KR101299733B1

KR101299733B1 - ｍｉＲＮＡ의 발현 억제를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 방법

Info

Publication number: KR101299733B1
Application number: KR1020110029908A
Authority: KR
Inventors: 강경선
Original assignee: 주식회사 강스템홀딩스
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-31
Publication date: 2013-08-28
Also published as: WO2011122889A3; WO2011122889A2; KR20110110058A

Abstract

본 발명은 성체줄기세포의 노화 억제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 성체줄기세포에서 발현하는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 발현을 특이적인 억제제를 이용하여 발현을 억제시킴으로써, high mobility group A2(HMGA2)의 발현을 증가시키고, p16 또는 p21의 발현을 감소시켜 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 성체줄기세포의 노화 억제 방법은 성체줄기세포 배양시 계대배양을 시행할수록 세포의 노화가 빠른 속도로 진행되어 세포 분열이 급격히 감소하는 문제점을 해결할 수 있다. 이로써 분화능과 세포 재생 능력을 그대로 유지한 성체줄기세포를 오래 유지할 수 있어 세포 치료제 혹은 연구용으로 사용할 수 있는 세포를 더욱 많이 확보할 수 있다.

Description

ｍｉＲＮＡ의 발현 억제를 이용한 성체줄기세포의 노화 억제 방법 {Method for Inhibiting Senescence of Adult Stem Cells Using Inhibition of miRNA Expression}

본 발명은 성체줄기세포의 노화 억제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 성체줄기세포에서 발현하는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 miRNA를 특이적인 억제제와 히스톤 modification을 이용하여 발현을 억제함으로써, 성체줄기세포의 HMGA2(high mobility group A2) 발현을 증가시키고, p16 또는 p21 발현을 감소시켜 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법 및 성체줄기세포의 증식 방법에 관한 것이다.

마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 염기서열이 22개 이내의 암호화되지 않은(non-cording) RNA로서, 타켓 mRNA를 분해하거나 타켓 mRNA의 전사(translation)를 억제하여 유전자 발현을 조절한다. 이것의 유전자 발현 조절은 세포 분화와 세포 증식과 관련되어 있으며, 특히, 배아 발생 과정 중에 miRNA는 포착하기 어려운 시점에 발현하게 되는데, 이는 각 배아 발달 단계에 중요한 기능을 한다. 하지만 miRNA의 미분화를 조절하는 중요한 기능은 계속 발견되고 있음에도 불구하고, miRNA의 발현을 조절하는 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않고 있다. 최근 사람의 암세포에서 항암의 기능을 하는 miRNA의 후생성 발현 가능성이 제시되고 있으며, miRNA cluster의 후생성 조절에 대한 다양한 증거들이 보고되고 있다. 상세하게는 다양한 DNA 부위를 암호화하고 있는 항암 기능을 하는 miRNA는 사람의 유방암 세포주에서 비정상적인 과메틸레이션(hypermethylation)되어있어 유전자가 활성화되지 않고 있으며, AGS 위암 세포주에서 DNMT(DNA methylatransferase)인 5-Asa-dC(5-Asa-deoxycytidine)를 처리했을 때, DNA가 demethylation되면서 특정 miRNA cluster의 발현이 복구된다는 연구결과가 제시되고 있다.

중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)는 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래하는 다분화성의 성질을 갖는 줄기 세포이다. 예를 들어, 골수(bonemarrow)로부터 유래된 중간엽 줄기 세포는 지방조직, 뼈/연골 조직, 근육조직으로 분화될 수 있는 다분화성에 의해 세포치료제로서의 개발을 위해 다양한 연구가 진행되고 있다. 한편, 중간엽 줄기 세포는, 다른 인체 초대배양 세포와 유사하게, 체외(in vitro) 배양시 텔로미어 소실(telomere shortening)과 무관한 노화(senescence) 기전에 의해 세포의 분열이 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다(Shibata, K.R. et al . Stem cells , 25; 2371-2382, 2007).

이러한 노화 현상은, 그 기전이 아직 명확히 밝혀진 것은 아니나, 장기간의 체외 배양에 의한 환경적 스트레스의 축적으로 Cdk 저해 단백질인 p16(INK4a)가 발현되고 축적되어, 세포의 성장을 담당하는 Cdk 단백질의 활성이 억제되는 현상이 주요 원인으로 지적되고 있다. 중간엽 줄기세포에서는 Bmi-1이라는 종양유전자를 발현시켜 p16의 발현을 저해하였을 때, 세포의 노화가 억제되는 것이 확인되었으며(Zhang, X. et al. Biochemical and biophysical research communications 351; 853-859, 2006), 또한 배양 중에 FGF-2를 처리하여 p21(Cip1), p53, 및 p16(INK4a)의 mRNA 발현을 억제되었을 때, G1 시기의 성장 정지된 중간엽 줄기 세포가 성장 정지 억제되는 것이 보고된 바 있다(Ito, T. et al ., Biochemical and biophysical research communications , 359; 108-114 2007). 또한 대한민국공개특허 제 10-2009-0108141호에서는 Wip1 단백질을 코딩하는 유전자를 중간엽 줄기세포에 형질전환시켜, 중간엽 줄기세포의 노화를 억제시키는 방법을 제시하였다.

