KR20140046339A

KR20140046339A - ｍｉＲＮＡ-203의 억제를 이용한 줄기세포의 망막세포로의 분화방법

Info

Publication number: KR20140046339A
Application number: KR1020120112669A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 최순원
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2014-04-18

Abstract

본 발명은 줄기세포의 망막세포로의 분화방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 miRNA-203을 억제함으로써, 줄기세포를 망막세포로 분화를 유도하는 방법, miRNA-203을 억제제로 포함하는 줄기세포로부터 망막세포 분화 유도용 조성물, 상기 방법을 이용한 망막세포 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 망막세포를 포함하는 망막 변성 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포의 망막세포로의 분화 방법은 단기간 내에 줄기세포로부터 풍부한 수의 광수용체세포를 생성할 수 있으며, 분화된 광수용체세포는 변성 또는 손상 망막에 이식 시, 망막 내에서 생착 및 융합함으로써 망막 변성을 방지 또는 회복할 수 있는 능력을 지니고 있어 세포치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 또한 본 발명은 망막의 분화과정에 관여하는 새로운 유전자 및 분자들을 발견함으로써, 이들 유전자와 분자들에 의한 병변이나, 망막 변성질환의 발생 기전을 규명하고, 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ｍｉＲＮＡ-203의 억제를 이용한 줄기세포의 망막세포로의 분화방법{Method for differentiation into retinal cells from stem cells using inhibition of miRNA-203}

본 발명은 줄기세포의 망막세포로의 분화방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 miRNA-203을 억제함으로써, 줄기세포를 망막세포로 분화를 유도하는 방법, miRNA-203을 억제제로 포함하는 줄기세포로부터 망막세포 분화 유도용 조성물, 상기 방법을 이용한 망막세포 제조방법, 및 상기 방법으로 제조된 망막세포를 포함하는 망막 변성 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.

실명(失明)은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5 %인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나로서 망막의 광수용체세포 (photoreceptor cell)의 변성을 들 수 있는데, 이는 선천적 요인 또는 다른 다양한 원인들에 의해 발생한다. 망막미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성 (aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성 (retinitis pigmentosa), 선천성 망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시 (Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장 (glaucoma), 시신경병증 및 외상 등 많은 질환들이 이 질환에 해당된다. 현재까지 이 질환들에 대한 근본적인 치료를 위한 약물요법은 없으며, 이들 질환의 원인이며 결과인 기능부전의 광수용체세포를 새로운 광수용체세포로 이식하는 것이 가장 가능성 있는 치료법으로 여겨지고 있다. 광수용체세포 이식법은 망막 변성을 지연시키거나, 억제하고, 퇴화 또는 변성된 망막을 재생한 후 망막 기능을 향상시켜 실명을 방지하거나 또는 손상된 시력을 재생시킬 수 있을 것으로 평가되고 있다.

이러한 변성된 망막세포의 대체와 보호를 위한 세포치료법의 후보로 다양한 줄기세포 (stem cell), 즉, 골수줄기세포 (bone marrow stem cell: BMS), 망막줄기세포 (retinal stem cell: RSC), 배아줄기세포 (embryonic stem cell: ESC), 유도전분화능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC) 및 체세포핵치환 줄기세포 (somatic cell nuclear transfer cell: SCNT) 등을 이용한 치료 가능성이 대두되고 있다.

한편, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)는 염기서열이 22개 이내의 암호화되지 않은(non-cording) RNA로서, 타켓 mRNA를 분해하거나 타켓 mRNA의 전사(translation)를 억제하여 유전자 발현을 조절한다. 또한 miRNA는 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3′-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 새로운 물질이다. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 stem-loop 구조의 pre-miRNA로 만들어지고, 세포질로 이동하여 Dicer에 의해 절단되어 miRNA로 만들어진다. 이렇게 만들어진 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 분화, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다

최근 사람의 암세포에서 항암 기능을 하는 miRNA의 후생성 발현 가능성이 제시되고 있으며, miRNA cluster의 후생성 조절에 대한 다양한 증거들이 보고되고 있다. 상세하게는 다양한 DNA 부위를 암호화하고 있는 항암 기능을 하는 miRNA는 사람의 유방암 세포주에서 비정상적인 과메틸화(hypermethylation)되어 있어 유전자가 활성화되지 않고 있으며, AGS 위암 세포주에서 DNMT(DNA methylatransferase)인 5-AsadC(5-Asa-deoxycytidine)를 처리했을 때, DNA가 탈메틸화되면서 특정 miRNA cluster의 발현이 복구된다는 연구결과가 제시되고 있다.

그러나 줄기세포로부터 망막세포(특히, 광수용체세포)로의 분화 및 이를 이용한 세포치료에 대한 연구 성과는 미진한 상태에 있다. 이들 줄기세포로부터 망막세포로의 분화가 가능할 경우 1) 효과적인 세포 치료를 위한 무한한 세포공급이 가능하며, 2) 지금까지 알려지지 않은 줄기세포로부터의 망막 세포로의 분화 기전이 규명되고, 3) 망막의 분화 관련 유전자 및 분자들의 발견 및 그에 의한 병변 규명과, 4) 망막 변성질환의 발생기전 파악, 그리고 5) 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제 개발에도 이용 가능할 것이다.

이러한 배경 하에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 줄기세포 배양시 miRNA-203을 억제시키는 경우, 망막세포 특이유전자 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB 발현이 증가되어 줄기세포의 망막세포로의 분화가 유도됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 줄기세포 배양시 miRNA-203(microRNA-203)을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 miRNA-203을 억제제로 포함하는, 줄기세포로부터 망막세포 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다,

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용한 망막세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 망막세포를 포함하는, 망막 변성 관련 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 줄기세포 배양시 miRNA-203(microRNA-203)을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "성체 줄기세포"란 동물의 내배엽(mesoderm) 및 외배엽 (ectoderm)유래의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency), 또는 조직 또는 기능에 있어 밀접하게 관련된 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency)을 가지는 세포를 의미한다. 또한 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수, 혈액, 양막, 제대, 근육, 피부, 지방 및 망막에서 추출되는, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 특정 조직의 세포로 분화하게 되는 미분화상태의 세포이다.

바람직하게 상기 성체 줄기세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMS), 제대혈 유래 줄기세포, 양막 유래 줄기세포, 망막줄기세포(retinal stem cell, RSC), 망막 내 뭘러아교세포, 유도 전 분화능 줄기세포 (induced pluipotent stem cell, iPSC) 또는 체세포핵치환줄기세포 (somatic cell nuclear transfer cell, SCNT)를 포함하며, 가장 바람직하게는 제대혈 유래 줄기세포 또는 양막 유래 줄기세포이다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적 줄기세포로서 인간 양막 유래 줄기세포 및 인간 제대혈 유래 줄기세포를 이용하여 망막세포로 분화를 유도하였다.

