TWI762460B - 使用ｍｉＲ-３０２前驅物作爲治療阿茲海默症之藥物的組合物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明一般涉及使用重組microRNA(miRNA)及其髮夾型前驅物(pre-miRNA)作為用於治療阿茲海默症(AD)的治療藥物之組合物及方法。更具體而言，本發明涉及人工製造之miRNA miR-302前驅物(pre-miR-302)在人類的阿茲海默症治療中的用途。這些pre-miR-302分子可在原核生物中以DNA表達勝任DNA載體及/或髮夾型RNA之形式大量生成。由於原核細胞不會轉錄或處理髮夾型RNA，本發明亦教示一種用於在原核生物中使用在原核生物中新發現之新穎髮夾型RNA轉錄機制來表達pre-miRNAs的方法，亦即，pro-miRNA。此外，由於miR-302是人類眾所周知的胚胎幹細胞(ESC)特異性因子，本新穎發明之研究結果可進一步推廣用於治療許多其他老化相關退行性疾病之新穎再生醫學的設計及開發，例如帕金森氏症、骨質疏鬆症、糖尿病及癌症。

Description

使用miR-302前驅物作為治療阿茲海默症之藥物的組合物及方法 相關申請案的交互參照

本發明主張於2015年12月2日申請之美國臨時申請案No.62/262,280之優先權，其標題為「miR-302通過Akt訊號活化來減弱Aβ誘發神經毒性(miR-302 Attenuates Aβ-induced Neurotoxicity through Activation of Akt Signaling)」。

本發明一般涉及使用重組microRNA(miRNA)及其髮夾型前驅物(pre-miRNA)作為用於治療阿茲海默症(AD)的治療藥物之組合物及方法。更具體而言，本發明涉及人工製造之miRNA miR-302前驅物(pre-miR-302)在人類的阿茲海默症治療中的用途。這些pre-miR-302藥物可在原核生物中以表達勝任DNA載體及/或髮夾型結構RNA之形式大量生成。由於原核細胞不會轉錄或處理類似於原核生物中之轉錄終止密碼的髮夾型RNA，且基於原核生物中亦進一步缺乏數種必要真核酵素，例如第二型RNA聚合酶(type-II RNA polymerases,Pol-2)以及核糖核酸酶III Dicers(RNaseIII Dicers)，本文之本發明進一步教示在原核生物中使用在原核生 物中新發現之新穎髮夾型RNA轉錄機制來表達pre-miRNAs，或稱之為pro-miRNA的方法(如申請人之先前美國專利申請案No.13/572,263中所揭示)。此外，由於miR-302是人類眾所周知的胚胎幹細胞(ESC)特異性因子，本發明之研究結果可進一步推廣用於治療許多其他老化相關退行性疾病之新穎再生醫學的設計及開發，例如帕金森氏症(Parkinson’s diseases)、糖尿病(diabetes)、骨質疏鬆症(osteoporosis)及癌症。

胰島素阻抗(Insulin resistance)表示其對於靶組織之正常功能的喪失或減低，且因此影響我們的認知和記憶功能，最終導致阿茲海默症(AD)的發病(Cholerton等，2011)。胰島素阻抗與先前驗證之加速認知功能障礙和老化過程的數種風險因素相關聯，包含糖尿病、肥胖、高血壓(hypertension)，高脂血症(hyperlipidemia)和代謝症候群(metabolic syndrome)(Spielman等，2014)。具體而言，出現缺陷的胰島素受體(insulin receptor，IR)及胰島素受體基質-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)之大腦會顯現促進阿茲海默症的胰島素訊號之改變或異常活化，其中阿茲海默症是癡呆的最常見原因(Williamson等，2012)。此些研究結果指出神經胰島素訊號在阿茲海默症的大腦中變得具功能障礙，類似於第二型糖尿病(Type 2 diabetes)的癡呆症狀。阿茲海默症的的致病機轉首先是藉由胞外乙型類澱粉(amyloid-β,Aβ)胜肽之存在而誘發，其破壞粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)並促使胞內活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)的累積量增加，最終造成神經細胞死亡(Butterfield DA，2002；Li等人，2015)。已普遍的認知Aβ堆積可能在老化相關阿茲海默症之病理機制中扮演了重要角色(Lesne等，2013)。另外，申請人先前之研究提示了Aβ誘發p-Ser307 IRS-1的表達，且抑制IRS-1酪氨酸磷酸化(IRS-1 tyrosine phosphorylation)及其下游靶蛋白激酶B(PKB，也稱為Akt)(Kornelius等，2015)。隨後，Aβ進一步抑制肝醣合成酶激酶3β(GSK3β)之Ser9磷酸化，其中此為負責引起Tau過度磷酸化及神經毒性的酵素之一(Hernandez等，2013)。這些發現都表明於阿茲海默症患者中胰島素訊號在Aβ誘發神經毒性及神經細胞死亡中扮演了關鍵的調控角色。

細胞的存活是藉由外部因子像是生長因子(growth factors)來維持，其缺乏通常會導致細胞凋亡。Akt訊號路徑被報告為抑制細胞凋亡之生長因子介導細胞存活機制之主要下游效應物(a major downstream effector)(Bhat和Thirumangalakudi，2013)。對此，Akt作用以通過滅活部分促細胞凋亡介導因子(pro-apoptotic mediators)以促進細胞存活，促細胞凋亡介導因子例如為Bid，涉及誘發死亡受體介導細胞凋亡之Bcl-2家族的促凋亡成員(Majewski等人，2004)。另外，Akt訊號可以通過活化核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/第一型血紅素氧化酶(heme oxygenase-1,HO-1)抗氧化路徑來減少氧化壓力(Surh等人，2008)，從而致使避免Aβ誘發神經毒性(Kwon等，2015)。因此，這些經報告的針對細胞凋亡及氧化壓力之Akt介導保護機制可用於防止人類腦部之神經退行(neurodegeneration)和粒線體功能障礙。有意思的是，在人類胚胎幹細胞(hESC)中，發現microRNA miR-302通過下調磷酸酶與張力蛋白同源物(tensin homolog,PTEN)介導Akt活化以維持hESC之多能性(Alva 等，2011)。進一步，Akt訊號亦調節多能性相關基因Nanog以維持幹細胞自我更新和抗老化(Kuijk，2010；Han等，2012)。基於上述所有發現，發明人提出miR-302可能能夠刺激神經元中Akt訊號路徑的活化，從而避免在阿茲海默症患者中之Aβ誘發神經毒性。然而，作為體細胞一種類型的神經元通常不表達miR-302。

MicroRNA(miRNA)miR-302是在人類胚胎幹細胞(hESCs)和誘導多能幹細胞(iPSCs)中特異發現之最富集非編碼RNA。發明人先前之研究顯示，哺乳動物體細胞中的異位表達miR-302能夠重編程體細胞為類hESC之誘導多能幹細胞(iPSCs)(如Lin等人，2008年，2010年及2011年；EP 2198025；US 12/149,725；US 12/318,806；US 12/792,413所示)。此外，發明人亦觀察到引入miR-302於哺乳動物細胞中可進一步誘發許多其他miRNA因子(miRNA species)的表達，例如miR-92、miR-93、miR-367、miR-369、miR-371-373、miR-374、miR-517及整個miR-520家族成員(Lin等人，2008年、2010年及2011年；EP 2198025；US 12/149,725；US 12/318,806；US 12/792,413)。使用網路上於桑格研究院miRBase網站(the Sanger Institute miRBase website)(http：//www.mirbase.org/)發佈之「TARGETSCAN」及「PICTAR-VERT」程式的進一步分析，顯現了miR-302與這些受激miRNAs共享超過400個靶基因，暗示其可能扮演如同miR-302之類似角色或部分功能性角色。基於發明人及許多其他先前研究報告，這些共享的靶基因包含但不限於下列之成員：RAB/RAS相關致癌基因、ECT相關致癌基因、多形性腺瘤基因(pleiomorphic adenoma genes)、E2F轉錄因子(E2F transcription factors)、細胞週期蛋白D結合Myb類轉錄因子(cyclin D binding Myb-like transcription factors)、HMG盒轉錄因子(HMG-box transcription factors)、Sp3轉錄因子(Sp3 transcription factors)、轉錄因子CP2類蛋白(transcription factor CP2-like proteins)、NFkB活化蛋白基因(NFkB activating protein genes)、細胞週期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)、MAPK/JNK相關激酶、SNF相關激酶、肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinases)、TNF-α誘導蛋白基因(TNF-alpha-induce protein genes)、DAZ相關蛋白基因、LIM相關同源箱基因(LIM-associated homeobox genes)、DEAD/H盒蛋白基因(DEAD/H box protein genes)、叉頭框蛋白基因(forkhead box protein genes)、BMP調節子(BMP regulators)、Rho/Rac鳥嘌呤核苷酸交換因子(Rho/Rac guanine nucleotide exchange factors)、IGF受體(IGFR)、內皮素受體(endothelin receptors)、左右決定因子(left-right determination factors,Lefty)、細胞週期蛋白(cyclins)、p53誘導型核蛋白基因(p53 inducible nuclear protein genes)、類視網膜母細胞瘤基因1(RB-like 1)、RB結合蛋白基因、最大結合蛋白基因(Max-binding protein genes)、免疫識別的c-MIR細胞調節子(c-MIR cellular modulator of immune recognition)、Bcl2類凋亡促進子(Bcl2-like apoptosis facilitator)、原鈣黏附蛋白基因(protocadherins)、TGFß受體、整合素ß4/ß8(integrin ß4/ß8)、抑制素(inhibin)、錨蛋白(ankyrins)、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、組蛋白乙醯基轉移酶MYST3(histone acetyltransferase MYST3)、核RNP H3(nuclear RNP H3)、以及許多核受體和因子。值得注意的是，這些靶基因大多數係高度參與胚胎發育及癌症致瘤性(cancer tumorigenecity)。因此，可以想到miR-302可刺激這些下游同 源miRNAs，像是miR-92、miR-93、miR-367、miR-371-373、miR-374及miR-520，以增強及/或保持其功能。

特別地，發明人注意到miR-302、miR-92~93、miR-367、miR-371-374及miR-520都是hESCs和iPSCs中大量表達的hESC特異性miRNA(Lin等人，2008；EP 2198025；U.S.12/149,725)，所有這些亦可用於設計和開發新型再生醫學。為了達到此目的，例如hESCs和iPSCs之幹細胞可讓人們作為寶箱及工具使用，以篩選、搜索、提取及生產有用於設計及開發許多醫學及治療用途之新穎有效藥物成分，包括但不限於，刺激組織/器官再生、修復及/或恢復損傷/老化的細胞/組織、治療老化相關的退行性疾病(亦即阿茲海默症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、糖尿病及癌症)、以及預防腫瘤和/或癌症形成/進展/轉移。因此，可體認到人們可以使用這些hESC特異性miRNA作為用於開發新穎療法及活體內治療人類疾病的候選藥物。為了滿足這個目標，人們需要使用現代藉由細菌細胞之DNA重組及擴增技術來生產顯著大量髮夾型miRNA及其前驅物(pre-miRNAs)的方法；然而，眾所周知，髮夾型DNA/RNA結構類似於原核生物中內在轉錄終止機制(intrinsic transcription termination mechanisms)的訊號(McDowell等人，Science 1994)，且因此使得原核細胞不可能轉錄髮夾型RNA，像是小髮夾RNAs(small hairpin RNAs,shRNA)、microRNAs(miRNA)及相關前驅物(亦即，pre-miRNA)。針對此問題，不管是miR-302的第一個發現者Houbaviy等人(Developmental Cell(2003)5,351-358)或下一個追隨者Kim等人(WO 2005/056797)皆未提供任何對此之解決方案。

