CN108882705A - 基于经由来自人间充质干细胞(hMSC)的间隙连接递送寡核苷酸的癌症治疗 - Google Patents

基于经由来自人间充质干细胞(hMSC)的间隙连接递送寡核苷酸的癌症治疗 Download PDF

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I·S·科恩
P·R·布林克
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Abstract

在体内治疗癌症的方法包括将至少一种类型的抑制性寡核苷酸在体外引入到人间充质干细胞(hMSC)中，并且在体内使合胞体癌细胞的肿瘤组织在允许hMSC与所述肿瘤组织的第一合胞体癌细胞形成间隙连接通道的条件下与所述hMSC接触。因此，通过穿过所述间隙连接通道将所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸递送至所述第一合胞体癌细胞中，并且通过穿过所述第一合胞体癌细胞与第二合胞体癌细胞之间的间隙连接通道将所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸递送至所述肿瘤组织的所述第二合胞体癌细胞中。

Description

基于经由来自人间充质干细胞(hMSC)的间隙连接递送寡核苷 酸的癌症治疗
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年3月23日提交的临时申请62/312,230的权益，所述临时申请的全部内容特此以引用的方式并入，就如同完全在本文阐明一样。
本申请涉及：2004年12月17日作为PCT申请PCT/US2004/042504提交的美国申请序列号10/583,369，其于2010年11月30日作为美国专利7,842673授权；以及2010年10月22日提交的美国继续申请序列号12/910,346，其于2012年5月29日作为专利8,188,062授权。
对通过EFS-WEB提交的序列表的引用
本申请是通过EFS-Web以电子版提交的并且包括以电子版呈递的呈.txt格式的序列表。.txt文件含有于2017年3月23日创建的名称为“20170323_15003087PC0_ST25.txt”的序列表并且大小为2KB。包含在此.txt文件中的序列表是说明书的一部分并且特此以引用的方式整体并入本文
政府利益声明
本发明是在政府资助下根据美国国立卫生研究院授予的GM055263进行。美国政府对本发明具有一定的权利。
发明背景
在本申请通篇中，各个公布是在脚注内或在括号内的文本中引用。除了与本文中使用的术语不一致的术语，这些公布中的每个据此以引用的方式整体并入本申请，以便更全面描述本发明涉及的技术现状。在说明书末尾和权利要求书前面可发现这些参考文献的完整文献目录引用。
如共同拥有的2003年1月15日提交的先前申请美国序列号10/342,506中以及Plotnikov等人,2003和Valiunas等人,2002中所述的，干细胞已用于与靶组织形成间隙连接。此类干细胞可通过递送基因产物或小分子来影响靶组织的活性。
如在美国专利7,842673和8,188,062中所述，寡核苷酸，单链或双链，或者两者，都可以穿过通过由HeLa细胞对中的连接蛋白Cx43或连接蛋白Cx40形成的间隙连接，如通过将荧光标记的寡核苷酸单电极递送至供体细胞并且经由间隙连接介导的通讯确定其向靶细胞的转移所证实的。因此，那些专利建议使用形成间隙连接的任何供体细胞将寡核苷酸递送至靶细胞。
然而，呈反义RNA或siRNA形式的核苷酸在由人间充质干细胞(hMSC)递送至由各种癌症的肿瘤细胞组成的靶组织时没有显示出有效地减少肿瘤生长。其中一个原因是观察到hMSC与肿瘤细胞一起生长促进脉管系统，这增加了肿瘤生长速率。例如，Tian等人,2011陈述“我们发现hMSC对肿瘤生长的促进作用与肿瘤血管形成的增加有关。我们目前的研究表明，hMSC在体外与体内之间对肿瘤细胞生长具有矛盾的影响，因此，在恶性条件下在新的治疗策略中利用hMSC必须是谨慎的”。
发明内容
如本文所述，抑制性寡核苷酸可穿过间隙连接从hMSC到肿瘤组织，令人惊讶地，其量在延迟体内肿瘤生长方面是有效的，且因此是治疗性的。hMSC不仅用于有效地将抑制性寡核苷酸引入到肿瘤细胞中，而且还减少肿瘤外部的细胞暴露于抑制性寡核苷酸，因为抑制性寡核苷酸不是全身性引入的，而是在肿瘤内部的接触部位局部引入。
根据第一组实施方案，在体内治疗癌症的方法包括将至少一种类型的抑制性寡核苷酸在体外引入到人间充质干细胞(hMSC)中，并且在体内使包括合胞体癌细胞的肿瘤组织在允许hMSC与肿瘤组织的第一合胞体癌细胞形成间隙连接通道的条件下与hMSC接触。结果，通过穿过所述间隙连接通道将抑制性寡核苷酸递送至第一合胞体癌细胞中，并且通过穿过第一合胞体癌细胞与第二合胞体癌细胞之间的间隙连接通道将抑制性寡核苷酸递送至肿瘤组织的第二合胞体癌细胞中。
实施方案提供了有用的治疗，其中通过某些抑制性寡核苷酸引起的对某些肿瘤中的基因活性的下调足以克服通常在hMSC存在下观察到的加速的肿瘤生长。
相比于其中RNA或反义的至靶细胞的递送是通过裸质粒或间质液完成的现有技术方法，在各种实施方案中，递送是经由间隙连接经由hMSC直接进入靶组织细胞的细胞质中并且预期转染率会高得多。此外，在靶肿瘤细胞中，递送至一个肿瘤细胞的抑制性寡核苷酸也经由间隙连接以足以延迟体内肿瘤生长的速率转染至相邻的肿瘤细胞。因此，各种实施方案提供针对某些各种癌症的治疗。
根据以下详细描述，仅通过示出多个特定实施方案和实现方式，包括预期用于实施本发明的最佳模式，本发明的其他方面、特征和优点变得显而易见。本发明还能够具有其他且不同的实施方案，并且其若干细节可以在各种明显的方面进行修改，而所有修改均不脱离本发明的精神和范围。因此，附图和描述应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。
附图说明
本发明在附图的各图中以举例而非限制的方式例示，并且附图中的相似参考数字指代相似元件，并且其中：
图1A根据实施方案示出穿过由连接蛋白43构成的间隙连接通道的示例12成员单链寡核苷酸；
图1B根据实施方案示出穿过由连接蛋白43构成的间隙连接通道的示例16成员单链寡核苷酸；
图1C根据实施方案示出穿过由连接蛋白43构成的间隙连接通道的示例24成员单链寡核苷酸；
图1D根据实施方案示出穿过由连接蛋白43构成的间隙连接通道的示例12聚体杂交双链寡核苷酸；
图2A是根据实施方案示出示例数据的概述的图，其中x轴是寡核苷酸的长度，并且y轴是在将寡核苷酸递送至源细胞后12分钟受体细胞(在图1A至图1D的所有示例中在左侧的细胞)中荧光标签的相对强度；
图2B是根据实施方案示出x轴上的示例连接电导相对于y轴上的荧光标签的相对强度的图；
图3A和图3B是示出当在体内用人间充质干细胞(hMSC)治疗时肿瘤生长速率的示例增加的图；
图4是根据实施方案示出干扰各种细胞过程途径；并且因此代表用于延迟肿瘤生长的潜在剂的微小RNA的图解；
图5A至图5C是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂对各种合胞体癌症的肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图；
图6是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16)对黑素瘤肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图；
图7A至图7C是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括微小RNA miR-16的SiRNA模拟物)对前列腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图；
图8A至图8D是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16模拟物和KrasGAT SiRNA)对胰腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的图像和绘图；
图9A是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16模拟物)对不同细胞系的胰腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的图像并且图9B是其绘图；
图10A至图10F是根据实施方案示出在体外直接转染到hMSC中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂的负载的图像和绘图；
图11是根据各种实施方案示出用于负载在体外直接转染到hMSC中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂的各种方法的一组绘图；
图12A和图12B是根据实施方案示出在负载在体外直接转染到hMSC中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂后hMSC的存活的绘图；
图13A和图13B是根据实施方案示出hMSC与合胞体癌细胞之间的间隙连接的形成的绘图；
图14A和图14B是根据实施方案示出两个合胞体癌细胞之间的间隙连接的示例形成，所述间隙连接用于使抑制性寡核苷酸传播通过合胞体癌肿瘤的多个细胞；
图14C和图14D是用于各种实施方案的示出间隙连接连接蛋白存在于多种结肠直肠癌细胞系中的电泳凝胶的图像；
图14E和图14F是用于各种实施方案的示出干扰若干种结构或功能蛋白的产生的RNA可以在癌细胞之间转染的电泳凝胶的图像；
图15A至图15C是根据实施方案示出siRNA传播通过合胞体癌肿瘤的多个细胞的图像和绘图；
图16是根据实施方案示出通过在体外与hMSC共培养对结肠直肠肿瘤生长的相对影响的绘图；
图17是示出肿瘤重量与肿瘤体积之间的直接关系以便比较各种剩余绘图的绘图；
