CN105861551B - 联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用 - Google Patents

联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明为联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用，公开了一种核酸构建载体。本发明还公开了核酸构建载体用于制备抑制乳腺癌细胞增殖的组合物方面的应用。本发明还公开了一种真核联合表达载体pEGFPC3‑miR145/16，本载体可以同时表达两个成熟的microRNA分子：miR145‑5p和miR16‑5p，其表达效率不受插入位置(即距离启动子远近)的影响，并且靶向miR155‑5p高水平表达的乳腺癌细胞系具有很强的协同抑制肿瘤生长作用。本发明的microRNAs联合表达载体可显著抑制乳腺癌细胞的增殖并表现特异性。本发明为建立靶向治疗特定种类乳腺癌的miR145‑5p和miR16‑5p联合治疗核酸药物提供了实验基础和理论依据。

Description

联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方 法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用；具体构建用于联合表达miR145-5p和miR16-5p的抑制乳腺癌细胞增殖的真核表达载体，在乳腺癌细胞中验证其作用效应和治疗用途。
背景技术
近年来，乳腺癌发病率呈现快速上升的趋势。我国女性乳腺癌发病率正以每年3％～4％的比例急剧增加，而中国城镇中年人口中，乳腺癌发病率在过去数十年增长了20％～30％，成为我国发病率增幅最快的恶性肿瘤之一。由于乳腺癌发病率高、危害性大，已经成为严重危害人民健康、制约经济发展的重要疾病。然而，迄今为止，国际上对于乳腺癌治疗的特效药物并不多，针对各类型乳腺癌的治疗方法并不完全有效，探索乳腺癌的发病机制和防治方法是应用基础和临床研究领域的重要课题。
MicroRNAs为一种新型的基因调控因子，它能在转录后水平抑制靶基因的表达或蛋白翻译，从而参与生物体内多种生理、病理过程的调节，如细胞分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭等。乳腺癌组织/细胞特异性高水平表达的microRNAs有几大类，如miR21、miR155、miR301、miR375等，特异性低表达的microRNAs有：miR145、miR125b、miR16、let-7a等。关于microRNAs与肿瘤的关系已经有很多文献报道，正常细胞和肿瘤细胞中的microRNAs表达水平的差异，表明microRNAs的异常表达与肿瘤发生之间具有特定的相关性。MicroRNAs作为有前景的肿瘤治疗的核酸药物，其体外转染给药和其表达丰度对肿瘤的靶向治疗尤为重要。如何将体外microRNAs运送到靶组织，保持其效能与靶向性成为此项技术的关键点之一。
MicroRNAs种类及其作用的靶基因众多，考虑到单种microRNA分子对肿瘤细胞的作用有限，因此常将抑癌的microRNAs与肿瘤抑制剂联合使用。此外，还可考虑联合两种或多种microRNAs的表达及其协同作用获得增强的抗肿瘤效应，有研究报道将共表达(co-expressed)的miR145和miR143的分子簇(miR143/145cluster)转染细胞后，共同作用于肿瘤细胞，具有良好的协同作用。但有研究发现将两个microRNAs分子依次插入在同一个表达载体上转染细胞其表达水平存在差异，即表达效率受插入位置的影响：靠近启动子的microRNAs表达效率要高于远离启动子的microRNAs分子。因此，研究不受插入表达载体位置(即距离启动子远近)的影响从而满足高效表达，又同时可发挥几种microRNAs协同作用的基因药物成为此项技术的另一个关键点。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种核酸构建载体，用真核表达载体高效表达microRNAs，使得插入的目的microRNAs的表达不受插入位置的影响，即所表达的microRNAs表达效率相互不影响；
本发明还要解决的技术问题是提供一种核酸重组表达载体。本发明的目的是提供一种microRNAs表达载体，所构建的microRNAs表达载体只在miR155-5p高表达的乳腺癌肿瘤细胞中高表达，而在miR155-5p低表达的正常细胞中表达很弱，从而达到靶向抑制特定乳腺癌细胞的作用。
本发明最后要解决的技术问题是根据乳腺癌细胞中两种microRNAs的表达的特异性，通过上述的核酸重组表达载体在乳腺癌细胞/组织内表达期望的microRNAs，从而实现协同抑制乳腺癌细胞的增殖达到抑癌方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种核酸构建载体，其包括至少一种编码microRNAs的核酸分子，和一种编码结合沉默复合物的核酸序列，和一种编码间隔microRNAs的核酸序列，和一种编码减少通读现象的核酸序列；其中所述的核酸构建载体使得所述的microRNAs的核酸分子，和结合沉默复合物的核酸序列，和间隔microRNAs的核酸序列，和编码减少通读现象的核酸序列能够共顺反子的表达。
其中，上述的编码microRNAs的核酸分子是miR145-5p和miR16-5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