此外，從目前的教科書中習知，所屬技術領域中具有通常知 識者一定會知道原核與真核轉錄機制是不同的，且因此在許多方面彼此不相容。例如，基於大多數目前的理解，真核RNA聚合酶不直接結合基因啟動子序列，且因此需要額外的輔助蛋白來幫助其啟動RNA轉錄，而原核RNA聚合酶可形成直接與基因啟動子結合的全酶，以起始RNA轉錄。然而，由於全酶不能通過具有高度二級結構的DNA序列，例如髮夾DNA來處理，原核啟動子本質不包含任何髮夾型結構，否則會類似於原核生物中的轉錄終止密碼(McDowell等人，1994)。此外，所屬技術領域中具有通常知識者通常明瞭真核信使RNA(mRNA)藉由第二型RNA聚合酶(Pol-2)於細胞核中轉錄，然後被處理及輸出至細胞質中以用於合成蛋白質，而由於原核細胞像是細菌或古細菌不具有任何核狀結構，原核生物RNA轉錄及蛋白質轉譯是在相同位置(細胞質)以相同片段DNA同時進行。由於這些差異，使得原核生物難以或甚至不可能使用真核RNA啟動子生成真核RNA及相關胜肽/蛋白質，其中真核RNA啟動子傾向於包含具有特異性二級結構的DNA基序在5'-非轉譯區(5'-UTR)中。

在細菌細胞中生產哺乳動物基因產物的現有技術嘗試，諸如授予Buechler的美國專利No.7,959,926與授予Mehta的美國專利No.7,968,311，使用了細菌或噬菌體啟動子。由於原核生物不含任何剪接機制像是剪接體來處理內含子，因此製造所需基因的缺內含子(intron-less)互補DNA(cDNA)，並複製入由細菌或噬菌體啟動子驅動的質體載體中。接著，所獲得之載體被引入細菌細胞之勝任菌株(competent strain)中，例如Escherichia coli(E.coli)，以表達基因轉錄物(即mRNA)，且接續將mRNAs轉譯成蛋白質。然而，細菌和噬菌體啟動子，諸如Tac、Lac、Tc、T1、T3、 T7及SP6 RNA啟動子不是pol-2啟動子，且其轉錄活性傾向為錯誤傾向過程(error-prone process)，其導致突變，且無法表達髮夾型miRNAs或shRNAs，如McDowell等人(Science 1994)所報告。此外，Mehta進一步教示甘油/甘油(glycerol/glycerin)可能用於提高細菌轉形的效率；然而，沒有任何教示與加強RNA轉錄相關，特別是pol-2啟動子驅動的髮夾型RNA轉錄。由於真核和原核轉錄系統之間缺乏相容性，這些現有技術仍受限於使用原核RNA啟動子在原核生物中表達基因cDNA，且其皆無法用於表達髮夾型RNA，如miRNAs和shRNAs。

使用原核生物中新發現的新穎髮夾RNA轉錄機制(Lin等人，美國專利申請號No.13/572,263、No.14/502,608及No.14/527,439)，發明人現在可以克服原核轉錄終止機制，從而誘導原核細胞中髮夾型microRNA前驅物(pre-miRNA)及shRNA之過度表達(over-expression)，特別是用於表達人類miR-302家族microRNAs(miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-302e、及miR-302f)及其前驅物(pre-miR-302)。藉由向細菌培養基中添加某些轉錄誘導劑化學物質，發明人得以轉形原核生物採用真核pol-2和/或病毒pol-2類啟動子來轉錄所需的髮夾RNA及其相關的miRNAs/shRNAs。這種生產方法的優點是：首先，由於單細胞原核生物如細菌細胞的快速及便宜生長，故為具成本效益的生產；第二，因為不需要培養專一性融合瘤(dedicate hybridomas)或哺乳動物細胞而較易於處理；第三，有鑑於改良之pol-2啟動子驅動轉錄的讀碼忠實性(reading fidelity)而具高生產品質；第四，針對所需髮夾RNAs及其相關miRNAs/shRNAs以及引入載體皆全部一次於原核生物中達到工業級批量生產(industrial level bulk production)；以及最後一點，所需RNAs及其他所需胜肽/蛋白質可一起生產但可自所得細菌萃取物及/或裂解物分別地分離並純化以進一步應用之多任務能力。因此，總結而言，針對量產髮夾型RNA藥物之需求，非常需要在原核生物中使用真核RNA啟動子驅動轉錄來生產髮夾RNAs及/或其相關miRNAs/shRNAs的組合物及方法。

發明人先前之發明，歐洲專利號No 2198025已經證明了使用miR-302類小髮夾RNA(shRNAs)及/或短干擾RNAs(siRNAs)以重新編程哺乳動物體細胞為類hESC之誘導多能幹細胞(iPSCs)。這些miR-302類shRNAs/siRNAs具有與天然miR-302分子相同的功能結構，並且皆共享相同之17個核苷酸種子序列(seed sequence)，5'-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3'(SEQ.ID.NO.1)以特定地及同時地靶向人類中超過400個基因。在發明人的特殊設計和方法中，這些miR-302類shRNAs/siRNAs從重組miR-302家族基因(SEQ.ID.NO.2，如圖13A所示)轉錄，其中轉錄物可進一步被處理為前驅物(亦即，pre-miRNAs)：miR-302a之前驅物(pro-miR-302a,SEQ.ID.NO.3)、miR-302b之前驅物(pro-miR-302b,SEQ.ID.NO.4)、miR-302c之前驅物(pro-miR-302c,SEQ.ID.NO.5)、以及miR-302d之前驅物(pro-miR-302d,SEQ.ID.NO.6)，如圖13B所示。結果，本發明亦進一步揭示了一種使用這些miR-302類shRNAs/siRNAs以治療人類之糖尿病相關的阿茲海默症(AD)的新穎組合物及方法。

在一較佳實施例中，本發明所需的miR-302類shRNA/siRNA 分子衍生自基於載體的表達組合物(vector-based expression composition)，像是質體及/或病毒載體，其可遞送於至少一靶細胞類型、組織及/或器官，特別是腦部及/或胰腺，以釋放用於AD治療的所需miR-302類shRNAs/siRNAs。在另一較佳實施例中，所需的miR-302類shRNAs/siRNAs可以在體外(in vitro)量產，且接著作為阿茲海默症治療進一步純化並使用以體內遞送於至少一靶細胞類型、組織及/或器官，特別是腦部及/或胰腺。對於體內治療，遞送/轉染方法包括但不限於，所有類型之注射、脂質/甘油/化學介導的輸注/灌注、胜肽/糖/脂質體/化學介導的轉染、抗原/抗體/受體介導的胞吞作用、轉位子//反轉錄轉位子介導的細胞穿透(cell penetration)、腺病毒/逆轉錄病毒/慢病毒感染及其組合。為了促進體內傳遞效率，所需之miR-302類shRNAs/siRNAs可進一步以至少一種脂質/脂質體、胜肽/蛋白質、糖及/或胺醯化甘油(glycylglycerin)基分子及其組合來配制，其能夠穩定shRNAs/siRNAs的結構完整性以及增加體內藥物的滲透速率。

在此提出作為實行證據的示例，在發明人的實驗設計中，圖1A及1B顯示miR-302表達慢病毒質體載體(miR-302-expressing lentiviral plasmid vector)(稱為pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302或pLVX-GFP-miR302)的基本構建體，其測試用於在動物模型體內治療老化相關疾病(亦即，癌症、糖尿病及阿茲海默症)以及用於在原核生物中(例如E.coli和Lactobacillus spp細菌細胞)實現miR-302類microRNAs/shRNAs/siRNAs之量產。如圖1A所示，miR-302表達質體載體之組分(components)可被重新配置以位於載體之不同區域或甚至刪除，以使其更緊密且使其得以有效地遞送至靶細胞。鑑於該實例，所屬技術領域中具有通常知識者將明瞭的是， 任何具相似結構特徵之載體可用於達成如同本發明之相同功能目的。另外，在載體遞送到靶細胞後，從miR-302表達質體/載體所產生之miR-302生成之自然過程將進一步於圖1B中演示。

為了使用原核生物來生成髮夾型microRNAs/shRNAs，重組miR-302家族基因(SEQ.ID.NO.2；圖13A)必須置於其編碼基因(即RGFP)的5'-UTR中，如圖1A及圖1B所示。因為原核細胞不含任何剪接機制如剪接體以處理框內內含子，用於發明人先前發明之原始載體，像是授予給Lin之EP 2198025；U.S.12/149,725；U.S.12/318,806；U.S.12/792,413，無法在原核生物中用於生成髮夾型microRNAs/shRNAs。此外，由於髮夾型DNA/RNA結構類似於原核生物中內在轉錄終止機制的停止訊號(McDowell等，1994)，在未添加任何化學誘導劑如MOPS、甘油(glycerin)、及/或乙醇下，所設計之位於RGFP基因之5'-UTR中的重組miR-302家族基因不會在原核生物中轉錄(圖3、圖4及圖5)。為了克服這個問題，發明人主張的優先權發明，授予給Lin之美國專利申請號No.13/572,263、No.14/502,608及No.14/527,439發現在原核細胞中存在之新穎髮夾RNA轉錄機制。如圖2、圖3、圖4、圖5、及圖6所示，通過在細菌培養基中加入某些轉錄誘導劑，例如3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid,MOPS)、乙醇(ethanol)及/或甘油(glycerin)(或稱為甘油(glycerol))，發明人可進一步轉形原核生物採用真核pol-2和病毒pol-2類啟動子來轉錄髮夾型RNAs(亦即，重組miR-302家族基因，SEQ.ID.NO.2；圖13A)，以實現miR-302類shRNA/siRNA分子之量產。此些真核pol-2和病毒pol-2類啟動子包括但不限於哺乳動物EF1α及/或巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子，如圖1A所示。

在實驗中，通過具有類似於pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302的結構設計的載體轉形或轉染勝任細胞(亦即，大腸桿菌(E.coli))，並接續在約37℃下在Luria-Bertani(LB)基培養液中以約150-300rpm頻繁攪拌來進行培養。在培育

8小時後，於補充有約0.05%-8%(v/v)MOPS及/或約0.05%-4%(v/v)甘油(glycerin)的LB培養液中生長之轉形細胞顯示了紅色RGFP蛋白的富集表達，其可將LB培養液染成紅色，而沒有任何誘導劑添加的其它空白對照無法產生任何RGFP，如圖2及實例1所示。紅色螢光RGFP的存在表示其RNA及蛋白質皆成功地生成。為了進一步證實由化學誘導劑，如MOPS及/或甘油所誘導的RNA轉錄物的特異性，兩個轉形的勝任細胞菌株係如下製備：其中一個攜帶具有修飾的CMV啟動子驅動綠色螢光蛋白(AcGFP)的pLVX-GFP-miR302+367質體載體，其在5’-UTR編碼整個miR-302~miR-367基因簇；而另一個則是攜帶上述pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302載體(圖1A)。在補充有

0.1%(v/v)MOPS的培養基/培養液中培育

8小時後，用pLVX-GFP-miR302+367轉形的細胞僅產生綠色AcGFP，而其他用pLenti-EF1α-RGFP-miR302轉形之細胞顯示紅色RGFP(圖3)。該結果清楚地表明，化學物質如MOPS和甘油可以誘發通過真核pol-2啟動子驅動及pol-2類病毒啟動子驅動之轉錄機制的特異性髮夾型RNA表達。根據發明人在圖2、3及4所示之實際證據，這些「轉錄誘導劑」化學物質包括但不限於乙醇、甘油(glycerin)(甘油(glycerol))、MOPS及其化學異構體以及衍生物，例如2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)以及4-(2-羥乙基)-1-呱嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES)、甘露糖醇 (mannitol)、及/或其混合物。誘導的RGFP蛋白質產生的定量水平可以通過西方墨點法分析來測量，如圖5所示，其中細菌RuvB蛋白作用為管家基因標準(house-keeping standard)以標準化(normalize)RGFP表達量。此外，誘導的髮夾型miR-302/pre-miR-302表達的定量水平也可以通過北方墨點法分析來測量，如圖6所示。由於所有microRNAs(miRNAs)和shRNAs的結構相似性，對於所屬技術領域中具有通常知識者而言將顯而易見可使用本發明之載體設計以於原核生物中產生其他種類的miRNAs、shRNAs及/或其前驅物/同源物。

