CN104531709A - 抑制肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤治疗药物应用领域，特别涉及一种抑制乳腺癌肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用。siRNA双干扰组合物，包括寡聚核酸 VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子，按照物质量比(0-2)∶(2-0)混合；所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.1，反义链为SEQ ID No.2；所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.3，反义链为SEQ ID No.4。将小鼠乳腺癌细胞株4T1接种于Balb/c小鼠的腋下脂肪垫中，用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染移植瘤细胞的实验结果表明VEGF-C- siRNA+survivin-siRNA的组合物能够在体内有效抑制上述肿瘤细胞的生长以及肿瘤细胞的肺转移。作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。

Description

抑制肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗药物应用领域，特别涉及一种抑制乳腺癌肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来包括中国在内的发展中国家女性乳腺癌的发病正呈明显升高的趋势。据统计2008年我国女性乳腺癌发病率约为47.64/10万，居女性恶性肿瘤发病率的第二位，仅次于第一位的肺癌。当前乳腺癌肿瘤治疗的方针是以手术及放疗、化疗为主，得益于乳腺癌防治知识的普及以及早期诊断技术的提高，乳腺癌致死率的增长趋势近年来得以缓解，但是乳腺癌晚期及手术后的肿瘤转移现象仍然不能完全避除，这大大影响了治疗的预后及患者的生存质量，因此，探寻肿瘤转移发生的机制，寻找有效的防止肿瘤转移的方法已然成为解决乳腺癌肿瘤治疗的当务之急。临床研究表明，淋巴系统与早期乳腺癌转移密切相关，淋巴转移往往是乳腺癌转移发生的第一个步骤。

淋巴管生长因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)属于VEGF家族的成员，由Joukov于1996年首次发现，是唯一特异性作用于脉管内皮细胞的生长因子。由于其在癌组织中大量表达，而且能促进肿瘤内新淋巴管的生成，因此被认为在肿瘤的淋巴转移中起到关键作用。VEGF-C的受体为VEGFR-2与VEGFR-3，其中VEGFR-2结合VEGF-C后可以促进血管的生成，而VEGFR-3结合VEGF-C后可以诱导胞内的丝裂原活化蛋白酶(MAPK)与蛋白激酶B(Akt)发生磷酸化，从而保护内皮细胞免于凋亡，促进淋巴内皮细胞增殖与迁移，最终促进淋巴管的新生与肿瘤的淋巴管转移。VEGF-C在乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌等肿瘤组织中高表达，能够通过促进淋巴管的生成以及改变癌细胞的生物学性状影响肿瘤疾病的进程。

细胞凋亡是一个多基因控制下的细胞自我灭亡过程，而Survivin 是乳腺癌肿瘤细胞避免凋亡的重要因素。survivin是凋亡抑制基因家族成员，是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，在细胞生长发育中起到重要的作用。Survivin在分化成熟的正常组织中几乎不表达，却在胚胎期的脏器以及肿瘤组织中大量表达。Survivin可以作用于细胞的紡锤体微管，从而发挥抗凋亡作用，进而促进肿瘤细胞的分裂增殖和浸润能力。Survivin还能保护肿瘤细胞并能够增强肿瘤细胞的转移，降低肿瘤细胞对化疗药物和放射的敏感性，其表达与肿瘤的恶性程度及病人的预后密切相关。

     目前公开的均为单一抑制Survivin 表达的siRNA 分子，如专利号200910051374.0一种抑制Survivin 表达的siRNA 分子及其应用和专利号200910054393.3一种干扰Survivin 表达的siRNA 分子及其应用。 然而单一抑制靶向基因表达的应用有其使用的局限性，例如VEGF-C的抑制主要是针对肿瘤的淋巴转移进行治疗，虽然有报道称VEGF-C对肿瘤具有一定的抑凋亡及促进生存的作用，但抑制VEGF-C所造成的促进肿瘤细胞凋亡及抑制增长的效果相对于survivin的抑制来讲仍然不具有优势。相反survivin的主要作用为抑制肿瘤细胞的凋亡以及促进肿瘤细胞的增长，同时也具有增强肿瘤细胞转移的功能，但对于survivin单独沉默而言，其抑制肿瘤细胞淋巴转移的结果并不及VEGF-C的抑制。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提供了一种包含靶向VEGF-C与靶向survivin的siRNA药物组合物，以及该组合物在乳腺癌症治疗中的用途。