图18A和图18B是根据实施方案示出通过在体外与负载有miR-16或miR-16的siRNA模拟物的hMSC共培养对前列腺肿瘤生长的相对影响的绘图；并且，
图19A至图19C是根据实施方案示出通过用负载有miR-16的siRNA模拟物的hMSC体内治疗对前列腺肿瘤生长的示例影响的绘图。
具体实施方式
1.定义
以下定义和解释意指并且旨在控制任何未来构建，除非在以下实施例中明确并毫无疑问地被修改或是当含义的应用使得任何构建无意义或基本上无意义。在术语的构建将使它无意义或基本上无意义的情况下，定义应该从韦氏字典(Webster's Dictionary),第3版或本领域技术人员已知的字典如生物化学和分子生物学牛津字典(Anthony Smith编著,Oxford University Press,,Oxford,2004)中取得。
本文使用的术语只用于描述特定实施方案的目的，而不意图为限制。除非上下文中另有明确指出，否则本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”也意在包括复数形式。此外，至于术语“包括(including/includes)”、“具有(having/has/with)”和其变体在详细描述和/或权利要求书中使用的程度，所述术语意欲与术语“包含(comprising)”类似的方式具有包含性。
术语“约”或“近似”意指由本领域普通技术人员测定的具体值处于可接受的误差范围内，这将部分取决于所述值的测量或测定方式，例如，测量系统的限制性。例如，“约”可意谓根据本领域中的实践，在1个或大于1个标准偏差以内。可替代地，“约”可以意指参考值的+-10％范围或最小非零数字所暗示的精度。
如本文所用，术语“DNA”或“脱氧核糖核酸”意指由某些核酸碱基构成的分子。DNA可以携带用于所有已知的活的生物体和许多病毒的发育、功能和繁殖的大多数遗传指令。DNA是核酸；核酸与蛋白质和碳水化合物一起构成了所有已知生命形式所必需的三种主要大分子。大多数DNA分子由两条彼此盘绕以形成双螺旋的生物聚合物链组成。这两条DNA链被称为多核苷酸，因为它们由称为核酸碱基或更简单地称为核苷酸的更简单单元构成。每个核苷酸由含氮核碱基-胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)-以及称为脱氧核糖的单糖式糖和磷酸基团构成。核苷酸通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸之间的共价键在链中彼此连接，从而产生交替的糖-磷酸骨架。根据碱基配对规则(A与T，并且C与G)，氢键结合两个分开的多核苷酸链的含氮碱基以产生双链DNA。
如本文所用，术语“RNA”或“核糖核酸”意指聚合物分子，其常常涉及在基因的编码、解码、调节和表达中的各种生物作用。与DNA一样，RNA是核酸。RNA是由以下四种类型的称为核糖核苷酸碱基的较小分子构成的线性分子：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)以及代替存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)的尿嘧啶(U)。
术语“基因”意指参与产生多肽链的DNA区段；它包括在编码区之前和之后的参与基因产物的转录/翻译和转录/翻译的调节的区域(前导序列和尾随序列)，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文所用，术语“反义”意指与编码序列互补并因此能够结合编码序列的核苷酸序列，其可以是DNA双螺旋的经历转录的链的核苷酸序列，或者是信使RNA分子的核苷酸序列。反义DNA是与双链DNA中的编码链互补的非编码链。反义链充当信使RNA(mRNA)合成的模板。
术语“核酸”和“核酸分子”可以在整个本公开中互换使用。所述术语是指来自以下的任何成分的核酸：诸如DNA(例如，互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA)等)、RNA(例如，信息RNA(mRNA)、短抑制RNA(siRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA、微小RNA、由胎儿或胎盘高度表达的RNA等)和/或DNA或RNA类似物(例如，含有碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些都可以呈单链或双链形式，并且除非另有限制，否则可以涵盖可以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的天然核苷酸的已知类似物。核酸可以是或可以来自质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒、人工染色体、染色体或能够在体外或在宿主细胞中复制或被复制的其他核酸、细胞、细胞核或在某些实施方案中来自细胞的细胞质。除非另有指明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指明的序列。术语核酸可以与基因座、基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。所述术语还可包括作为等同物的由核苷酸类似物合成的RNA或DNA的衍生物、变体和类似物、单链(“有义”或“反义”、“正”链或“负”链、“正向”阅读框或“反向”阅读框)和双链多核苷酸。
术语“杂交”意指一个或多个核苷酸中的互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键合，所述氢键合可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合。
术语“合成核酸”意指核酸不具有天然存在的核酸的化学结构或序列。合成核苷酸包括工程化核酸，诸如DNA或RNA分子。然而，预期可以随后在细胞中修饰或改变施用于细胞的合成核酸，使得其结构或序列与非合成或天然存在的核酸(诸如成熟miRNA序列)相同。例如，合成核酸可以具有与前体miRNA的序列不同的序列，但该序列可以在细胞中改变一次，以与内源性加工miRNA相同。因此，应当理解术语“合成miRNA”是指在细胞中或在生理条件下作为天然存在的miRNA起作用的“合成核酸”。
如本文所用，术语“寡核苷酸”意指短的DNA或RNA分子的寡核苷酸，其易于以序列特异性方式结合对应的互补寡核苷酸、DNA或RNA以形成双链体。
如本文所用，术语“分离的核苷酸”意指通过人工干预从天然状态改变或移取出的核苷酸。
如本文所用，术语“mRNA”或“信使RNA”意指用于经由翻译进行蛋白质合成的模板，并且是从DNA到核糖体传送遗传信息的RNA分子大家族，在核糖体中它们指定基因表达的蛋白质产物的氨基酸序列。
术语小干扰RNA(siRNA)，有时被称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对。各种siRNA起着许多作用，但它在RNA干扰(RNAi)途径中最为显著，在此途径中其干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。siRNA通过在转录后使mRNA分解而起作用，导致未翻译成蛋白质。通过与术语siRNA偶联的蛋白质名称指示防止翻译成特定蛋白质的siRNA。因此，通过表述“Akt siRNA”指示干扰重要激酶Akt翻译的siRNA。通常，siRNA在各种实施方案中是包含两条核苷酸链的双链核酸分子，每条链具有约19至约28个核苷酸(即约19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)。
术语微小RNA(缩写为miRNA)是存在于植物、动物和一些病毒中的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调控中起作用。miRNA类似于RNA干扰(RNAi)途径的小干扰RNA(siRNA)，不同的是miRNA衍生自RNA转录物的区域，其自身折叠形成短发夹，而siRNA衍生自双链RNA的较长区域。在标准命名系统下，将名称分配给实验确认的miRNA。前缀“miR”后跟破折号和数字，后者通常指示命名顺序。“MIR”是指编码对应miRNA的基因。除了一个或两个核苷酸之外具有几乎相同序列的不同miRNA用另外的小写字母注释。
如本文所用，术语miRNA模拟物是指当被引入到细胞中时被设计成模拟内源性成熟miRNA分子的小的双链RNA分子，诸如siRNA。在一些图中，miR-16模拟物被命名为Mir-16模拟物。
术语“抑制性寡核苷酸”是指诸如通过在核糖体中干扰将mRNA翻译成蛋白质降低蛋白质的生产或表达，或与编码一种或多种靶蛋白的基因或mRNA足够互补、与一种或多种靶基因或mRNA特异性结合(或杂交)，从而降低靶蛋白的表达或生物活性的任何寡核苷酸。抑制性寡核苷酸包括分离的或合成的shRNA或DNA、siRNA或DNA、反义RNA或DNA、嵌合反义DNA或RNA、miRNA和miRNA模拟物等。
如本文所用，术语“连接蛋白”意指允许细胞间通讯以及离子和小信号传导分子的转移和组装以形成间隙连接的跨膜蛋白大家族。连接蛋白是具有C和N细胞质末端、细胞质环(CL)和两个细胞外环(EL-1)和(EL-2)的四次跨膜蛋白。连接蛋白以六个为一组进行组装形成半通道或连接子，并且每个细胞上一个的两个半通道然后组合形成两个细胞之间的间隙连接。连接蛋白基因家族是多样的，在测序的人类基因组中有21个鉴定成员，并且在小鼠中有20个(其中19个是直系同源对)。它们的重量通常在26与60千道尔顿(kDa)之间，并且平均长度为380个氨基酸。已经观察到各种连接蛋白组合成同型间隙连接(两个连接蛋白相同)和异型间隙连接(两个不同的连接蛋白)，其中的每一个可以表现出不同的功能特性，包括孔电导、尺寸选择性、电荷选择性、电压门控和化学门控。术语连接蛋白缩写为Cx并且编码其基因缩写为CX。在最近的文献中，连接蛋白通常根据其分子量命名，例如Cx26是26kDa的连接蛋白，使用人蛋白质的重量用于其他物种中直向同源蛋白的编号。
如本文所用，术语“间隙连接”意指多种动物细胞类型之间的特化细胞间连接。它们直接连接两个细胞的细胞质，这允许各种分子、离子和电脉冲直接穿过细胞之间的调控门。
