CN108192895B - 靶向NOB1基因的siRNA分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向NOB1基因的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：正义链是5’‑CCUACGAGCUGCGGUUCAANn‑3’，反义链是5’‑UUGAACCGCAGCUCGUAGGNn‑3’。其中，正义链和反义链中的N相同或者不同，并且各自独立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0、1或2。本发明的siRNA分子可用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。

Description

靶向NOB1基因的siRNA分子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于靶向NOB1基因的siRNA分子及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常见的类型，大约85-90％的肺癌属于NSCLC。由于早期诊断困难和缺乏有效的治疗手段，NSCLC在全世界范围内被认为是因癌症导致死亡的主要病因，据报道只有不到15％的NSCLC患者生存时间在5年以上。所以，寻找NSCLC早期诊断的生物学标记和发现新的分子治疗靶点成为攻克这一致命性疾病的首要任务，也是肺癌分子病理机制研究的热点。

NOB1(Nin one binding)基因是新发现的一个与细胞周期及转录调节有密切关系的基因，2005年，Zhang等人(Mol Biol Rep.2005,32(3):185-189)克隆得到了酵母Nob1p(Nin one binding protein)基因的人类同源基因NIN1/RPN12binding protein 1homolog(S.cerevisiae)，简称NOB1。NOB1定位于人染色体16q22.1，包含9个外显子和8个内含子，cDNA全长1749碱基对(base pair，bp)。NOB1基因编码412个氨基酸序列的、分子量为46675Da的RNA结合蛋白，该蛋白的氨基端含一个RNase活性的PIN(PilT amino terminus)结构域，羧基端含一个锌指结构域，PIN结构域和转录相关，而锌指结构域在细胞周期调节中起重要作用。NOB1能促进20S Pre-rRNA向成熟的18S rRNA转变，在核糖体装配过程中发挥重要作用(Nat Struct Mol Biol.2012,19(8):744-53；Nucleic Acids Res,2012；40(7):3259-3274)。近年来研究表明NOB1的表达水平在人的多种肿瘤细胞中高表达，如乳腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌等。我们前期的研究发现NOB1的mRNA和蛋白水平在非小细胞肺癌(NSCLC)组织和细胞系中明显上调，并与TNM分期、淋巴结转移和组织病理分级明显相关(Int J Biol Markers.2015,30(1):e43-48；Pathol Oncol Res,2014；20(2):461-466)。研究结果提示，NOB1可以作为潜在的NSCLC诊断生物学标记以及分子治疗靶点。

近几年，RNA干扰(RNA interfering，RNAi)作为一个新的基因治疗技术，其在抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等医药领域应用前景广阔，得到了迅速发展，部分RNA药物已进入临床试验阶段，为疑难杂症尤其是多因素的疾病如癌症、病毒感染开辟了全新的治疗途径。2016年12月23日，美国食品和药物管理局FDA批准了首个用于治疗脊髓性肌萎缩的RNA药物Spinraza(Nusinersen)的上市申请，标志着RNA药物正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。RNAi是一种转录后的基因沉默效应，是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA，称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)识别有同源序列的mRNA，对其特异性切割，从而阻断其翻译的过程，最终抑制转录该mRNA的基因的表达(Nature.1998,391:806-811)。RNAi药物现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。

发明内容

为了得到能有效治疗肿瘤比如非小细胞肺癌的RNA药物，发明人以NOB1基因为靶点，设计并筛选出数百种siRNA分子，发现其中一些能够特异性地抑制NOB1表达，其中有两组siRNA分子能有效地抑制NOB1基因。因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于靶向NOB1基因的siRNA分子，其由如下序列的正义链和反义链组成：

正义链：5’-GGAACAAGACCCUGAAGAANn-3’(SEQ ID NO:1)，

反义链：5’-UUCUUCAGGGUCUUGUUCCNn-3’(SEQ ID NO:2)，

其中，正义链和反义链中的N相同或者不同，并且各自独立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0、1或2。