由于VEGF-C与survivin作为乳腺癌肿瘤治疗的靶点均具有肿瘤的特异性，同时又具有肿瘤的普遍适宜性特点，应用小干扰RNA（siRNA）沉默VEGF-C与survivin的表达能够有效的抑制肿瘤的生长与转移，将VEGF-C-siRNA与survivin-siRNA组合应用，比单一的任何一种siRNA能够更加有效的治疗乳腺癌肿瘤疾病。进一步而言，针对不同的肿瘤类型以及病情发展状况可以相应的调节本组合药物中两种siRNA的配比进行有侧重的对症治疗。

本发明的技术方案是：

一种siRNA双干扰组合物，包括寡聚核酸 VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子；所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.1，反义链为SEQ ID No.2；所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.3，反义链为SEQ ID No.4。

以上方案的基础上，所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比(0-2)∶(2-0)混合。

优选的，所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和所述寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比1∶1混合。

以上寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子核苷酸序列的获得均通过以下方法：

首先在NCBI网站的Genbank中获取小鼠VEGF-C mRNA的全长序列 (GenBank accession No.NM_009506)以及小鼠survivin mRNA的全长序列 (GenBank accession No.NM_009689)，然后将其分别输入invitrogen公司的在线设计软件进行靶向siRNA设计以及BLAST同源基因序列比对排除。

本发明所解决的另一问题是，提供所述的siRNA双干扰组合物在制备抗乳腺癌基因治疗药物中的应用。

本发明公开的siRNA双干扰组合物，可包含至少一种药学上可接受的载体。

所述的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的双链RNA分子相容。所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI( 线性聚乙烯亚胺)，TF-PEI( 转铁蛋白聚乙烯亚胺) 脂质体，转铁蛋白，叶酸等。

本发明的有益效果是：

将小鼠乳腺癌细胞株4T1接种于Balb/c小鼠的腋下脂肪垫中，用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染移植瘤细胞的实验结果表明VEGF-C- siRNA+survivin-siRNA的组合物能够在体内有效抑制上述肿瘤生长以及肿瘤细胞的肺转移。

作为新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。

附图说明

图1 为MTT法检测不同配比{(0-2)∶(2-0)}的survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物转染肿瘤细胞48小时后对肿瘤细胞增殖的影响；

其中，a表示与Blank组比较有统计学意义（P<0.05）；b表示与100nM浓度siVC组比较有统计学意义（P<0.05）。

图2 为细胞划痕实验检测不同配比{(0-2)∶(2-0)}的survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物转染肿瘤细胞24小时后对肿瘤细胞迁移性能的影响；

其中，a表示与Blank组比较有统计学意义（P<0.05）；b表示与100nM浓度siVC组比较有统计学意义（P<0.05）。

图3 为细胞划痕实验检测不同配比{(0-2)∶(2-0)}的survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物转染后，不同实验组肿瘤细胞增殖率（对应组OD值/Blank组OD值）与迁移率（对应组迁移距离/Blank组迁移距离）在同一图表中表示的曲线图；

其中，1为100nM浓度NC-siRNA组；2-10分别代表VEGF-C-siRNA：survivin-siRNA质量浓度配备分别为0:2、0.5：2、1：2、1.5：2、2：2、2：1.5、2：1、2：0.5的各实验组。

图4 为RT-PCR 检测survivin-siRNA及survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物抑制肿瘤细胞的survivin的mRNA表达图；

其中，泳道1为未转染的细胞，2为转染随机序列的阴性对照(NC)，3为转染survivin-siRNA，4为转染组合siRNA。

图5 为RT-PCR 检测VEGF-C-siRNA及survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合物抑制肿瘤细胞的VEGF-C的mRNA表达图；

其中，泳道1为未转染的细胞，2为转染随机序列的阴性对照(NC)，3为转染转染VEGF-C-siRNA，4为转染组合siRNA。

图6 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA、VEGF-C-siRNA以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后各组间小鼠的肺转移率比较。

图7 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA、VEGF-C-siRNA以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后的瘤体积比较示意图。