其中，上述的一种编码结合沉默复合物的序列是miR155-5p的反义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
其中，上述的一种编码间隔microRNAs的序列是6bp的核酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
其中，上述的一种编码减少通读现象的序列是一个短的polyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
上述的核酸构建载体用于制备抑制细胞增殖的组合物方面的应用。
一种重组载体，其含有上述的核苷酸序列。
上述的重组载体，包括编码microRNAs的核酸分子，编码miR155-5p的对应反义链核酸序列，编码间隔microRNAs的核酸序列，编码减少通读现象的核酸序列中的一种或几种，并且编码microRNAs的核酸分子两边都是miR155-5p反义链，编码microRNAs的核酸分子与miR155-5p反义链之间由6bp间隔序列连接，所述编码microRNAs的核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p；其中所述重组载体使得所述编码microRNAs的核酸分子能够共顺反子地表达。
一种真核联合表达载体pEGFPC3-miR145/16，所述载体同时表达两个成熟的microRNAs分子：miR145-5p和miR16-5p。
上述的重组载体在制备乳腺癌药物方面的应用。
上述的重组载体在乳腺癌导管癌细胞内表达期望的microRNAs协同抑制增殖药物方面的应用。
本发明构建的microRNAs表达载体，表达的两种microRNAs为miR145-5p和miR16-5p的成熟序，列具有抑癌作用、协同作用；该表达载体含有可以特异性结合癌细胞中的miR155-5p的序列：miR155-5p反义链。
本发明构建的microRNAs表达载体的目的片段两侧都是miR155-5p反义链。
本发明构建的microRNAs表达载体，表达的序列在吸附miR155-5p后，会被沉默复合物剪切，将miR155-5p反义链从表达序列上切下。
本发明构建的microRNAs表达载体，在miR155-5p反义链被切掉之后，即形成miR145-5p和miR16-5p的成熟序列。
发明人构建了联合表达miR145-5p和miR16-5p并特异性靶向乳腺癌细胞的真核表达载体，实现特异性高效表达目的microRNAs，并有效的抑制乳腺癌肿瘤细胞生长。
本发明的具体方法如下：
一、MicroRNAs协同作用的筛选
筛选的microRNA mimics药物购于广州锐博生物科技有限公司：miR145-5p mimic(micrONTM hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micrONTM hsa-miR-125b-5pagomir)，miR16-5p mimic(micrONTM hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micrONTMhsa-let-7a-5p agomir)，Negative control mimic(microRNAs mimiccontrol)。
选取4种文献报道的乳腺癌中低表达的microRNAs分子(miR145-5p mimic,、miR125b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7a mimic)，两两一组分别共转染T47D细胞，MTT增殖实验结果显示，miR145-5p和miR16-5p具有最佳协同作用(图1-A、图1-B)。
二、MicroRNAs真核表达载体的构建
为了实现本发明的目的，发明人设计联合表达miR145-5p和miR16-5p的真核表达载体的构建方法，在于：用同尾酶将目的片段连接到真核表达载体pEGFPC3上。
本发明使用的pEGFPC3载体(Clontech公司，美国)是非病毒性哺乳动物细胞表达载体，启动子是CMV，载体大小4727bp，载体标签：N-EGFP，载体抗性：卡那霉素，载体筛选标记：新霉素。多克隆位点(MCS)区在1328-1413bp，如图2-A所示。
本发明构建的所有载体，选择插入目的片段的限制性内切酶位点为多克隆位点区(MCS)的Bgl II和EcoR I(原始载体1335bp和1360bp之间)，如图2-A所示。pEGFPC3-miR145/16、pEGFPC3-miR16/145、pEGFPC3-miR145、pEGFPC3-miR16和pEGFPC3-miRNC等载体的构建按图2-B所示将各个片段依次插入pEGFPC3。各插入片段由深圳华大基因科技服务有限公司合成：
miR145-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
miR16-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
miR155-5p的反义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6bp间隔microRNAs的核酸序列，为限制性内切酶连接形成的序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
短的polyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