본 발명에서 용어, "망막 (retina)"이란 안구의 가장 안쪽에 위치한 투명한 신경막으로서 시각과 직접적인 관련이 있다. 망막의 바깥쪽은 색소상피세포들로 이루어진 망막색소상피층이 덮고 있다. 넓은 의미로는 내층의 신경망막과 외층의 망막색소상피층을 포함하여 망막이라고도 일컫는다. 망막은 안구의 뒤쪽 2/3에 형성되어 있으며, 발생학적으로는 뇌의 일부가 튀어나와 자라서 생긴 조직이다. 망막은 모두 5층으로 이루어진 5단 케익 모양을 하고 있는데, 3층의 신경핵층이 존재하고, 그 사이를 2층의 신경망층이 채우고 있는 구조이다. 3층의 신경핵층은 가장 바깥쪽의 광수용체 세포의 핵들로 이루어진 외핵층과 수평세포, 두극세포, 무축삭세포, 뮐러아교세포의 핵들로 이루어진 내핵층, 가장 안쪽의 망막 신경절 세포의 핵들로 이루어진 망막 신경절 세포층으로 구성되어 있다. 눈의 각막과 렌즈를 통과한 빛은 망막 신경절세포층, 내핵층을 차례로 거쳐 외핵층에 도달하며, 외핵층을 구성하고 있는 광수용 체세포에서 빛에 의한 신경흥분이 일어난다. 신경흥분은 빛의 유입 과정과 반대 방향으로 전도되는데, 광수용체 세포가 빛에 의해 자극되면 신경전류가 내핵층으로 전달되고 다음으로 망막 신경절 세포층을 통하여 시신경섬유로 전달된다.

본 발명의 용어, "줄기세포를 망막세포로 분화시키는 단계"의 분화는 줄기세포의 신경망막세포 또는 광수용체세포로의 분화를 확인한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는, miRNA-203이 억제된 성체줄기세포에서 망막세포 또는 광수용체세포 관련 유전자 또는 단백질 발현 정도를 확인한 결과, 신경 망막 전구세포 CHX10, 광수용체 전구세포 마커 RORβ 및 OPN1MW, 및 광수용체 마커 NRL이 발현되었고, 많은 양의 로돕신 및 옵신 단백질이 발현됨을 확인함으로써 상기 miR-203 억제제인 anti-miR-203이 줄기세포의 망막세포분화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다(도 6).

한편, 상기 줄기세포는 다양한 배양조건(예컨대, 배양액의 성분, 상기 성분의 함량, 배양기간 등)에 따른 in vitro 배양과정을 거쳐 망막세포로 분화될 수 있는데, 상기 배양조건이나 방법은 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포 배양용 배지는 줄기세포와 동일한 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 배지로, 양막 유래 줄기세포에는 각질세포 무혈청 배지(Keratinocyte-SFM), 제대혈 유래 줄기세포에는 EBM-2 배지(Endothelial cell basal medium-2)에 혈청을 함유시켜 얻어진 배지를 이용할 수 있다. 상기 혈청으로는 양막 유래 줄기세포 배지에는 EGM-2SingleQuots(Lonza), 제대혈 유래 줄기세포 배지에는 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용할 수 있으며, 그 함량은 혈청 배지 총 중량에 대하여 약 10 중량%일 수 있다. 또한 필요에 따라 항생제, 항진균제 및 오염 방지를 위한 마이코플라스마 억제제를 포함할 수 있다.

항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상의 세포 배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있으며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신(tyrosine), 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 파이루베이트 등의 에너지대사물질을 더 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 2 mM의 글루타민, 0.5 내지 1 mM의 소디움 파이루베이트, 0.1 내지 10 %의 FBS, 1 %의 항생제(100 IU/ml), 및 1 내지 4.5 g/L의 글루코오스로 보충될 수 있다. 배양은 90 내지 95 %의 습도 및 35 내지 39 ℃의 조건으로 5 내지 10 %의 CO₂배양기에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라, 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량%가 되도록 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가할 수 있으며, 트립신-EDTA를 처리함으로써 성장을 촉진시킬 수 있다. 누적집단 배증 시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75 내지 85 % 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80 % 합류시기에 세포를 채취하여 계대 배양을 수행할 수 있다.

상기 배양된 줄기세포는 다양한 배양조건에 따른 분화과정을 거쳐 망막세포로 분화될 수 있는데, 망막세포로의 분화용 배지는 당업계에 통상적으로 사용되는 줄기세포 분화용 배지들을 제한 없이 사용할 수 있다.

망막세포로의 분화용 배지는 상기 줄기세포 배양액에 엘-글루타민, 비필수 아미노산, 머캅토에탄올, B-27 보충체, N-2 보충제(N2 supplement)가 추가된 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 2 mM 엘-글루타민, 1 내지 2 mM 비필수 아미노산, 0.1 내지 0.2 mM 머캅토에탄올, 1 내지 2 % B-27 보충체((B-27 supplement), 1 내지 2 % N-2 보충제(N2 supplement)가 추가될 수 있으며 더욱 바람직하게는 상기 줄기세포배양 배지에 1 mM 엘-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 0.1 mM 머캅토에탄올, 1 % B-27 보충제 및 1 % N-2 보충제를 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 100 U/ml 페니실린 및 100 U/ml 스트렙토마이신이 첨가된 줄기세포 배양배지 Keratinocyte-SFM 또는 EBM-2에 1 % B-27 보충제, 1 % N-2 보충제 및 1 % FBS를 추가로 포함한 분화용 배지에서 줄기세포의 분화를 유도하였다.

줄기세포의 신경망막으로 분화는 일반적으로 EFTF(Eye Field Transcription Factor), 신경망막기원세포, 광수용체 기원세포, 성숙한 광수용체와 같은 여러 단계의 발달과정을 통해서 유도되는데, 본 발명에서는 줄기세포의 망막 특이 유전자를 타겟으로 하는 miRNA를 억제시킴으로써 줄기세포를 신경망막으로 직접 분화를 유도할 수 있음이 본 발명자들에 의해서 최초로 규명되었다(도 1의 A).

본 발명에서 용어, "microRNA(마이크로 RNA, miRNA)"는 생물의 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 작은 RNA를 의미하며, 타겟 mRNA 3'UTR(untranslated region)과의 상보적인 염기쌍 배열에 의한 타겟 mRNA 번역의 억제를 통해, 유전자 발현 과정에서 중요한 조절 역할을 할 수 있는 20 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 작은 RNA이다. 상기 microRNA는 증식, 분화, 세포사멸 등을 포함하는 세포 기능에 있어서 중요한 역할을 하며, 모든 동물에 존재하는 진화적으로 보존된 조절물질로서, 일부 microRNA는 그 프로모터 부위와 관련된 후성 유전학적 조절 기작(히스톤 변형, DNA 메틸화 등)을 통해 유전자 발현 조절을 일으킨다고 알려져 있다.

miRNA는 대부분 염색체상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며, 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha) 등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태(pre-miRNA)로 바뀐 후 엑스포틴(exportin)에 의해서 핵을 빠져나와 다이서(Dicer)에 의해 약 22 bp 내외 길이의 성숙된 형태로 바뀌게 되고 이는 RISC(RNA interference silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다. 본 발명의 miRNA-203 억제제는 이러한 miRNA-203이 활성화되어 기능을 하는 경로에 관여하여 miRNA-203의 발현 수준을 감소시키거나, 활성을 억제할 수 있다.