由於發明人發現在原核細胞中之髮夾RNA轉錄機制，本發明能夠使用所獲得之miRNA/shRNA表達的病毒載體(亦即，pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302；圖1A)或髮夾狀shRNA/siRNA分子(亦即，pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d；圖13B)於疾病治療，特別是如本發明所展示之阿茲海默症之治療。在真核細胞中，這些髮夾型miRNAs/shRNA可以進一步被處理成成熟的microRNA分子(亦即，miR-302a、miR-302b、miR-302c及miR-302d)以引發其功能。另外，可以設計一些非編碼RNA(ncRNAs)，例如短干擾RNA(siRNAs)和小髮夾RNA(shRNAs)，以模擬天然microRNAs。這些ncRNAs較佳含有至少一個與microRNA或其一部分前體(pre-miRNA)共享30%至100%同源性的序列。此外，這些shRNAs/siRNAs可人工地設計為包含完全匹配的髮夾-莖幹區域(hairpin-stem regions)，而天然microRNA前驅物(pre-miRNAs或pri-miRNAs)通常包含不匹配的鹼基對。有鑑於大多數microRNAs作用為特異性基因沉默子，可能在許多生理和病理機制中發揮各種不同的作用，包 括但不限於，生物發育、幹細胞生成、核重編程、細胞分化、細胞週期調節、腫瘤抑制、免疫防禦、細胞凋亡、回春(rejuvenation)、傷口癒合等其他多種機制，因此在這些醫學及治療領域中的潛在應用係受到高度的期待。

在原核生物中之真核啟動子驅動miRNA/shRNA表達之誘發

如上所述，慢病毒pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302質體載體包含位於其編碼RGFP基因的5'-UTR中的重組miR-302家族簇基因(SEQ ID NO：2；圖13A)(圖1A和1B)；結果，RGFP基因的誘導表達也將產生miR-302分子(miR-302a、miR-302b、miR-302c及miR-302d；SEQ ID NO：3-6；圖13B)，如圖1B之示意性機制所示。由於在原核細胞中缺乏RNA剪接機制(例如剪接體)，如此獲得的miR-302分子將保留為髮夾型microRNA前驅物(pre-miR-302s和pri-miR-302s)，如圖6所示，其可用於被分離並遞送到真核細胞中以引發miR-302的所需功能。使用此生產方法，可以在轉形的原核細胞，如大腸桿菌中同時增殖載體和miR-302分子。用於分離經增殖之pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302載體DNA及轉錄miR-302分子的方法係於實例5及實例6中分別揭示。用於遞送/轉染miR-302、pre-miR-302及/或其編碼表達載體(亦即，pLenti-EF1alpha/CMV-RGFP/GFP-miR302；圖1A)至原核及/或真核細胞中之方法可選自注射、顯微注射(microinjection)、脂質/甘油/化學介導的輸注/灌注、胜肽/糖/脂質體/化學介導的轉染、抗原/抗體/受體介導的胞吞作用、轉位子/反轉錄轉位子介導的細胞穿透、病毒感染、基因槍穿透(gene gun penetration)、電穿孔(electroporation)及其組合所組成之群組。

在載體遞送至細胞後(實例1)，發明人觀察到在補充有 MOPS或甘油或乙醇或其組合的LB培養液中所培育之轉形細胞分別誘導表達之紅色RGFP及綠色GFP，但在未添加任何誘導劑之LB培養液中則沒有(圖3、4及5)，表示此轉錄誘導效果與此些化學誘導劑具高度依賴性，且因此轉錄滲漏(transcriptional leakage)無法於空白負對照組中找到。RGFP蛋白之表達係藉由西方墨點法分析來驗證，如圖5所示。在驗證誘導的RGFP表達後，發明人進一步測量在具有誘導劑添加或不具有誘導劑添加的pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302轉形細胞中誘導的miR-302表達水平。誘導的髮夾型miR-302/pre-miR-302表達結果係藉由北方墨點法分析來驗證，如圖6所示。與誘導之RGFP表達結果相符，僅在用MOPS、甘油及/或乙醇處理的轉形細胞中檢測到miR-302表達，而未在空白負對照組中檢測到，表示缺乏任何化學誘導劑之下，在原核細胞中沒有轉錄活性可通過含有髮夾型結構的基因啟動子起作用，如McDowell等人所報告(Science 1994)。因此，圖6中之髮夾型miR-302表達是藉由添加本發明之轉錄誘導劑所誘發之特定結果，並非為隨機的轉錄滲漏事件(random transcription leakage event)。

本發明在神經幹細胞生成中的功能應用

已然發現MicroRNA miR-302會將哺乳動物體細胞重編程為類胚胎幹細胞(ESC)誘導多能幹細胞(iPSC)(Lin，2008、2010、2011；指派給林之美國專利申請號No.12/149,725以及No.12/318,806)。使用這些iPSCs，已經開發了許多幹細胞相關應用和治療方法來推進現代再生醫學。然而，miR-302僅在人類ESCs中而非分化的組織細胞中大量發現。此外，自人類ESCs分離miR-302是非常有爭議的、昂貴的和繁瑣的。為了解決此些問題，本發明提供一種簡單、便宜、快速和可誘導的組合物和方法，以在原 核生物中量產髮夾型miR-302分子和/或其前驅物/同源物。另外，從原核細胞分離miR-302及/或其前驅物是相對容易且具成本效益的，如本發明之圖6及實例6所示。

如實例5及6所示，發明人使用pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302轉形的大腸桿菌細胞來產生及分離大量及高質量的pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302載體和pre-miR-302s。鑒於發明人之先前美國專利申請號No.12/149,725及No.12/318,806，使用pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302顯示產生人類之類ESC iPSCs。此外，如發明人先前的研究(Lin等人，2008年、2010年及2011年)所示，所獲得的iPSCs可進一步分化為神經細胞(neuron cells)。在本發明之圖7及實例2中，發明人進一步使用通過本發明方法所獲得的高濃度(

600μg/mL)的pre-miR-302s將人類角質細胞(human keratinocytes)重編程為iPSCs，其接著將表達強烈的ESC標誌物(ESC marker)Oct4。使用亞硫酸鹽DNA定序測定(bisulfite DNA sequencing assays)的進一步分析表明，在這些iPSCs的核中確實發生了整體DNA去甲基化(global DNA demethylation)，特別是在Oct4和Sox2基因的啟動子區域中，其為人類ESCs和iPSCs中最重要的兩個重編程因子和標誌物之一(圖8和實例8)。由於整體DNA去甲基化和Oct4表達是廣為人知的幹細胞多能性的首先也是最重要的標誌(Simonsson和Gurdon，(2004)Nat Cell Biol.6：984-990)，本發明亦可提供一種使用分離的miR-302及/或pre-miR-302分子誘導iPSC衍生的組合物及方法。對於此應用，用於遞送miR-302及/或pre-miR-302分子至哺乳動物細胞中之方法可選自顯微注射、脂質/甘油/化學介導的輸注/灌注、胜肽/糖/脂質體/化學介導的轉染、抗原/ 抗體/受體介導的胞吞作用、轉位子/反轉錄轉位子/半胱天冬酶(caspase)介導的細胞穿透、病毒感染、基因槍穿透、電穿孔及其組合所組成之群組。

分離的miR-302和/或pre-miR-302分子的應用可以進一步包括CD34陽性成體幹細胞的誘導和增殖。如圖9A及9B所示，發明人於使用新穎miR-302配制藥物之傷口癒合治療中的目前研究表明，相對低濃度(50-500μg/mL)的分離miR-302/pre-miR-302分子的處理不僅在豬皮膚體內大大增進少疤之傷口癒合，同時也誘導受傷部位附近的CD34陽性成體幹細胞增殖。根據圖9B的miR-302處理(胺醯化甘油(glycylglycerin)配製的miR-302s/pre-miR-302s +抗生素軟膏)結果與圖9A之對照(僅有抗生素軟膏)結果之比較，清楚呈現在miR-302處理後，體內CD34陽性成體幹細胞群體(綠色螢光抗體標記)具

40倍的增加。目前已知的CD34陽性成體幹細胞類型包括但不限於皮膚、毛髮、肌肉、血液(造血(hematopoietic))、間質(mesenchymal)以及神經幹細胞(neural stem cells)。結果，由於miR-302可用於在體內誘導CD34陽性成體幹細胞增殖，所以這種治療作用也可以用於在患者中治療阿茲海默症有助於重新生長及/或恢復功能性神經元。

MiR-302保護SK-N-MC細胞免受Aβ誘發的細胞凋亡

最近的研究已經證明了miR-302在調節氧化壓力誘發之細胞凋亡中的關鍵作用。為了解開miR-302對神經元細胞是否針對Aβ誘發的細胞凋亡展現任何保護作用，發明人用先前所報告之巨細胞病毒(CMV)啟動子驅動的miR-302表達慢病毒載體(expression lentivector)來轉染人類神經SK-N-MC細胞(human neuronal SK-N-MC cells)(林等人，2008、2010及2011)，且接著暴露於Aβ(2.5μM)24小時。在這之後，miR-302轉染的 細胞係在倒立螢光顯微鏡下藉由共同表達之AcGFP綠色螢光蛋白之存在來鑑定(圖14A)，且miR-302之表達係進一步藉由RT-qPCR(n=3，p<0.01，圖14B)與miRNA微陣列分析(圖12)來確認，顯示整個miR-302家族簇基因(亦即，miR-302a、miR-302b、miR-302c及miR-302d)的成功轉錄。值得注意的是，圖14C進一步展示Aβ處理引起對照細胞組的大量細胞死亡，而miR-302轉染細胞顯示這樣的Aβ誘發細胞死亡之顯著減弱(n=3，p<0.01)。為了確定由Aβ所誘發之細胞死亡的類型，發明人進一步藉由DAPI染色檢查了細胞核碎裂(nuclei fragmentation)。如圖14D及圖14E所示，Aβ處理破壞了核緣(nucleus margin)，且相較於miR-302轉染的細胞顯著增加對照組中的凋亡細胞群體(n=3，p<0.01)。此外，圖14F顯示Aβ處理顯著地增加了對照細胞中半胱天冬酶3(caspase 3)和PARP的裂解形成(cleavage formation)，但在miR-302轉染的細胞中則沒有(n=3，p<0.01)，進一步證實了此點。總結而論，發明人之資料有力的指出miR-302在預防Aβ誘發的細胞凋亡中扮演了保護角色。

Akt訊號的活化涉及miR-302介導的神經保護

發明人先前報告在神經元中的胰島素敏感性(insulin sensitivity)的復原將會致使Akt活化，從而抑制Aβ誘發的細胞凋亡(Kornelius等，2015)。為了確定miR-302表達是否能恢復神經元胰島素敏感性並阻止Aβ誘發的神經毒性，發明人使用西方墨點法分析來測量主要胰島素訊號相關蛋白的表達水平(major insulin signaling-related proteins)，像是pSer307-IRS-1、IRS-1之酪氨酸磷酸化及其下游靶標pSer473-Akt。如圖15A所示，對照細胞中的Aβ處理顯著增加p-307 IRS-1絲氨酸磷酸化(serine phosphorylation)(n=3，p<0.05)，同時降低IRS-1酪氨酸磷酸化(n=3，p<0.01)，兩者皆被視為胰島素阻抗之標誌特點；然而，在miR-302轉染的細胞中，這種Aβ誘發的胰島素阻抗顯著地減弱(n=3，p<0.05)。此外，Aβ處理亦導致對照組中p-Ser 473-Akt的顯著降低，而在miR-302轉染的細胞中則不會(n=3，p<0.01)(圖15A)。為了進一步闡明PI3K/Akt訊號在miR-302轉染細胞中的保護作用，發明人應用PI3K抑制劑LY294002。結果，圖15B顯示Aβ(2.5μM)和LY294002(20μM)的共同處理可能破壞miR-302介導的Akt訊號傳導(n=3，p<0.01)，從而導致活細胞群體顯著減少，如MTT測定所測定(n=3，p<0.01，圖15C)。所有這些發現表明miR-302通過活化PI3K/Akt訊號傳導來避免Aβ誘發的神經毒性及神經元死亡。另外，Aβ受損的胰島素訊號傳導可能導致GSK3β活性增加以及tau高磷酸化，這是AD病理機制中的相應步驟。為此，發明人發現miR-302表達可以刺激Akt訊號，從而略微增加p-Ser 9-GSK3β水平，且因此可提供對於tau高磷酸化之溫和抑制效果(n=3，p<0.05)(圖15D)。結果，圖15D亦顯示，與miR-302轉染細胞相比，Aβ和LY294002的共同處理完全消除了miR-302對於對照細胞中p-Ser 9-GSK3β表達和tau磷酸化的抑制作用(n=3，p<0.05)。總結而論，發明人的資料表明miR-302可能主要通過活化及/或恢復Akt/GSK3β訊號路徑來發揮其保護作用。