术语合胞体是指由通过具有间隙连接的特化膜互连的细胞组成的合胞体组织，所述间隙连接在动作电位中是电同步的。合胞体细胞包括心肌细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、结缔组织细胞或合胞体癌细胞。
如本文所用，术语“递送(delivering)”或“递送(delivered)”意指将分子引入到细胞膜的内部中。
如本文所用，术语“供体细胞”意指已负载有待递送至称为靶细胞的不同细胞中的分子的细胞。
如本文所用，术语“靶细胞”意指选择性地受到特定剂，诸如通过供体细胞或由供体细胞携载的内容物的细胞。
如本文所用，术语“人间充质干细胞”(缩写为hMSC)意指可以分化成多种细胞类型的人多能基质细胞，所述细胞类型包括：人成骨细胞(骨细胞)、人软骨细胞(chondrocyte)(软骨细胞(cartilage cell))、人肌细胞(肌肉细胞)和人脂肪细胞(adipocyte)(脂肪细胞(fat cell))。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。
本文使用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得希望的药理作用和/或生理作用。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物体内疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易于感染疾病但尚未诊断出患疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即使疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。对其中治疗使患者的不希望临床症状稳定或减少的正在进行的疾病的治疗为特别感兴趣的。此种治疗希望在受影响组织功能完全失去之前进行。本发明疗法将希望在疾病的症状阶段过程中施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
分子和细胞生物化学中的一般方法可见于如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；Short Protocols inMolecular Biology,第4版(Ausubel等人编著,John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner等人编著,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编著,Academic Press1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编著,Academic Press 1997)；以及Celland Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)的此类标准教科书中，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。在本公开中提及的用于遗传操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商业供应商，诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。
2.综述
根据我们自己的早期工作，将寡核苷酸或表达寡核苷酸的质粒递送至靶细胞中的方法包括将寡核苷酸引入到供体细胞中，并且在允许供体细胞与靶细胞形成间隙连接的条件下使靶细胞与供体细胞接触，由此将寡核苷酸或寡核苷酸的产物从供体细胞递送至靶细胞中。
根据一些新的实施方案，供体细胞是人间充质干细胞(hMSC)，抑制性寡核苷酸是可以穿过间隙连接的抑制性寡核苷酸，并且靶细胞是合胞体癌组织的细胞。在本文中，合胞体癌组织也称为合胞体癌肿瘤。在本文中，靶细胞也称为合胞体癌细胞或肿瘤细胞。所述方法显示出有效地延迟了合胞体癌肿瘤的生长。这是令人惊讶的，因为过去的研究表明hMSC增强癌肿瘤生长。这也是令人惊讶的，因为先前不知道可以将抑制性寡核苷酸负载到供体细胞中而不损害供体细胞，所述损害可能使得供体细胞不能存活足够久以产生抑制性寡核苷酸的有效递送。
在各种实施方案中，寡核苷酸是可以穿过间隙连接的抑制性寡核苷酸。寡核苷酸可以是编码siRNA、反义RNA、miRNA或miRNA模拟物的DNA，诸如质粒。寡核苷酸可以是产生可以穿过间隙连接的抑制性寡核苷酸的反义寡核苷酸或cDNA。寡核苷酸可以是产生可以穿过间隙连接的siRNA或miRNA，或miRNA的siRNA模拟物的mRNA或cDNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是编码siRNA的质粒。寡核苷酸可包含12-28个成员或更多。
间隙连接通道可以由存在于合胞体癌组织中的连接蛋白43(Cx43)、连接蛋白40(Cx40)、连接蛋白45(Cx45)、连接蛋白32(Cx32蛋白)和连接蛋白37(Cx37)等中的一种或多种构成。在一些实施方案中，Cx32不用于传递siRNA。
在各种实施方案中，所治疗的合胞体肿瘤包括子宫颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌和前列腺癌的肿瘤。
我们自己的早期工作提供了使寡核苷酸(DNA和/或RNA片段)穿过间隙连接通道的方式。这已经在实验中得到证实，其中由连接蛋白43(Cx43)构成的间隙连接通道用于针对宫颈癌的HeLa细胞系中。
实验确定寡核苷酸复合物(诸如限定长度的DNA或RNA序列)能够穿过间隙连接通道。DNA或RNA在溶液中形成α螺旋，具有0.9-1.0nm的小直径。12-24个核苷酸或核苷酸对大小范围内的寡核苷酸是特别令人感兴趣的。在各种实验中，用来自Philomath,Oregon的GENE TOOLS,LLCTM的荧光探针标记不能分解成较小片段的独特DNA序列(称为吗啉代)，该探针专门用于制造寡核苷酸序列。将Hek 293亲本细胞在置于35mm培养皿内的18x18mm无菌盖玻片上生长。接种后大约24小时，将每个培养皿上的培养基用其中添加24聚体吗啉代(GeneTools)和Endo-Porter(Gene Tools)的2ml新鲜完全培养基(10％FBS，1％P/S)替换。吗啉代终浓度为1.25uM，Endo-Porter终浓度为～6uM。将吗啉代保留在细胞上以便最大限度地递送，不洗涤。对照培养皿接受仅具有Endo-Porter的完全培养基。在不同时间点用3.7％甲醛固定盖玻片。将盖玻片用Vectashield(Vector Labs)固定，使用63x油物镜在OlympusFluoview 1000共聚焦显微镜上捕获图像。通过使用Olympus线系列分析软件工具产生荧光强度分布。
第一组实验是用12成员寡核苷酸、16成员寡核苷酸和24成员的寡核苷酸进行。结果证实，所有的三种单链形式穿过由Cx43构成的间隙连接通道(图1A、图1B和图1C)。此外，将两个12成员互补序列杂交，产生双链形式并测量其传代(图1D)。双链型式的小直径仅具有很小的增加。图2A示出数据的概述，其中X轴是寡核苷酸的长度。将杂交的12成员寡核苷酸不按顺序地绘制在X轴上。Y轴是在将寡核苷酸递送至源细胞后12分钟受体细胞(在图1A至图1D的所有示例中在左侧的细胞)中荧光标签的相对强度。对于每种寡核苷酸，示出了各个实验导出值以及每种寡核苷酸的平均值和标准偏差。在多个实验中，同时监测连接电导和荧光标记的寡核苷酸的转移。图2B是X轴上的连接电导相对于Y轴上的荧光标签的相对强度的图示。为了比较，示出了针对荧光黄(Lucifer Yellow)穿过Cx43间隙连接通道的电导-强度关系(Valiunas等人,2002)(2)。在所有情况下，表示从一个细胞到另一个细胞的转移速率的相对强度比受体细胞中的荧光黄荧光强度小5-10倍。这种较低的转移速率与寡核苷酸的棒状尺寸和分子量一致，其小直径为1.0纳米(nm)，在溶液中的移动性小于荧光黄。
这些观察结果证实，间隙连接通道是一种用于分子例如沉默RNA(siRNA)或类似尺寸的任何其他分子的可行递送端口。我们先前已证实，hMSC彼此之间并且与靶细胞形成间隙连接。我们先前还已证实，可以通过电穿孔将质粒负载到干细胞中。本结果证实，与另一种靶细胞类型形成间隙连接的任何供体细胞类型(这包括作为潜在供体或靶细胞的hMSC)可用作递送RNA或DNA的媒介物。
在以下描述中，出于说明目的，提出了许多具体细节，以便提供对本发明的透彻的了解。然而，对于本领域技术人员而言，将清楚的是本发明可被实现而无需这些具体细节。在其他情形中，以框图形式示出了众所周知的结构和装置，以免不必要地使本发明变得模糊。
在示例实施方案中，寡核苷酸是干扰肿瘤生长的siRNA或miRNA或miRNA的siRNA的模拟物(在下文为方便起见称为“miRNA模拟物”)，诸如miR-16、miR-34a、miR-16模拟物、miR-34a模拟物、皮层肌动蛋白(Cortactin)siRNA、凝溶胶蛋白siRNA、Akt siRNA、α-微管蛋白siRNA、GAPDH siRNA、KrasGAT siRNA或编码这种siRNA的DNA中的一种或多种。最初选择这些抑制性寡核苷酸是因为它们在影响必需的细胞结构或过程或细胞凋亡(细胞死亡)方面的已知特性。在这些之中，某些抑制性寡核苷酸在以下实验实施方案中被鉴定为有利的。
例如，在一些实施方案中，miR-16是基因ID：406950-MIR16-1微小RNA 16-1并且其对应的miR-16模拟物是CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA(hsa-mir-16-1，SEQ ID NO:1)。在其他实施方案中，mirR-34a是基因ID：07040-MIR34A微小RNA 34a并且其对应的miR-34a模拟物是UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU(hsa-mir-34a，SEQ ID NO:2)。