본 발명에서 줄기세포를 신경망막으로 직접 분화유도할 수 있는 miRNA-억제제(anti-miRNA)의 전달은 DharmaFECT 형질감염시약(Thermo Scientific)을 이용하여 실시할 수 있다. 바람직하게 miRNA 억제제에 의한 줄기세포의 형질감염을 시키기 위하여 세포(3 x 10⁵)를 60 mm 배양접시에 분주한 후, 형질감염시약 및 anti-miRs 혼합액을 제조하여 상기 세포에 감염시킬 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 세포의 형질감염은 30 nM anti-miR-203(Ambion Anti-miR miRNA Inhibitor) 또는 음성 대조군 siRNA(QIAGEN AllStars Negative Control siRNA)를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 miRNA-203의 염기서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

본 발명에서는 miRNA-203(mirR-203, microRNA-203, miR-203)이 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB와 같은 망막 특이 발생 유전자 대부분을 표적하는 것으로 확인할 수 있었다(실시예 1 및 도 1). 본 발명에서 용어 miRNA-203, miR-203 및 microRNA-203은 혼용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "miRNA-203의 억제"는 miRNA-203에 특이적인 억제제를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물일 수 있다. 상기 화합물은 이에 제한되지는 않으나, 항산화제, 세포성장에 영향을 미치는 물질 및 세포신호전달물질 중 miRNA-203을 억제시키는 화합물이라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "miRNA-203 억제제"는 세포 내에서 miRNA-203의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 miRNA-203에 직접적으로 작용하거나 또는 miRNA-203의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 miRNA-203의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 miRNA-203의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, miRNA-203의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 의미한다.

본 발명에서는 상기 microRNA 중에서 miRNA-203을 억제할 경우에, 줄기세포를 망막세포로 분화시킬 수 있음을 확인함으로써. 상기 miR-203를 선택하여 성체 줄기세포가 망막세포로 분화하는 세포 배양 배지에 miR-203 억제제를 첨가하여 분화를 유도하였다(도 6)

본 발명에서 이용할 수 있는 miRNA-203 억제제는 miRNA-203 억제 활성을 가진 물질이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다. 바람직하게는, miRNA-203 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA-203에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머, 리보자임 및 화합물 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 상기 siRNA는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 목적상 miRNA-203에 특이적으로 작용하여 miRNA-203 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 miRNA-203을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중-가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 miRNA-203에 결합하여 miRNA-203의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 miRNA-203의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 상기 miRNA-203에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열을 의미한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 miRNA-203 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 miRNA-203의 프로세스 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고 기능을 저해시킬 수 있다. 성숙된 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프(stem-loop) 구조)를 가질 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전구체 miRNA-203 분자의 단일가닥 단편에 상보적이거나, 성숙된 miRNA-203 분자에 상보적일 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 miRNA-203 핵산에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 miRNA-203 염기서열에 상보적일 수 있고, 이들 자체적으로 루프를 형성하여 루프를 형성하는 miRNA-203에도 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miRNA-203 단일가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다 상기 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있다.

본 발명의 miRNA-203 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "리보자임(ribozyme)"은 효소 활성이 있는 RNA 분자를 의미하는 것으로서, 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 생체 내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용 가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 본 발명의 목적상 RNA 기질을 절단할 수 있다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.

본 발명에서는 miRNA-203의 발현을 억제하는 anti-miRNA-203을 줄기세포 내로 감염시키기 위하여 상기 줄기세포 분화용 배지에 anti-miRNA-203을 첨가하여 배양할 수 있다. 구체적으로 상기 줄기세포 분화용 배지에 10 내지 100 nM 농도의 anti-miRNA-203을 첨가하여 3 내지 7 일 마다 1 내지 3 회 실시하여 7 내지 28 일 동안 분화배지에서 배양할 수 있다. 더 구체적으로 miRNA-상기 줄기세포 분화용 배지에 30 nM 농도의 anti-miRNA-203을 7일 마다 3회 실시하여 28일 동안 분화배지에서 배양할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기줄기세포에 30 nM 농도의 anti-miRNA-203을 7일 마다 3회 실시하여 28일 동안 분화배지에서 배양함으로써 형질감염된 성체줄기세포를 획득하였다(실시예 4). 또한 분화유도된 줄기세포와 미분화줄기세포에서 miRNA-203의 발현량을 비교하여 미분화 줄기세포에서 miRNA-203의 발현이 anti-miRNA-203에 감염된 줄기세포보다 높게 나타났으며, anti-miRNA-203으로 감염된 줄기세포에서는 miRNA-203이 발현되지 않음을 확인하였다(실시예 5)

본 발명에서는 miRNA-203이 망막세포 발현 특이 유전자를 직접적으로 타겟함을 루시퍼라제 방법으로, 줄기세포의 망막세포로의 분화를 억제하는 miR-203이 미분화 줄기세포에 다량함유되어 있음을 확인할 수 있으며, anti-miR-203이 처리된 성체 줄기세포에서 miR-203이 감소됨으로써 신경 망막으로 분화를 유도하고 있음을 확인할 수 있다. 또한 분화과정에서 anti-miR-203이 광수용체기원세포 마커 DKK1 및 CRX, 광수용체 전구세포 마커 RORβ 및 NEUROD1, 광수용체 마커 NRL 및 THRB의 표적 유전자의 발현을 증가시킴을 확인할 수도 있다(도 7).

이러한 결과를 종합해보면, miR-203은 줄기세포의 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB의 표적 유전자의 발현을 억제시킴으로써, 망막세포 특이 유전자를 직접 타겟함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법은 상기 miRNA-203을 억제시킴으로써, DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 함을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 miRNA-203(microRNA-203)을 억제제로 포함하는, 줄기세포로부터 망막세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 줄기세포에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 성체줄기세포, 보다 바람직하게는 양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다. 그리고 상기 miRNA-203 억제제에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물 형태일 수 있다. 또한 상기 miRNA-203 을 억제시켜 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB의 발현을 증가시키는 것에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물에는 줄기세포의 망막세포 분화를 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 조성물의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. miRNA-203 억제제의 세포 내 유입을 촉진시키는 제제에는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민 (polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다. miRNA-203 억제제를 복합체 형태로 체내 투여할 경우 유전자의 체내 체류시간 및 발현 지속시간이 네이키드 핵산에 비하여 현저히 증가할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법을 이용한 망막세포 제조방법을 제공한다.