MiR-302通過Akt上調的Nrf2/HO-1減弱Aβ誘發的氧化壓力

為了確定miR-302介導的Akt活化是否可以預防Aβ誘發的細胞內ROS堆積，發明人進行螢光測定(fluorometric assay)以測量在細胞內累積之過氧化氫濃度。如圖16A所示，Aβ處理刺激了對照組的細胞內超氧 化物自由基陰離子的顯著升高，但miR-302轉染細胞中則沒有(n=3，p<0.01)。Aβ(2.5μM)和胰島素(1μM)的共同處理可以復原對照組中細胞內超氧化物自由基陰離子的正常水平(p<0.05)，表示miR-302介導的Akt活化確實抑制Aβ誘發的ROS。此外，氧化還原敏感性轉錄因子(redox-sensitive transcription factor)Nrf2亦可藉由上調抗氧化反應元件(antioxidant-response elements)如HO-1來賦予對ROS損傷的保護作用。由於據稱PI3K/Akt訊號傳導會提升HO-1表達以及Nrf2依賴性轉錄(Kwon等，2015)，發明人進一步藉由西方墨點法分析來釋明miR-302的這種可能的抗氧化作用。結果，圖16B顯示Aβ處理同時降低對照組中之Nrf2及HO-1表達，但在miR-302轉染的細胞中則沒有(n=3，p<0.05)。為了進一步驗證這種效果的來源，進一步的LY294002(20μM)與Aβ(2.5μM)之處理亦在miR-302轉染細胞中降低Nrf2表達(n=3，p<0.05)(圖16C)，表示miR-302是透過PI3K/Akt訊號路徑來調節Nrf2表達。此外，於對照組中，於Aβ(2.5μM)與胰島素(1μM)共同處理後，Akt訊號的活化顯著地恢復Nrf2表達(n=3，p<0.05)(圖16C)，進一步表明miR-302介導的Akt活化可以通過Nrf2和HO-1的上調而阻止Aβ誘發的ROS堆積。

為了研究miR-302對Aβ介導的粒線體功能障礙和細胞凋亡的影響，發明人以JC-1染色測定法檢測了MMP並以西方墨點法分析檢測凋亡相關標誌截短型Bid(truncated Bid,tBid)的表達及抗凋亡相關標誌Bcl-2。如圖16D所示，回應於Aβ處理，對照細胞顯示出粒線體膜去極化的顯著缺陷(n=3，p<0.05)，然而此並未於miR-302轉染的細胞中發現，依據細胞質紅色J聚集體螢光(cytoplasmic red J-aggregate fluorescence)之缺少與擴 散之綠色螢光的提升兩者所表明。然而，通過共處理Aβ(2.5μM)和LY294002(20μM)24小時可完全消除對於MMP完整性的此種miR-302介導保護效果(n=3，p<0.05)，表示了Akt/PI3K訊號的參與。此外，Aβ處理導致對照組中tBid表達的顯著增加(p<0.01)與Bcl-2的減少(p<0.05)，但在miR-302轉染的細胞中則不會(圖16E)。所有這些發現清楚地表明miR-302介導的Akt活化可以通過上調Nrf2活性來抑制Aβ誘發的氧化壓力、粒線體功能障礙及細胞凋亡。

MiR-302通過靶向PTEN和誘導Nanog表達來調節Akt訊號

在確定miR-302在活化Akt訊號傳導以防止Aβ誘發的神經毒性中的重要地位之後，發明人進一步研究了在此miR-302介導的Akt活化下的分子機制。近來的研究表示miR-302通過靶向PTEN的Akt訊號傳導來促進多能性(Alva等，2011)。為了搜尋PTEN中的miR-302靶位點(target site)，發明人使用預測程式TargetScan(http：//www.targetscan.org/)進行篩選分析(screening analyses)，並鑑定位於人PTEN基因之3'UTR中的特異性miR-302結合位點(圖17A)。由於發明人之西方墨點法資料顯示在miR-302轉染的細胞中PTEN表達顯著降低(n=3，p<0.05)(圖17B)，這表明miR-302可靶向此3'UTR結合位點以抑制PTEN表達。此外，由於剔除PTEN可以增加多能性相關基因Nanog的表達(Kuijk等人，2010)，其在ESCs中進一步藉由PI3K/Akt訊號傳導來介導(Alva等人，2011)，發明人在此以西方墨點法測定來檢驗miR-302對於PTEN、pSer473 Akt及Nanog表達之作用。結果，圖17C顯示僅在miR-302轉染的細胞中檢測到Nanog表達的顯著提升(n=3，p<0.05)，而Aβ處理(2.5μM，24小時)在對照組激發了PTEN的顯著提升以及pSer473 Akt 及Nanog表達的降低而在miR-302轉染的細胞中則不會(n=3，p<0.05)(圖17D)。有意思的是，進一步的研究表明，用LY294002(20μM，24小時)阻斷Akt訊號可以在miR-302轉染細胞中恢復Aβ介導的對於pSer473 Akt與Nanog表達的抑制作用(n=3，p<0.05)(圖17E)，證明miR-302活化Akt訊號以誘導Nanog表達。

為了確定Nanog在Aβ處理中是否起保護作用，發明人進一步在miR-302轉染細胞中進行了shRNA介導的Nanog敲低(knockdown)。如圖17F所示，在Aβ處理後之miR-302轉染細胞中，Nanog的下調導致p-Ser307IRS-1表達的增加，以及酪氨酸磷酸化與p-Ser 473-Akt/p-Ser 9-GSK3β水平兩者之降低。總結而論，發明人的研究結果強烈地表明miR-302可以藉由下調PTEN以活化Akt及下游Nanog訊號來提供保護對抗Aβ誘發神經毒性。

體外及體內之Nanog與miR-302(來自LARP7基因)的表達模式(Expression Patterns)

發明人觀測到受損的Nanog表達與Aβ破壞的胰島素敏感性相關。為了研究這一點，發明人首先進行RT-qPCR來顯示其中於體外(in vitro)之Aβ處理會在對照神經元中顯著地降低Nanog mRNA表達(n=3，p<0.05，圖18A)。接著，我們進一步藉由測量阿茲海默症患者的周邊血液單核細胞(PBMCs)中Nanog的mRNA表達水平來釋明此發現與人類阿茲海默症患者體內的相關性。測試對象特徵的詳細概述總結於圖20中。一些阿茲海默症患者(n=7)依據MMSE和CASI測量量表具有中度失智症(moderated dementia)，此可區分阿茲海默症患者及年齡匹配的健康對照組(n=6)。結果，這些阿茲海默症患者的MMSE和CASI分數皆下降(圖20)。對此，圖18B 進一步顯示，與正常年齡匹配對照組相比，阿茲海默症患者的Nanog mRNA水平顯著降低(p<0.05)。此觀測結果證實發明人之miR-302處理的治療目標，其中阿茲海默症患者展現降低之Nanog表達，此促成了阿茲海默症相關之神經退行性疾病的病理機制，且因此可為本發明之miR-302處理在阿茲海默症患者中的有效治療標靶。

此外，已知miR-302家族基因編碼於人類基因組染色體4上的人類LARP7基因中。為了確定miR-302的內源性水平在阿茲海默症之病程中是否受到Aβ誘發之神經毒性影響，發明人以針對外顯子8及9的連接區的特異性引子藉由RT-qPCR來測試編碼miR-302的LARP7基因的表達。結果，圖18C顯示Aβ處理會顯著地在體外對照神經元中降低LARP7 mRNA表達(n=3，p<0.05)。在阿茲海默症患者之PBMCs中的LARP表達的進一步檢測也顯示與正常年齡匹配對照組相比，阿茲海默症患者中LARP7 mRNA的表達係顯著地降低(圖18D，p<0.05)。這些結果證明，內源性LARP7/miR-302表達可能在預防AD進展中起重要作用。

總結而論，如圖19中所彙總，胰島素訊號之受損不僅對神經元存活造成嚴重威脅，其亦在老化相關疾病如阿茲海默症中起關鍵作用。在本發明中，首次展示miR-302可以透過活化Akt訊號路徑來調節細胞存活與抗老化過程，此在人類神經細胞中賦予對Aβ誘發的神經毒性的保護作用。發明人在此得到結論：(i)miR-302沉默PTEN以活化Akt訊號，其刺激Nrf2/HO-1升高並因此減弱Aβ誘發的凋亡、以及(ii)miR-302介導的Akt活化也刺激Nanog表達以抑制p-Ser307 IRS-1表達，從而增強IRS-1酪氨酸磷酸化及p-Ser 473-Akt/p-Ser 9-GSK3β的形成。可設想地，這兩種新鑑定的 miR-302效應可用於開發AD相關療法。

雖然已經參考所有上述實例描述了本發明，但是應當理解的是，各種修改及變化皆涵蓋於本發明的精神和範疇內。

A.定義

為了有助於理解本發明，部分詞彙係定義如下：

核酸：單鏈或雙鏈的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合物。

核苷酸：由糖部分體(戊糖)、磷酸基團(phosphate)及含氮雜環鹼基(nitrogenous heterocyclic base)所組成之DNA或RNA的單體單元。該鹼基係經由糖苷碳(glycosidic carbon)(戊糖之1號碳)與糖部分體鏈結，且鹼基與糖的組合為核苷(nucleoside)。含有至少一個磷酸基團鍵結至戊糖之三端或五端位置的核苷即為核苷酸。去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)係分別由不同類型之核苷酸單元，即去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸所組成。

寡核苷酸(Oligonucleotide)：包含二或多個之去氧核糖核酸(DNA)及/或核糖核酸(RNA)之單體單元的分子，其中單體單元較佳超過3個，而通常為超過10個。超過13個核苷酸單體的寡核苷酸亦稱為多核苷酸(polynucleotide)。寡核苷酸確切的大小取決於許多因素，並且依據該寡核苷酸之最終功能或用途而定。寡核苷酸可用任何方式生成，包括：化學合成、DNA複製、RNA轉錄、反轉錄、或其組合。

核苷酸相似物(Nucleotide Analog)：嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)核苷酸，其結構上不同於腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌 呤(G)、胞嘧啶(C)或脲嘧啶(U)核苷酸，但足夠相似至可取代核酸分子中的正常核苷酸。

核酸組成物(Nucleic Acid Composition)：核酸組成物係指寡核苷酸或多核苷酸，例如具有單股或雙股分子結構的DNA或RNA序列、或混合DNA/RNA序列。

基因(Gene)：核酸組成物，其中的寡核苷酸或多核苷酸的序列編碼RNA及/或多肽(蛋白質)。基因可以是RNA或DNA。基因可能編碼非編碼RNA，如小髮夾RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA，以及其RNA前驅物及衍生物。另一方面，基因可編碼蛋白質/肽類合成所需之編碼蛋白質RNA，像是傳訊核糖核酸(mRNA)及其RNA前驅物與衍生物。在一些情況下，基因可編碼亦包含至少一microRNA或shRNA序列的編碼蛋白質RNA。

