16下调序列的插入
（a）设计能与miR-16成熟序列进行互补的8次重复的下调载体序列（见SEQ-2）。
（b）miR-16下调载体序列交由上海捷瑞公司进行合成。
（c）利用Xba I and EcoRI 内切酶将miR-16下调序列以及载体pLV- U6-miR-30c-OE-EGFP进行酶切和割胶回收酶切产物。
（d）用T4DNA酶将miR-16下调序列连接到pLV- U6-miR-30c-OE-ZsGreen1载体中，此载体命名为pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1。
（e）将pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1转化DH5α感受态细胞及后续对克隆进行测序进行鉴定。
实施例1-3 含有双启动子pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1表达载体慢病毒的包被及滴度测定
在获取了双启动子pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1表达载体后，我们需要检测两个小RNA联合作用下的功能，故我们获取了表达载体的慢病毒液。之后将抽提到的pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1表达载体和辅助载体psPAX2、PMD2.G按照1:1:1的比例(分子量)进行混合溶于10 ml Opti-MEM，室温孵育5 min，之后与含有Lipofactamine3000的Opti-MEM培养液进行混合，室温孵育25 min，转染指数期HEK293T细胞（10 cm培养皿，2.5×106细胞）。转染6 h后更换为完全培养液，转染后48-72 h收获含病毒的上清，45 μm滤膜过滤，之后于24,000 rpm离心120 min进行浓缩。
为了确定成体miR-16和miR-30c的高效表达，需要在脑立体定位前对病毒滴度进行测定。利用了流氏细胞法对病毒滴度进行精确测定，即首先将病毒稀释1/10，1/100，1/1000和1/10000四个浓度，加入到已经接种6 h的HEK293T细胞中，48 h后用0.25% trypsin-EDTA（500 μl，6孔板）裂解制备单细胞悬浊液，离心去上清（12,000 rpm，5 min），并加入乙醇于-20℃下固定 2 h，之后用PBS清洗后重悬，利用流氏测定ZsGreen1阳性细胞的百分比。
病毒滴度(IU/ml)=接种细胞数×荧光蛋白阳性细胞所占百分数×1000/所加入病毒的体积(μl)。
实施例2 miR-16和miR-30c联合表达载体的应用
实施例2-1体外实验检测载体对神经干细胞增殖的影响
用戊巴比妥钠溶液(45mg/kg)行腹腔注射，对E14.5天的AD孕鼠进行麻醉，剖开腹部，从子宫角中取出胚胎，体式显微镜下，解剖出海马脑区，利用木瓜蛋白酶（50 U）37℃进行组织消化1 h，获得单细胞悬液，于Neurobasal-A培养液中进行培养，其中Neurobasal-A辅加有B27（终浓度20 ng/ml）、L-谷氨酰胺（终浓度2 mM、bFGF（终浓度20 ng/ml）和EGF（终浓度20 ng/ml）。5天后，用巴斯德吸管轻轻吹打神经细胞球使之成单细胞悬液，进行传代，接种到聚-L-鸟氨酸和纤维结合蛋白包被的细胞板中。24 h后用细胞核转染试剂（Nucleofector kit），按照试剂盒说明将miR-16下调载体和miR-30c过表达载体转染到AD孕鼠来源的神经干细胞中。5天后，PH3和GFAP免疫染色和DAPI对核进行复染后于荧光显微镜下进行成像，以检测miR-16和miR-30c联合载体对神经干细胞增殖的影响。利用Image J软件的标尺工具对神经球的直径进行计算，并对PH3的数量进行计算（每组挑选10个神经细胞球进行测量和计算）。结果显示，miR-16和miR-30c联合作用组的体外神经球增殖直径是对照组的1.48倍（图1）。而且，miR-16和miR-30c联合作用组的体外神经球增殖性细胞数量和对照组相比增加了1.72倍（图2）。
实施例2-2利用脑立体定位特异性的将携带有miR-16下调和miR-30c过表达的慢病毒显微注射到脑区的神经干细胞增殖区：侧脑室室下区和海马齿状回。
小鼠分为两组：阿尔兹海默病小鼠组和慢病毒侵染小鼠组即shRNA组，每组小鼠15只。用戊巴比妥钠溶液(45mg/kg)行腹腔注射，麻醉小鼠。固定小鼠（双耳和上颌固定），从直至各个方向推压小鼠头部，均不会出现移动。备皮，去除筋膜、肌肉和骨膜，暴露前囟，以前囟位置为零点，对定位仪进行校零。根据小鼠脑图谱，按照坐标钻颅。在钻孔部位下降微量进样器针头，刺开硬膜，缓缓穿刺至相应深度，匀速缓慢注射，注射速度为0.2 μl/min（病毒滴度1.21×109IU/ml)注射完毕后针头留置20 min后，再缓慢退出进样针。海马齿状回的注射位置为（室下区：AP+0.86 mm，ML-0.8 mm，DV -3.8 mm；海马齿状回：AP-1.75 mm，ML0.75mm，DV-3.8 mm）。
实施例2-3 miR-16和miR-30c联合表达载体的应用——增殖性和干性
利用连续脑片对神经干细胞的数量以及神经干细胞的增殖进行检测。
脑片的制备和免疫荧光染色的操作，首先用戊巴比妥钠溶液行腹腔注射方式对慢病毒注射后4周后的小鼠进行麻醉，随后进行灌注，进行梯度蔗糖脱水及连续矢状冷冻切片制备（20 μm），挑选两副连续切片进行免疫荧光染色，其中一副对神经干细胞数量进行检测（在封闭后的切片上共同孵育鼠抗-Nestin，羊抗GFAP和兔抗Ki67），另一副对神经增殖进行检测（鼠抗GFAP和兔抗Ki67或鼠抗GFAP和兔抗PH3)，4℃过夜孵育。PBS清洗以上切片(5 min×3次)。其中标记神经干细胞的切片同时加入Alexa Fluor647驴抗鼠，Alexa Fluor488驴抗兔, Alexa Fluor549驴抗羊以及Alexa Fluor546驴抗鼠二抗。标记增殖性神经干细胞的切片加入Alexa Fluor488驴抗鼠和Alexa Fluor549驴抗兔二抗，室温孵育2 h。PBS清洗以上切片(5 min×3次)后，用防淬灭剂进行封片，激光共聚焦显微镜拍照检测。