상기 줄기세포에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 성체줄기세포, 보다 바람직하게는 양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포일 수 있다. 그리고 상기 miRNA-203 억제제에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물 형태일 수 있다. 또한 상기 miRNA-203 을 억제시켜 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB의 발현을 증가시키는 것에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같다. 그리고 상기 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임으로 구성된 군에서 선택되는 miRNA-203 억제제를 포함하는 분화배지에서 배양하는 단계를 1일 내지 28일 동안 수행하는 방법일 수 있다. 그리고 상기 분화배지에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 페니실린, 스트렙토마이신 및 소태아혈청이 첨가된 각질세포 무혈청 배지(Keratinocyte-SFM) 또는 EBM-2 배지(Endothelial cell basal medium-2)에 B-27 보충제 및 N-2 보충제를 추가로 포함하는 것인 방법에 관해서도 상기에서 설명한 바와 같다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 망막세포를 포함하는, 망막 변성 관련 질환의 치료용 조성물을 제공한다.

상기 망막 변성 관련 질환은 선척적 또는 후천적으로 망막에 이상이 생기거나 변성이 생겨 발생한 질환이면 제한 없이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 망막 미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성(aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환(diabetic retinopathy), 망막색소변성(retinitis pigmentosa), 선천성 망막위축증, 레버씨 선천성 흑암시(Leber congenital amaurosis), 망막박리, 녹내장(glaucoma), 시신경병증 또는 외상일 수 있다.

본 발명에서 상기 치료용 조성물은 체외에서 인간 성체 줄기세포로부터 광수용체세포의 분화를 유도하여 신경 망막세포 또는 광수용체세포를 대량 증식 및 분화시킨 후, 이를 상기 질환을 갖는 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당 업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과 수술적으로 망막부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 망막부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기 조성물을 개체에게 투여하여 망막 변성 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 치료용 조성물의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명에서 용어, “투여“는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 망막 내 조직에 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 줄기세포의 망막세포로의 분화 방법은 단기간 내에 줄기세포로부터 풍부한 수의 광수용체세포를 생성할 수 있으며, 분화된 광수용체세포는 변성 또는 손상 망막에 이식 시, 망막 내에서 생착 및 융합함으로써 망막 변성을 방지 또는 회복할 수 있는 능력을 지니고 있어 세포치료에 효과적으로 이용할 수 있다. 또한 본 발명은 망막의 분화과정에 관여하는 새로운 유전자 및 분자들을 발견함으로써, 이들 유전자와 분자들에 의한 병변이나, 망막 변성질환의 발생 기전을 규명하고, 망막 변성방지 및 망막 신경보호를 위한 약제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은, anti-miR-203을 이용한 배아줄기세포, 성체줄기세포(중간엽 줄기세포 및 양막상피 줄기세포)로부터 광수용체로의 분화를 나타낸 도이다. (A)는 중간 발달 단계를 나타내는 마커에 의해 28일에 걸친 배아줄기세포의 성숙한 광수용체로의 신경 망막 분화를 개략적으로 나타낸 도이다. 성체줄기세포의 신경 망막 분화는 anti-miR-203의 연속적인 처리에 의해 직접 유도되었다. (B)는 인간 배아줄기세포 및 섬유아세포와 비교하여 양막 유래 줄기세포에 풍부한 miRNA의 발현을 나타내는 히트맵(heat map)이다. 각각의 miRNA에 대한 세 가지 세포 형태 중에서, 적색 사각형은 상대적으로 더 높은 발현을 나타내며 청색 사각형은 상대적으로 더 낮은 발현을 나타낸다. (C)는 세가지 다른 miRNA 표적 예측 프로그램에 의해 예상되는 miR-203의 후보 표적 유전자를 나타낸 도이다. 벤 다이아그램의 중첩되는 영역은 6개 망막 발달-특이적 유전자를 나타낸다. (D)는 miRanda에 의해 분석된 miRNA 및 6개 후보 표적 유전자의 정렬을 나타낸 도이다.
도 2는, 172개 인간 조직 중 성체 줄기세포에서 miR-203의 과발현을 나타낸 도이다. 막대 그래프 (A) 및 히트맵 (B)는 다양한 인간 조직에서 miR-203의 발현 수준을 나타낸다. 172개 조직 중 miR-203은 USSC(unrestricted adult stem cells)에서 8번째로 과다하게 발현되었다. 신경아세포(neuroblast), 중뇌(midbrain), 뇌하수체(pituitary), 해마(hippocampus), 소뇌(cerebellum) 등의 신경 조직에서 miR-203의 상대적인 발현 수준은 심지어 낮게 나타났다.
도 3은, 성체줄기세포를 신경 망막 세포 형태로 전환시키는 과정을 나타낸 도이다. (A)는 DKK1, Noggin, IGF-1 및 bFGF를 이용하여 제대혈 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포를 28일간 분화시키는 신경 망막 분화를 나타내는 개략도이다. (B)는 분화과정 동안 다른 시점(a; 0일, b; 14일, c 및 d; 28일, d는 c의 확대도)에서 양막 유래 줄기세포의 위상차 이미지를 나타낸 도이다. (C)는 인간 망막 조직(Retina)과 비교하여 분화 전(AESCs 및 UCB-MSCs) 및 28일 후(28D) 양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포의 신경 망막-특이적 유전자 발현 패턴을 보여주는 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. (D)는 세 가지 다른 세포 형태에서 OPN1MW, NRL 및 RHO의 상대적인 유전자 발현 수준을 보여주는 정량 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다: 제대혈 유래 줄기세포(UCB-MSCs), 28일간 분화시킨 제대혈 유래 줄기세포(DKK1) 및 인간 망막 조직(Retina).
도 4는, 양막 유래 줄기세포, DKK1을 포함하는 칵테일을 처리하여 분화시킨 양막 유래 줄기세포 및 anti-miR-203을 이용하여 분화시킨 양막 유래 줄기세포에서 신경 망막-특이적 유전자의 발현을 나타낸 도이다. (A)는 인간 망막 조직(Retina)을 포함하여 7일(7D) 및 21일(21D) 동안 칵테일-매개 분화시킨 AESC에서의 RT-PCR 분석결과이다. (B)는 미분화, 칵테일에 의해 또는 anti-miR-203에 의해 분화된 AESC에서 옵신 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 분석결과이다. (C)는 siRNA 음성 대조군을 반딧불이/레닐라 비율의 배수 변화를 보여주는 293T 세포에서 상대적인 루시퍼라제 활성을 나타낸 도이다. 상기 비율은 각각의 리포터 구조물로부터의 값에 대하여 표준화하였다.
도 5는, anti-miR-203에 의해 유도되는 성체 줄기세포의 신경 망막 세포로의 분화를 나타낸 도이다. (A)는 21일에 걸친 성체 줄기세포의 신경 망막 세포로의 분화과정 동안 anti-miR-203처리 시점을 보여주는 개략도이다. (B)는 anti-miR-203으로 형질감염 후 3일째에 양막 유래 줄기세포에서 DKK1의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타낸 정량 RT-PCR 분석 결과이다. *P<0.05, **P<0.01. (C)는 anti-miR-203-매개 분화과정 동안 다른 시점(a; 0일, b; 14일, c 및 d; 28일, d는 c의 확대도)에서 양막 유래 줄기세포의 위상차 이미지를 나타낸 도이다. (D)는 정상 인간 망막 조직(Retina)과 비교하여 분화 전(양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포), 분화 후 7일(7D) 및 21일(21D) 양막 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 신경 망막-특이적 유전자 발현 패턴을 보여주는 RT-PCR 정량 분석 결과를 나타낸 도이다. (E)는 정량 RT-PCR 분석에 의해 분화과정 동안 CHX10, RX 및 OPN1MW의 유전자 발현 수준을 인간 망막 조직과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은, anti-miR-203 장기처리에 따른 광수용체 형성을 나타낸 도이다. (A)는 28일에 걸친 과정 동안 양막 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 신경 망막 분화를 유발하는 anti-miR-203 연속처리에 대한 분화 개략도이다. (B)는 인간 망막 조직(Retina)과 비교하여 분화 전(AESCs 및 UCB-MSCs) 및 28일 후(28D) 양막 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 신경 망막-특이적 유전자 발현 패턴을 보여주는 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. (C)는 인간 망막 조직(Retina)과 비교하여 미분화 및 anti-miR-203-분화된 양막 유래 줄기세포에서 OPN1MW 및 NRL의 상대적인 유전자 발현 수준을 보여주는 정량 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. (D)는 미분화 제대혈 유래 줄기세포, 신경 망막-특이적 칵테일(DKK1)을 이용하여 분화시킨 제대혈 유래 줄기세포 및 anti-miR-203을 처리하여 분화시킨 제대혈 유래 줄기세포에서 Chx10, Otx2, 로돕신(rhodopsin) 및 옵신(opsin)의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과이다. (E) 및 (F)는 면역세포화학법에 의해 분화된 제대혈 유래 줄기세포에서 로돕신 및 옵신의 발현을 나타낸 도이다. 발현 빈도를 나타내었으며, 세포핵은 DAPI로 염색하였다.
도 7은, miR-203이 신경 망막 발달에 관여하는 유전자를 직접적으로 표적함을 나타낸 도이다. (A)는 인간 망막 조직(Retina)에 대한 미분화 세포(제대혈 유래 줄기세포 또는 양막 유래 줄기세포), 외인성 인자의 신경 망막-특이적 칵테일에 의해 분화된 세포(DKK1) 또는 anti-miR-203에 의해 분화된 세포(anti-miR-203)에서 miR-203의 상대적인 발현 수준을 나타낸 정량 RT-PCR 결과이다. ***P<0.001. (B)는 CRX 및 DKK1의 리포터 구조물을 개략적으로 나타낸 도이다. CRX 3'-UTR의 748 bp 단편 및 DKK1 3'-UTR의 278 bp 단편을 pmirGLO Dual-Luciferase vextor에 복제하였다. (C)는 miR-203 처리 후 레닐라(Renilla)에 대한 반딧불이의 배수변화로서 표현한 293T 세포에서의 상대적인 루시퍼라제 활성을 나타낸 도이다. 상기 비율은 각각의 리포터 구조물의 값에 대해 표준화하였다. *P<0.05. (D)는 신경 망막 발달과 관련된 발달 단계 및 유전자를 나타낸 개략도이다. 성숙한 miR-203은 DKK1, CRX, RORB, NEUROD1, THRB 및 NRL과 같은 유전자의 억제제로서 신경 망막 분화에 관여하는 것을 확인하였다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 망막세포 분화유도용 miRNA 선별; 마이크로어레이 분석(Microarray analysis)