그러나, Bmi-1 자체가 종양을 야기할 수 있는 종양 유전자(oncogene)이기 때문에(Haupt, Y. et al ., Oncogene , 8; 3161-3164, 1993; Bruggeman, S.W. et al . Cancer cell 12; 328-341 2007), Bmi-1와 hTERT(telemorase catalytic subunit)로 처리된 중간엽 줄기 세포를 세포치료제로 적용할 경우, 종양 형성의 가능성을 배제할 수 없다. 또한, 배양 중에 FGF-2를 처리하는 방법은 상대적으로 고가인 FGF-2를 배양시 지속적으로 사용하여야 하므로 비용이 상승할 뿐만 아니라, FGF-2로 인해 노화가 억제되기보다는 일시적인 세포성장 증대의 효과가 기대되므로, 노화를 억제하는 데에 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 성체줄기세포 배양시 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 억제시킬 경우, 세포 노화가 억제 및 증식되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a의 발현 억제를 통한 성체줄기세포의 노화 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a의 발현 억제제를 포함하는 성체줄기세포의 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 노화 억제용 조성물을 포함하는 성체줄기세포의 노화 억제용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 HMGA2(high mobility group A2)의 발현을 조절을 통한 성체줄기세포의 노화 조절 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a의 발현 억제를 통한 성체줄기세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a의 발현 억제제를 포함하는 성체줄기세포 증식용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 증식용 조성물을 포함하는 성체줄기세포 증식용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 성체줄기세포 배양 시 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 성체줄기세포의 노화 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

miRNA -23a, miRNA -26a 및 miRNA-30a의 염기서열

Gene	서열번호	Sequence
miRNA-23a	서열번호 1	5'- AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC -3'
miRNA-26a	서열번호 2	5'- UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU -3'
miRNA-30a	서열번호 3	5'- UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG -3'

miRNA-23a는 retinoic-acid로 유도되어 신경세포로 분화된 NT2 세포에서 transcriptional repressor로 알려진 Hes1의 발현을 조절한다고 보고되었다. miRNA-26a는 간암을 억제하는데 효과적으로 작용하는 것이 알려져 있으며, miRNA-26a의 발현이 감소된 경우에 다양한 암 관련 유전자의 발현이 증가하는 것으로 확인되었다. miRNA-30a는 갑상선 악성 종양세포에서 정상적인 갑상선 세포에서보다 발현이 감소하는 것이 관찰되었다. 하지만 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 세포에서 구체적으로 어떠한 기능을 하고 있는지 아직까지 알려져 있지 않고 있다. miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 성체줄기세포의 노화 억제 및 증식에 이용될 수 있다는 것은 본 발명자들에 의해 최초로 규명되었다. 본 발명의 일 실시예에서는 HDAC 억제제를 이용하여 인위적으로 노화된 성체줄기세포를 만들고 노화된 세포에서 miRNA의 발현 변화를 microarray를 이용하여 관찰하였으며, 그 결과 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 노화된 성체줄기세포에서 발현이 증가하는 것을 관찰하였다. 이것으로 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 세포 노화를 조절하는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 본 발명의 다른 실시예에서 대표적으로 miRNA-23a을 선택하여 성체줄기세포에서의 발현을 억제시켰을 때, 세포의 증식에 관여하는 유전자의 발현이 증가하고 노화가 억제되는 것을 확인하였다. 이것으로 미루어보았을 때, 노화된 줄기세포에서 발현이 증가한 miRNA-26a와 miRNA-30a도 노화된 성체줄기세포에서 발현을 억제시켰을 경우, miRNA-23a를 억제시켰을 때와 동일한 노화억제현상을 기대할 수 있다. 또한 본 발명자들은 세포의 노화에 있어서, miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 HMGA2를 동일하게 조절하는 것을 확인하였으며(도 8), 이와 같은 결과는 본 발명의 miRNA가 동일한 세포 노화 억제 효과가 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 성체줄기세포는 줄기세포 배양용 배지를 사용하여 통상의 방법으로 배양될 수 있다.

상기 배양용 배지는 성체줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로, EMEM (Eagle's minimal essential medium)에 혈청을 함유시켜 얻어진 배지일 수 있다. 상기 혈청으로는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용할 수 있으며, 그 함량은 혈청 배지 총 중량에 대하여 약 10 중량%일 수 있다. 필요에 따라 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마 억제제를 포함할 수 있다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상의 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tyrosine), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 파이루베이트 등의 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 2 mM의 글루타민, 0.5 내지 1 mM의 소디움 파이루베이트, 0.1 내지 10%의 FBS, 1%의 항생제(100 IU/ml), 및 1 - 4.5 g/L의 글루코오스로 보충된 EMEM 일 수 있다. 배양은 90 내지 95%의 습도 및 35 내지 39 ℃의 조건으로 5 내지 10%의 CO₂ 배양기에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라, 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량%가 되도록 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가할 수 있으며, 트립신-EDTA를 처리함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다. 누적집단 배증 시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75 내지 85% 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80% 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 발현 억제는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 특이적인 억제제를 사용하는 것을 특징으로 하며, siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴틀레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 화합물은 항산화제, 세포성장에 영향을 미치는 물질 및 세포신호전달물질 중 miRNA의 발현을 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다. 하지만 이에 한정되지 않으며 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현을 억제하는 물질이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA"는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a에 특이적으로 결합하여 상기 miRNA의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

1990년 미국 콜로라도대의 래리 골드 박사가 임의로 합성한 RNA가 효소처럼 표적분자와 결합할 수 있다는 사실을 밝혀내었고 이러한 기능을 가진 RNA구조체를 앱타머라고 한다. 이러한 엡타머를 생산하는 방식은 세포 안에서 RNA가 합성되는 방식과는 다르게 생성되는데 100조 개가 넘는 RNA를 무작위로 합성하고 암을 유발하는 단백질 등과 같은 표적분자나 바이러스와 섞은 뒤 가장 잘 결합하는 것만을 골라내는 “셀렉스(selex)”기술을 사용한다. 이 과정을 10회 이상 반복하여 표적분자와 가장 잘 결합하는 RNA를 골라내게 되는데 이렇게 골라진 RNA가 앱타머이다. 앱타머는 결합력 (Kd)이 nanomolar 이거나 더 좋은 경우가 많고 specificity가 매우 뛰어나서 유사한 분자와도 결합하지 않는 특이성이 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지는 않으나 antisenseRNA, antagonist mRNA를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA 억제제의 세포 내로의 도입은 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 공동-침전법, 전기 천공법 및 리포좀 이용법 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 발현이 억제됨으로써, HMGA2의 발현이 증가하는 것을 특징으로 한다.