图8 为生理盐水、NC-siRNA、survivin-siRNA、VEGF-C-siRNA以及二者组合物治疗乳腺癌移植瘤6次以后瘤重柱形图。

具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1. 靶向小鼠VEGF-C与survivin的siRNA的设计与合成

本发明中所述靶向VEGF-C的siRNA序列（以下皆简称siVC），

正义链为：5′-GCAAGACGUUGUUUGAAAUtt-3′(SEQ ID NO.1 ) ；

反义链为：5′-AUUUCAAACAACGUCUUGCtt-3′(SEQ ID No.2) ；

本发明中靶向survivin的siRNA序列(以下皆简称siSV)，

正义链为5′-GGAAUUGGAAGGCUGGGAAtt-3′( SEQ ID NO.3 ) ；

反义链 为5′-UUCCCAGCCUUCCAAUUCCtt-3′(SEQ ID No.4) 。

以上两种siRNA序列的获得均通过以下方法：首先在NCBI网站的Genbank中获取小鼠VEGF-C mRNA的全长序列 (GenBank accession No.NM_009506)以及小鼠survivin mRNA的全长序列 (GenBank accession No.NM_009689)，然后将其分别输入invitrogen公司的在线设计软件进行靶向siRNA设计以及BLAST同源基因序列比对排除。

本发明中以随机序列作为阴性对照(NC)，NC序列（以下皆简称siNC），

正义链序列为：5′-UUGAUGUGUUUAGUCGCUAtt-3′(SEQ  ID  No.5)，

反义链序列为：5′-UAGCGACUAAACACAUCAAtt-3′(SEQ ID No.6)。

所述寡聚核酸和NC 序列中的A、G、C、U、t 表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T 表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

所述寡聚核酸和NC委托上海吉玛(GenePharma) 制药技术有限公司合成。

实施例2：依据所述siRNA分子不同配比的混合物转染后抑制肿瘤细胞增殖与迁徙效果进行优选。

一种siRNA双干扰组合物，包括寡聚核酸 VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子；所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.1，反义链为SEQ ID No.2；所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.3，反义链为SEQ ID No.4。所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照物质量比混合。

MTT法的步骤为：将对数生长期4T1细胞用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶进行消化，用含10%胎牛血清的DMEM溶液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度后接种于96孔板中，每孔细胞数3×10³个，每孔体积为200μl，之后放置于饱和湿度5％ CO₂浓度条件下的37℃恒温孵箱中进行培养。继续培养24 h后，吸出旧培养液，更换不含血清的新DMEM培养液，依照实例3所述方法，实验组加入siRNA终浓度为100nM，质量浓度比例分别为0：2；0.5：2；1：2；1.5：2；2：2 ；2：1.5；2：1；2：0.5；的siSV与siVC小干扰RNA及对应脂质体,同时设立空白对照组及阴性对照组（终浓度为100nM的siNC及对应脂质体），每孔体积为200μl，每组设5个复孔。将96孔板移入CO₂孵箱中6小时后取出弃上清，加入新的完全培养基后继续培养，于转染后48h时间点进行MTT检测。每孔加MTT(5mg/mL) 20mL，于37℃恒温孵箱中继续孵育4h后终止培养，弃上清液后每孔加入DMSO 100mL，振荡10分钟使结晶充分溶解，最后应用全自动酶标仪检测490nm波长处各孔的吸光度（OD）。进行数据统计分析，实验重复三次。