其中海马齿状回和室下区神经干细胞的增殖检测是利用Image J软件对每只小鼠连续脑切片的15张激光共聚焦图片中的ki67细胞数量进行计数（每组有6只小鼠），最终求得shRNA处理组与AD组ki67细胞数的比值即为shRNA组较之AD组小鼠神经干细胞增殖的倍数（图3）。
所述的神经干细胞干性是通过神经干细胞的数量进行反映的，GFAP、ki67和Nestin共标的细胞为神经干细胞。利用Image J软件对每只小鼠连续脑切片的15张激光共聚焦图片中的GFAP/ki67/Nestin共标的细胞数量进行计数（每组有6只小鼠），最终求得shRNA处理组与AD组神经干细胞数的比值即为shRNA组较之AD组小鼠神经干细胞的倍数（图4）。
SEQ ID NO: 1
miR-30c-OE sequence(5'-3')：
GAGTGACAGATATTGTAAACATCCTACACTCTCAGCTGTGAAAAGTAAGAAAGCTGGGAGAAGGCTGTTTACTCTCTCTGCCTT
SEQ ID NO: 2
miR-16-KD sequence(5'-3')：
CGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCGCGCCAATATTGCAATGCTGCTAGCATCG
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Figure DEST_PATH_IMAGE004
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序列表
<110> 枣庄学院
<120> 一种miR-16与miR-30c联合表达载体及其构建方法与应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gagtgacaga tattgtaaac atcctacact ctcagctgtg aaaagtaaga aagctgggag 60
aaggctgttt actctctctg cctt 84
<210> 2
<211> 224
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
cgccaatatt gcaatgctgc tagcatcgcg ccaatattgc aatgctgcta gcatcgcgcc 60
aatattgcaa tgctgctagc atcgcgccaa tattgcaatg ctgctagcat cgcgccaata 120
ttgcaatgct gctagcatcg cgccaatatt gcaatgctgc tagcatcgcg ccaatattgc 180
aatgctgcta gcatcgcgcc aatattgcaa tgctgctagc atcg 224
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ccgctcgagc ggaacttata agatt 25
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ctagtctaga ctagaaaacg aattcgaacg c 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
cgcggatccg cgccgctcga gcggaactta taa 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
cccacccacc ccggaattcc ggctagtcta gac 33
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgctgag 50
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccgccaa t 51
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
gcccgtcctg taaacatcct acac 24
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
ccagtgcagg gtccgaggta t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
gcagcaggct agcagcacgt a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
ccagtgcagg gtccgaggta t 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
ggcaaatcat ctttcgggac tg 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
ccagtgcagg gtccgaggta t 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
ctacggccat accaccctga ac 22
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
cggtctccca tccaagtact aacc 24

Claims (5)

1.一种miR-16与miR-30c联合表达载体，其特征在于，包含miR-16下调序列与miR-30c过表达序列和质粒载体；所述的miR-16下调序列为miR-16-KD，编码序列为SEQ ID NO: 2，所述的miR-30 c过表达序列为miR-30c-OE，编码序列为SEQ ID NO: 1。
2.根据权利要求1所述的联合表达载体，其特征在于，所述的联合表达载体为双启动子表达载体。
3.根据权利要求2所述的联合表达载体，其特征在于，所述的联合表达载体为pLV-U6-miR-30c-OE-H1-miR-16-KD-ZsGreen1：U6和H1为启动子。
4.一种权利要求1所述的联合表达载体的应用，其特征在于，所述的联合表达载体应用于神经干细胞迁移药物的制备。
5.一种权利要求1所述的联合表达载体在制备阿尔兹海默症早期检测试剂中的应用。
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