HMGA2(High mobolity group AT-hook 2)는 HMG(high mobolity group) 단백질 패밀리로써, 구조적으로 DNA binding domain을 가지고 있다. 또한 이 단백질은 전사 조절 요소(transcription factor)와 같은 기능을 한다. HMGA2는 다능성(pluripotent)을 가진 배아 줄기세포와 대부분의 암세포에서 강하게 발현되고 일반적인 체세포에서는 관찰되지 않는다. 이러한 것을 토대로 연구가 진행된 결과, HMGA2가 줄기세포의 다능성과 재생 능력 유지를 조절하는 것으로 알려졌다. 또한 다능성을 유지하는 과정에서 p16, p19의 발현이 감소되는 것으로 알려졌다. 이러한 HMGA2는 HDAC(histon deacetylase)에 의해서 발현이 조절되는데, 본 발명에서는 HDAC inhibior를 처리로 세포 노화가 유도된 성체줄기세포에서 HMGA2의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 miRNA-23a 억제제를 성체줄기세포에 처리하였을 때, 세포 재생 능력 유지를 조절하는 HMGA2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 발현이 억제됨으로써, p16과 p21의 발현이 감소하는 것을 특징으로 한다.

p16과 p21은 암 억제제로 알려져 있으며, 특히 cell cycle을 조절하는데 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. p16에 변이가 증가하게 되면 암이 다양하게 발달하게 되는데, 특히 흑색종에서 p16의 변이가 두드러지게 나타난다. p16과 p21은 노화된 조직에서 발현이 증가하게 되는데, 이는 p16과 p21의 발현이 증가하면서 세포의 증식 능력이 억제되기 때문이다. 따라서 줄기세포에서 p16과 p21의 발현이 증가하게 되면 줄기세포의 특징인 다능성이 감소하게되고 세포가 노화되게 된다. 본 발명의 실시예에서는 miRNA-23a 억제제를 성체줄기세포에 처리하였을 때, p16과 p21의 발현이 감소되어 세포 노화가 억제되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 성체줄기세포 유래인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에는 성체줄기세포의 노화를 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 조성물의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현 억제제의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는, 리포좀(미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-Llysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다. miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현 억제제를 복합체 형태로 체내 투여할 경우 유전자의 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 핵산에 비하여 현저히 증가하게 된다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며,국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용한 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 성체줄기세포 노화 억제용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 성체줄기세포의 노화 억제용 조성물을 포함하는 성체줄기세포 노화 억제용 키트를 제공한다.

이와 같은 키트에는 상기에서 설명한 노화 억제용 조성물 이외에 세포 배양에 필요한 배지, 사용방법을 설명한 설명서 등을 추가로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 HMGA2의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 성체줄기세포의 노화 조절방법을 제공한다.

HMGA2은 본 발명의 다른 실시예에서 나타는 바와 같이, 성체줄기세포의 노화가 진행할수록 발현이 점차 줄어드는 것을 확인하였고, 또한 노화된 줄기세포에 노화 억제제를 투여하였을 경우, HMGA2의 발현이 증가하고 노화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 HMGA2가 노화를 억제하는 것으로 예측할 수 있으며, 이로써, HMGA2의 발현을 조절함으로써, 성체줄기세포의 노화를 조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 HMGA2의 발현 조절은 HMGA2의 발현조절제를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 HMGA2의 발현조절제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 하지만 이에 한정되지 않으며, HMGA2의 발현을 증가시키는 물질이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

상기 화합물은 항산화제, 세포성장에 영향을 미치는 물질 및 세포신호전달물질 중 miRNA의 발현을 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 성체줄기세포 배양 시 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 성체줄기세포의 증식 방법을 제공한다.

성체줄기세포의 노화는 계대 수가 증가함에 따라 세포가 사멸하면서, 세포 수가 줄어드는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 억제할 경우에 세포의 노화가 억제되며, 세포 증식과 관련된 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였으며, 대표적으로 miRNA-23a가 억제된 성체 줄기세포는 miRNA-23a가 억제되지 않은 성체줄기세포에 비하여 세포의 증식이 증가되는 것을 MTT assay를 통해 확인하였다. 이와 같은 결과는 miRNA-26a 및 miRNA-30a를 억제하여도 동일한 결과를 나타낸다는 것을 뒷받침하는 것이다.

상기 miRNA-23a, miRNA-26a 또는 miRNA-30a의 발현 억제는 앱타머, 안티센스올리고뉴클레오타이드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 miRNA의 발현 억제제를 이용하여 이루어질 수 있으며, 이는 상기에서 설명한 바와 같다.

바람직하게 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 성체줄기세포 유래인 것을 특지으로 한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포 증식용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에는 성체줄기세포의 증식을 위한 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 조성물의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. 이에 대한 설명은 상기에서 한 바와 같다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 성체줄기세포 증식용 조성물을 포함하는 성체줄기세포 증식용 키트를 제공한다.

이와 같은 키트에는 상기에서 설명한 증식용 조성물 이외에 세포 배양에 필요한 배지, 사용방법을 설명한 설명서 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 성체줄기세포의 노화를 억제하는 방법은 성체줄기세포 배양시 계대배양을 시행할수록 세포의 노화가 빠른 속도로 진행되어 세포 분열이 급격히 감소하는 문제점을 해결할 수 있다. 이로써 분화능과 세포 재생 능력을 그대로 유지한 성체줄기세포를 오래 유지할 수 있어 세포 치료제 혹은 연구용으로 사용할 수 있는 세포를 더욱 많이 확보할 수 있다. 또한 인간과 동물의 노화과정에서 생체내 줄기세포수가 감소하는 원인을 밝혀냄으로써, 노화의 현상을 규명할 수 있을 것으로 기대되다.