初級RNA轉錄物(Primary RNA Transcript)：直接由基因轉錄而來且未經任何RNA處理或修飾之RNA序列。

前驅傳訊RNA(Precursor messenger RNA，pre-mRNA)：編碼蛋白質基因之初級RNA轉錄物，透過真核細胞中的真核第二型RNA聚合酶(Pol-II)機制經由稱為轉錄作用的細胞內機制所產生。前驅傳訊RNA序列包含五端非轉譯區(5’-untranslated region,UTR)、三端非轉譯區(3’-UTR)、外顯子(exon)及內含子(intron)。

內含子(Intron)：基因轉錄序列編碼非蛋白質讀框之一部分或多個部分，例如框內內含子(in-frame intron)、五端非轉譯區(5’-UTR)及三端非轉譯區(3’-UTR)。

外顯子(Exon)：基因轉錄序列編碼蛋白質讀框(cDNA)之一部分或多個部分，例如細胞基因、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同源物與衍生物的互補去氧核糖核酸(cDNA)。

傳訊RNA(mRNA)：pre-mRNA外顯子之集合，在內含子由細胞內的RNA剪接機制(例如剪接體)移除後形成，並且作用為肽類/蛋白質合成之編碼蛋白質RNA。由mRNAs編碼的肽類/蛋白質包含但不限於酵素、生長因子、胰島素、抗體及其類似物/同源物與衍生物。

互補DNA(cDNA)：單股或雙股DNA，其含有與mRNA序列互補的序列，且不含任何內含子序列。

正義(Sense)：核酸分子與同源之mRNA為相同之序列順序及組成。以「+」、「s」或「sense」符號來表示此正義構形。

反義(Antisense)：與個別mRNA分子互補之核酸分子。以「-」符號來表示此反義構形，或是在DNA或RNA之前加上「a」或「antisense」，例如：「aDNA」或「aRNA」來表示此反義構形。

鹼基對(Base Pair，bp)：雙股DNA分子中存在於腺嘌呤(adenine，A)與胸腺嘧啶(thymine，T)之間，或胞嘧啶(cytosine，C)與鳥嘌呤(guanine，G)之間的Watson-Crick鹼基配對之組合(partnership)。在RNA中，脲嘧啶(uracil，U)取代胸腺嘧啶(thymine，T)，且介於鳥嘌呤(guanine，G)與脲嘧啶(uracil，U)之間的非Watson-Crick鹼基配對之另一種組合(partnership)亦可能出現。一般來說，此組合透過氫鍵來達成。舉例而言，正義核苷酸序列“5’-A-T-C-G-U-3’”可與其反義序列“5’A-C-G-A-T-3’”或“5’-A-U-G-A-T-3’”形成完全鹼基配對。

五端(5’-end)：連續核苷酸在五端位置缺乏核苷酸之一端，其中一個核苷酸之五端羥基(5’-hydroxyl group)係以磷酸二酯鍵(phosphodiester linkage)與下一個核苷酸之三端羥基連接。在該端亦可存在有其他官能基，例如一或多個磷酸基團。

三端(3’-end)：連續核苷酸在三端位置缺乏核苷酸之一端，其中一個核苷酸之五端羥基係以磷酸二酯鍵與下一個核苷酸之三端羥基連接。在該端亦可存在有其他官能基，最常見為羥基。

模板(Template)：能以核酸聚合酶複製之核酸分子。依聚合酶的不同，一模板可為單股、雙股或部分雙股。合成後之複製物係與該模板、該雙股模板或部分雙股模板中之至少一股互補。RNA與DNA皆從五端往三端的方向合成。核酸雙鏈體(duplex)之兩股總是對齊，使得該兩股之五端係在該雙鏈體之相對端上(三端亦然)。

核酸模板(Nucleic Acid Template)：雙股DNA分子、雙股RNA分子、雜合分子，如DNA-RNA或RNA-DNA雜合物、或單股DNA或RNA分子。

保守(Conserved)：若核苷酸序列與一預選(參考)序列之確切互補物(exact complement)非隨機地雜合，則該核苷酸序列與該預選序列是保守的。

同源(Homologous或Homology)：意指多核苷酸序列與基因或mRNA序列相似的詞彙。舉例而言，一核酸序列可與一特定基因或mRNA序列部分或完全同源。同源也可用相似核苷酸數在全部核苷酸數中所佔的的百分比表示。

互補(Complementary或Complementarity或Complementation)：用於表示依前述鹼基配對原則(「base pair(bp)」rule)相聯之介於兩個多核苷酸之間的匹配鹼基配對(亦即，mRNA與cDNA的序列)之詞彙。舉例而言，序列“5’-A-G-T-3’”與序列“5’-A-C-T-3’”及“5’-A-C-U-3’”互補。互補可以發生於兩股DNA之間、一股DNA與一股RNA之間、或是兩股RNA之間。互補可以是「部分(partial)」或「完全(complete)」或是「整體(total)」的。當僅一些核酸鹼基根據鹼基配對原則相配對時，則產生部分互補(partial complementarity或complementation)。當鹼基在該等核酸股之間完全或恰好相配時，則產生完全或整體互補(complete or total complementarity or complementation)。核酸股之間的互補程度對於核酸股間雜合的效率及強度有重要的影響。此對於倚賴核酸間之鍵合(binding)來達成的擴增(amplification)反應與偵測方法也特別重要。互補率(percent complementarity或complementation)係指在該核酸之一股中失配(mismatch)鹼基數在全部鹼基中所佔的比例。因此，50%的互補率意指一半的鹼基失配(mismatched)，而另一半的鹼基相配對。即使核酸之兩股具有不同鹼基數，核酸之兩股也能互補。在此情況下，互補發生於較長股之一部分與較短股間，其中較長股之該部分的股上為對應於與較短股之鹼基配對之鹼基。

互補鹼基(Complementary Bases)：當DNA或RNA形成一雙股結構時正常配對之核苷酸。

互補核苷酸序列(Complementary Nucleotide Sequence)：單股DNA或RNA分子的一核苷酸序列，其充分地與另一單股分子之核苷酸序列互補，以致兩股之間藉由隨應之氫鍵而專一地雜合。

雜合(Hybridize及Hybridization)：在核苷酸序列之間的雙鏈體的形成，其係透過鹼基配對充分地互補而形成複合。當一引子(或剪接模板)與標的(模板)「雜合」，則複合體(或雜合物)係充分穩定，提供DNA聚合酶開始DNA合成所需的引子功能(priming function)。兩條互補多核苷酸之間有可被競爭性抑制(competitively inhibited)的特殊，亦即非隨機之交互作用(interaction)。

轉錄後基因靜默(Posttranscriptional Gene Silencing)：標的基因在mRNA降解或轉譯抑制階段下的剔除(knockout)或敲低(knockdown)效應，其通常由外來/病毒DNA或RNA轉殖基因(transgenes)或小型抑制性RNAs任一者所觸發。

RNA干擾(RNAi)：一種真核細胞內的轉錄後基因靜默機制，可由小型抑制性RNA分子如microRNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)及小干擾RNA(siRNA)引發。該等小型RNA分子通常可作為基因靜默子，干擾細胞內與該等小型RNA完全或部分互補之基因的表達。

基因靜默效應(Gene silencing effect)：細胞在基因功能被抑制後的反應，包含但不限於細胞週期減弱(cell cycle attenuation)、G0/G1檢控點停滯(G0/G1-checkpoint arrest)、腫瘤抑制、抗致腫瘤性(anti-tumorigenecity)、癌細胞凋亡，及其組合。

非編碼RNA(Non-coding RNA)：無法用於羥由細胞內轉譯機制合成肽類或蛋白質的RNA轉錄物。非編碼RNA包含長與短的調節性RNA分子如microRNA、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)、以及雙股RNA(dsRNA)。這些調節性的RNA分子通常作用為基因靜默子，干 擾細胞內與非編碼RNA完全或部分互補之基因的表達。

MicroRNA(miRNA)：單股RNAs，能夠與和miRNA部分互補之標的基因的轉錄物結合。MiRNA通常長約17-27個核苷酸，並能依據miRNA與其標的mRNA間的互補程度來直接降解細胞內之mRNA標的，或抑制所標的之mRNA的蛋白質轉譯。在幾乎所有的真核生物內都能發現天然的miRNAs，其作為對抗病毒感染的防衛，並能在動植物發育期間調節基因表達。

前驅MicroRNA(Pre-miRNA)：包含莖臂(stem-arm)及莖環(stem-loop)區域之髮夾型單股RNA，用於與細胞內RNaseIII核糖核酸內切酶作用，以產生一或多個microRNAs(miRNAs)，其中microRNAs(miRNAs)可靜默與microRNA之序列互補之標的基因(a targeted gene or genes)。pre-miRNA的莖臂可形成為完全(100%)或部分(失配(mis-matched))之雜合雙鏈體，而其莖環係連接至莖臂雙鏈體之一端而形成圓形或髮夾環的構形。然而，在本發明中，microRNA之前驅物亦可包含初級微型核糖核酸(pri-miRNA)。

小干擾RNA(siRNA)：短雙股RNAs，大小約18-27個完全鹼基配對的核糖核苷酸雙鏈體，並可降解與其幾乎完全互補的標的基因之轉錄物。

小髮夾或短髮夾RNA(shRNA)：單股RNAs，包含一對部分或完全相配之莖臂核苷酸序列，其中該對序列由未匹配(unmatched)寡核苷酸環隔開而形成髮夾型結構。許多天然miRNAs係衍生自髮夾型RNA前驅物，即前驅microRNA(pre-miRNA)。

載體(Vector)：一重組核酸組成物，例如重組DNA(recombinant DNA，rDNA)，能於不同基因環境移動或滯留。一般來說，另外的核酸可操作性地(operatively)連接於其中。載體能在一細胞內自動複製，在此情況下，該載體及所接附之片段也會複製。較佳之載體的其中一類型係游離基因體(episome)，亦即可染色體外(extrachromosomal)複製的核酸分子。較佳的載體為能夠自動複製並表達的核酸。能導引編碼一或多個多肽之基因及/或非編碼RNA之表達的載體在此稱為「表達載體(expression vector)」或「表達勝任載體(expression-competent vector)」。特別重要的載體能夠使用反轉錄酶(reverse transcriptase)從生成之mRNAs複製(cloning)cDNA。載體可包含由下列所組成之組分：病毒啟動子或第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子或兩者、Kozak一致性轉譯起始位(Kozak consensus translation initiation site)、多聚腺苷酸化訊號(polyadenylation signals)、複數個限制/選殖位(restriction/cloning site)、pUC複製起始點(pUC origin of replication)、在複製勝任原核細胞中用於表達至少一抗生素抗藥性基因之SV40早期啟動子(SV40 early promoter)、在哺乳動物細胞中用於複製之選擇性SV40起始點、及/或四環黴素反應元件(tetracycline responsive element)。載體的結構可以是線形或環形的單股或雙股DNA，且選自由質體、病毒載體、轉位子、逆轉位子、DNA轉殖基因(DNA transgene)、跳躍基因(jumping gene)、及其組合所組成之群組。

啟動子(Promoter)：由聚合酶分子所辨識，或與其結合並啟始RNA轉錄之核酸。依據本發明之目的，啟動子可以是習知的聚合酶結合位點、增強子及類似物，以及可使用所需聚合酶來啟始RNA轉錄物之合 成的任何序列。

真核啟動子(Eukaryotic promoter)：核酸基序(motifs)之序列，為RNA轉錄所需，且能由真核第二型RNA聚合酶(pol-2)、pol-2等效物、及/或pol-2類病毒聚合酶所辨識。

第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)等效物：真核轉錄機構，選自由哺乳動物第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)及Pol-II類病毒RNA聚合酶組成之群組。

第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)啟動子：RNA啟動子，由轉錄真核傳訊RNAs(mRNAs)及/或microRNAs(miRNAs)之真核第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)辨識及使用。舉例而言，但不侷限於此，哺乳動物EF1α(EF1alpha)啟動子為pol-2啟動子。