miRNC(无意链序列，即序列不靶向任何一个基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所有合成序列5’端加入BglⅡ，3’端加入BglⅡ和EcoRⅠ。
所有合成序列都是同时合成两条互补双链。
三、McroRNAs真核表达载体对T47D细胞抑制率检测
将构建的microRNAs真核表达载体转染T47D细胞，通过MTT增殖实验，检测不同载体对T47D细胞的抑制率。如图3所示，在细胞水平证实了pEGFPC3-miR145/16具有最佳的抑制T47D细胞增殖效果。
四、McroRNAs真核表达载体的表达效率检测
将构建的几种micoRNA真核表达载体或microRNA mimics转染T47D细胞，48h后，提取总RNA，TARAKA公司试剂盒反转录第一链，实时荧光定量PCR检测各个载体的目的片段的表达。如图4所示，在mRNA水平证实构建的真核表达载体能够成功表达miR145-5p、miR16-5p、miRNC等相应的目的片段。
五、McroRNAs真核表达载体对预测靶基因的mRNA水平的抑制
将构建的几种micoRNA真核表达载体或microRNA mimics转染T47D细胞，48h后，提取总RNA，TARAKA公司试剂盒反转录第一链，实时荧光定量PCR检测各个实验组的靶基因的表达。如图5所示，在mRNA水平上证实了转染构建的各种microRNAs表达质粒或microRNAmimics后，Cyclin D1(周期蛋白D1)、C-myc(v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物)、Erk1/2(细胞外信号调节激酶)基因的表达下降，单独转染pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16，或单独转染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic后，BCL2(B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2)的表达上调，共转染miR145-5p和miR16-5p的mimic或pEGFPC3-miR145/16后，BCL2的表达下降。
六、MicroRNAs真核表达载体对预测靶基因的蛋白水平的抑制
将构建的几种microRNA真核表达载体转染T47D细胞，加药处理48h后用全蛋白提取试剂盒(KGP2100，凯基生物)提取细胞总蛋白；然后用BCA法定量蛋白浓度，取50μg蛋白上样跑SDS-PAGE电泳；如图6-A、图6-B所示，通过对4个靶基因的检测，发现几个靶蛋白在单独转染pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16时无明显抑制作用，在转染pEGFPC3-miR145/16后，Erk1/2、Cyclin D1、C-myc、BCL2都被敲降，以BCL2最为明显。
有益效果：本发明所构建的表达载体用于目的microRNAs的表达不受插入位置(即距离启动子远近)的影响，可同时高效表达两种抑癌microRNAs分子miR145-5p和miR16-5p；本发明所构建的载体靶向miR155-5p高表达的乳腺癌细胞体现了显著的协同抑癌作用。发明人构建新型生物载体的方法有望在临床上应用于治疗特定种类的乳腺癌，提高患者的存活率和生存质量。
附图说明
图1四种microRNAs两两组合对T47D细胞的抑制率(图1-A：单独加药处理的抑制率；图1-B：组合加药处理的抑制率；)
图2载体构建示意图。(图2-A：载体构建使用的原始载体pEGFPC3示意图；图2-B：pEGFPC3-miR145/16联合表达载体、pEGFPC3-miR16/145联合表达载体、pEGFPC3-miR145表达载体、pEGFPC3-miR16表达载体、pEGFPC3-miRNC表达载体等构建示意图；图2-C成功构建的pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16或pEGFPC3-miRNC测序图；)
图3MTT法检测构建载体抑制T47D细胞增殖的作用(图3：MTT实验结果)；
图4实时荧光定量PCR检测构建的质粒表达目的片段的效率(图4-A：miR145-5p和miR16-5p含量的实时荧光定量PCR检测；图4-B：miRNC含量的实时荧光定量PCR检测)；
图5实时荧光定量PCR检测4个预测靶基因表达；
图6Western blot检测4个预测靶基因的表达(图6-A：western blot结果图；图6-B：western blot条带灰度扫描结果柱状图)；
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。一般地，本说明书中关于细胞核组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因、蛋白质和核酸化学、和杂交使用的术语和技术是本领域众所周知并且通常使用的。一般地，除非另外指出，否则本发明方法和技术都是根据本领域众所周知，并且在本说明书中所引用或讨论的各种一般性和专业出版物中有介绍的标准方法来实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：四种抑癌的microRNAs两两组合对T47D细胞的抑制率。
T47D细胞使用PRIM1640培养基加5％FBS培养，放在细胞培养箱生长。传代时将细胞稀释成50000个/ml，在96孔板中每个孔加入100μl。