도 1은 성체줄기세포의 early passage와 late passage의 특징을 비교한 것이다. 도 1a는 광학 현미경 관찰 결과를, 도 1b는 웨스턴 블랏을 이용한 단백질 발현 확인 결과를, 도 1c는 real-time PCR을 이용한 mRNA 발현 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 HDAC 억제제가 HMGA2를 down-regulation을 시키고, 노화를 유도하는 것을 나타낸 도이다. 도 2a는 HDAC 억제제인 VPA 및 NB를 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 처리한 후, HDAC 억제제 농도를 바탕으로 HMGA2, p16INK4A, p21^CIP1/WAF1 및 p27^KIP1 발현 수준을 분석한 Real-time qPCR 분석 결과를, 도 2b는 시간에 따른 결과를, 도 2c는 HMGA2 및 p16^INK4A의 시간 간격에 따른 웨스턴 블랏을 이용한 단백질 발현 확인 결과, 도 2d는 면역세포화학법에 따른 단백질 발현 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 HDAC1 및 HDAC2가 HMGA2의 발현을 조절하고, HMGA2 억제는 세포 노화를 유도하는 것을 나타낸 도이다. 도 3a는 siRNA를 이용하여 HDAC1 및 HDAC2의 특이적 억제를 통해 HDAC1 및 HDAC2의 발현 수준이 감소하는 RT-PCR 결과를, 도 3b는 HDAC1 및 HDAC2의 특이적 억제가 HMGA2의 발현을 감소시키는 결과를, 도 3c는 HDAC1, HDAC2 및 HMGA2 특이적 down-regulation이 중간엽줄기세포의 노화 원인으로 충분하다는 것을 SA β-gal 염색으로 나타낸 결과이다.
도 4는 마이크로어레이를 이용하여 노화된 성체줄기세포에서의 증가된 miRNA를 찾아낸 것이다.
도 5a는 HMGA2를 타겟팅하는 miRNA를 검색하여 나타낸 것이고, 도 5b는 노화된 성체줄기세포에서 발현하는 miRNA 중에서 HMGA2를 타겟팅하는 miRNA를 검색한 것을 나타낸 것이다.
도 6a는 VPA 또는 NB로 인하여 노화된 성체줄기세포에서 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 나타낸 것이며, 도 6b는 HDAC1의 siRNA와 HDAC2의 siRNA로 인하여 노화된 성체줄기세포에서의 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 나타낸 것이다. 도 6c는 HDAC 억제제 처리 후, miRNA의 전구체의 발현 수준을 나타낸 RT-PCR 결과이고, 도 6d는 RT-PCR 결과를 ImageJ 분석으로 나타낸 것이다. * 및 **은 각각 p < 0.05 및 p < 0.01의 통계적 유의성을 나타낸다.
도 7은 miRNA-23a의 발현이 억제된 성체줄기세포의 특징을 나타낸 것이다. 도 7a는 real-time PCR을 이용한 miRNA-23a의 발현을 확인한 결과이며, 도 7b는 real-time PCR을 이용한 HMGA2 mRNA 발현 확인 결과를, 도 7c는 MTT assay 결과를, 도 7d는 광학 현미경 관찰 결과를, 도 7e는 real-time PCR을 이용한 p16과 p21의 mRNA 발현 확인 결과를 나타낸다.
도 8은 miR-23a, miR-26a 및 miR-30a miRNA 억제 또는 과발현이 HMGA2 발현 및 노화를 조절하는 것을 나타낸 도이다. 항-miRNA 또는 성숙 miRNA를 트랜스펙션시킨 후, miR-23a, miR-26a and miR-30a의 억제 또는 과발현 후, 각 miRNA의 발현 수준(도 8a), HMGA2의 발현 수준(도 8b)을 real-time qPCR로 분석한 결과이다. 도 8c는 p16^INK4A의 발현 수준을 도 8d는 p21^CIP1 ^/ ^WAF1의 발현 수준을 real-time qPCR로 분석한 결과이다. 도 8e는 miR-23a, miR-26a 및 miR-30a의 억제 또는 과발현 후에 세포의 노화를 SA β-gal 염색 결과로 나타낸 도이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

1-1 : 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

제대혈(Seoul National University Hospital)의 적혈구를 제거하기 위하여 Hetasep solution(Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)을 제대혈과 5 : 1의 부피비로 섞은 후 30분 동안 상온에서 배양하였다. 상층액을 주의하여 수집하고, 단일세포를 수집하기 위하여 피콜 용액을 첨가하여 2500 rpm으로 20분 동안 원심 분리하였다. 분리된 세포만을 수득하여 PBS로 두세 번 세척하고 헤파린(heparin), 아스코르빅산(ascorbic acid), 상피세포성장인자(recombinant human epidermalgrowth factor (rhEGF)), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor (VEGF)), 섬유아세포성장인자(recombinant human fibroblast growth factor (rhFGF-B)), 인슐린양 성장인자-1(recombinant long R insulin-like growth factor-1 (R3-IGF-1)), 황산겐타마이신(gentamycin sulfate), 암포테리신 B(amphotericin- B (GA-1000)) 및 10% FBS (Gibco)가 첨가된 EMEM(Gibco) 배양액에 2 × 10⁵/㎝ 의 농도로 배양하였다. 배양하고 4일 후, 바닥에 붙지 않은 세포들을 제거하였고, 세포가 80% 합류되었을 때 계대 배양하였다. 그 결과, 제대혈로부터 줄기세포를 분리 및 배양할 수 있었다.

1-2 : 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 early passage 와 late passage 세포 수득

제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 early passage(5 passage) 세포를 수득하기 위하여 6-well 플레이트에 5 × 10⁴/well의 농도로 3일 동안 배양하였고, late passage(15 passage) 세포를 수득하기 위하여 6-well 플레이트에 1 × 10⁵/well의 농도로 배양하였다.