Pol-II類病毒啟動子(Pol-II-like Viral Promoter)：病毒RNA啟動子，能使用真核pol-2或其等效的轉錄機構於其基因表達。舉例來說，但不侷限於此，巨細胞病毒(CMV)啟動子與反轉錄病毒長末端重複啟動子(retroviral long terminal repeat(LTR)promoter)即為Pol-II類病毒啟動子。

順反子(Cistron)：DNA分子內的核苷酸序列，編碼胺基酸殘基序列，且包含上游及下游的DNA表達控制元件。

RNA處理(RNA processing)：一細胞內機制，負責RNA的成熟、修飾、與降解，包含RNA剪接、內含子切除、外泌體消化(exosome digestion)、無義介導的降解(nonsense-mediated decay，NMD)、RNA編輯、RNA處理及其組合。

抗生素抗藥性基因(Antibiotic Resistance Gene)：能夠降解 抗生素之基因，其中抗生素選自由盤尼西林G(penicillin G)、鏈黴素(streptomycin)、安比西林(ampicillin(Amp))、新黴素(neomycin)、G418、卡那黴素(kanamycin)、紅黴素(erythromycin)、巴龍黴素(paromycin)、霍火黴素(phophomycin)、斯派克黴素(spectromycin)、四環黴素(tetracycline(Tet))、去氧羥四環素(doxycycline(Dox))、利福平(rifapicin)、兩性黴素B(amphotericinB)、健他黴素(gentamycin)、氯黴素(chloramphenicol)、先鋒黴素(cephalothin)、泰黴素(tylosin)及其組合所組成之群組。

限制/選殖位(Restriction/Cloning Site)：供限制酶切割之DNA基序(DNA motif)，包含但不限於AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III/RV、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI之切割位置。

基因遞送(Gene Delivery)：基因工程方法，選自由多聚體(polysomal)轉染、脂質體(liposomal)轉染、化學轉染、電穿孔、病毒感染、DNA重組、轉位子插入、跳躍基因插入、顯微注射、基因槍穿透，及其組合所組成之群組。

基因工程(Genetic Engineering)：DNA重組方法，選自由 DNA限制酶反應與接合反應、同源重組、轉殖基因併入、轉位子插入、跳躍基因併入、反轉錄病毒感染，及其組合所組成之群組。

細胞週期調節子(Cell Cycle Regulator)：細胞基因，參與控制細胞分裂及細胞增生速率，包含但不限於週期素依賴性激酶2(CDK2)、週期素依賴性激酶4(CDK4)、週期素依賴性激酶6(CDK6)、週期素(cyclins)、BMI-1、p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1和p27Kip1，及其組合。

腫瘤抑制(Tumor Suppression)：細胞抗腫瘤及抗癌症的機制，包含但不限於細胞週期減弱、G0/G1檢控點停滯、腫瘤抑制、抗致腫瘤性、癌細胞凋亡、及其組合。

標的細胞(Targeted Cell)：單一或複數個人類細胞，選自由體細胞、組織、幹細胞、生殖細胞(germ-line cell)、畸胎瘤細胞(teratoma cell)、腫瘤細胞、癌細胞、及其組合所組成之群組。

癌組織(Cancerous Tissue)：腫瘤組織(neoplastic tissue)，來自選自由皮膚癌、攝護腺癌(prostate cancer)、乳癌、肝癌、肺癌、腦瘤/癌、淋巴癌(lymphoma)、血癌(leukemia)、及其組合所組成之群組。

抗體(Antibody)：肽類或蛋白質分子，具有預選之保守結構域結構(conserved domain structure)編碼為能與預選之配體(ligand)結合之受體(receptor)。

醫藥或治療應用(Pharmaceutical或therapeutic Application)：生物醫學的應用及/或裝置，用於幹細胞生成、幹細胞研究及/或治療法發展、癌症治療、疾病處理、傷口癒合及組織再生處理、提高藥物產量及/或 食物供給、及其組合。

原核生物或原核細胞：缺乏明顯的帶膜細胞核(membrane-bound nucleus)之單一細胞有機體且具其基因材料於DNA的連續股形式(continuous strand)，如細菌。

真核生物或真核細胞：細胞具有封閉在膜內之細胞核及其他結構(胞器)的單一細胞或多細胞有機體，像是酵母菌、植物及動物細胞。

轉錄誘導劑(Transcription Inducer)：化學物質，能在原核細胞內促使及/或增強自真核pol-2或pol-2類病毒啟動子之髮夾型RNA轉錄。舉例而言，轉錄誘導劑包含但不限於與3-嗎啉丙烷磺酸(3-morpholinopropane-1-sulfonic acid,MOPS)、乙醇、及/或甘油(glycerin)相似的化學結構，以及其功能類似物，像是甘露糖醇(mannitol)、2-(N-嗎啉)乙烷磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)及4-(2-羥乙基)-1-呱嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES)或其混合物。

B.組合物及應用

一種組合物，用於運用能夠保護人腦神經元免受阿茲海默症中之Aβ誘發神經毒性的microRNA前驅物(pre-miRNA)之髮夾型RNA模擬物，其包含：(a)至少一載體，其能夠通過真核啟動子來表達所述之髮夾型pre-miRNA模擬物，其中載體是pLenti-EF1alpha/CMV-RGFP/GFP-miR302；以及(b)至少一轉錄誘導劑，其能夠在要處理的神經元中遞送及誘導所述髮夾型pre-miRNA模擬物的表達，其中所述髮夾型pre-miRNA模擬物的表達是藉由在包含要處理之神經元 之細胞基質中混合(a)及(b)來誘導。

或者，本發明是一種以microRNA前驅物之髮夾型RNA模擬物(髮夾型pre-miRNA模擬物)保護人腦神經元免受阿茲海默症中之Aβ誘發神經毒性的方法，其包含：(a)以載體處理至少一神經元，其中載體含有SEQ.ID.NO.2且能夠通過真核啟動子表達至少一髮夾型pre-miRNA模擬物；以及(b)在施用至少一轉錄誘導劑的情況下，在要處理的神經元中誘導所述至少一髮夾型pre-miRNA模擬物的表達。

原則上，本發明提供了一種新穎的組合物設計及其應用策略，用於誘導原核生物適用以使用真核啟動子產生大量髮夾型RNA作為治療人腦神經元中阿茲海默症的藥物。較佳地，所述髮夾型pre-miRNA模擬物是miR-302前驅物(pre-miR-302)，且為選自microRNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)、其前驅物及同源物以及其組合所組成之群組之結構構形。

較佳地，所述原核生物特別是細菌細胞，大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))，且所述轉錄誘導劑是3-嗎啉丙烷磺酸(MOPS)、乙醇、或甘油(glycerin)或其組合。亦較佳地，所述真核RNA啟動子是真核的pol-2啟動子，例如EF1alpha，或pol-2相容(pol-2 compatible)的病毒啟動子，像是巨細胞病毒(CMV)啟動子或反轉錄病毒長末端重複(LTR)啟動子。由所述真核RNA啟動子介導的基因係編碼選自microRNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)、傳訊RNA(mRNA)、其前驅物及同源物以及其組合所組成之群組的非編碼或編碼蛋白質RNA轉錄物或兩者。

僅為了說明目的而非限制特別參照圖式，其中繪示：

圖1A和1B顯示了真核啟動子驅動的髮夾RNA表達組合物的基本設計(A)及其相關RNA處理及轉譯機制(B)真核啟動子驅動的髮夾RNA表達組合物(亦即，可能攜帶EF1alpha及CMV啟動子兩者之pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302質體載體)之單獨組分可被重新定位於載體之不同位置或甚至去除以提供更緊實及更有效之遞送於標的細胞。根據(B)中揭示的機制，所屬技術領域中具有通常知識者可能使用任何microRNA/shRNA取代本發明教示之miR-302，或可能使用任何mRNA/蛋白質取代本發明教示之RGFP。黑色箭頭表示蛋白質/肽類生產的路徑，而白色箭頭表示髮夾RNA產生的步驟。

圖2描繪了使用(左)或不使用(右)約0.1%(v/v)MOPS及約0.05%(v/v)甘油的混合物處理的大腸桿菌培養液的結果。在處理前通過pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302轉形大腸桿菌細菌。

圖3顯示在使用約0.1%(v/v)MOPS處理後的不同細菌團塊的結果。在MOPS處理前分別通過pLVX-GFP-miR302+367(綠色)或pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302(紅色)載體轉形大腸桿菌細菌。

圖4顯示不同化學誘導劑在勝任大腸桿菌細胞中刺激EF1alpha及/或CMV啟動子驅動的基因表達的誘導性。在本發明測試的所有化學品中，前三種最有效的轉錄誘導劑是MOPS、甘油及乙醇。所使用的誘導劑濃度可以介於約0.001%至約10%，最佳為約0.05至約4%。

圖5分別顯示由MOPS、甘油及乙醇誘導的紅色RGFP蛋白表達的西方墨點法結果。細菌RuvB蛋白作用為管家基因標準(house-keeping standard)以比較誘導之RGFP表達水平。從沒有任何載體轉形的原始大腸桿菌細胞提取的蛋白質及RNA則作為陰性對照(negative controls)。

圖6分別顯示由MOPS、甘油及乙醇誘導的miR-302及其pre-miRNA/pri-miRNA簇基因表達的北方墨點法結果。從沒有任何載體轉形的原始大腸桿菌細胞提取的RNA則作為陰性對照。

圖7顯示了使用從細菌提取物(BE)分離的miR-302及pre-miR-302的iPS細胞(iPSC)生成，其中miR-302/pre-miRNA表達已經通過北方墨點法分析驗證，如圖6所示。如先前所報告的(林2008、2010、2011)，miR-302重編程的iPS細胞(mirPSCs)形成球狀細胞集落，並表達強烈的ESC標誌物Oct4蛋白(由Oct4啟動子驅動的綠色螢光蛋白表達所標記)。

圖8顯示了從細菌提取物(BE)分離的miR-302及pre-miR-302所誘導的Oct4和Sox2基因啟動子的整體DNA去甲基化，其中miR-302/pre-miRNA表達已經通過北方墨點法分析驗證，如圖6所示。根據Simonsson及Gurdon(Nat Cell Biol.6,984-990,2004)的報告，整體DNA去甲基化(global DNA demethylation)及Oct4表達的兩個事件都是體細胞重編程以形成iPSCs所需要的。

圖9A及9B顯示了在體內未處理(9A)及miR-302處理(9B)傷口之間癒合結果的比較。用胺醯化甘油(glycylglycerin)及抗生素軟膏配製分離出的miR-302分子(20-400μg/mL)以形成候選藥物(candidate drugs)，用於體內檢測豬背皮大面積2cm×2cm開放傷口的局部處理(每組n=6)。經過約兩週的處理(每天一次處理)，解剖癒合的傷口，並進一步製成組織切片，用顯微鏡進行組織學檢查。數據顯示，在miR-302處理的傷口中沒有看到或幾乎沒有疤痕，(圖9B，頂部，n=6/6)，而幾乎所有未處理的(僅用抗生素軟膏處理)傷口都含有大的疤痕(圖9A，頂部，n=5/6)。另外，在miR-302處理的傷口中發現了顯著大量的CD34陽性成體幹細胞簇(由綠色螢光抗體所標記)(9B底部，n=6/6)，但在未處理的對照傷口中則沒有(圖9A，底部，n=0/6)。

圖10A及10B顯示了使用合成標準uDNA(由Sigma-Genosys製造)以及由pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302轉形的大腸桿菌細胞所分離的新鮮提取的miR-302s/pre-miR-302s(或稱為Pro-miR-302s)的HPLC純化和分析的結果。標準uDNA係設計以模擬天然pre-miR-302a，即為：5'-CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3'(SEQ.ID.NO.3)。