3.实验实施方案
下面的实验证实，某些抑制性寡核苷酸：可以在体外延迟合胞体癌肿瘤生长；可以在体外负载到hMSC中而未阻止hMSC的存活；可以经由间隙连接在hMSC与合胞体癌细胞之间传递；可以经由肿瘤内细胞之间的间隙连接传播；并且当负载到hMSC中并与此类肿瘤接触时可以在体内有效且治疗性地延迟或减少肿瘤生长。由于这些原因，预期各种实施方案为合胞体癌症肿瘤提供有效治疗。
在下文所述的各种体外直接转染实验中，将hMSC或其他细胞直接用siRNA转染以产生负载的细胞。除非另有说明，否则这些实验在含有相同细胞培养基的培养皿中、在本领域熟知的无菌条件下进行。转染用抑制性寡核苷酸溶液(通常为100纳摩尔(nM)溶液)和转染剂(lipofectamine)溶液经24小时转染时段进行，其中细胞密度为约20％至约30％。在24小时时段结束时，用培养基冲洗细胞并且将hMSC或其他细胞群引入到下文所述的间接转染实验，或使用任何细胞计数方法(包括任何标记的吸光度或荧光强度)随时间记录，以随时间得到细胞增殖。
在各种体外间接转染实验中，将负载或未负载的hMSC或其他细胞与靶细胞群共培养。当负载时，如上所述地直接转染hMSC。除非另有说明，否则这些实验是通过将负载或未负载的hMSC铺板到靶细胞的汇合度为约20％至30％的培养皿上进行的。然后用培养基冲洗共铺板的细胞。然后使用任何细胞计数方法(包括任何标记的吸光度或荧光强度)随时间记录靶细胞群，以随时间得到靶细胞增殖。
3.1用hMSC的体内治疗可以增强肿瘤生长
图3A和图3B是示出当在体内与人间充质干细胞(hMSC)接触时肿瘤生长速率的示例增加的图。图3A是示出单独地(对照)和在未负载有某些抑制性寡核苷酸的hMSC存在下生长的小鼠中(体内)肿瘤细胞的肿瘤体积生长的图。横轴指示实耗时间(以天计)并且纵轴指示归一化的肿瘤体积。肿瘤是用于前列腺癌研究中的人前列腺癌的PC-3细胞系。这些细胞可用于研究晚期前列腺癌细胞的生化变化以及评估它们对治疗的响应。此外，它们可用于在小鼠中产生皮下肿瘤以便研究生物体背景下的肿瘤环境的体内模型。
空心圆示出了在引入到裸鼠后20天与50天之间的不同时间处对照的PC-3肿瘤体积，所述PC-3肿瘤体积是在五只不同的小鼠上取平均。实心圆示出了在引入到裸鼠后20天与50天之间的不同时间处与hMSC一起生长的PC-3肿瘤体积，所述PC-3肿瘤体积是在另外的五只不同的小鼠上取平均。在该实验中，向PC-3细胞注射相等数量的hMSC。该图是在48天相对于对照值归一化。绝大多数注射的hMSC不可能在肿瘤部位停留超过约3至4天。结果的标准偏差用垂直条表示。与hMSC一起生长的肿瘤始终测量到比对照更大的体积。
在实验结束时，将动物处死并称重肿瘤。图3B是示出单独地(对照)和在未负载有某些抑制性寡核苷酸的hMSC存在下生长的肿瘤细胞的肿瘤重量的条形图。横轴指示组并且纵轴指示重量(以克计)。图3B中的肿瘤重量是根据通过对肿瘤细胞表达的绿色荧光蛋白(GFP)进行成像获得的肿瘤体积估计的。空心条指示对照组的平均重量并且实心条指示与hMSC一起生长的组的平均重量，垂直线指示标准偏差。与通过未负载有抑制性寡核苷酸的hMSC进行的治疗相关的肿瘤生长存在着显著增加。
3.2某些siRNA可通过体外直接暴露延迟肿瘤生长
进行研究以发现用于实验测试的候选抑制性寡核苷酸，然后在体外进行实验以发现适合经由hMSC引入到体内的对应肿瘤中的最有效抑制性寡核苷酸。候选抑制性寡核苷酸包括针对在细胞结构和主要功能中发挥作用的凝溶胶蛋白、GAPDH、α微管蛋白、皮层肌动蛋白和Akt的siRNA。如果此类结构蛋白或主要功能在靶细胞中受限，则预期受影响的细胞不能适当地起作用并且生长得更缓慢。虽然在所示实施方案中鉴定了上述蛋白质靶标，但在各种其他实施方案中，其他细胞蛋白质被抑制性寡核苷酸靶向。
如本领域已知的，凝溶胶蛋白是重要的肌动蛋白调节剂，并且(与Arp3、皮层肌动蛋白和Rho GTP酶一起)在胞足体形成中起作用，所述胞足体形成影响细胞运动性并且在许多不同的特化细胞诸如侵袭性癌细胞中表现出。凝溶胶蛋白还通过稳定线粒体来抑制细胞凋亡(细胞死亡)。甘油醛3-磷酸脱氢酶(缩写为GAPDH)是大小～37kDa的酶，其催化糖酵解的第六步，因此用于分解葡萄糖以产生能量和碳分子。α-和β-微管蛋白均聚合成微管，其是真核细胞骨架的主要成分。微管在许多至关重要的细胞过程(包括有丝分裂)中起作用。皮层肌动蛋白存在于所有细胞类型中；它是位于细胞的细胞质中的单体蛋白质，可被外部刺激激活以促进肌动蛋白细胞骨架，尤其是细胞周围的肌动蛋白皮质的聚合和重排。Akt，也称为蛋白激酶B(PKB)，是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在多种细胞过程，诸如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移中起关键作用。
在已知影响各种重要的细胞过程途径的微小RNA之中选择候选的其他抑制性寡核苷酸。图4是根据实施方案示出干扰各种细胞过程途径；并且因此代表用于延迟肿瘤生长的潜在剂的微小RNA的图解。例如，已知miR-16和miR-34a干扰各种蛋白质的翻译。虽然在所示实施方案中鉴定了上述miRNA及其siRNA模拟物，但在各种其他实施方案中，将其他miRNA及其siRNA模拟物用作抑制性寡核苷酸。如图4中所示，miR-16干扰蛋白质CDK1、CDK2和CDC2的翻译；并且，miR-34a干扰蛋白质CDC2和CDK4的翻译。这些蛋白质在细胞的生长和分裂周期中起作用，因此这种干扰可潜在地导致细胞周期停滞。类似地，miR-16干扰蛋白质FGF-2、CCND1和FGFR-1的翻译；并且，miR-34a干扰蛋白质CDK5、E2F3和E2F5的翻译。这些蛋白质在细胞增殖(数量增加)和迁移中起作用，因此这种干扰可潜在地导致对这种增殖和迁移的抑制。还如图4中所绘示，miR-16干扰蛋白BCL2、PDC6IP、MCL1和WNT3A的翻译；并且，miR-34a干扰蛋白质CCND1、BCL2和SIRT1的翻译。这些蛋白质在延迟细胞凋亡(细胞死亡)和衰老(细胞老化)中起作用，因此这种干扰可潜在地导致诱导衰老或细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。
图5A至图5C是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂对各种合胞体癌症或细胞的肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图。图5A绘示了两种类型的抑制性寡核苷酸对正常人胚胎肾293细胞(在本文也称为HeK293)的生长的影响。HeK293细胞是特定的非癌细胞系，其最初源自在组织培养中生长的人胚肾细胞。HEK293细胞非常容易生长并且非常容易转染，并已广泛用于细胞生物学研究。使用具有24小时的转染时段的直接转染实验方案。横轴指示实验开始后的小时数。纵轴指示以一万个细胞为单位的单位数。垂直线指示在标记适用的n＝6个实验上的标准偏差。标记为“对照”的迹线是正常HeK293的生长曲线。标记为“皮层肌动蛋白”的迹线是指在48小时暴露于干扰皮层肌动蛋白的siRNA(即皮层肌动蛋白siRNA)后生长的细胞。标记为“mir-16”的迹线是指在48小时暴露于模拟miR-16的siRNA(即miR-16模拟物)后生长的细胞。显然，皮层肌动蛋白siRNA可有效减少HeK293的细胞生长，这表明皮层肌动蛋白siRNA当转染到其他细胞类型(例如癌细胞)中时可以有效控制生长。如下文所示，当转染到癌细胞中时，miR-16模拟物比它们对图5A中所示的正常HeK细胞更有效。
图5B绘示了三种类型的抑制性寡核苷酸对由UACC-62细胞系(在本文也称为UACC62细胞)表示的人黑素瘤的生长的影响。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝6个实验。横轴指示实验开始后的小时数。纵轴指示以一万个细胞为单位的单位数。标记为“对照(UACC62)”的迹线是没有负载抑制性寡核苷酸的UACC-62细胞的生长曲线。标记为“皮层肌动蛋白siRNA、凝溶胶蛋白siRNA、Akt siRNA”的迹线分别是指在0小时开始暴露于干扰皮层肌动蛋白、凝溶胶蛋白和Akt的siRNA后生长的细胞。显然，皮层肌动蛋白siRNA、凝溶胶蛋白siRNA、Akt siRN全部都降低了增殖速率，这表明全部均可以有效控制黑素瘤的生长。
图5C绘示了三种类型的抑制性寡核苷酸对由PC-3细胞系(在本文也称为PC3细胞)表示的人前列腺癌的生长的影响。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝6个实验。横轴指示实验开始后的小时数。纵轴指示以一万个细胞为单位的单位数。垂直线指示在标记类型的6个不同实验之间的标准偏差。标记为“对照(PC3)”的迹线是没有负载抑制性寡核苷酸的PC-3细胞的生长曲线。标记为“皮层肌动蛋白siRNA、Akt siRNA和Mir-16模拟物”的迹线分别是指在0小时开始暴露于干扰皮层肌动蛋白和Akt以及模拟miR-16的siRNA后生长的细胞。显然，皮层肌动蛋白siRNA和Akt siRN都降低了增殖速率，这表明两者均可以有效控制前列腺肿瘤的生长。也显然的是，miR-16模拟物对前列腺癌甚至更有效；并且，这表明miR-16模拟物可能比Akt siRNA或皮层肌动蛋白siRNA对其他癌症类型(包括黑素瘤)更有效。
图6是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16)对黑素瘤肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝6个实验。横轴指示实验开始后的小时数。纵轴指示光束的吸光度，其与细胞数量有关。标记为“阴性对照”的迹线指示没有负载抑制性寡核苷酸的UACC-62细胞的生长曲线。标记为“皮层肌动蛋白、凝溶胶蛋白”的迹线分别是指直接暴露于干扰皮层肌动蛋白和凝溶胶蛋白的siRNA后生长的细胞。标记为“miR-16、miR-34”的迹线分别是指直接暴露于模拟miR-16的siRNA和模拟miR-34a的siRNA后生长的细胞。每条迹线的每个点处的值指示平均值并且每个点处的垂直线指示在每种标记类型的6个实验上的标准偏差。凝溶胶蛋白siRNA和miR-34a模拟物未呈现出可用于减少这个黑素瘤细胞系的增殖。这确证了图5B中皮层肌动蛋白siRNA呈现为有效的结果，具有约50％的估计速率降低。这进一步证实，至少对于该细胞系来说，模拟miR-16的siRNA在降低黑素瘤增殖速率方面确实比皮层肌动蛋白siRNA更有效，具有约80％的较佳的估计速率降低。