인간 배아줄기세포, 섬유아세포 및 양막 상피 줄기세포에서 망막 발달 특이전사 발현량의 차이를 비교하고자 마이크로 어레이 기술을 이용하였다.

애질런트 인간 microRNA 어레이는 Sanger miRBASE public database (Release 12.0, 2008년 9월)의 자료인 모든 인간 miRNAs에 대한 프로브 및 주석정보를 함유하고 있다. 애질런트 인간 모든 게놈 에레이는 GRCh34(Genome Reference Consortium Human Build 34) 자료인 모든 인간 유전자들에 대한 프로브 및 주석정보를 함유하고 있다. 상기 애질런트 miRNAs 프로브는 1회 배열을 기준으로 20회 복제하였다.

GeneSpring GX 소프트웨어는 데이터 정상화, 클러스팅, 변형된 miRNA 선택 및 통계분석에 사용하였으며 유전자 발현량을 계산하여 각 유전자에 대한 상대적 강도를 나타내었다.

상기 마이크로 어레이 방법을 통하여 인간 배아줄기세포, 섬유아세포 및 양막 유래 줄기세포의 유전자를 비교해 본 결과 38 개의 miRNA가 인간 배아줄기세포 및 섬유아세포보다 양막 유래 줄기세포에서 높게 발현됨을 확인하였다(도 1). 또한 상기 38 개 miRNAs의 각각에 대한 표적물을 miRNA 표적 예측 프로그램을 통하여 예측하였으며 특히 DKK1, NOG 및 NEUROD1을 포함하는 6개의 망막 발달-특이 전사인자에 대하여 자세히 분석하였다. 이러한 분석을 통하여, 상기 38개 miRNAs 가운데, mirR-203이 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB와 같은 망막 특이 발생 유전자 대부분을 표적하는 것으로 확인하였다(표 2).

실시예 2: 컴퓨터 분석

hsa-miR-203(GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG, 서열번호 1) 표적물의 예측은 3가지 온라인 miRNA 표적 예측 프로그램, TargetScanHuman(Release 5.2), miRanda(Release August 2010) 및 DIANA microT(Version 3.0)에서 수행하였다.

miRNA에 대한 조직 발현 양상은 26가지 조직계로부터 250 개 이상의 소형 리보핵산 라이브러리(small RNA libraries)를 기반으로 한 microRNA.org resource를 이용하여 분석하였다. 상기 분석결과, 인간 및 설치류 세포는 정상 및 악성 조혈세포 및 조직뿐만 아니라 신경세포도 풍부하였다.