圖11A和11B顯示使用從空白大腸桿菌勝任細胞或pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302(RGFP-miR302)轉形/轉染的細胞提取的小RNA的microRNA(miRNA)微陣列分析的結果。提取的小RNA通過HPLC進一步純化，如圖10B的綠色標記區域所示。圖11A顯示來自空白大腸桿菌細胞的RNA幾乎不存在microRNA(綠點表示非統計學顯著性，而紅點表示陽性結果)。這是因為原核生物缺乏microRNA表達及處理所需的幾種必需酵素，如Pol-2、Drosha及核糖核酸酶III Dicers(RNaseIII Dicer)。此外，原核RNA聚合酶不轉錄具有高二級結構的小RNA，例如髮夾型pre-miRNAs及 shRNAs，其類似於原核生物中的內在轉錄終止訊號。結果，僅僅是使用本發明，即可在原核細胞中刺激特異性microRNAs之表達，像是miR-302a、a*、b、b*、c、c*、d及d*，如圖11B所示。由於原核生物不具有Dicer，所以大多數如此獲得的microRNAs仍然保留在其髮夾型前驅物構形，例如pri-miRNA(4-髮夾簇(4-hairpin cluster))及/或pre-miRNA(1個髮夾前驅物)。

圖12顯示從空白大腸桿菌細胞(圖11A所示的組別1)或pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302轉形/轉染的細胞(圖11B所示的組別2)提取的表達microRNAs的列表。小於500的信號在統計學上不顯著(如圖11A及11B所示為綠色)，這可能是由低拷貝數(copy number)表達或高背景所造成的。

圖13A及13B顯示了miR-302家族簇(13A)及個體pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d序列(13B)的定序結果(sequencing results)。整個miR-302家族簇基因轉錄物(=pri-miR-302)之結果為：

(SEQ.ID.NO.2)，而pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c、及pro-miR-302d的個別序列分別如下：5’-CCACCACUUA AACGUGGAUG UACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3’(SEQ.ID.NO.3)、5’-GCUCCCUUCA ACUUUAACAU GGAAGUGCUU UCUGUGACUU UAAAAGUAAG UGCUUCCAUG UUUUAGUAGG AGU-3’(SEQ.ID.NO.4)、5’-CCUUUGCUUU AACAUGGGGG UACCUGCUGU GUGAAACAAA AGUAAGUGCU UCCAUGUUUC AGUGGAGG-3’(SEQ.ID.NO.5)、及5’-CCUCUACUUU AACAUGGAGG CACUUGCUGU GACAUGACAA AAAUAAGUGC UUCCAUGUUU GAGUGUGG-3’(SEQ.ID.NO.6)。

圖14A-14F顯示miR-302的處理抑制人SK-N-MC神經細胞中Aβ誘發的細胞凋亡。(14A)使用lipofectamine 2000試劑用pLVX-Grn-miR302載體(黑色條，以形成miR-302-過度表達細胞)或空載體(白色條，用作對 照細胞)轉染SK-N-MC細胞。在倒立螢光顯微鏡下藉由共同表達綠色螢光蛋白(AcGFP)來檢測陽性轉染的細胞。(14B)分別使用從miR-302轉染(黑色條)或對照(白色條)細胞提取的總RNA樣品之miR-302表達的RT-qPCR分析。於轉染細胞中檢測到的miR-302表達水平係以對照細胞的水平進行標準化(normalized)(n=3，p<0.01)。(14C)通過MTT測定法測定細胞存活率(Cell viability)。將細胞接種在24孔盤中過夜，然後用2.5μM Aβ處理24小時。使用對照細胞之水平來標準化細胞存活率的結果，顯示出異位miR-302表達顯著降低Aβ誘發的細胞死亡。(14D)螢光顯微鏡下以DAPI染色觀察細胞凋亡期間核染色質(nuclear chromatins)的形態學變化(Morphological changes)。將細胞在塗佈載玻片(coated slides)上培養並用2.5μM Aβ處理24小時。標記細胞核碎裂(nuclei fragmentation)(白色箭頭)且藉由每個條件計數四次隨機場(random fields)來定量。(14F)在Aβ處理後(2.5μM Aβ，24小時)之Aβ誘發的細胞凋亡係通過半胱天冬酶3(Caspase 3)和PARP裂解的西方墨點法來測定。結果與對照細胞的密度水平進行標準化下，顯示出miR-302轉染細胞中Aβ誘發的細胞凋亡係明顯減弱(n=3，p<0.01)。(Aβ，乙型類澱粉(amyloid-β)；+，有處理；-，沒有處理。所有數值均以平均值±S.E.M.表示。藉由使用鄧奈特(Dunnett)的事後比較測試(post-hoc trest)進行多次比較，確定顯著性差異* p<0.05及** p<0.01。)

圖15A-15D顯示異位miR-302表達活化Akt訊號並因此降低Aβ誘發的細胞毒性。(15A)Aβ處理(2.5μM)24小時後，pSer307-IRS-1、pTyr-IRS-1及pSer473-Akt表達的西方墨點法分析，顯示出與miR-302轉染細 胞相比，在對照組中pSer307-IRS-1的顯著提升(n=3，p<0.01)以及pTyr-IRS-1和pSer473-Akt水平兩者的降低(n=3，p<0.05)。(15B)以2.5μM Aβ或20μM LY294002，或同時兩者處理24小時後，pSer473-Akt水平的西方墨點法分析。(15C)回應於(15B)之處理，由MTT測定法所測定之細胞存活率。(15D)回應於miR-302s之處理(15B)，pSer9-GSK3β和pThr231-tau水平的西方墨點法測量結果，顯示出miR-302可以刺激Akt訊號傳導來抵消Aß介導的細胞毒性，致使顯著增加的GSK3βSer9磷酸化以及tau-Thr231磷酸化的降低(n=3，p<0.05)。然而，進一步共同處理Aβ(2.5μM)及LY294002(20μM)則消除了在miR-302轉染的細胞中所有Akt訊號傳導之這些保護效果(n=3，p<0.05)。(Aβ，乙型類澱粉(amyloid-β)；+，有處理；-，沒有處理。所有數值均以平均值±S.E.M.表示。藉由使用鄧奈特(Dunnett)的事後比較測試(post-hoc trest)進行多次比較，確定顯著性差異* p<0.05及** p<0.01。)

圖16A-16E顯示miR302誘導的Akt訊號活化減弱了Aβ誘發的氧化壓力。(16A)藉由螢光顯微鏡檢測用DHE染色的細胞內超氧化物自由基陰離子。用2.5μM Aβ或1μM胰島素或兩者處理細胞2小時，然後用DHE染色來分析。在比較之前，用對照細胞的水平對紅色螢光染料的強度進行標準化。(16B)Aβ處理(2.5μM)24小時後，西方墨點法分析顯示，與miR-302轉染細胞相比，對照細胞中Nrf2和HO-1的表達降低(n=3，p<0.05)。(16C)在1μM胰島素或20μM LY294002或兩者的存在下用2.5μM Aβ處理細胞，然後用西方墨點法分析Nrf2。如所示般，共同處理Aβ及LY294002會抑制Nrf2表達(n=3，p<0.05)，而胰島素(1μM)的進一步處理防止對Nrf2表達的 此抑制作用(n=3，p<0.05)。(16D)用JC-1染料進一步染色(16C)之細胞，並於倒立螢光顯微鏡下觀察，顯示出Aβ處理降低了miR-302轉染細胞中JC-1綠色螢光的強度(n=3，p<0.05)，而進一步以LY294002(20μM)處理則可防止這種作用。(16E)西方墨點法分析顯示，在Aβ處理(2.5μM)24小時後，與miR-302轉染的細胞相比，在對照細胞中觀察到tBid的顯著增加以及Bcl-2的降低。(Aβ，乙型類澱粉(amyloid-β)；+，有處理；-，沒有處理。對於螢光強度定量，在進行比較前，測試細胞的水平係以比對細胞進行標準化。數值以平均值±S.E.M.表示。藉由使用鄧奈特(Dunnett)的事後比較測試(post-hoc trest)進行多次比較，確定顯著性差異* p<0.05及** p<0.01。)

圖17A-17F顯示miR-302靶向PTEN並通過Akt訊號上調Nanog。(17A)顯示人PTEN 3'UTR內預測的miR-302結合位點的比對(Alignment)。(17B及17C)分別從未處理的對照細胞和miR-302轉染的細胞獲得細胞裂解物，且進一步以西方墨點法分析PTEN及Nanog，顯示於miR-302轉染的細胞中之PTEN之下調及Nanog的上調(n=3，p<0.05)。(17D)在Aß處理(2.5μM)24小時後，PTEN、pSer473 Akt及Nanog表達的西方墨點法分析，顯示出與miR-302轉染細胞(n=3，p<0.05)相比，在對照細胞(n=3，p<0.01)中，PTEN增加(p<0.05)，以及pSer473 Akt與Nanog降低(p<0.05)。(17E)以Aβ(2.5μM)或LY294002(20μM)或兩者處理24小時後，pSer473 Akt及Nanog表達的西方墨點法分析，顯示出在以Aß及LY294002處理之miR-302轉染細胞中，pSer473 Akt及Nanog均顯著降低(n=3，p<0.05)。(17F)用shRNA-Nanog瞬時轉染miR-302轉染細胞， 然後用Aβ(2.5μM)處理24小時。與單獨用Aβ處理的對照細胞相比，在miR-302轉染細胞中的Nanog的shRNA引導敲低會顯著地提升pSer307-IRS-1，並降低pTyr-IRS-1、pSer473-Akt及pSer9-GSK3β表達水平。(Aβ，乙型類澱粉(amyloid-β)；shRNA-Nanog，對人類Nanog導向之shRNA基因靜默子。+，有處理；-，沒有處理。強度定量(density quantification)結果係以比對細胞之水平進行標準化。數值以平均值±S.E.M.表示。藉由使用鄧奈特(Dunnett)的事後比較測試(post-hoc trest)進行多次比較，確定顯著性差異* p<0.05及** p<0.01。)

圖18A-18D顯示miR-302處理後體外和體內Naong和LARP7mRNAs表達水平的比較。(18A)Aβ處理(2.5μM)24小時後，體外對照細胞中Nanog mRNA的表達明顯降低(n=3，p<0.05)。(18B)分別收集AD患者(n=7)和正常年齡匹配個體(n=6)血液樣本，並提取總RNA而用於RT-qPCR分析。結果顯示AD患者的PBMCs表達顯著低於正常個體之Nanog mRNAs(P<0.05)。(18C)24小時Aβ處理(2.5μM)後，與miR-302轉染的細胞相比，體外對照細胞中LARP7 mRNA的表達明顯降低(n=3，p<0.05)。(18D)AD患者的PBMCs表達顯著低於正常個體的LARP7 mRNA水平(p<0.05)。(Aβ，乙型類澱粉(amyloid-β)；AD，阿茲海默症。mRNA表達水平係以比對細胞之水平或正常健康個體之水平進行標準化。數值以平均值±S.E.M.表示。藉由使用鄧奈特(Dunnett)的事後比較測試(post-hoc trest)進行多次比較，確定顯著性差異* p<0.05及** p<0.01。)

圖19顯示了miR-302對Aβ誘發的神經毒性的保護作用的假設機制(scheme)。miR-302的上調可以沉默PTEN以活化Akt訊號，其隨後(i) 刺激Nrf2/HO-1升高，從而減弱Aβ誘發的氧化壓力和凋亡，以及(ii)刺激Nanog表達以抑制p-Ser307 IRS-1表達，致使胰島素/IRS-1/Akt訊號傳導的顯著增加，從而抑制GSK3β介導的tau高磷酸化。

圖20顯示了包含於對於阿茲海默症治療之miR-302處理之本研究中的阿茲海默症患者與年齡匹配的健康個體的資料。該表分別列出阿茲海默症患者及健康個體對照的性別、年齡、MMSE及CASI分數。

實例

僅為了實際演示目的而非限制特別參照所提供之實例。

1.細菌細胞培育及化學處理

大腸桿菌DH5α菌株的勝任細胞係從z-勝任大腸桿菌轉形試劑盒(z-competent E.coli transformation kit)(Zymo Research，Irvine，CA)獲得，並藉由混合約1-10μg所需的質體載體如pLVX-Grn-miR302 +367及/或pLenti-EF1alpha-RGFP-miR302載體來轉形。未轉形細菌細胞通常在37℃下於補充有10mM MgSO₄和0.2mM葡萄糖的Luria-Bertani(LB)培養液中以170rpm頻繁攪拌而生長，而轉形細菌細胞則在相同條件下進一步加入100μg/mL安比西林(ampicillin)來培育。為了化學誘導，在100μg/mL安比西林之存在下分別加入約0.1-10mL的MOPS、甘油及/或乙醇或其組合於補充有10mM MgSO₄及0.2mM葡萄糖的每公升(per litter)LB培養液中。作為陰性對照，將轉形細胞在相同的安比西林添加LB培養液中培育，但不加入任何化學誘導劑。