图7A至图7C是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16或其模拟物)对前列腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的绘图。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝6个实验。在图7A中，横轴指示实验开始后的小时数。纵轴指示光束的吸光度，其与细胞数量有关。标记为“阴性对照”的迹线指示没有负载抑制性寡核苷酸的PC-3细胞的生长曲线。标记为“皮层肌动蛋白、凝溶胶蛋白”的迹线分别是指直接暴露于干扰皮层肌动蛋白和凝溶胶蛋白的siRNA后生长的细胞。标记为“miR-16、miR-34”的迹线分别是指直接暴露于模拟miR-34的siRNA和模拟miR-16的siRNA后生长的细胞。每条迹线的每个点处的值指示平均值并且每个点处的垂直线指示在每种标记类型的6个实验上的标准偏差。所有siRNA对减少细胞增殖都有一定作用，其中凝溶胶蛋白siRNA具有最小效果。皮层肌动蛋白siRNA呈现为有效，具有约60％的估计速率降低，miR-34模拟物的效果稍差并且miR-16模拟物比皮层肌动蛋白siRNA更有效。
在图7B中，横轴与图7A中的相同；但是，纵轴指示肿瘤中细胞的数量，以相对单位表示。标记为“对照”的迹线指示没有负载抑制性寡核苷酸的PC-3细胞的生长曲线。标记为“Akt siRNA”的迹线是指在直接暴露于干扰Akt的siRNA后生长的细胞。标记为“SiRNA模拟物mir-16、SiRNA模拟物miR-34”的迹线分别是指直接暴露于模拟miR-34的siRNA和模拟miR-16的siRNA后生长的细胞。每条迹线的每个点处的值指示平均值并且每个点处的垂直线指示在每种标记类型的若干个实验上的标准偏差。所有siRNA对减少细胞增殖都有一定作用，其中miR-16模拟物最有效。
图7C是示出对于单独地(对照)和在转染图7B的抑制性寡核苷酸后生长的PC-3肿瘤细胞经历细胞凋亡的细胞百分比。横轴指示组，其中标记Akt、miR-16和miR-34a分别指示用Akt siRNA、miR-16的siRNA模拟物和miR-34a的siRNA模拟物转染的组。纵轴指示经由末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定确定的以细胞百分比计的细胞凋亡。TUNEL测定是用于通过标记核酸末端来检测DNA断裂的方法；并且，是用于检测由细胞凋亡信号传导级联引起的DNA断裂的常用方法。与直接转染miR-16和miR-34a的SiRNA模拟物相关的细胞凋亡存在显著增加，其中miR-16的模拟物是最有效的。在120小时的实验结束时对样品进行TUNEL测定。
在所有上述实验中，miR-16的模拟物被证明是最有效减少细胞增殖；因此用于大多数剩余的实验和后面章节中介绍的第一个体内实验。
图8A至图8D是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16和KrasGAT SiRNA)对胰腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的图像和绘图。非内分泌型胰腺癌使用人胰腺上皮样癌的PANC-1细胞系进行建模。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝4个实验。图8A绘示了四个图像。左边的两个图像绘示了在实验开始后24小时和96小时培养物中的人PANC-1细胞的显微照片。右边的两个图像绘示了在实验开始后24小时和96小时培养物中的人PANC-1细胞的细胞显微照片，所述细胞在模拟miR-16的100纳摩尔(nM)siRNA溶液中进行了直接转染。如通过在96小时比较两个图像可以看出，暴露于miR-16模拟物的培养物中PANC-1细胞的增殖明显减少。
该结果在绘示相对于时间的PANC-1细胞群生长(增殖)的图8B中得到定量。横轴指示时间(以小时计)，并且纵轴指示在24小时用对照群体归一化的群体。对照迹线指示未暴露于抑制性寡核苷酸的PANC-1细胞的群体大小。miR-16迹线指示暴露于模拟miR-16的siRNA的100nM溶液的PANC-1细胞的群体大小。在96小时，为24小时群体的约1.3倍的暴露于miR-16模拟物的群体相对于为24小时群体的5.7倍的对照群体减少几乎80％。在暴露于甚至更低浓度的miR-16模拟物时也可以实现相同的减少。
图8C是示出对于不同浓度的miR-16模拟物在96小时的示例PANC-1细胞系群体减少；并且，因此绘制出暴露于miR-16的剂量响应的绘图。对数水平轴指示miR-16模拟物的浓度，单位为纳摩尔(nM)；并且，垂直轴与图8B中的相同。用空心圆绘制对照迹线，并且用实心圆绘制暴露于miR-16模拟物溶液的迹线。图8B中的迹线是针对100nM miR-16模拟物浓度绘制的。在图8C中的100nM处，可以看到相同的结果：暴露于miR-16模拟物的群体是在1.3处，相对于约5.7的对照群体减少几乎80％。在略大于100nM处和在约20nM处差异大致相同。即使浓度仅为4nM，与约5.5处的对照群体相比，暴露于miR-16模拟物的细胞群体也显著减少，在约2.7处，减少约50％。与20nM溶液相比，使用更高浓度的100nM溶液似乎没有任何优势。
图8D是示出其他siRNA对PANC-1细胞系的影响的绘图。KRAS和BRAF是参与控制细胞增殖、分化和细胞凋亡的表皮生长因子受体(EGFR)信号传导途径的癌基因。KRAS和BRAF癌基因中的突变很多情况下发现于人合胞体癌症，诸如结肠直肠癌和非小细胞肺癌中。然而，非小细胞肺癌具有降低的连接蛋白表达，因此它们不是用于所提出的涉及siRNA的间隙连接递送的治疗的理想候选者。在一些癌症中，观察到密码子12中的基因突变并将其称为GAT突变。因此，干扰由该突变编码的蛋白质(在本文称为KrasGAT)的翻译的siRNA(在本文称为KrasGATsiRNA)可以在对抗此类癌症的扩散方面具有有益效果。横轴指示时间(以小时计)，并且纵轴指示在24小时用对照群体归一化的群体。对照迹线使用空心圆并且指示未暴露于抑制性寡核苷酸的PANC-1细胞的群体大小。KrasGAT迹线使用实心圆并且指示暴露于KrasGAT siRNA的150nM溶液的PANC-1细胞的群体大小。对照siRNA迹线使用填充有对角线阴影的圆圈并且指示暴露于不干扰任何主要途径或结构的siRNA的150nM溶液的PANC-1细胞的群体大小。对照siRNA与KrasGAT siRNA具有相同的长度，但对照siRNA不编码任何基因并且被称为无义siRNA。两个群体的转染均在零小时开始。该绘图显示KrasGAT siRNA具有超过无义siRNA的中等效果。
图9A是根据实施方案示出在体外直接转染的用于延迟肿瘤生长的潜在剂(包括miR-16模拟物)对不同细胞系的胰腺肿瘤生长的相对影响；并且由此指明用于经由hMSC引入的候选剂的图像并且图9B是其绘图。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝6个实验。命名为CFPAC-1的细胞系是来自具有囊性纤维化的患者的人胰腺癌细胞系。图9A绘示了四个图像。左边的两个图像绘示了在转染开始后24小时和96小时培养物中的人CFPAC-1细胞的显微照片。右边的两个图像绘示了在于模拟miR-16的100nM siRNA溶液中开始直接转染后24小时和96小时培养物中的人CFPAC-1细胞的细胞显微照片。如通过在96小时比较两个图像可以看出，暴露于miR-16模拟物的培养物中CFPAC-1细胞的增殖明显减少。
类似于图8A和图8B，图9A的结果在绘示相对于时间的CFPAC-1细胞群生长(增殖)的图9B中得到定量。横轴指示时间(以小时计)，并且纵轴指示在24小时用对照群体归一化的群体。对照迹线指示未暴露于抑制性寡核苷酸的CFPAC-1细胞的群体大小。miR-16迹线指示暴露于模拟miR-16的siRNA的100nM溶液的CFPAC-1细胞的群体大小。在96小时，为24小时群体的约1.5倍的暴露于miR-16模拟物的群体相对于为24小时群体的约8.3倍的对照群体减少超过80％。
同样在这些实验中，miR-16的siRNA模拟物证明在减少细胞增殖方面是最有效的。
3.3可以在体外使hMSC细胞质负载有延迟肿瘤生长的siRNA。
对于有效地将诸如抑制性寡核苷酸的剂从供体细胞转染至靶细胞的间隙连接，所述剂应当在供体细胞的细胞质中是丰富的并且因此通常在邻近间隙连接的位置处。在一些转染过程中，经由内吞作用将剂从周围流体负载到细胞中。内吞作用是一种主动转运的形式，其中细胞通过吞噬分子(例如核酸和蛋白质)而将它们转运到细胞中，形成囊泡。这是能量使用过程。所有细胞都使用内吞作用及其对应形式即胞吐作用，因为对它们重要的大多数化学物质是不能通过被动方式穿过疏水性原生质膜或细胞膜的极性大分子。对于通过内吞作用负载以可用于通过间隙连接进行转染的剂，囊泡壁应当降解并将剂释放到细胞质中。接下来的实验证实siRNA有效地移动到hMSC的细胞质中。
图10A至图10F是根据实施方案示出在体外直接转染到hMSC中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂的负载的图像和绘图。在这些实施方案中，将用荧光团标记的siRNA负载到培养物中的hMSC细胞中。标记的siRNA具有约500微米的长尺寸(1微米(micron)＝1微米(micrometer)，μm＝10-6米。将Hek 293亲本细胞在置于35mm培养皿内的18x18mm无菌盖玻片上生长。接种后大约24小时，将每个培养皿上的培养基用其中添加24聚体吗啉代(GeneTools)和Endo-Porter(Gene Tools)的2ml新鲜完全培养基(10％FBS，1％P/S)替换。吗啉代终浓度为1.25uM，Endo-Porter终浓度为～6uM。将吗啉代保留在细胞上以便最大限度地递送，不洗涤。对照培养皿接受仅具有Endo-Porter的完全培养基。在不同时间点用3.7％甲醛固定盖玻片。将盖玻片用Vectashield(Vector Labs)固定，使用63x油物镜在OlympusFluoview 1000共聚焦显微镜上捕获图像。通过使用Olympus线系列分析软件工具产生荧光强度分布。