筛选的microRNA mimics药物(广州锐博生物科技有限公司)：miR145-5p mimic(micrONTM hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micrONTM hsa-miR-125b-5pagomir)，miR16-5p mimic(micrONTM hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micrONTMhsa-let-7a-5p agomir)，Negative control mimic(microRNAs mimiccontrol)。
处理浓度：50nmol microRNA mimic每孔，0.2μl Lipofectamine2000每孔，检测时间72h。
处理方式：将miR145-5p mimic、miR125b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7amimic、四种microRNA mimics单独组合或两两一组分别共转染T47D细胞，对照组用Negative control mimic等处理，检测处理72h后对T47D细胞的增殖的抑制率{抑制率＝(1-实验组OD/对照组OD)×100％}。
图1-A(数据如表1所示)结果显示四种microRNAs单独作用T47D细胞抑制率。
图1-B(数据如表2所示)显示miR145-5p mimic和miR16-5p mimic共转染组的抑制率较预期高出最多，说明miR145-5p mimic和miR16-5p mimic具有最佳协同作用。(抑制率预期为对应的两种microRNA mimic单独药物处理的抑制率之和)
表1
表2
实施例2：MicroRNAs真核表达载体的构建
准备材料：限制性内切酶BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ；常规PCR体系；Annealing Buffer；大肠杆菌扩增体系；T4连接酶，连接缓冲液；凝胶电泳和成像系统；本发明使用的pEGFPC3载体(Clontech公司，美国)是非病毒性哺乳动物细胞表达载体，启动子是CMV，载体大小4727bp，载体标签：N-EGFP，载体抗性：卡那霉素，载体筛选标记：新霉素。多克隆位点(MCS)是1328-1413bp。原始载体如图2-A所示。
本发明构建的所有载体，选择插入目的片段的酶切位点为多克隆位点(MCS)区的BglⅡ和EcoRⅠ(原始载体1335bp和1360bp之间)；按图2-B所示将各个片段依次插入载体。pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16或pEGFPC3-miRNC等载体的构建按图2-B所示将各个片段依次插入pEGFPC3。各插入片段由深圳华大基因科技服务有限公司合成：
miR145-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
miR16-5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
miR155-5p的反义链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6bp间隔microRNAs的核酸序列，为限制性内切酶连接形成的序列。其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
短的polyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
miRNC(无意链序列，即序列不靶向任何一个基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
所有合成序列5’端加入BglⅡ，3’端BglⅡ和EcoRⅠ。
所有合成序列都是同时合成两条互补核苷酸双链。
具体载体构建实验步骤：
如图2-B所示，各个表达载体在EGFPC3质粒上的MCS区，从5‘端(BglⅡ)到3’端(EcoRⅠ)插入的外源核苷酸序列次序如下：
pEGFPC3-miR145依次插入的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:1+SEQ IDNO:3+SEQ ID NO:5；
pEGFPC3-miR16依次插入的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:2+SEQ IDNO:3+SEQ ID NO:5；
pEGFPC3-miRNC依次插入的核苷酸序列为：SEQ ID NO:3+：SEQ ID NO:6+：SEQ IDNO:3+SEQ ID NO:5；
pEGFPC3-miR145/16依次插入核苷酸的序列为：SEQ ID NO:3+：SEQ ID NO:1+：SEQID NO:3+：SEQ ID NO:2+：SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:5；
pEGFPC3-miR16/145依次插入核苷酸的序列为：SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:2+SEQID NO:3+SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:5。
所有表达载体每次插入一段新的核苷酸序列的实验方法步骤均如下面S1到S6所述。
S1、取1μg需要插入核苷酸序列的载体双酶切过夜：
S2、试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit CodeNo.9762)回收酶切产物，随后使用30μl灭菌水溶解吸附柱上的产物。