실시예 2: 노화된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 특징 확인

2-1 : SA β- gal ( Senescence associated beta - galactosidase ) 염색

제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화 정도를 확인하기 위하여, SA β-gal 염색을 실시하였다.

상세하게는 실시예 1-2에서 배양한 early passage와 late passage의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 PBS로 2회 세척하고 0.5% glutaraldehyde를 상온에서 5 분 동안 처리하여 고정하였다. 이후 1 mM MgCl₂로 세척하고 X-gal 용액을 37 ℃에서 오버나잇 동안 처리하였다. 그리고 PBS로 2회 세척하고 현미경(Olympus, IX70)으로 이미지를 관찰하였다.

그 결과, 도 1a에서 나타나는 바와 같이 early passage 세포에서는 X-gal이 염색되지 않았으나, late passage의 세포에서는 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있었다.

2-2 : 노화 관련 유전자의 단백질의 발현 확인

세포의 노화는 HDAC의 발현이 줄어들면서 일어난다고 알려져 있으며, 이러한 HDAC의 발현이 줄어들면서 HMGA2의 발현은 감소하고 p16의 발현은 증가한다. 본 실험의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화가 일어나면서 이와 같은 단백질의 발현이 나타나는지 웨스턴 블랏(western blot)을 통하여 확인하였다.

실시예 1-2에서 배양한 early passage와 late passage의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 10 ㎍/㎖의 정량된 세포 전체 단백질을 7.5 ∼ 15%의 SDS-PAGE에 로딩하여 350 mA로 5시간 동안 분리하였다. 분리된 단백질은 전기적으로 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose)막에 옮겼다. 그리고 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 포함된 5% 탈지분유(skim milk)로 블로킹한 후, HDAC1(Upstate, USA),HDAC2(Upstate, USA), HMGA2(Millipore, USA), p16(Abcam, UK) antibody와 Second antibody(Amersham Inc., U.K)에 반응시켰다. 이후 ECL detection kit(Amersham Inc., U.K)에 의해서 blot을 발현시키고 hyperfilm(Amersham Inc., U.K)에 노출시켜 확인하였다.

그 결과, 도 1b에서 나타나는 바와 같이, early passage에서 late passage가 되면서 HDAC1, HDAC2, HMGA2의 단백질 발현은 감소하며, p16의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

2-3 : 노화 관련 유전자의 mRNA 발현 확인

실시예 1-2에서 배양한 줄기세포를 PBS로 2회 세척하고 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이후 전체 RNA를 oligo-dt primer와 Accupower RT premix(Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA에 하기 표 2에 기재되어 있는 HDAC1,HDAC2, HMGA2, p16, p21, p27의 프라이머와(서열번호 1-12) SYBR Green(Applied biosystems)을 첨가하여 Prime 7000 sequence detection system 2.1 software(Applied biosystems)를 이용하여 real-time PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 1c에서 나타나는 바와 같이, early passage에서 late passage가 되면서 HDAC1, HDAC2, HMGA2의 mRNA 발현은 감소하며, p16, p21, p27의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

서열번호 4 ~ 15

Gene	서열번호	Primer sequence
HDAC1-sense	서열번호 4	5'- GAAGAGTTCTCCGATTCTGA -3'
HDAC1-antisense	서열번호 5	5'- CTCTTCGGTGACTTCTTTCT -3'
HDAC2-sense	서열번호 6	5'- GACAGTGGAGATGAAGATGGA -3'
HDAC2-antisense	서열번호 7	5'- TTCTGATTTGGTGCCTTTGG -3'
HMGA2-sense	서열번호 8	5'- AGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAG -3'
HMGA2-antisense	서열번호 9	5'- GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC -3'
p16^INK4A-sense	서열번호 10	5'- GAAGGTCCCTCAGACATCCC -3'
p16^INK4A-antisense	서열번호 11	5'- CCCTGTAGGACCTTCGGTGA -3'
p21 ^Cip1 ^/ ^Waf1-sense	서열번호 12	5'- ATTAGCAGCGGAACAAGGAG -3'
p21 ^Cip1 ^/ ^Waf1-antisense	서열번호 13	5'- CTGTGAAAGACACAGAACAG -3'
p27 ^Kip1-sense	서열번호 14	5'- AGATGTCAAACGTGCGAGTG -3'
p27 ^Kip1-antisense	서열번호 15	5'- GCGTGTCCTCAGAGTTAGCC -3'

실시예 3: HDAC 억제제의 HMGA2 down - regulation 및 노화 유도 확인

HDAC 활성이 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 세포 노화 동안 HMGA2의 조절에 필요한 지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HDAC의 억제제인 VPA(valproic acid) 및 NB(sodium butyrate, NaBu)를 사용하였다.

4 mM VPA 또는 2 mM의 NB가 노화 유도에 충분한 것을 확인하여, 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 7일간 4 mM 또는 8 mM의 VPA 및 2 mM 또는 4 mM의 NB를 처리한 후, HMGA2 및 다른 관련 유전자들의 발현 수준을 조사하였다. 실시예 2-3의 방법과 유사하게, real-time qPCR을 수행하였다.

그 결과, HMGA2의 발현은 감소하였으나, p16^INK4A 및 p21^CIP1 ^/ ^WAF1는 VPA 및 NB 농도 의존적으로 증가하였다. 그러나, p27^KIP1의 발현은 8 mM의 VPA 처리 그룹에서만 증가하고, 다른 처리 그룹에서는 p27^KIP1의 발현이 유의적으로 증가하지 않았다 (도 2a).