在一种实施方式中，所述n为0，即

正义链：5’-GGAACAAGACCCUGAAGAA-3’(SEQ ID NO:3)，

反义链：5’-UUCUUCAGGGUCUUGUUCC-3’(SEQ ID NO:4)。

该siRNA分子是该组siRNA分子的主干序列。

在另一种优选的实施方式中，所述N为dT，n为2，即

正义链：5’-GGAACAAGACCCUGAAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:5)，

反义链：5’-UUCUUCAGGGUCUUGUUCCdTdT-3’(SEQ ID NO:6)。

作为另一组靶向NOB1基因的siRNA分子，本发明提供了另一种用于抑制NOB1基因的siRNA分子，其由如下序列的正义链和反义链组成：

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAANn-3’(SEQ ID NO:7)，

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGGNn-3’(SEQ ID NO:8)，

其中，正义链和反义链中的N相同或者不同，并且各自独立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0、1或2。

在一种实施方式中，所述n为0，即

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAA-3’(SEQ ID NO:9)，

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGG-3’(SEQ ID NO:10)。

该siRNA分子是该组siRNA分子的主干序列。

在另一种优选的实施方式中，所述N为dT，n为2，即

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAAdTdT-3’(SEQ ID NO:11)，

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGGdTdT-3’(SEQ ID NO:12)。

本发明的第二个目的在于提供上述siRNA分子在制备用于抑制NOB1表达的药物中的用途。

可选地，上述药物是抗肿瘤药物。

优选地，所述药物是治疗非小细胞肺癌药物。

其中siRNA分子可以作为有效成分用于抑制肺癌细胞的生长、转移，或者促进肺癌细胞的凋亡。

在一种优选的实施方式中，上述药物是适用于注射的剂型或凝胶剂。

优选地，上述药物还包含必要的佐剂。

体外实验证明，本发明提供的siRNA分子可特异性地下调NOB1基因表达，达到抑制非小细胞肺癌细胞生长、转移以及促进癌细胞凋亡的技术效果。

附图说明

图1是本发明的siRNA抑制A549肺癌细胞中NOB1靶基因mRNA表达水平的柱状图。与阴性对照组NC相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4均抑制了NOB1基因的mRNA表达水平，而siRNA2和siRNA4的抑制性尤其显著，其中*P<0.05。

图2是本发明的siRNA抑制H1299肺癌细胞中NOB1靶基因mRNA表达水平的柱状图。与阴性对照组NC相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4均抑制了NOB1基因的mRNA表达水平，而siRNA2和siRNA4的抑制性尤其显著，其中*P<0.05。

图3是本发明的siRNA抑制A549肺癌细胞中NOB1靶基因蛋白质表达水平的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了NOB1蛋白质表达水平。

图4是本发明的siRNA抑制H1299肺癌细胞中NOB蛋白质表达水平的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了NOB1蛋白质表达水平。

图5是本发明的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的生长曲线图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4在48h、72h和96h显著抑制了细胞的生长。

图6是本发明的siRNA抑制H1299肺癌细胞增殖的生长曲线图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4在48h、72h和96h显著抑制了细胞的生长。

图7是本发明的siRNA抑制A549肺癌细胞迁移的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了细胞的迁移，其中*P<0.05。

图8是本发明的siRNA抑制H1299肺癌细胞迁移的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了细胞的迁移，其中*P<0.05。

图9是本发明的siRNA抑制A549肺癌细胞侵袭的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了细胞的侵袭，其中*P<0.05。

图10是本发明的siRNA抑制H1299肺癌细胞侵袭的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著抑制了细胞的侵袭，其中*P<0.05。

图11是本发明的siRNA促进A549肺癌细胞凋亡的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著促进了细胞的凋亡，其中*P<0.05。

图12是本发明的siRNA促进H1299肺癌细胞凋亡的结果图。与阴性对照组NC相比，siRNA2和siRNA4显著促进了细胞的凋亡，其中*P<0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本发明人发现了一些siRNA分子可以特异性靶向NOB1基因，阻断NOB1基因的mRNA转录，阻止基因的翻译，从而根本上抑制NOB1的表达，最终达到抑制肿瘤的目的。