도 1의 C에 제시된 벤 다이아그램에서와 같이 miRNA 표적 예측 프로그램, TargetScanHuman 및 miRanda에서 mirR-203 표적물로서 상기 6개 유전자를 동일하게 예측하였고, 5개 유전자는 DIANA-microT program에 의해 예측할 수 있었다(표 3 , 표 4 및 표 5). miR-203의 성숙 시퀀스는 각 표적유전자의 결합부위을 보충하였다(도 1의 D). microRNA.org resource는 miR-203의 조직발현양상을 제공하였다(Nucleic Acids Res 36: D149-53, 2008).

상기 miR-203은 성체줄기세포에서 풍부하게 발현되었고 USSC(unrestricted adult stem cells)는 miR-203을 발현하는 172개 조직 중 상위 8번째 위치를 차지하였다(도 2). 또한 상기 예측프로그램을 통하여 miR-203이 DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB와 같은 망막 특이 발생 유전자 대부분을 표적하는 것으로 분석됨으로서, 상기 miR-203의 억제제가 성체 줄기세포의 신경망막분화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 줄기세포로부터 신경망막세포 분화 유도

실시예 3-1. 줄기세포 배양

인간 양막 유래 줄기세포 및 인간 제대혈 유래 줄기세포 배양은 공지된 방법에 의해 실시하였다(Hong et al., 2012, Seo et al., 2011).

인간 양막 유래 줄기세포를 유지하기 위하여 10 % fetal bovine serum (FBS, Invitrogen), 100 U/ml 페니실린( penicillin, Invitrogen) 및 100 U/ml 스트렙토마이신(streptomycin, Invitrogen)을 보충하면서 각질세포 무혈청 배양액(Keratinocyte - SFM, Invitrogen)에서 배양하였다.

제대혈 유래 줄기세포는 EGM-2SingleQuots (Lonza) 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 U/ml 스트렙토마이신이 첨가된 EBM-2(Endothelial Cell Basal Medium-2, Lonza)에서 배양하였다.

신경망막세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대 8 내지 15의 제대혈 유래 줄기세포 및 계대 2 내지 5의 양막 유래 줄기세포를 이용하였다.

실시예 3-2. 신경망막 분화유도

상기 줄기세포의 신경망막세포로의 분화를 유도하기 위하여 상기 실시예 3-1의 줄기세포유지 배양배지에 N-2 Invitrogen), B-27(Invitrogen) 및 1% FBS가 함유된 분화배지를 2일 마다 교체하면서 배양하였다.

본 발명에서는 외인성 요소들(exogenous factors)의 칵테일 또는 miRNA 억제제를 이용한 2가지 방법으로 성체 줄기세포를 신경망막세포로 분화를 유도하였다.

실시예 3-3. 외인성 요소들(exogenous factors)의 칵테일을 이용한 분화유도방법

상기 배양된 줄기세포를 신경망막세포로 분화시키기 위하여, 100 ng/ml Dkk-1(R&D systems), 10 ng/ml Noggin(R&D systems), 10 ng/ml IGF-1(Peprotech) 및 5 ng/ml bFGF(Peprotech)를 첨가한 분화배지에서 배양하였다. 3주 배양한 후, 이전 단계에서 첨가해주던 외인성 요소들(exogenous factors)의 칵테일은 배양액에 첨가하지 않고 분화배지에서 배양하였다.

양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포에 상기 신경망막분화용 칵테일을 첨가하여 배양한 결과(도 3의 A). 둥근 모양을 한 양막 상피 줄기세포가 신경과 유사한 형태로 변하는 것을 도 3의 B에서 확인하였다.

분화 말기에 양막 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포는 세포공급원에 의존하여 분화가 이루어졌다. 28일 동안 분화를 유도한 후, 신경망막세포 마커가 제대혈 유래 줄기세포에서 발현되었지만 양막 상피 줄기세포에서는 대부분 발현되지 않았다(도 3의 C 및 도 4).

상기 배양된 제대혈 유래 줄기세포에서 광수용체 유전자 OPN1MW, NRL 및 RHO의 발현을 정량적으로 분석하였다. 도 3의 D에서는 상기 3가지 광수용체 유전자의 상대적 발현 수준(각각 12.9, 0.01, 0.0004)을 인간 망막조직 발현 수준과 비교하여 나타내었다. 이와 같은 결과들은 신경망막 분화용 칵테일이 제대혈 유래 줄기세포를 신경망막 세포 형태로 분화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 3-4: anti-miR-203을 이용한 분화유도 방법

상기 배양된 줄기세포를 신경망막세포로 분화시키기 위하여, 세포를 분화배지에서 배양하면서 반복적으로 anti-miR-203(Ambion)를 매 7일 마다 처리하여 분화를 유도하였다. 3주가 지난 후, anti-miR-203은 배양액에 첨가하지 않고 분화배지에서 배양하였다.

miR-203의 예측된 표적군은 여러가지 신경망막 특이 유전자를 포함하고 있기 때문에 본 발명에서는 성숙한 miR-203의 기능을 차단하기 위하여 anti-miR-203을 세포에 처리하였다(도 5의 A). anti-miR-203을 처리한 세포에서 miR-203 표적 유전자 DKK1의 발현농도가 형질감염 3일째에 2배 정도 증가함을 확인하였다(도 5의 B). 이러한 결과를 토대로, 성체 줄기세포를 21일 동안 배양한 후 anti-miR-203으로 형질감염을 실시하였다. 형질감염이 2번 실시된 21일 째, 양막 상피 줄기세포의 형태는 신경과 유사한 모양으로 변하였다(도 5의 C).

실시예 3-5: miRNA이 억제된 줄기세포에서 신경망막세포 발현 유전자 확인

칵테일 매개 신경망막 분화에 의한 유도와는 달리, anti-mir-203은 제대혈 유래 줄기세포보다 양막 유래 줄기세포의 유전자 발현양상이 더욱 두드러지게 나타났다. 신경 망막 전구세포 마커 RX, 광수용체 전구세포 마커 CRX 및 초기 추상체 광수용체 마커 THRB는 1 차 형질감염 7일째에 양막 유래 줄기세포에서 발현되었다(도 5의 D). 3주 경과 후, 성숙한 추상체 광수용체 세포 마커 OPN1MW이 발현되었다. 게다가 상기 세포에서 유전자 발현 수준을 정량적으로 평가한 결과, CHX10, RX 및 OPN1MW의 발현 수준이 인간 망막 조직과 비교하여 21일 동안 분화유도된 양막 유래 줄기세포에서 각각 0.1, 0.01, 0.005로 측정되었다(도 5의 E). 제대혈 유래 줄기세포에서 유전자 발현량의 차이는 2차 형질감염 21일째에 관찰되었다. 특히 신경 망막 전구세포 CHX10 및 광수용체 전구세포 마커 RORβ 및 OPN1MW이 2차 형질감염시기에 발현되었다(도 5의 D).