细胞划痕实验的步骤为：实验前先用Marker笔沿着直尺在六孔板下面每孔画一条横线，然后再与之垂直交叉画五条纵线，每两条线间隔距离为0.5cm。将对数生长期4T1细胞用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶进行消化，用含10%胎牛血清的DMEM溶液吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度后接种于以上画好刻度的6孔板中，每孔细胞数1×10⁵个，每孔培养基体积为2mL, 之后放置于饱和湿度5％ CO₂浓度条件下的37℃恒温孵箱中进行培养。继续培养24 h后，吸出旧培养液，用20mL枪头对比六孔板后画的直线，每孔垂直划5道痕。之后吸出旧培养液，每孔加入PBS摇晃冲洗3次，清除划道上的细胞，更换不含血清的新DMEM培养液。依照实例3所述方法，实验组加入siRNA终浓度为100nM，物质量浓度比例分别为0：2；0.5：2；1：2；1.5：2；2：2 ；2：1.5；2：1；2：0.5；的siSV与siVC小干扰RNA及对应脂质体, 同时设立空白对照组及阴性对照组（终浓度为100nM的siNC及对应脂质体），每孔体积为1mL。然后将6孔板移入CO₂孵箱中，37 ℃，5% CO₂条件继续培养，并于6小时后，弃上清，加入无血清，无抗生素的新培养基继续培养。于转染后24小时取出培养板拍照，拍照视野为孔中一固定的划痕与背面黑线交点处,应用IPP6.0软件计算划痕间距宽度以及细胞迁移距离（细胞迁移距离=0小时划痕间距宽度-24小时划痕间距宽度）。

如图1所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(图中简称siNC) 比较，不同比例组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1肿瘤细胞增殖均受到显著抑制（p<0.5）；当siVC与siSV的配比≥(2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组无显著差异（p>0.5），当siVC与siSV的配比<(2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组有显著差异（p<0.5）。

如图2所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(图中简称siNC) 比较，不同比例组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1肿瘤细胞的迁移均受到显著抑制（p<0.5），而当siSV与siVC的配比<(2:2)时组合组增殖细胞的迁移距离与单独siVC转染组有显著差异（p<0.5）, 当siVC与siSV的配比≥(2:2)时组合组增殖细胞的吸光度值与单独siSV转染组无显著差异（p>0.5）。

如图3所示，将各实验组所得数据值除以Blank空白对照组数据值所得比值绘制成曲线图，不同配比的siRNA组合物转染对肿瘤细胞增殖率与迁徙率的影响效果并不同步，两条曲线的交集在配比为（2：2）组附近。

本实施例中，各组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞的增殖与迁移均显著降低，但siSV转染肿瘤细胞的增殖抑制效果更为明显，而siVC转染对于肿瘤细胞的迁移抑制效果更为显著，由此可见，针对于增殖活性与迁移能力不同的肿瘤细胞，或者肿瘤发展的不同阶段，有侧重性的调整siVC与siSV的配比进行组合转染治疗，因该会产生更加优异的疗效。

本实例为兼顾组合物对于肿瘤细胞增殖与迁移的抑制效果，优选siVC与siSV比例为（2：2）作为后续应用。

实施例3. RT-PCR方法检测siRNA转染对肿瘤细胞VEGF-C与survivin的mRNA表达影响。

使用北京普利来公司的HifectinⅡ真核细胞转染试剂进行转染，所有操作均按北京普利来公司提供的操作规程。将小鼠乳腺癌4T1细胞接种到6孔板中(1×10⁵个细胞/ 孔)，用含10％胎牛血清的DMEM 养液( 购自Hyclone) 培养16-24小时后，吸出旧培养液，更换为不含血清与抗生素的新DMEM培养液1500μL。将寡聚核酸粉末(siVC,siSV及siNC) 分别溶解于无RNA 酶的无菌水中，配成终浓度为20μmol/L的寡聚核酸溶液。

分别将10μL寡聚核酸溶液(上述siVC,siSV及siNC) 和5μL的HifectinⅠ分别稀释于250μL无血清培养培养液(DMEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与HifectinⅡ溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，按如下分组把寡聚核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为50-70％)，使每组转染的寡聚核酸终浓度为100nM：1.Blank组（500μL DMEM培养基/孔）；2.NC组（500μL NC-脂质体复合物/孔）；3.siVC组（500μL siVC-脂质体复合物/孔）；4.siSV组（500μL siSV-脂质体复合物/孔）；5.组合组（250μL siVC-脂质体复合物与250μL siSV-脂质体复合物/孔）。转染6小时之后再换为10％FBS-DMEM培养基继续培养,并于转染后48小时收集细胞进行RT-PCR 检测。