通过对这些siRNA分子进行研究，发现有两组siRNA分子对于NOB1基因的抑制性特别突出，一组是由正义链SEQ ID NO:1和反义链SEQ ID NO:2组成的双链siRNA分子；另一组是由正义链SEQ ID NO:7和反义链SEQ ID NO:8组成的双链siRNA分子。

在实施例中具体列举了几种可以靶向NOB1基因的siRNA分子，分别编号为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4。它们都具有抑制NOB1基因的活性。其中由正义链SEQ ID NO:5和反义链SEQ ID NO:6组成的双链siRNA分子抑制NOB1表达的效果突出，在实施例中编号为“siRNA2”；由正义链SEQ ID NO:11和反义链SEQ ID NO:12组成的双链siRNA分子抑制NOB1表达的效果也很突出，在实施例中编号为“siRNA4”。

在本文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”、“siRNA分子”、“双链siRNA”、或“双链siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。

siRNA分子的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。

本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持RNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。该药物也可以是凝胶剂。

任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持RNA分子的活性。

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。

实施例

本文中的siRNA和PCR引物由百奥迈科生物技术有限公司合成。

实施例1合成siRNA分子并转染细胞A549和H1299

1.细胞培养

人肺癌细胞株A549和H1299(南通大学附属医院保藏)在含10％FBS的DMEM/F12培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)中，于37℃、5％CO₂培养箱(美国ThermoFisher Scientific公司)中培养。

2.设计并合成siRNA分子

设计并合成靶向NOB1基因的siRNA序列，见表1，所有siRNA均具有正义链和反义链。分别将正义链和对应的反义链退火成siRNA双链，转染前配置成浓度为20μM。

表1.靶向NOB1基因的siRNA序列

另外，设计并合成了与人基因不同源的siRNA作为阴性对照的NC siRNA(Negetivecontrol siRNA)，其序列为：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO:17)；

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO:18)。

3.用siRNA转染细胞

细胞铺板并转染：将步骤1所得细胞按1×10⁵个/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗生素、含10％FBS的DMEM/F12培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。用细胞转染试剂2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)，按其说明书进行siRNA转染。

4.细胞RNA的提取

细胞转染48h后，收集细胞，用RNA提取试剂Trizol(美国Thermo公司)提取RNA，按其说明书进行RNA提取，所得RNA沉淀用50μL无RNase水溶解，并取2μL进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，提纯的细胞总RNA的纯度和完整性较好，符合实验要求。

5.实时定量PCR

用基因特异性引物检测样本中NOB1基因mRNA的表达水平，同时扩增看家基因β-actin作为内参对照。每个样本同时扩增NOB1基因和内参基因β-actin，每个反应做3个平行。用2×Master Mix(美国Thermo公司)进行定量反应，建立如下反应体系：2μL RNA模板，12.5μL的2×Master Mix，上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各0.5μL，0.5μL的50×SYBRGreen Solution，用无RNase的水补足体系至25μL。混合均匀后，置实时定量PCR检测系统反应。

检测NOB1基因的实时定量PCR引物：

上游引物为：5’-TGAGGAGGAGGAGGAGGAAG-3’(SEQ ID NO:19)；

下游引物为：5’-TGCTGGATCTGCTTGATGTTAC-3’(SEQ ID NO:20)。

检测看家基因β-actin的实时定量PCR引物：

上游引物为：5’-CCACACCTTCTACAATGAG-3’(SEQ ID NO:21)；

下游引物为：5’-ATAGCACAGCCTGGATAG-3’(SEQ ID NO:22)。

反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性5min，95℃变性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次。并做溶解曲线反应：95℃/5min，58℃/5min，以0.5℃/5sec升温至95℃。

用2^-ΔΔCt法分析实验结果，并作柱状图，如图1和2所示，与阴性对照NC相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4均抑制了NOB1基因的mRNA表达水平，而siRNA2和siRNA4的抑制性尤其显著。比如，在A549细胞中siRNA2和siRNA4抑制NOB1的mRNA水平分别达到76％和78％，在H1299细胞中siRNA2和siRNA4抑制NOB1的mRNA水平分别达到73％和69％，均显著抑制了其mRNA表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)。