또한 real-time qPCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 HDAC 억제제 처리에 따른 유전자 변화의 시간 변동을 확인하였다. HMGA2의 mRNA 및 단백질 수준은 처리 3일 후에 유의적으로 증가하였다(도 2b 및 2c). p16^INK4A 및 p21^CIP1 ^/ ^WAF은 각각 HDAC 억제제를 처리한 1일 및 3일 후에 발현이 증가하였다. 반면에, p27^KIP1의 발현은 처리 전체 기간동안 유의적으로 증가하지 않았다(도 2b).

HDAC 억제제 처리 3일 후에 HMGA2의 발현이 감소하므로, 다음과 같은 면역세포화학법을 수행하여 HMGA2의 발현 패턴을 분석하였다. HDAC 억제제를 3일, 5일 및 7일간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 처리하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.2% Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 투과시켰다. 그 후, 10% 정상 염소 혈청(Zymed Labortories Inc., San Fransico, CA)과 반응시킨 후, 항-HMGA2(1:200, Abcam, UK)으로 염색 후, 1시간 동안 Alexa 488-표지된 이차 항체(1:1,000; Molecular Probes, Eugene, OR)와 반응시켰다. 핵을 Hoechst 33258(1㎍/㎖, 10분)으로 염색하고, 공초점 현미경(Eclipse TE200, Nikon, Japan)으로 이미지를 캡쳐하였다. 그 결과, HMGA2의 핵내 위치를 확인하고, HMGA2의 발현이 시간-의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2d).

실시예 4: HDAC1 및 HDAC2 의 HMGA2 발현 조절 및 HMGA2 억제에 의한 세포 노화 확인

HDAC 억제제는 HDAC 억제만이 아니라, 넓은 범위의 생물학적 활성을 갖으므로, HDAC1 및 HDAC2을 특이적으로 억제하기 위하여 siRNA(small interfering RNA)를 이용하였다. 먼저, 실시예 2-3과 유사하게 real-time qPCR을 이용하여, 각각 siHDAC1 및 siHDAC2 처리 후에 HDCA1 및 HDCA2의 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 3a). 게다가, siHDAC1 및 siHDAC2 둘 다는 HMGA2의 발현 수준을 감소시켰다(도 3a).

HMGA2의 억제가 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 노화를 이끄는지 확인하기 위하여, HMGA2를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA를 이용하였다. HMGA2를 억제시킨 후, 실시예 2-3과 유사하게 real-time qPCR을 수행하여 HMGA2의 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다(도 3b). 결론적으로, 상기 SA β-gal 염색 결과에서 나타난 바와 같이, 중간엽 줄기세포의 노화는 HDAC1 및 HDAC2 뿐만 아니라, HMGA2의 억제에 의해서 일어난다는 것을 알 수 있었으며, 더욱이 p21^CIP1 ^/ ^WAF1 및 p16^INK4AD의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(도 3b 및 3c).

실시예 5: 노화된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 발현 증가하는 miRNA 확인 ; 마이크로 어레이( Microarray analysis )

실시예 1-2에서 배양한 줄기세포를 PBS로 2회 세척하고 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 전체 RNA 2 ㎍을 USL aRNA labeling kit(Kreatech diagnostics, Netherlands)로 라벨링·증폭하였다. Cy5로 라벨링된 전체 RNA는 10㎕ hybridization solution으로 하이브리디제이션 시켰다. Agilent human microRNA arrays는 프로브(probe)와 Sanger miRBASE public database로부터 사람의 모든 miRNA 정보를 가지고 있다. 또한 Agilent human whole genome arrays는 probe와 Genome Reference Consortium Human Build 34(GRCh34)의 사람의 모든 유전자 정보를 가지고 있다. Agilent miRNA 프로브는 각 array마다 20회 반복하였으며, GeneSpring GX software 를 이용하여 miRNA의 변화를 분석하였다. miRNA data base는 Mirande, Target scan, Pictar를 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 노화된 세포에서 증가하는 miRNA를 확인하였고, 도 5a에 HMGA2를 타켓팅(targeting)하는 miRNA를, 도 5b에 노화와 관련된 miRNA중에서 HMGA2를 타켓팅(targeting)하는 miRNA를 골라내었다. 이 중에서 공통으로 겹치는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a를 발견하였다.

실시예 6: 노화된 세포에서의 miRNA -23a, miRNA -26a 및 miRNA -30a 발현 확인

6-1 : HDAC inhibitor 로 인하여 노화된 세포에서의 miRNA -23a, miRNA -26a 및 miRNA-30a 발현 확인

상기 실시예 5에서 선택한 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a가 노화된 세포에서 발현이 증가하는지 확인하기 위하여, HDAC의 inhibitor를 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 인위적으로 세포 노화를 시킨 후, miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. HDAC의 inhibitor인 VPA(valporic acid) 및 NaBu(sodium butyrate)를 사용하였다.

제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 4 mM VPA 또는 2 mM NaBu를 3일 동안 처리하고, 세포를 수득하여 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 노화와 관련된 다른 miRNA(miRNA-7a1, miRNA-7d, miRNA-7f1)들과 발현을 비교하였다. real-time PCR은 하기 표 3에 나타나있는 프라이머(서열번호 13-24)를 사용하였다.

그 결과, 도 6a에 나타나는 바와 같이, VPA와 NaBu를 첨가하였을 때, 노화와 관련된 miRNA-7a1, miRNA-7d, miRNA-7f1는 증가하는 것을 확인하였고, miRNA-23a은 VPA를 첨가하여 세포를 노화시킨 경우에는 발현이 증가하지 않고, NaBu를 첨가하여 세포를 노화시켰을 경우에만 증가하는 것을 확인하였다.