RT-PCR 检测的步骤为：用1mL TRIzol(invitrogen) 裂解转染所述寡聚核酸或寡聚核酸阴性对照的小鼠乳腺癌细胞株4T1的移植瘤细胞，并按TRIzol 产品说明的操作规程提取总RNA。由于RNA 干扰的效果可能被潜在的少量的基因组DNA 影响，实验采用DNase I(RNase-free)(TaKaRa) 来进一步消化降解总RNA中残留的DNA。在用DNase I 37℃消化30分钟后，按照DNase I产品说明重新提纯总RNA 并对RNA 进行定量和质量鉴定。使用Promega公司的反转录试剂盒进行逆转录反应，将1μg的总RNA与0.5ug 的Oligo dT混合，加热5分钟，迅速冷却至0℃。按产品说明加入缓冲液，42 ℃孵育1小时。逆转录反应后的cDNA，作为RT-PCR 反应的模板检测靶基因。

Survivin的上游引物为5’-AATCCTGCGTTTGAGTCGT-3’ (SEQ ID No.7)，下游引物为5’-ACCCCGTGGTAGGAAAACTC-3’ (SEQ ID No.8)，扩增长度为865 bp。

VEGF-C的上游引物为5’-AAACCTCAGCTGTCTGGTCC-3’ (SEQ ID No.9)，下游引物为5’-GAACCATGTGGATTACTGCG-3’ (SEQ ID No.10)，扩增长度为97 bp。

β-actin的PCR上游引物为5-GCGGACTGTTACTGAGCTGCGT-3’ (SEQ ID No.11)，下游引物为5’-GAAGCAATGCTGTCACCTTCCC-3’ (SEQ ID No.12) ，扩增长度为453 bp。

RT-PCR 检测的步骤为：使用上述步骤的cDNA 为模板，上述引物，进行PCR 反应。反应体系为，94 度5 分钟，94 度1 分钟，54 度30 秒，72 度20 秒，共28个循环。PCR产物在质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳上观察拍照，并运用天能分析软件对条带进行光密度扫描，检测各组survivin或VEGF-C的mRNA扩增产物与其对应的内参β-actin mRNA扩增产物A值，然后将A目的条带/A β-actin的比值进行统计学分析。

如图4所示，与转染寡聚核酸的阴性对照组(图中简称siNC) 比较，siSV组以及组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1肿瘤细胞中survivin的mRNA表达均受到显著抑制。

如图5所示，与siNC组比较，siVC组及组合组中小鼠乳腺癌细胞株4T1肿瘤细胞中survivin的mRNA表达均明显降低。

本实施例中，组合物中小鼠乳腺癌细胞株4T1细胞的VEGF-C与survivin的mRNA表达均较对照组显著降低，说明组合使用靶向survivin的siRNA以及靶向VEGF-C的siRNA能够同时干扰对survivin与VEGF-C的mRNA表达。

实施例4. siRNA的体内抑瘤作用

用含10％胎牛血清的DMDM 培养液培小鼠乳腺癌4T1细胞株，取对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，调节细胞浓度1.5×10⁷个细胞/ml。在5周龄的雌性BALB/C 小鼠的背侧翼部皮下注射0.1ml 肿瘤细胞悬液，使其形成移植瘤，当肿瘤长径≥3mm后认为肿瘤移植成功，随机将小鼠分为5组：分别为生理盐水注射组（简称盐水组）；NC-siRNA注射组(简称NC 组)，survivin-siRNA注射组( 简称VC组)，VEGF-C-siRNA注射组( 简称SV组)，survivin-siRNA与VEGF-C-siRNA组合注射组( 简称组合组，组合组中siVC和siSV按照质量比1：1混合），进行瘤内注射治疗。

瘤内注射用的siRNA制剂的配制方法是用不含RNA 酶的无菌水50μl 溶解20μg 的siRNA。单siRNA组取50μl 不含RNA 酶的无菌水溶解20μg 的siRNA，组合组用两份不含RNA 酶的无菌水25μL 分别溶解每组内的两种10μg siRNA后混合（总容积50ul）。然后各组再加转染剂HifectinⅡ真核细胞转染试剂2μl（购自北京普利来公司），室温孵育15 分钟后，与等体积50μl无菌生理盐水溶液混合起来，总体积100ul，在室温孵育15 分钟后进行瘤内注射。一次注射的siRNA用量为20μg/只。每3天注射一次，瘤内注射共6次。给药期间观测各组小鼠的生存状态，体重，移植瘤大小等情况。每次给药前测量记录小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤最大直径a、短径b，记录并按公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积，最后根据肿瘤体积的变化绘制肿瘤生长曲线。