实施例2 Western blot检测蛋白表达水平

将细胞按1×10⁶个/孔铺到6孔板中，24h后生长至70-80％的汇合度，按实施例1的方法进行细胞转染。处理48h后，用预冷的1×SDS buffer(50mM Tris-HCl,pH7.6；1％SDS；150mM NaCl；0.5％Triton-X 100；5mM EDTA；5％β-mercaptoethanol(BME)；1mM PMSF)蛋白裂解液裂解细胞，置于4℃中，10,000rpm离心20min，取上清稀释后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(美国Millipore公司)，并用5％脱脂牛奶室温进行封闭2h，然后用兔抗人NOB1单克隆抗体(美国Abcam公司，1:200稀释)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Abcam公司，1:200稀释)作为内参。TBST洗涤后，再用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育(NOB1用羊抗兔IgG-HRP，1:1000稀释；β-actin用羊抗鼠IgG-HRP，1:2000稀释)，用TBST洗涤3次(5min/次)。用BeyoECL Plus试剂盒(碧云天公司)检测。

如图3和4所示，与阴性对照NC相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4均抑制了NOB1蛋白质表达水平，而siRNA2和siRNA4的抑制性尤其显著。比如，在A549细胞中siRNA2和siRNA4抑制NOB1蛋白质的水平分别达到77％和73％，在H1299细胞中siRNA2和siRNA4抑制NOB1蛋白质的水平分别达到70％和68％，均差异均有统计学意义(P<0.05)。

由于siRNA2和siRNA4对于NOB1基因的抑制性突出，下述实验将它们作为重点研究对象。

实施例3细胞增殖检测

按实施例1的方法进行细胞培养和siRNA转染。

转染前待细胞汇合度达到60-80％时，将对数生长期的细胞铺到96孔细胞培养板中，重复3个孔，作为未转染的样本(即转染0h的样本)。

分别取转染24h、48h、72h和96h后的各实验组的细胞进行CCK8细胞增殖测定，所述测定方法为：将混合的100μL DMEM(美国Thermo公司)和10μL CCK8(Cell Counting Kit-8，日本Dojingo公司)加入到每个孔中，培养箱孵育4h，在波长490nm处用酶标仪(Bio-Rad公司)测定OD值，制作生长曲线。

如图5和6所示，与阴性对照NC相比，在A549和H1299细胞中siRNA2和siRNA4均显著抑制了细胞的增殖。

实施例4细胞迁移检测

将肺癌细胞A549和H1299分别铺到24孔细胞培养板中，24h后按实施例1的方法进行处理，48h后用DMEM培养进行重悬，调整浓度至1×10⁶个细胞/mL。Transwell板(美国Corning公司)内室用DMEM培养基预孵育1h，上室和下室用8μm的聚碳酸酯膜隔开。100μL的细胞重悬液与600μL含10％PBS的DMEM培养基或者条件培养基(上述48h处理的细胞培养基上清)加到每个上室中。24h后，留在上室中的细胞用棉签去除，迁移到下室中的细胞用10％甲醛固定30s。最后，细胞用0.5％结晶紫染色4min，随后用PBS缓冲液洗3遍。细胞在200倍放大视野中计数，每个条件下计数5个视野。算出迁移细胞数，制作柱形图。

如图7和8所示，与阴性对照NC相比，在A549和H1299细胞中siRNA2和siRNA4均显著抑制了细胞的迁移，差异均有统计学意义(P<0.05)。

实施例5细胞侵袭检测

将肺癌细胞A549和H1299分别铺到24孔细胞培养板中，24h后按实施例1的方法进行处理，48h后用DMEM培养进行重悬，调整浓度至1×10⁶个细胞/mL。Transwell板(美国Corning公司)内室用DMEM培养基预孵育1h，上室和下室用包被有50μL的Matirgel(0.5mg/mL，美国BD公司)的8μm的聚碳酸酯膜隔开。将100μL的细胞重悬液与600μL含10％PBS的DMEM培养基或者条件培养基(上述48h处理的细胞培养基上清)加到每个上室中。24h后，留在上室中的细胞用棉签去除，迁移到下室中的细胞用10％甲醛固定30s。最后，细胞用0.5％结晶紫染色4min，随后用PBS缓冲液洗3遍。细胞在200倍放大视野中计数，每个条件下计数5个视野。算出侵袭细胞数，制作柱形图。