为了区分由负载的siRNA产生的荧光与hMSC中天然存在的背景荧光，首先测量未经受负载的对照hMSC的荧光。图10A是示出来自对照hMSC的荧光强度的示例显微照片的图像。在图像的椭圆形hMSC中存在稍微更亮的背景荧光。将沿图10A中的大约700微米长的白线段的荧光强度分布绘制在图10B中。横轴指示沿白线段的距离。hMSC细胞边界在大约100微米和600微米处，长度为约500微米。纵轴指示为任意单位的荧光强度。在hMSC的右侧边界附近存在大于平均梯度的荧光强度。
图10C是示出在暴露于使用荧光团标记的siRNA的负载3小时后来自不同hMSC的荧光强度的示例显微照片的图像。在图像的椭圆形hMSC的左右边缘处存在明显比背景更亮的荧光。在两个边缘处，宽几个像素的囊泡是明显的，其中荧光非常亮。将沿图10C中的大约700微米长的白线段的荧光强度分布绘制在图10D中。横轴指示沿白线段的距离。hMSC细胞边界在大约100微米和500微米处，长度为约400微米。纵轴指示为任意单位的荧光强度在hMSC的左侧边界和右侧边界附近存在两个明显的荧光强度峰。荧光似乎仍局限于细胞边界附近的囊泡并且在整个细胞质中并不亮。
所述情节经48小时的暴露而改变。图10E是示出在暴露于使用荧光团标记的siRNA的负载48小时后来自不同hMSC的荧光强度的示例显微照片的图像。存在背景荧光但三角形hMSC明显比背景亮。宽几个像素的囊泡仍是明显的，其中荧光额外亮。然而，整个细胞质中的荧光是亮的。将沿图10E中的大约800微米长的线段的荧光强度分布绘制在图10F中，所述线段在这种情况下是黑色的以使其在明亮的细胞质上可见。横轴指示沿黑色线段的距离。hMSC细胞边界在大约200微米和700微米处，长度为约500微米。纵轴指示为任意单位的荧光强度。在hMSC的左侧边界和右侧边界附近存在两个明显的荧光强度峰，但是在细胞的中间存在更宽且更强的峰。整个hMSC中的荧光是亮的。这是有利于用于通过间隙连接转染的siRNA分布。
图11是根据各种实施方案示出用于负载在体外直接转染到hMSC和其他细胞中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂的各种方法的一组绘图。使用两种转染试剂并将其与不含转染试剂的对照进行比较。用于转染的测试siRNA是Mission siRNA，其使用花青3(在下文称为Cy3并在绘图上命名为Cy3PE-A)而变得有荧光。为了帮助区分细胞，也将它们用荧光素染色(在绘图上命名为6FAM FITC-A)。图11中九个绘图中的每个具有指示来自Cy3的荧光强度对数纵轴和指示来自荧光素的荧光强度的对数横轴。没有必要读取这些轴上的标度，如在下文中将显而易见的。每个绘图是一组细胞内Cy3和荧光素分布的散点图。
对三种细胞类型进行比较，即在图11的底行的hMSC，和两个胰腺癌细胞系，在中间行的PANC-1和在顶行的CFPAC-1。左列示出了三种细胞类型的对照-即在没有转染试剂的情况下在由Cy3标记的100nM Mission siRNA溶液中浸浴时Cy3和荧光素的分布。大多数细胞具有针对Cy3和荧光素的较低值，其限定了在每个绘图上标示的左下象限Q3。左下象限对于每种细胞类型是不同的，如通过比较针对对照事例的左列中的三个绘图将显而易见的。
中间列示出当使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂时将细胞在由Cy3标记的100nM Mission siRNA溶液中浸浴的影响。荧光素强度保持较低，但细胞内部的Cy3强度跳出象限Q3并进入象限Q1中。这显示Mission siRNA有效转染到所有三种细胞类型(包括底行的hMSC)中。如针对所有三种细胞类型在右列所示的，当使用X-tremeGene siRNA转染试剂(可从Roche Molecular Systems Inc.,Branchburg,NJ购得)时，发生类似的结果。
图11证实siRNA在体外易于负载到hMSC中以用作体内供体细胞。来自24孔板的单个孔的平均细胞产量是1.9x105个负载有siRNA的hMSC细胞。当在体内与合胞体癌细胞的肿瘤接触时引入负载有干扰siRNA的105个hMSC细胞预期是治疗性的。
在其他实施方案中，使用其他机制在体外将siRNA转染到hMSC中；包括但不限于，以单独或某种组合的方式使用磷酸钙、或电穿孔、或细胞挤压、或通过将阳离子脂质与材料混合以产生脂质体，所述脂质体与细胞膜融合并将其载物沉积在内部。
3.4hMSC可以在负载有延迟肿瘤生长的某些siRNA的情况下存活
图12A和图12B是根据实施方案示出在负载在体外直接转染到hMSC中的用于延迟肿瘤生长的潜在剂后hMSC的存活的绘图。使用直接转染实验方案，对于每个迹线n＝4个实验。图12A是示出当负载有上文所示的抑制性寡核苷酸以减少至少一些癌细胞的增殖时hMSC的示例存活的图。横轴指示转染后的小时数并且纵轴指示以数万个细胞计的细胞数，对于每个迹线0小时的初始群体为50,000个细胞。标记为“hMSC-对照”的迹线显示群体变化长达48小时但未相对于初始群体偏离超过约10％也示出了分别针对负载有Akt siRNA、针对siRNA和皮层肌动蛋白siRNA的hMSC的迹线。所有均在72小时内略有变化，但所有均结束在hMSC的初始群体的约40％之内，这是足以与相邻细胞形成大量间隙连接的量。
图12B是示出当负载有上文所示的为减少所有测试癌细胞的增殖的最有效的剂的miR-16的siRNA模拟物时hMSC的示例存活的图。横轴指示负载后的小时数并且纵轴指示为任意单位的细胞数。标记为“对照”的迹线显示，对于未负载有miR-16的SiRNA模拟物的hMSC，群体生长长达96小时。还示出了分别在处于100nM、200nM和300nM的不同浓度水平的溶液中负载有miR-16的siRNA模拟物并对应地进行标记的hMSC的迹线。每个点是4个实验的平均值，并且由垂直线表示的标准偏差在符号大小的数量级上，因此不容易观察到。针对负载有miR-16模拟物的hMSC的所有迹线显示出仅略微低于对照迹线的生长，三种非对照迹线之间几乎没有差异。
因此，负载有miR-16模拟物的hMSC应当存活足够久以与靶细胞形成间隙连接并将其miR-16模拟物负载递送到靶细胞。
3.5hMSC与合胞体癌细胞形成功能性间隙连接并且因此可以经由间隙连接将延迟 肿瘤生长的某些siRNA转染到合胞体癌细胞中
图13A和图13B是根据实施方案示出hMSC与合胞体癌细胞之间的间隙连接的形成的绘图。在这种情况下，合胞体癌细胞是LoVo(人结肠腺癌)细胞系的成员。图13A示出了由双全细胞膜片钳产生的数据。横轴是时间，并且有两个纵向标度，下标度示出施加电压，并且上标度示出产生的电流。在零时间时，施加的电压为零并且电流为零。将电压立即降至-110毫伏(mV，1mV＝10-3伏)并且通过白色迹线给出的电流跳变到600皮安(pA，1pA＝10-12)以上，然后稍微衰减。5秒后，将电压切换到+110mV并且电流反转到-600pA以下，然后逐渐衰减。十秒后，将电压返回到零并且电流也返回到零。此外，将0与110mV之间的电压以10mV的增量进行测试，以产生其他迹线。在LoVo细胞中检测到施加于hMSC的电流。这种响应表明已形成间隙连接，其在细胞之间传递离子以携载测量的电流。图13B是示出电压电流响应曲线的图，所述电压电流响应曲线示出hMSC细胞中的连接电流随施加于LoVO癌细胞的电压的变化。在虚线中电流变平的情况下，耦合太高而无法检测到依赖性。实线迹线是测量值，如果细胞之间的电导较低(即能够观察到电导的电压依赖性)，则虚线迹线是期望的。
3.6合胞体癌细胞彼此形成功能性间隙连接并且因此可以经由间隙连接转染延迟 肿瘤生长的某些siRNA
图14A和图14B是根据实施方案示出两个合胞体癌细胞之间的间隙连接的示例形成，所述间隙连接用于使抑制性寡核苷酸传播通过合胞体癌肿瘤的多个细胞。图14A是两个UACC-62黑素瘤细胞的显微照片，所述细胞已被荧光标记以用红色荧光团突出外膜中的肌动蛋白、用细胞核中的蓝色DAPI荧光团突出DNA，并且用细胞质中的绿色荧光团突出凝溶胶蛋白。图14B示出了由双全细胞膜片钳产生的数据。在另一个细胞中检测到施加于一个细胞的电流。
图14C和图14D是用于各种实施方案的示出间隙连接连接蛋白存在于多种结肠直肠癌细胞系中的电泳凝胶的图像。在两个不同的实验中，发现Cx43存在于作为对照的Hek293中并且存在于四个结肠直肠细胞系中的三个中，所述三个结肠直肠细胞系包括LoVo、人结肠直肠癌细胞系HCT116和结肠腺癌SW480。仅人结肠直肠腺癌细胞系HT29不表达Cx43。Cx 43的普遍存在可用于与细胞系的其他成员以及与hMSC形成间隙连接。
3.7合胞体癌细胞确实相互转染某些siRNA
图14E和图14F是根据实施方案示出干扰若干种结构或功能蛋白的产生的RNA在癌细胞之间转染；并且由此代表用于延迟肿瘤生长的潜在剂的电泳凝胶(蛋白质印迹)的图像。图14E绘示了五列凝胶。第一列包括已知大小的标记分子，包括55kDa、72kDa、95kDa、130kDa和170kDa。第2至5列示出了通过分别成功转染到UACC-62(恶性黑素瘤)、HelaCX43H10(宫颈癌)、作为对照的HeK293和C6(大鼠神经胶质瘤(Giloma))细胞系的细胞中的其抗体(90kDa的抗凝溶胶蛋白和36kDa的抗GAPDH)检测的蛋白质的存在。图14F绘示了三列凝胶，其尺寸与图14E的图像对齐。在图14F中，第三列包括已知大小的标记分子，包括40kDa、50kDa和60kDa。第1和2列示出了通过其抗体(90kDa的抗凝溶胶蛋白和55kDa的抗α-微管蛋白)检测的蛋白质的存在，所述蛋白质被已成功转染到UACC-62细胞中的siRNA下调。被敲减的蛋白质是在右侧的蛋白质印迹中显示出较低的密度的那些(凝溶胶蛋白)。转染进凝溶胶蛋白的siRNA并降低蛋白质的水平。这些绘图表明这种siRNA可以在偶联的肿瘤细胞之间转染，并且因此在各种实施方案中至少可以用于对抗由此类细胞系代表的肿瘤。