最后一次给药后48小时，拖颈断髓处死小鼠，剥离瘤体进行称重与拍照。

实验结束处死小鼠后，解剖并分离各组小鼠的肺脏，用PBS清洗后，在Bonous固定液中浸泡24小时，随后取出，在70%无水酒精浸泡24小时后更换新的70%无水酒精继续浸泡48小时进行脱水脱色，在解剖显微镜下观察计数肺转移结节个数(肺转移灶为白色结节)，并进行拍照记录。

图6 为乳腺癌移植瘤注射治疗6次以后，各组小鼠的肺转移率比较。VC组，SV组与组合组的小鼠肺脏的肿瘤转移结节数比盐水组显著减少，而NC组与盐水组无显著差异，组合应用siVC与siSV进行瘤内注射对肿瘤肺转移的抑制效果明显优于单独siVC或siSV的治疗。

图7 为乳腺癌移植瘤注射治疗6次以后各组小鼠的瘤体积比较。随着治疗时间延长，各组小鼠的肿瘤体积均逐渐增大，盐水组小鼠的肿瘤体积均增加迅速；NC组与盐水组比较无明显差异； sVC组，SV组与组合小鼠的肿瘤体积增长速度逐渐趋缓，明显低于盐水组。其中组合应用siVC与siSV进行瘤内注射的抑瘤效果最好。

图8 为乳腺癌移植瘤注射治疗6次以后各组小鼠的瘤重比较。与肿瘤体积的对比图相似，VC组，SV组与组合组的小鼠平均瘤重明显低于比盐水组， NC组与盐水组无显著差异。SV组与盐水组平均瘤重轻58.75%；VC组比盐水组平均瘤重轻47.28%；组合组比盐水组平均瘤重轻73.84%.

本实施例中，单独注射siVC与siSV均能够对肿瘤的增长和转移产生抑制作用，但两种siRNA的组合应用所产生的治疗效果明显强于任何一种单独应用组。

<110>  葛银林、刘永超

<120> 抑制乳腺癌肿瘤生长与转移的siRNA双干扰组合物及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> 人工序列

<213> DNA

<400> 1

   gcaag acguu guuug aaaut t       21

 

<210> 2

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<212> 人工序列

<213> DNA

<400> 2

   auuuc aaaca acguc uugct t     21

 

<210> 3

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<212> 人工序列

<213> DNA

<400> 3

    ggaau uggaa ggcug ggaat t     21

 

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<212> 人工序列

<213> DNA

<400> 4

     uuccc agccu uccaa uucct t  21

 

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<212> 人工序列

<213> DNA

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     uugau guguu uaguc gcuat t   21

 

<210> 6

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<212> 人工序列

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      uagcg acuaa acaca ucaat t  21

 

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<212> 人工序列

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<400> 7

      aatcc tgcgt ttgag tcgt      19

 

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       acccc gtggt aggaa aactc     20

 

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<212> 人工序列

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      aaacc tcagc tgtct ggtcc       20

 

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<212> 人工序列

<213> DNA

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      gaacc atgtg gatta ctgcg   20

 

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      gcgga ctgtt actga gctgc gt   22 

 

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<212> 人工序列

<213> DNA

<400> 12

       gaagc aatgc tgtca ccttc cc   22

Claims (4)

1.一种siRNA双干扰组合物，其特征在于，包括寡聚核酸 VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子；所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.1，反义链为SEQ ID No.2；所述寡聚核酸survivin-siRNA分子的核苷酸序列，正义链为SEQ ID NO.3，反义链为SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的siRNA双干扰组合物，其特征在于，所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比(0-2)∶(2-0)混合。

3.根据权利要求2所述的siRNA双干扰组合物，其特征在于，所述寡聚核酸VEGF-C-siRNA分子和寡聚核酸survivin-siRNA分子按照质量比1∶1混合。

4.如权利要求1-3所述的siRNA双干扰组合物在制备抗肿瘤基因治疗药物中的应用，所述肿瘤包括乳腺癌、宫颈癌、肝癌或肺癌。