서열번호 16 ~ 27

Gene	서열번호	Primer sequence
pre-miR-23a-sense	서열번호 16	5'- TCCTGGGGATGGGATTTGCTTCCT -3'
pre-miR-23a-antisense	서열번호 17	5'- GGTCGGTTGGAAATCCCTGGCA -3'
pre-miR-26a-sense	서열번호 18	5'- TAATCCAGGATAGGCTGTGCAGGT -3'
pre-miR-26a-antisense	서열번호 19	5'- GCGTCCCCGTGCAAGTAACCA -3'
pre-miR-30a-sense	서열번호 20	5'- GCGACTGTAAACATCCTCGACTGG -3'
pre-miR-30a-antisense	서열번호 21	5'- TGCAAACATCCGACTGAAAGCCCA -3'
pre-let 7a-1⁴⁰-sense	서열번호 22	5'- AGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGG -3'
pre-let 7a-1⁴⁰-antisense	서열번호 23	5'- TAGGAAAGACAGTAGATTGTATAGT -3'
pre-let 7d⁴⁰-sense	서열번호 24	5'- AGGTTGCATAGTTTTAGGGCA -3'
pre-let 7d⁴⁰-antisense	서열번호 25	5'- AAGGCAGCAGGTCGTATAGT -3'
pre-let 7f-1⁴⁰-sense	서열번호 26	5'- GATTGTATAGTTGTGGGGTAGTG -3'
pre-let 7f-1⁴⁰-antisense	서열번호 27	5'- GGGAAGGCAATAGATTGTATAG -3'

6-2 : HDAC 특이적인 siRNA 로 인하여 노화된 세포에서의 miRNA -23a, miRNA -26a 및 miRNA -30a 발현 확인

HDAC의 inhibitor외에 HDAC 특이적인 siRNA를 이용하여 세포를 노화시킬 경우에도 miRNA-23a의 발현이 증가하는지 확인하기 위하여, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 50 nM의 HDAC1 특이적인 siRNA(Dharmacon, ON Target plus SMART pool, USA)와 HDAC2 특이적인 siRNA(Dharmacon, ON Target plus SMART pool, USA)를 첨가하여 세포를 형질전환시켜 노화시킨 후, 상기 실시예 6-1과 같은 방법으로 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 6b에 나타나는 바와 같이, HDAC1 특이적인 siRNA를 첨가하여 세포를 노화시킨 경우에는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현이 증가하지 않았으나, HDAC2 특이적인 siRNA를 첨가하여 세포를 노화시킨 경우에는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a의 발현이 세포 노화와 관련이 있는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 7: HDAC 의 억제 후 miRNA 전구체의 증가 확인

mRNA의 발현 조절은 전사 또는 전사 후 수준에서 수행될 수 있다. 비록, miRNA 조절이 전사 후 수준에서 일어나는 것이 많이 알려져 있지만, miRNA의 전사 조절에 영향을 미치는 인자에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. HMGA2-타겟팅 miRNA가 도 6a 및 6b에 나타난 바와 같이, HDAC 억제제 처리 후에 발현이 증가하는 것을 바탕으로 본 발명자들은 RT-PCR 분석을 통해, let-7a1, let-7d, let-7f1, miR-23a, miR-26a 및 miR-30a 전구체의 발현 수준을 분석하여 전사 수준에서 miRNA의 up-regulation이 일어나는 지를 조사하였다. miRNA의 전구체는 HDAC 억제제 처리 1일 및/또는 3일 후에 유의적으로 up-regulation이 되었다. 이와 같은 결과를 바탕으로 본 발명자들은 miRNA 발현은 HDAC 억제제 처리 후 전사 수준에서 조절될 것이라는 것을 알 수 있었다(도 6c 및 6d). miRNA의 합성은 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되고, RNase III, Drosha 및 Dicer에 의해 프로세싱이 일어난다. 본 발명자들은 HDAC 억제제-매개 중간엽 줄기세포의 노화 동안 상기 인자의 발현 수준을 조사하였고, Drosha 및 Dicer의 발현 수준은 변하지 않거나, 약하게 감소하였다. 이와 같은 결과는 HMGA2를 타겟팅으로 하는 let-7a1, let-7d, let-7f1, miR-23a, miR-26a 및 miR-30a가 miRNA의 전사 후 프로세스에 의해서 강화되기보다는 전사적으로 up-regulation되는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 8: miRNA -23a의 성체줄기세포의 노화 억제 기능 확인

8-1 : miRNA -23a가 억제된 성체줄기세포에서의 HDAC 발현 확인

miRNA-23a가 억제된 성체줄기세포의 세포 증식에 대한 영향을 확인하기 위하여, 성체줄기세포에 miRNA-23a 억제제를 처리한 후, 세포 증식에 영향을 미치는 HMGA2 발현을 확인하였다.

상기 실시예 1의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 2×10⁴/well를 50 nM hsa-miR-23a 타겟팅 억제제(Ambion, Anti-miR^TM miRNA inhibitor)가 첨가된 배양액에서 48∼96 시간 동안 배양하며 형질전환시켰다. 대조군으로 miRNA precusor negative control#1(Ambion)을 사용하였다. 형질전환된 지 48∼72 시간 후, 세포를 계대배양하였다. 계대배양 시 24시간 동안은 세포를 안정화시키고, 이후 48∼72 시간 동안 50 nM hsa-miR-23a 타겟팅 억제제를 처리하여 배양하였다. 배양된 세포는 광학 현미경(Olympus, IX70)으로 이미지를 관찰하였다.

그 결과 도 7d에 나타나는 바와 같이, miRNA-23a의 발현이 억제된 성체줄기세포가 억제되지 않은 세포보다 세포의 양이 많은 것을 확인할 수 있었다.

이후 상기 실시예 2-3과 같은 방법으로 miRNA-23a, HMGA2의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 7a에 나타나는 바와 같이 hsa-miR-23a 타겟팅 억제제를 처리하였을 때, miRNA-23a의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 도 7b에 나타나는 바와 같이, HMGA2의 발현은 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

8-2 : miRNA -23a가 억제된 성체줄기세포에서의 MTT assay 를 통한 세포 노화억제 및 증식 확인

miRNA-23a가 억제된 성체줄기세포에서 세포 증식을 확인하기 위하여, 성체줄기세포에 miRNA-23a 억제제를 처리한 후, 노화를 확인하는 MTT assay을 실시하였다. MTT는 살아있는 세포에서 물에 녹지 않는 formazan crystals로 환원되는데, formazan crystals의 양을 확인함으로써 세포의 증식을 확인할 수 있다.