S3、按照前面说明的核苷酸序列插入顺序，将本次需要插入的核苷酸序列的两条合成的互补链退火形成双链：
S5、转化、涂板：取S4产物5μl，Top10感受态100μl，按照Top10产品说明书转化感受态细胞，转化完成后加入700μl LB于37℃摇床震荡45min，取20μl涂布于培养皿，放37℃生化培养箱过夜。
S6、鉴定：取S5培养皿，挑取3个克隆，送测序，测序结果显示载体构建成功，将质粒和菌液保种。
S7、按照图2所示的连接顺序，按照S1到S6的操作顺序，依次将合成序列插入pEGFPC3载体中，构建pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145，pEGFPC3-miR16和pEGFPC3-miRNC。
S8、将S6鉴定正确的5个目的质粒(如图2-C所示，pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16或pEGFPC3-miRNC)扩大培养，用去内毒素试剂盒(PureLinkTM HiPure Plasmid DNA Purification Kits)纯化质粒，将纯化好的质粒浓度调整为1μg/μl。
实施例3：MTT增殖实验检测构建的载体对T47D细胞的增殖抑制。
T47D细胞使用PRIM1640培养基加5％FBS培养，放在细胞培养箱生长。传代时将细胞稀释成50000个/ml，在96孔板中每个孔加入100μl；处理浓度：100ng表达载体每孔，0.2μlLipofectamine2000每孔；检测时间：0h、24h、48h、72h、96h。
实验结果如图3(数据如表3所示)所示：pEGFPC3-miR145表达载体的抑制细胞增殖的效果低于pEGFPC3-miR16表达载体。pEGFPC3-miR145/miR16表达载体的抑制率在72h的时候具有显著效应。因此，pEGFPC3-miR145/miR16可以有效的抑制T47D乳腺癌细胞系的增殖。
表3
实施例4：实时荧光定量PCR检测构建的质粒表达目的片段的效率。
T47D细胞培养条件：使用RPMI1640培养基加5％FBS，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养；细胞传代时种入6孔板，每孔10000个细胞，用1％FBS饥饿处理1天，分别转染各组microRNAs表达载体或microRNA mimics，继续培养24h，用small RNA提取试剂盒提取总RNA。
实时荧光定量PCR(Applied Biosystems)：反转录总RNA用量0.1μg，染料采用SYBRGreen(FastStart Universal SYBR Green Master,Rox)。具体步骤如下：S1、95℃15min解开双链；S2、95℃15s变性；S3、60℃25sec退火加延伸；S4、重复S2到S3共40个循环，伴随解链数量分析。
MicroRNAs反转录与实时荧光定量引物根据文献给出的设计方法设计，核苷酸序列如下：
miR145-5p反转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGATTC(SEQ ID NO:7)
miR16-5p反转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAATA(SEQ ID NO:8)
miRNC反转录引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTGTGCC(SEQ ID NO:9)
miR145-5p定量引物Forward：GTCCAGCTGGTCCAGTTTTCCCAGGA(SEQ ID NO:10)
miR16-5p定量引物Forward：GCGGCGGTAGCAGCACGTAAATAT(SEQ ID NO:11)
miRNC定量引物Forward：GATCC AATTACGATTAGCACTATCCCCAAGATCTG(SEQ ID NO:12)
MicroRNA定量反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGTATTC(SEQ ID NO:13)
如图4-A(数据如表4所示)所示，检测转染表达载体后细胞内的目的microRNAs含量，其中：miR145-5p和miR16-5p含量都升高，miR145-5p含量最高；从pEGFPC3-miR145/16和pEGFPC3-miR16/145两个目的microRNAs位置互换的质粒中两个microRNAs分子的表达量来看，不同插入位置对目的microRNAs的表达无影响(p>0.5)；加入miR155-5p的抑制剂，消减了内源性miR155后，目的片段的表达大幅降低。
表4
药物处理 miR-145-5p相对丰度±标准差 miR-16-5p相对丰度±标准差
Blank 1.00±0.34 1.00±0.23
EGFPC3 0.03±0.02 1.28±1.06
pEGFPC3-miR145 777.5±197.82 0±0
pEGFPC3-miR16 0.23±0.10 2.95±0.82
pEGFPC3-miR145/16 733.24±239.32 2.36±0.54
pEGFPC3-miR16/145 1016.13±50.81 4.33±1.3
pEGFPC3-miR145/16+miR-155Inhibitor 101.59±32.45 0.94±0.5
pEGFPC3-miR145/16+NC mimic 647.28±27.36 3.81±1.47