이러한 결과를 통하여, 상기 2가지 성체줄기세포의 신경망막으로의 분화는 세포 공급원에 따라 유도될지라도, 신경 망막세포 특이 유전자 발현량은 시간이 지남에 따라 차이가 나타났으며 anti-miR-203에 의해 분화가 유도됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4. miR -203이 억제된 줄기세포에서 광수용체세포 유전자 또는 단백질 발현 확인

실시예 4-1. 세포 형질감염

miRNA 억제제에 의한 줄기세포의 형질감염은 상기 DharmaFECT 형질감염시약(Thermo Scientific)을 이용하여 실시하였다. 상기 세포의 형질감염은 30 nM anti-miR-203(Ambion Anti-miR miRNA Inhibitor) 또는 음성 대조군 siRNA(QIAGEN AllStars Negative Control siRNA)를 이용하여 실시하였다.

상기 세포를 1일 동안 형질감염시킨 후, 분화배양액에서 배양하였으며 반복적인 형질감염은 매 7일 마다 3회 실시하였다.

실시예 4-2. miR-203이 억제된 줄기세포로부터 광수용체세포로 분화유도

제대혈 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포를 광수용체 세포로 분화 유도하기 위하여 anti-miR-203을 연속처리하였다. anti-miR-203의 일차 형질감염은 mature 광수용체 마커 발현을 유도하기에 충분하지 않았지만 이차 형질감염은 OPN1MW이 발현되었다. 따라서 본 발명에서는 anti-miR-203의 여러 처리가 성체줄기세포를 광수용체 세포로 분화를 유도하는데 필수적임을 확인하기 위하여 상기 줄기세포를 28일 동안 배양한 다음 anti-miR-203의 3회 연속 형질감염을 실시하였다(도 6의 A).

실시예 4-3. miR-203이 억제된 줄기세포에서 광수용체세포 발현 유전자 확인

인간 망막 조직(Retina)과 비교하여 분화 전(AESCs 및 UCB-MSCs) 및 28일 후(28D) 양막 유래 줄기세포와 제대혈 유래 줄기세포의 신경 망막-특이적 유전자 발현 패턴을 RT-PCR 분석을 실시하여 확인하였다.

분화과정의 마지막 단계에서 여러가지 유전자들 즉, 광수용체 마커 OPN1MW, NR2E3 및 NRL이 양막 유래 줄기세포에서 상향 조절되었으며 또한 추상체 광수용체 마커 NR2E3 및 NRL이 분화 유도된 제대혈 유래 줄기세포에서 발현되었다(도 6의 B).

인간 망막 조직(Retina), 미분화 양막 유래 줄기세포 및 anti-miR-203-매개 분화 유도된 양막 유래 줄기세포에서 OPN1MW 및 NRL의 유전자 발현 수준을 정량 RT-PCR 분석을 실시하여 확인하였다(도 6의 C).

광수용체 마커 OPN1MW 및 NRL의 발현은 anti-miR-203-매개 분화 유도된 양막 유래줄기세포에서 두드러지게 높게 나타났다. 특히 NRL 유전자 발현 수준은 정상 망막 조직에서의 발현수준 만큼 높았다(도 6의 C).

실시예 4-4. miR-203이 억제된 줄기세포에서 광수용체세포 발현 단백질 확인

다른 추상체 광수용체 마커 로돕신(rhodopsin)의 발현양상은 웨스턴 블롯 분석 및 면역세포화학법을 실시하여 분화된 제대혈 유래 줄기세포에서 확인하였다(도 6의 D 및 도 6의 E). 또한, 추상체 광수용체 마커, 옵신(opsin)은 분화된 성체줄기세포에서 발현되는 것을 확인하였다(도 6의 D, 도 6의 E, 도 4). 흥미롭게도 로돕신 및 옵신 마커는 신경 망막 칵테일-분화세포에서보다 anti-miR-203-매개 분화세포에서 더 많은 양의 유전자가 발현되었다(도 6의 D). anti-miR-203-매개 분화가 일어난 후, 제대혈 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포는 신경과 유사한 모양을 나타내었다. 도 6의 E는 제대혈 유래 줄기세포에서 로돕신의 발현 그리고 양막 유래 줄기세포에서 옵신의 발현을 나타낸 도이다. 상기 분화된 세포의 유전자 발현량은 제대혈 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포 각각 24.5 % 및 18.5 %로 나타났다(도 6의 F). 반면 anti-miR-203 억제제의 연속처리는 성체 줄기세포를 두 가지 광수용체 아형으로 분화를 유도할 수 있었다.

이상의 결과를 통하여, miR-203이 억제된 줄기세포에서 광수용체 특이 유전자 OPN1MW 및 NRL이 발현되고, 많은 양의 로돕신 및 옵신 단백질이 발현됨을 확인할 수 있었고, 그에 따라 상기 miR-203 억제제인 anti-miR-203이 줄기세포의 망막세포분화를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. miR-203에 의한 줄기세포의 망막세포분화 억제 기능 확인

miR-203이 망막세포 발현에 관여하는 유전자를 직접적으로 타겟함을 입증하기 위해, 클로닝 및 루시퍼라제 방법을 실시하여 확인하였다.

실시예 5-1. 미분화줄기세포 또는 분화유도된 세포에서 miR-203 발현 확인

인간 망막 조직(Retina)에 대한 미분화 세포(제대혈 유래 줄기세포 또는 양막 유래 줄기세포), 외인성 인자의 신경 망막-특이적 칵테일에 의해 분화된 세포(DKK1) 또는 anti-miR-203에 의해 분화된 세포(anti-miR-203)에서 miR-203의 상대적인 발현 수준을 확인하고자 정량 RT-PCR을 실시하였다(도 7의 A).

양막 상피 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포에서 miR-203의 발현 수준은 망막 조직과 비교하여 각각 44 배 및 27배로 두드러지게 높게 나타났다. 흥미롭게도 상기 두 성체 줄기세포 유형의 miR-203 발현 수준 다음으로 신경망막 분화의 발현수준이 망막조직보다 두드러지게 감소하였다. 게다가 anti-miR-203-매개 분화가 일어난 후 miR-203은 발현되지 않았다.

이상의 결과를 통하여, 줄기세포의 망막세포로의 분화를 억제하는 miR-203이 미분화 줄기세포에 다량함유되어 있음을 확인할 수 있었으며, 신경 망막 분화 칵테일 및 anti-miR-203이 처리된 성체 줄기세포에서 miR-203이 감소됨으로써 신경 망막으로 분화를 유도하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 분화과정에서 anti-miR-203이 DKK1 또는 다른 5가지 표적 유전자의 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2. miR-203이 억제된 줄기세포에서 CRX, DDK1 발현 확인

예측되는 miR-203 표적 결합서열(CATTTCA)을 포함하는 3'-UTR(CRX, NM_000554.4, 748 bp; DKK1, NM_012242.2, 278 bp) 절편을 하기 표 6의 프라이머를 이용하여 역전사 증폭기법(RT-PCR)으로 증폭하였다.