제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 2×10⁴/ml을 24-well 플레이트에 배양하였다. 50 nM hsa-miR-23a 타겟팅 inhibitor(Ambion, Anti-miR^TM miRNA inhibitor)와 miRNA inhibitor control을 2일 동안 처리하여 배양하였다. 이후 5㎎/㎖의 MTT(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) 50 ㎕를 처리하고 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 이후 DMSO를 처리하여 formazan crystals를 녹이고 EL800 microplate reader(BIO-T다instruments)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 7c에서 나타나는 바와 같이, hsa-miR-23a 타겟팅 inhibitor를 처리하였을 때 formazan crystals의 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이것으로 miRNA-23a이 억제된 성체줄기세포에서 miRNA-23a가 억제되지 않은 성체줄기세포보다 세포의 증식이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이는 miRNA-23a이 억제된 성체줄기세포의 노화 억제에 기인한 것으로 판단된다. 또한 이와 같은 결과는 miRNA-23a의 억제는 성체줄기세포를 증식시킬 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다.

8-2 : miRNA -23a가 억제된 성체줄기세포에서의 세포에서의 p16 , p21 발현 확인

miRNA-23a가 억제된 성체줄기세포에서 노화가 억제되는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 8-1과 동일한 방법으로 miRNA-23a가 억제된 성체줄기세포에서 p16과 p21의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 7e에 나타나는 바와 같이, miRNA-23a가 억제된 성체줄기세포에서 노화된 세포에서 발현하는 p16과 p21의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 결과들은 miRNA-23a의 발현을 억제시키는 단계를 포함하는 배양 방법은 성체줄기세포의 노화를 억제시키는 것을 뒷받침하는 것이다.

실시예 9: miRNA -23a, miRNA -26a 및 miRNA -30a의 HMGA2 발현 억제 확인

miR-23a, miR-26a 및 miR-30a가 세포 노화와 관련된 HMGA2 mRNA를 실질적으로 타겟팅하는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 특이적 mRNA 억제제 및 성숙 miRNA를 이용하여 miR-23a, miR-26a 및 miR-30a가 HMGA2를 타겟팅하는지 실험을 수행하였다.

miR-23a, miR-26a 및 miR-30a 발현의 miRNA 억제제-매개 억제 후에, 본 발명자들은 실시예 2-3과 유사한 방법으로 real-time qPCR을 수행하여 miRNA가 down-regulation되고, HMGA2 mRNA 발현이 up-regulation되는 것을 확인하였다. 반면에, miRNA의 과발현은 HMGA2 mRNA의 발현을 down-regulation시켰다. 이와 같은 결과는 상기 miRNA가 HMGA2를 타겟팅하는 것을 시사하는 것이다(도 8a 및 8b).

p16^INK4A 및 p21^CIP1 ^/ ^WAF1와 같은 다운스트림의 노화 관련 인자 발현 수준에서 miRNA의 영향을 조사하기 위하여, 성숙 miRNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 miRNA를 일시적으로 억제 또는 과발현 후에 상기 실시예 2-3과 유사한 방법으로 real-time qPCR을 수행하였다. 그 결과, miR-23a 및 miR-30a는 p16^INK4A 및 p21^CIP1/WAF1발현 수준과 상호 관련 있었다(도 8c 및 8d). miR-23a 및 miR-30a의 항-miRNA 매개 억제는 p16^INK4A 및 p21^CIP1 ^/ ^WAF1 발현을 감소시켰다. 이와 반대로, 성숙-miR-23a 및 miR-30a은 p16^INK4A 및 p21^CIP1 ^/ ^WAF1 발현 수준을 증가시켰다(도 8c 및 8d). miR-26a의 과발현 역시 p16^INK4A을 증가시켰으나, miR-26a 억제는 p16^INK4A을 감소시키지 못하였다. miR-26a에 의한 p21^CIP1 ^/ ^WAF1 발현 조절은 miR-23a 및 miR-30a에 의한 조절과 일치하지 않았다(도 8c 및 8d). miR-23a 및 miR-30a의 억제 또는 과발현은 SA β-gal 염색 결과에서 나타난 바와 같이, 세포 노화에 영향을 줬다(도 8e).

항-miR-23a 및 항-miR-30a는 세포의 β-galactosidase 활성을 억제시켰다. 상기 miRNA의 성숙-miRNA는 SA β-gal 염색 상태를 증가시켰다. 그러나, miR-26a의 조절 후에 SA β-gal 염색 상태는 커다란 변화를 보이지 않았다(도 8e).

상기와 같은 결과들은 miR-23a, miR-26a 및 miR-30a가 세포 노화에 있어서, HMGA2를 조절한다는 것을 시사하는 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

중간엽 줄기세포 배양 시 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 노화 억제 방법.
제1항에 있어서, 상기 miRNA의 발현 억제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 발현 억제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 miRNA의 발현이 억제됨으로써, HMGA2의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 miRNA의 발현이 억제됨으로써, p16 또는 p21의 발현이 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포의 노화 억제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 miRNA의 발현 억제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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중간엽 줄기세포 배양 시 miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 증식 방법.
제11항에 있어서, 상기 miRNA의 발현 억제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레어티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 발현 억제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 세포 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
miRNA-23a, miRNA-26a 및 miRNA-30a로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 중간엽 줄기세포 증식용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 miRNA의 발현 억제제는 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항 또는 제7항의 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포 노화 억제용 키트.
제14항 또는 제15항의 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포 증식용 키트.