miR-145-5p mimic 301.39±42.23 0±0
miR-16-5p mimic 0±0 1.94±0.54
miR-145-5p mimic+miR-16-5p mimic 322.61±149.96 2.76±0.81
图4-B(数据如图5所示)：miRNC含量的实时荧光定量PCR检测，实验方法如实施例4中提到。定量结果显示加入一个22bp左右不靶向任何基因的miRNC短片段后，在miR155-5p高表达的细胞中都有约460倍的表达效率。
表5
以上实验结果显示，本载体的构建方式可以使插入的microRNAs不受位置影响高效表达目的microRNAs；在miR155-5p低表达的细胞中(正常细胞中)，本载体的表达效率很低。miR16-5p的实时荧光定量PCR检测出含量很少并不是质粒表达少，而是表达出的产物与细胞内的靶基因结合后被大量降解。
实施例5：实时荧光定量PCR检测转染质粒后4个预测靶基因的表达。
细胞培养、种板、加药、收集、反转录以及定量的操作参照实施例4。实时荧光定量PCR检测结果如图5(数据如表6所示)显示，转染构建的各种microRNAs表达质粒后，mRNA水平上对Cyclin D1(周期蛋白D1)、C-myc(v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物)、Erk1/2(细胞外信号调节激酶)基因都有抑制作用，但是单独转染pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16，或单独转染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic都促进BCL2(B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2)基因的mRNA的表达，然而在共转染miR145-5p和miR16-5p的mimic或pEGFPC3-miR145/16后，BCL2也被明显敲降，说明BCL2有可能是Cyclin D1、C-myc、Erk1/2等基因的补偿信号通路(backdoor)上的基因，而当miR145和miR16两个microRNAs分子同时作用时，BCL2这条补偿的信号通路也被抑制。结果说明，miR145-5p和miR16-5p可以协同抑制乳腺癌T47D细胞系的BCL2基因的表达，从而抑制了T47D细胞的增殖。
表6
实施例6：Western blot检测预测靶基因的表达
T47D细胞使用PRIM1640培养基加5％FBS培养，置于细胞培养箱生长。传代时将细胞稀释成50000个/ml，在6孔板中每个孔加入1000μl；处理浓度：1000ng表达载体每孔，2μlLipofectamine2000每孔。加药处理48h后提取细胞总蛋白(全蛋白提取试剂盒KGP2100，凯基生物)。然后用BCA法定量蛋白浓度，取50μg蛋白上样SDS-PAGE电泳。
实验结果如图6-A，(数据如表7所示)，图6-B显示，转染构建的各种microRNAs表达质粒后，单独转染pEGFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16对Cyclin D1、C-myc、Erk1/2、BCL2蛋白都没有明显抑制作用，但是在转染pEGFPC3-miR145/16后，Cyclin D1、C-myc、BCL2蛋白都被敲降，以BCL2蛋白最为明显，说明pEGFPC3-miR145/16联合表达载体能够同时表达两个microRNAs，而当miR145和miR16两个microRNAs分子同时作用时，BCL2这个靶分子受到最明显抑制，另外三个预测靶分子的表达也受到抑制。结果说明，miR145-5p和miR16-5p可以协同抑制乳腺癌T47D细胞系的BCL2等靶分子的表达，从而抑制了T47D细胞的增殖。
表7

Claims (3)

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括编码microRNAs的核酸分子，编码miR155-5p的反义链核酸序列，编码间隔microRNAs的核酸序列，编码减少通读现象的核酸序列，并且编码microRNAs的核酸分子两边都是miR155-5p反义链，编码microRNAs的核酸分子与miR155-5p反义链之间由6bp间隔序列连接，所述编码microRNAs的核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p；其中所述重组载体使得所述编码microRNAs的核酸分子能够共顺反子地表达。
2.一种真核联合表达载体pEGFPC3-miR145/16，其特征在于，所述载体同时表达两个成熟的microRNAs核酸分子：miR145-5p和miR16-5p，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1 和SEQID NO:2所示，编码microRNAs的核酸分子两边都是miR155-5p反义链，编码microRNAs的核酸分子与miR155-5p反义链之间由6bp间隔序列连接，所述miR155-5p的反义链其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，6bp间隔序列其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.权利要求2的重组载体在制备乳腺癌药物方面应用。
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