如图9和10所示，与阴性对照NC相比，在A549和H1299细胞中siRNA2和siRNA4均显著抑制了细胞的侵袭，差异均有统计学意义(P<0.05)。

实施例6细胞凋亡检测

按实施例1的方法进行细胞培养和siRNA转染。

用Annexin V-FITC凋亡测定试剂盒(美国Sigam-Aldrich公司)进行Annexin-V/propidium iodide(PI)双重分析。肺癌细胞A549和H1299转染48h后，用0.25％胰酶消化和PBS缓冲液洗两遍。1×10⁵个细胞用500μL结合缓冲液重悬，并按操作说明用5μL FITC标记的Annexin-V染色，加5μL PI并室温避光孵育15min。不同实验组细胞用BD FACS Calibur(美国BD公司)进行流式细胞测试分析，计算细胞凋亡率，制作柱形图。

如图11和12所示，与阴性对照NC相比，在A549和H1299细胞中siRNA2和siRNA4均显著促进了细胞的凋亡，差异均有统计学意义(P<0.05)。

由上述实验可见，靶向NOB1的siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4均表现出抑制NOB1表达的活性，其中siRNA2和siRNA4对于NOB1基因的抑制性尤其突出；siRNA2和siRNA4分子可以抑制A549和H1299细胞的增殖、迁移、侵袭，并显著促进A549细胞和H1299细胞的凋亡，因而具有应用于抗肿瘤、尤其是非小细胞肺癌治疗的潜力。

序列表

<110> 南通大学附属医院

<120> 靶向NOB1基因的siRNA分子及其应用

<130> SHPI1711630

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggaacaagac ccugaagaan 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

uucuucaggg ucuuguuccn 20

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggaacaagac ccugaagaa 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 4

uucuucaggg ucuuguucc 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggaacaagac ccugaagaad d 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 6

uucuucaggg ucuuguuccd d 21

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ccuacgagcu gcgguucaan 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 8

uugaaccgca gcucguaggn 20

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ccuacgagcu gcgguucaa 19

<210> 10

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 10

uugaaccgca gcucguagg 19

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ccuacgagcu gcgguucaad d 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 12

uugaaccgca gcucguaggd d 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 13

gaaagaaguu ugugaagaad d 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 14

uucuucacaa acuucuuucd d 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 15

caagaaccac agaagguuad d 21

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 16

uaaccuucug ugguucuugd d 21

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 17

uucuccgaac gugucacgud d 21

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 18

acgugacacg uucggagaad d 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

tgaggaggag gaggaggaag 20

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tgctggatct gcttgatgtt ac 22

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ccacaccttc tacaatgag 19

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

atagcacagc ctggatag 18

Claims (7)

1.一种靶向NOB1基因的siRNA分子，由如下序列的正义链和反义链组成：

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAANn-3’（SEQ ID NO: 7），

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGGNn-3’（SEQ ID NO: 8），

其中，正义链和反义链中的N相同或者不同，并且各自独立地是胞嘧啶C、尿嘧啶U、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n代表N的个数，n是0、1或2。

2.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述n为0，即

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAA-3’（SEQ ID NO: 9），

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGG-3’（SEQ ID NO: 10）。

3.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，n为2，即

正义链：5’-CCUACGAGCUGCGGUUCAAdTdT-3’（SEQ ID NO: 11），

反义链：5’-UUGAACCGCAGCUCGUAGGdTdT-3’（SEQ ID NO: 12）。

4.如权利要求1所述的siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是治疗非小细胞肺癌药物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述治疗非小细胞肺癌药物用于抑制肺癌细胞的生长、转移，或者促进肺癌细胞的凋亡。

7.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物是注射剂型或凝胶剂。