증폭한 다음, T 백터 연결 및 제한 효소 FastDigest XhoI 및 FastDigest AccI (Thermo Scientific)를 사용하여 이중분해를 실시하였다. 마지막으로, 3'-UTR 절편을 4 DNA Ligase (Invitrogen)를 사용하여 pmirGLO Dual-Luciferase miRNA 타겟 발현 백터(Promega)에 클로닝하였다(도 7의 B). 상기 증폭된 산물은 하기 표 7의 DNA 프라이머를 이용하여 확인하였다.

293T 세포를 형질감염 24시간 전에 24-웰 화이트 플레이트(NUNC)에 웰 당 50,000개씩 분주하였다. 293T 세포에 상기 증폭된 산물(1 ㎍), 30 nM miR-203 또는 음성 대조군과 같이 동시-형질감염시켰다. 형질감염은 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 제작자가 제시한 방법에 따라 실시하였다. 형질감염 48시간 후, Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)을 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 및 레닐라 루시퍼라제(Firefly 및 Renilla luciferase)활성을 측정하였다.

본 발명에서 CRX 리포터 및 DKK1 리포터 유래 루시퍼라제 활성은 miR-203이 있는 상태에서 두드러지게 억제되었으며(도 7의 C 및 도 4) 이러한 결과는 miR-203이 CRX 및 DKK1의 3'-UTRs에서 miR-203의 예측되는 타켓 결합지점과 상호 작용함을 나타낸다. 따라서, miR-203 타켓의 하향 조절이 293T 세포의 신경 망막 세포 분화 유도에 관여함을 알 수 있었다. .

이러한 결과를 통하여, miR-203이 성체줄기세포에서 풍부하게 발현되고 줄기세포를 배양시 miRNA-203을 억제함으로써, DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 및 THRB의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 7의 D). 그에 따라 상기 miR-203이 주요 miRNA에 의해 억제되는 다수의 유전자를 조절함으로써 세포 분화를 조절할 수 있는 유용한 도구일 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method for differentiation into retinal cells from stem cells using inhibition of miRNA-203 <130> PA120808KR <160> 47 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miRNA-203 <400> 1 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRX- Xho 1 <400> 2 ctcgaggaag ccccgtcggg aaacct 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRX- Acc 1 <400> 3 gtcgacaggg ctcttggaac ccgcct 26 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK- Xho 1 <400> 4 ctcgagtgga actcccctgt gattgcagta 30 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK- Acc 1 <400> 5 gtcgactcat tccaagagat ccttgcgttc t 31 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for DKK-1 <400> 6 tccgaggaga aattgaggaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for DKK-1 <400> 7 cctgaggcac 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<400> 15 catgccaggg tcttggtact 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OTX2 <400> 16 caacagcaga atggaggtca 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OTX2 <400> 17 ctgggtggaa agagagaagc tg 22 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CRX <400> 18 gtgaggaggt ggctctgaag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CRX <400> 19 acatctgtgg agggtcttgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RORB <400> 20 tttaggagga gccagcagaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RORB <400> 21 tctgcacctc agcatacagg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NEUROD1 <400> 22 tagacctgct agcccctcag 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NEUROD1 <400> 23 ctcgctgtac gatttggtca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for THRB(TRB2) <400> 24 agctgaaaaa tgggggtctt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for THRB(TRB2) <400> 25 tcacgtggtg ttttcggtaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for OPN1NW <400> 26 gctacaccgt ctccctgtgt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for OPN1NW <400> 27 acctgctcca accaaagatg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NR2E3 <400> 28 aggaccagtc ccaagtgatg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NR2E3 <400> 29 cctatggtct tgcggaaaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Recoverin <400> 30 agctccttcc agacgatgaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Recoverin <400> 31 caaactggat cagtcgcaga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NRL <400> 32 ccaagaagtc cccaagacaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NRL <400> 33 aagtctcacc tcagccctca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Rhodopsin <400> 34 tcatggtcct aggtggcttc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Rhodopsin <400> 35 ggaagttgct catgggctta 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Calbindin(CALB,CALB1) <400> 36 tttcgagatc tggctccatt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Calbindin(CALB,CALB1) <400> 37 tgcccatact gatccacaaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PRKCA(PKC-alpha) <400> 38 cctaaaggct gaggttgctg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PRKCA(PKC-alpha) <400> 39 atttagtgtg gagcggatgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Calretinin(CALB2) <400> 40 gctccaggaa tacacccaaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Calretinin(CALB2) <400> 41 cagctcatgc tcgtcaatgt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for RLBP1(CRALBP) <400> 42 agcccgattt aacggaaact 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for RLBP1(CRALBP) <400> 43 ttggacctgg gttcaagttc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for STX1A(HPC-1) <400> 44 gaccgcttca tggatgagtt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for STX1A(HPC-1) <400> 45 atggactgct cgatgctctt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BRN3B(POU4F2) <400> 46 agccggtgag aatgtgaaac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BRN3B(POU4F2) <400> 47 tgaacacggg tgatgtctgt 20

Claims

줄기세포 배양시 miRNA-203(microRNA-203)을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 miRNA-203의 억제는 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임으로 구성된 군에서 선택되는 miRNA-203 억제제를 이용하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 miRNA-203을 억제시켜, DKK1, CRX, RORβ NEUROD1, NRL 또는 THRB의 발현을 증가시키는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포의 유래는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포를 망막세포로 분화시키는 방법은 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임으로 구성된 군에서 선택되는 miRNA-203 억제제를 포함하는 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 배양단계는 1일 내지 28일 동안 수행하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 분화배지는 페니실린, 스트렙토마이신 및 소태아혈청이 첨가된 각질세포 무혈청 배지(Keratinocyte-SFM) 또는 EBM-2 배지(Endothelial cell basal medium-2)에 B-27 보충제 및 N-2 보충제를 추가로 포함하는 것인 방법.
miRNA-203(microRNA-203)을 억제제로 포함하는, 줄기세포로부터 망막세포 분화 유도용 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포인 것인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 miRNA-203 억제제는 miRNA-203에 특이적인 siRNA, 앱타머, 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 리보자임인 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 성체 줄기세포 유래는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것인 조성물.
제 10항에 있어서, 줄기세포를 anti-miRNA를 포함하는 배지에서 배양하여 망막세포로 분화시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법을 이용한 망막세포 제조방법.
제 14항의 방법으로 제조된 망막세포를 포함하는, 망막 변성 관련 질환의 치료용 조성물.
제 15항에 있어서, 상기 망막변성 관련 질환은 망막미형성, 망막 변성(retinal degeneration), 노인성 황반변성 (aged macular degeneration), 당뇨병성 망막 질환 (diabetic retinopathy), 망막색소변성 (retinitis pigmentosa), 녹내장(glaucoma), 시신경병증, 외상, 망막박리, 레버씨 선천성 흑암시 및 선천성 망막위축증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물.