3.8合胞体癌组织在体外将siRNA递送通过合胞体癌细胞的多个细胞宽度
对将siRNA从一个癌细胞到另一癌细胞的间隙连接转染的测定是使用划痕负载(scrape loading)进行的。在划痕负载中，在间隙连接可渗透示踪剂的存在下沿着单一线划开或刮擦单层粘附细胞，所述可渗透示踪剂沿着划痕并入细胞，这可能是由于膜的一些机械扰动。随着正常的膜渗透性重新建立，示踪剂被捕获在细胞质内并且随着时间的推移，可以从负载的细胞移动到通过由连接蛋白通道组成的功能性间隙连接相连的相邻细胞中。荧光染料在一定时段期间远离划痕线扩散的距离指示间隙连接细胞间通讯。
图15A至图15C是根据实施方案示出siRNA传播通过合胞体癌肿瘤的多个细胞的图像和绘图。在图15A中，负载到HeLa宫颈癌细胞系细胞中的荧光团标记的siRNA的量示出在针对溶液中四种不同浓度的标记siRNA的四个图像中，所述四种不同浓度分别为0nM、0.05nM、5nM和150nM，每个图像为在转染后24小时。在较高浓度下，使更多细胞转染有荧光标记的siRNA的亮点。
图15B示出在从顶部中心到右下角对角切割的划痕负载事件后22小时HeLa宫颈癌单层的图像。顶部图像是放大两倍的下部图像的一部分。沿着划痕线的细胞因是亮的，具有标记的siRNA，而相邻的细胞也由于间隙连接转移而显示出一些标记的siRNA。双箭头线段示出垂直于划痕方向的方向，其中数据绘制在图15C中。
图15C是示出随着距划痕负载线的距离而下降的荧光强度的图。横轴是距离(以微米计)；并且纵轴是为任意单位的荧光强度。荧光染料集中在每个细胞的核中，从而形成峰。可以通过计数峰来确定该标记的siRNA被转运通过的细胞宽度数。荧光强度在对应于约11个细胞宽度的约175微米的范围内下降至划痕线值的约5％。因此，标记的siRNA通过间隙连接传播通过十个间插细胞以到达显示标记的siRNA的最后一个细胞。对扩散曲线的拟合产生约5x10-9平方厘米/秒的扩散常数DC。
这证实，可以期望抑制性寡核苷酸在通过负载的hMSC引入后经由间隙连接从一个癌细胞传播至另一个癌细胞，从而增加了hMSC的效应，通常癌细胞的数量多于hMSC。
3.9在体外与负载的hMSC的共培养确实可以延迟肿瘤生长
当负载有适当的抑制性寡核苷酸时，发现与癌细胞在体外共培养的hMSC导致肿瘤生长的减少。这与当抑制性寡核苷酸未负载到hMSC中时获得的结果(例如，在图3A和图3B中)形成鲜明对比。基于上述实验，据信该结果是由于抑制性寡核苷酸经由间隙连接从hMSC转染至相邻癌细胞并且从那些相邻癌细胞转染到相继更远的癌细胞上。
图16是根据实施方案示出通过在体外与hMSC共培养对结肠直肠肿瘤生长的相对影响的绘图。该实验使用LoVo结肠直肠细胞系。使用间接转染实验方案，对于每个迹线n＝15个实验。横轴指示时间(以天计)；并且纵轴指示为任意单位的细胞群。示出了针对单独培养的LoVo细胞和针对与未负载有抑制性寡核苷酸的hMSC一起培养的LoVo细胞的迹线。还示出了针对与已负载有Akt siRNA(标记为“LoVo+hMSC+Akt”)的hMSC共培养的LoVo细胞的迹线。还示出了针对与已负载有乱序siRNA(标记为“LoVo+hMSC+乱序的”)的hMSC共培养的LoVo细胞的迹线。乱序siRNA是其序列不与任何已知基因序列互补并且因此代表无义siRNA的siRNA。每条迹线绘制15次培养的平均值，标准偏差由垂直线段指示。在第3天，LoVo+hMSC+Akt显著优于所有其他三组(p<0.001)。LoVo+hMSC+乱序的比单独的LoVo和LoVo+hMSC显著更好(p<0.05)。
图17是示出肿瘤重量与肿瘤体积之间的直接关系以便比较各种剩余绘图的绘图。横轴指示重量(以克计)；并且纵轴指示体积(以立方厘米(cm3)计)。数据是基于对照肿瘤和针对称重的较小肿瘤的用miR-16模拟物转染的肿瘤。对于约0.1克至约1.6克的重量，该关系是线性的，其中R2＝0.81。
图18A和图18B是根据实施方案示出通过在体外与负载有miR-16或miR-16的siRNA模拟物的hMSC共培养对前列腺肿瘤生长的相对影响的绘图。使用间接转染实验方案，对于每个迹线n＝4个实验。图18A是示出来自一组示例实验的数据的图。横轴指示时间(以小时计)；并且纵轴指示以数万个细胞计的细胞数。对照迹线示出了将PC-3前列腺细胞系与未负载有抑制性寡核苷酸的hMSC共培养的效果。另一个迹线示出了将PC-3前列腺细胞系与负载有miR-16模拟物的hMSC共培养的效果。每条迹线绘制四次培养的平均值并且标准偏差由垂直线段指示。肿瘤生长率降低约25％；不如直接转染miR-16模拟物显著。预期，较长的培养时间将显示出更多的降低，因为间隙连接数增加并且更多的miR-16模拟物被递送至PC-3细胞。
图18B是示出来自将天数延长更久至96小时的另一组示例实验的数据的图。横轴指示时间(以小时计)；并且纵轴指示以吸光度为单位的肿瘤细胞数。对照迹线示出了在每种类型细胞的均匀混合物(1:1)中将PC-3前列腺细胞系与未负载有抑制性寡核苷酸的hMSC共培养的效果。另一个迹线示出了也是在1:1混合物中将PC-3前列腺细胞系与负载有miR-16模拟物的hMSC共培养的效果。将hMSC在150nM miR-16模拟物的溶液中进行负载。每条迹线绘制六次培养的平均值并且标准偏差由垂直线段指示。肿瘤生长率降低约30％至40％；比在此处的72小时和在图18A中的72小时获得的稍好一些。
3.10用负载的hMSC的体内治疗确实可以延迟肿瘤生长
在本章节中，证实了负载有抑制性寡核苷酸的hMSC确实减少体内的肿瘤生长，这与图3A和图3B中针对未负载有抑制性寡核苷酸的hMSC示出的结果形成鲜明的对比。
图19A至图19C是根据实施方案示出通过用负载有miR-16模拟物的hMSC体内治疗对前列腺肿瘤生长的影响的绘图。图19A是示出在使用负载有miR-16模拟物的hMSC的情况下体内肿瘤生长的示例减少的图。横轴指示时间(以天计)，直到第40天，并且纵轴指示肿瘤体积(以立方厘米(cm3)计)。在第0天，将前列腺癌PC-3细胞系的100万个细胞注射到两组裸鼠中的每只裸鼠中，每组中n＝4只小鼠。在第10天，将在100nM溶液中负载有miR-16模拟物的hMSC注射到一组中的每只裸鼠的肿瘤中。对照迹线指示未接受负载有miR-16模拟物的hMSC的未治疗裸鼠组的平均肿瘤体积，标准偏差由垂直线段指示。治疗迹线指示接受负载有miR-16模拟物的hMSC的治疗裸鼠组的平均肿瘤体积，同样标准偏差由垂直线段指示。在第35天时，治疗组肿瘤体积为未治疗对照组的肿瘤体积的约50％。差异是统计学上显著的并且在治疗学上是重要的。
图19B是条形图，其示出了单独地(对照)和在负载有模拟miR-16的siRNA的hMSC存在下生长的肿瘤细胞在第35天在将动物从图19A中所示的实验中处死时的肿瘤重量。横轴指示组并且纵轴指示重量(以克计)。第一条柱指示对照组中四个肿瘤的平均重量并且实心条柱指示与hMSC一起生长的组中四个肿瘤的平均重量，垂直线段指示平均值的标准误差(SEM)。与通过负载有miR-16模拟物的hMSC进行的治疗相关的肿瘤生长存在着显著减少。该结果应当与图3B中所绘示的结果形成对比。
图19C是以肿瘤大小(宽度和高度)示出在使用负载有miR-16模拟物的hMSC的情况下体内肿瘤生长的示例减少的图。横轴指示时间(以天计)，直到第36天，并且纵轴指示以基线大小的％计的肿瘤大小。在第0天，将前列腺癌PC-3细胞系的100万个细胞注射到两组裸鼠中的每只裸鼠中，每组中具有6只小鼠。在第14天，将一百万个负载有充当miR-16模拟物的siRNA的hMSC注射到一组中的每只裸鼠的肿瘤中。对照迹线指示未接受负载有miR-16模拟物的hMSC的未治疗裸鼠组的平均肿瘤大小，平均值的标准误差(SEM)由垂直线段指示。治疗迹线指示接受负载有miR-16模拟物的hMSC的治疗裸鼠组的平均肿瘤大小，同样SEM由垂直线段指示。在第36天时，治疗组肿瘤大小为未治疗对照组的肿瘤大小的约60％。差异是统计学上显著的并且在治疗学上是重要的。
基于针对一种癌细胞系的实验结果，以及对于其他合胞体癌细胞系在连接蛋白出现、间隙连接形成和对miR-模拟物的应答方面的平行结果，预期到对于其他癌症可以通过注射已经负载有抑制性寡核苷酸的hMSC或以其他方式使肿瘤与所述hMSC接触来在肿瘤生长方面获得类似的显著且治疗性的减少，所述其他癌症包括本文示出的癌症(子宫颈癌、结肠直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌和大鼠神经胶质瘤)，所述抑制性寡核苷酸诸如miR-16模拟物、皮层肌动蛋白siRNA、凝溶胶蛋白siRNA、Akt siRNA和miR-34a模拟物等。
4.替代方案和修改
在先前描述的说明书中，已经参考其具体实施方案描述了本发明。然而，将显而易见的是：在不脱离本发明的更宽广精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改和改变。因此，应以说明性意义而不是限制性意义来理解本说明书和附图。贯穿本说明书和权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及其变体诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解成暗示包括所陈述的项目、元素或步骤或项目组、元素组或步骤组，但不排除任何其他项目、元素或步骤或项目组、元素组或步骤组。此外，不定冠词“一个”或“一种”旨在指示由该冠词修饰的项目、元素或步骤中的一个或多个。
参考文献
Tian et al.，2011，“Human mesenchymal stem cells play a dual role ontumor cell growth invitro and in vivo，”J Cell Physiol.，v226(#7)，pp1860-7，2011，doi：10.1002/jcp.22511.
Plotnikov et al.，2003，“Human mesenchymal stem cells transfected withHCN2 as a gene delivery system to induce pacemaker function in canine heart，”Circulation，v108：IV-547.
Valiunas et al.，2002，“Cardiac gap junction channels show quantitativedifferenccs in selectivity.”Cir.Res.，v91，pp104-111.
序列表
<110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK
THE RESEARCH FOUNDATION FOR THE STATE UNIVERSITY OF NEW
YORK
COHEN, Ira S.
BRINK, Peter R.
ROSEN, Michael R.
<120> 基于经由来自人间充质干细胞(hMSC)的间隙连接递送寡核苷酸的癌症治疗
<130> 15003-087PC0
<150> US 62/312,230
<151> 2016-03-23
<150> US 10/583,369
<151> 2004-12-17
<150> PCT/US2004/042504
<151> 2004-12-17
<150> US 12/910,346
<151> 2010-10-22
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的： miR-16模拟物、hsa-mir-16-1
<400> 1
ccaguauuaa cugugcugcu ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的： miR-34a模拟物、hsa-mir-34a
<400> 2
uggcaguguc uuagcugguu gu 22

Claims (8)

1.一种在体内治疗癌症的方法，所述方法包括：
a)将至少一种类型的抑制性寡核苷酸在体外引入到多个人间充质干细胞(hMSC)中；以及
b)在体内使包括多个合胞体癌细胞的肿瘤组织在允许所述多个hMSC的hMSC与所述肿瘤组织的第一合胞体癌细胞形成间隙连接通道的条件下与所述多个hMSC接触，由此通过穿过所述间隙连接通道将至少一种类型的抑制性寡核苷酸递送至所述第一合胞体癌细胞中，并且通过穿过所述第一合胞体癌细胞与第二合胞体癌细胞之间的间隙连接通道将所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸递送至所述肿瘤组织的所述第二合胞体癌细胞中。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸在所述hMSC能够将所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸递送至所述第一合胞体癌细胞之前不杀死所述hMSC。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述多个hMSC包括约105个hMSC。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸选自包括以下的组：miR-16、miR-34a、模拟miR-16的siRNA、模拟miR-34a的siRNA；干扰皮层肌动蛋白翻译的siRNA、干扰Akt翻译的siRNA、干扰凝溶胶蛋白翻译的siRNA、干扰a-微管蛋白翻译的siRNA、干扰GAPDH翻译的siRNA和干扰KrasGAT翻译的siRNA。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤组织是包括以下的组的成员：子宫颈癌组织、结肠直肠癌组织、黑素瘤组织、胰腺癌组织、前列腺癌组织、非小细胞肺癌和大鼠神经胶质瘤。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤组织是前列腺癌组织并且所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸是模拟miR-16的siRNA。
7.如权利要求1所述的方法，其中将至少一种类型的抑制性寡核苷酸在体外引入到所述多个人间充质干细胞(hMSC)中还包括将所述多个hMSC在编码所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸的所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸的20纳摩尔溶液中培养。
8.如权利要求1所述的方法，其中将至少一种类型的抑制性寡核苷酸在体外引入到所述多个人间充质干细胞(hMSC)中还包括将所述多个hMSC在转染试剂和编码所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸的所述至少一种类型的抑制性寡核苷酸的溶液中培养。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
CN116064678A (zh) 2016-01-15 2023-05-05 美国基因技术国际有限公司 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物
SG11202004680UA (en) * 2017-11-22 2020-06-29 Mesoblast Int Sarl Cellular compositions and methods of treatment i
KR102145176B1 (ko) * 2017-11-27 2020-08-18 (주)프로스테믹스 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US11352646B2 (en) * 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050002914A1 (en) * 2003-01-15 2005-01-06 Rosen Michael R. Mesenchymal stem cells as a vehicle for ion channel transfer in syncytial structures
WO2008141177A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Methods and compositions for the treatment of sarcoma
US20090253780A1 (en) * 2008-03-26 2009-10-08 Fumitaka Takeshita COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO miR-16 AND THERAPY OF PROSTATE CANCER
US20100068699A1 (en) * 2004-07-19 2010-03-18 Robinson Richard B Assay System For Monitoring The Effects Of Genetically Engineered Cells To Alter Function Of A Synctium

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050002914A1 (en) * 2003-01-15 2005-01-06 Rosen Michael R. Mesenchymal stem cells as a vehicle for ion channel transfer in syncytial structures
US20100068699A1 (en) * 2004-07-19 2010-03-18 Robinson Richard B Assay System For Monitoring The Effects Of Genetically Engineered Cells To Alter Function Of A Synctium
WO2008141177A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Methods and compositions for the treatment of sarcoma
US20090253780A1 (en) * 2008-03-26 2009-10-08 Fumitaka Takeshita COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO miR-16 AND THERAPY OF PROSTATE CANCER

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKIRA NAKAMIZO ET AL: "Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Gliomas", 《CANCER RES》 *
JORDI MARTINEZ-QUINTANILLA ET AL: "Therapeutic Efficacy and Fate of Bimodal Engineered Stem Cells in Malignant Brain Tumors", 《STEM CELLS》 *
V. VALIUNAS ET AL: "Connexin-specific cell-to-cell transfer of short interfering RNA by gap junctions", 《J PHYSIOL》 *
沈月兰 等: "microRNA与癌症发生相关性研究的现状", 《中华肿瘤防治杂志》 *

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