2.人類細胞培育及MicroRNA轉染

為了用miR-302誘導幹細胞衍生，在補充有20% FBS之新鮮RPMI 1640培養基中由最小單位2立方毫米塊(2 cubic mm)以4mg/mL膠原酶I(collagenase I)於37℃下消化35分鐘來分離及解離人表皮細胞(hpESCs)。針對培養角質細胞(keratinocytes)，在不含抗生素的情況下，在37℃，5% CO₂下，將分離的細胞培養在補充有人類角質細胞生長補充劑(HKGS，Invitrogen，Carlsbad，CA)的EpiLife無血清細胞培養基中。於50%-60%細胞滿度(confluency)時通過將細胞暴露於胰蛋白酶(trypsin)/EDTA溶液1分鐘，並用無酚紅DMEM培養基(Invitrogen)漂洗一次來繼代培養細胞，且脫離的細胞(detached cells)係依據1：10稀釋度重新接種(replated)於補充有HKGS之新鮮EpiLife培養基中。人類癌症/腫瘤細胞株MCF7、HepG2及Tera-2得自美國菌種中心(ATCC，Rockville，MD)並根據製造者之建議維持存續。對於microRNA/shRNA轉染，將15μg分離的miR-302及/或其前驅物溶解在1mL新鮮EpiLife培養基中，並與50μL的X-tremeGENE HP DNA轉染試劑混合。在培育10分鐘後，將混合物分別加入含有50%-60%細胞滿度之hpESCs或癌/腫瘤細胞的100-mm細胞培養皿中。12至18小時後，培養基由具有HKGS補充劑的新鮮EpiLife培養基或ATCC建議的條件培養基(conditioned medium)替代。此轉染過程可以每三到四天重複3-4次，以提高轉染效率。在細胞形態變成球形後，細胞(mirPSCs)於37℃，5% CO₂下在補充有20%剔除血清、1% MEM非必需胺基酸、100μM β-巰基乙醇(ß-mercaptoethanol)、1mM GlutaMax、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、10ng/mL bFGF、10ng/mL FGF-4,5ng/mL LIF、100IU/ml盤尼西 林(penicillin)/100μg/mL鏈黴素(streptomycin)、0.1μM A83-01及0.1μM丙戊酸(valproic acid)(Stemgent，San Diego，CA)的剔除DMEM/F-12培養基(Invitrogen，CA)中生長並繼代。

於以miR-302治療阿茲海默症的試驗中，自美國菌種中心(ATCC，Bethesda，MD，USA)取得人類神經母細胞瘤(human neuroblastoma)SK-N-MC細胞。於37℃，5% CO₂下在補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum)、100單位/mL盤林西林、100μg/mL鏈黴素及2mM的L-麩醯胺酸(L-glutamine)的伊格爾基礎培養基(Minimal Eagle's medium)(MEM，Gibco)中維續細胞。為了誘導miR-302表達，使用lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)遵循製造商之指示應用pLVX-Grn-miR-302載體以轉染SK-N-MC細胞，以形成miR-302轉染的細胞。藉由共表達的AcGFP綠色螢光蛋白之存在來鑑定miR-302轉染的細胞。為了沉默Nanog表達，從台灣中央研究院獲得導向針對人類Nanog mRNAs的另一shRNA基因沉默子載體，稱之為shRNA-Nanog。在一些實驗中，發明人進一步使用lipofectamine 2000試劑將shRNA-Nanog載體轉染到miR-302轉染的細胞中。

3.蛋白質提取及西方墨點法分析

遵循製造商的建議，細胞(10⁶)用補充有蛋白酶抑制劑(protease inhibitors)、亮肽素(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF的CelLytic-M裂解/提取試劑(CelLytic-M lysis/extraction reagent)(Sigma)裂解。裂解物在4℃以12,000rpm離心20分鐘，回收上清液。在E-max微盤分析儀(E-max microplate reader)(Molecular Devices，CA)上使用改良之SOFTmax蛋白測定套組(SOFTmax protein assay package)來測量蛋白質濃 度。在加載到6-8%的聚丙烯醯胺膠體(polyacylamide gel)之前，於還原(+50mM DTT)以及非還原(無DTT)條件下，將每30μg細胞裂解液加入SDS-PAGE樣品緩衝液中煮沸3分鐘。蛋白質係以SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳(PAGE)分析，電轉印(electroblotted)於硝酸纖維素膜上並在室溫下培育(incubated)於奧德賽阻斷試劑(Odyssey blocking reagent)(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中2小時。接著，將一級抗體(primary antibody)施加於試劑，並在4℃下培育混合物。一級抗體包含Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)、CDK2(Santa Cruz)、cyclin D1(Santa Cruz)、cyclin D2(Abcam)、BMI-1(Santa Cruz)、角蛋白16(keratin 16)(Abcam)、ß-actin(ß-肌動蛋白)(Chemicon，Temecula，CA)、RuvB(Santa Cruz)及RGFP(Clontech)。過夜後，用TBS-T將膜漂洗3次，接著再於室溫下暴露於接至Alexa Fluor 680反應性染劑之山羊抗小鼠IgG偶聯二級抗體(1：2000；Invitrogen-Molecular Probes)1小時。在三次另外的TBS-T沖洗之後，使用Li-Cor Odyssey Infrared Imager以及Odyssey Software v.10(Li-Cor)進行免疫轉印(immunoblot)的螢光掃描(fluorescent scanning)與圖像分析。

4.RNA提取及北方墨點法分析

以mirVana^TM miRNA分離試劑組分離總RNAs(10μg)(Ambion，Austin，TX)，通過15% TBE-脲聚丙烯醯胺膠體或3.5%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，與電轉印至尼龍膜(nylon membrane)來分級分離。使用[LNA]-DNA探針(5'-[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA-3')(SEQ.ID.NO.1)探針進行miR-302及/或pre-miR-302的檢測。藉由高效液層 析法(HPLC)純化探針並在[³²P]-dATP存在下(>3000 Ci/mM，Amersham International，Arlington Heights，IL)用末端轉移酶(terminal transferase)(20單位)加尾標記(tail-labeled)20分鐘。

5.質體擴增及質體DNA/總RNA提取

將經質體轉形處理之勝任大腸桿菌DH5α細胞(來自示例1)在補充有10mM MgSO₄及0.2mM葡萄糖之LB培養液中在37℃下在以170rpm頻繁攪拌下培養隔夜。為了誘導真核啟動子驅動之RNA及/或蛋白質產生，添加0.5至2ml MOPS、甘油及/或乙醇至每1公升LB培養液中以便進行以上細菌培養及擴增。使用HiSpeed質體純化套組(Qiagen，Valencia,CA)遵循製造商之方案但有RNase A不添加至P1緩衝液中的微小修改，將所有擴增之質體DNA及表達之mRNAs/microRNAs分離在一起。將含有質體及mRNAs/microRNAs兩者之最終提取產物溶解於經DEPC處理之ddH₂O中，且在使用之前儲存於-80℃下。為了僅純化擴增之質體載體，添加RNase A至P1緩衝液中且遵循製造商之方案執行提取程序。

6.MicroRNA及mRNA分離/純化

使用mirVana^TM miRNA分離套組(Ambion，Austin,TX)遵循製造商之方案，進一步純化自以上示例5分離之總RNA。將最終產物溶解於經DEPC處理之ddH₂O中，且在使用之前儲存於-80℃下。因為細菌RNA在本質上極快降解(數小時)，而真核poly-A RNA(mRNAs)及髮夾型microRNA前驅物(pre-miRNA或pri-miRNA)在4℃下保持相對穩定(半衰期達3-4天)，發明人可使用此差異獲取純mRNAs及/或pre-miRNAs以供進一步應用。舉例而言，RGFP mRNA可用以鑑別經轉染細胞，而pre-miR-302s用以將體細胞 重新編程為類ESC iPS細胞。經純化之pre-miR-302s亦可添加至幹細胞培養基中以促進且維持重新編程過程。

7.免疫染色測定

如所報導(Lin等人，RNA 2008)對組織樣品執行包埋、切片及免疫染色。一級抗體包括Oct4(Santa Cruz)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)及RGFP(Clontech)。經螢光染料標記之山羊抗兔或馬抗小鼠抗體用作二級抗體(Invitrogen-Molecular Probes)。在螢光80i顯微定量系統下用Metamorph成像程式(Nikon)以100x或200x放大率檢查及分析陽性結果。

8.亞硫酸鹽DNA定序

使用DNA分離套組(Roche，Indianapolis,IA)自約兩百萬個細胞分離基因體DNA，且用亞硫酸鹽(CpGenome DNA修飾套組，Chemicon，Temecula,CA)根據製造商之建議進一步處理1μg分離之DNA。亞硫酸鹽處理將所有去甲基化胞嘧啶轉化為脲嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持為胞嘧啶。在亞硫酸鹽DNA定序分析中，發明人用PCR擴增Oct4及Nanog之啟動子區域。引子包括用於Oct4之5’-GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG-3’(SEQ.ID.NO.2)及5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3’(SEQ.ID.NO.3)，及用於Nanog之5’-TGGTTAGGTT GGTTTTAAAT TTTTG-3’(SEQ.ID.NO.4)及5’-AACCCACCCT TATAAATTCT CAATTA-3’(SEQ.ID.NO.5)。將亞硫酸鹽修飾之DNA(50ng)首先與引子(總計100pmol)於1x PCR緩衝液中混合，加熱至94℃維持2分鐘，且立即於冰上冷卻。隨後，使用Expand High Fidelity PCR套組 (Roche)，如下執行25個PCR循環：94℃持續1分鐘及70℃持續3分鐘。將具有正確大小之擴增DNA產物藉由3%瓊脂糖凝膠電泳進一步分級收集，用凝膠提取過濾件(gel extraction filter)(Qiagen)純化，且隨後用於DNA定序中。隨後藉由將經轉化DNA序列中之未變胞嘧啶與未經轉化之DNA序列比較，生成DNA甲基化位點之詳細圖譜。

9.材料及製備

3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、二氫乙錠(dihydroethidium,DHE)及JC-1係購自Sigma(Munchen,Germany)。乙型類澱粉(Aβ)1-42係獲自AnaSpec Inc.(San Jose,CA,USA)，且溶液係根據發明人先前報導(Li等人,2015)來製備。所用抗體分別係針對Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β、IRS-1、Nrf2、HO-1、tBid、Bcl-2、半胱天冬酶3(caspase 3)、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(來自Santa Cruz,CA,USA)、p-酪氨酸、p-Tau、Tau(來自Merck Millipore，Darmstadt,Germany)、β-肌動蛋白(來自Novus Biologicals，Littleton,CO,USA)、p-IRS-1、Nanog及PTEN(來自Cell Signaling Technology，Danvers,MA,USA)。

10.細胞存活率測定

將細胞接種於24孔盤中隔夜，且隨後依據指示進行處理。在24小時之後，遵循製造商之指示添加四唑鹽(tetrazolium salt)MTT至培養基中。僅活細胞可使MTT代謝為紫色甲瓚(formazan)產物，藉由Bio-Rad分光光度計在550nm下進一步定量其色彩密度(OD)。藉由經處理細胞或 經轉染細胞之OD除以對照細胞之OD的百分比確定細胞存活率。

11.細胞核形態之檢查

將細胞以60%細胞滿度(confluency)培養於經塗佈之載片上，且隨後用藥物處理24小時。隨後，使用螢光顯微鏡檢查細胞的細胞核形態變化，尤其是細胞凋亡特徵之變化。將細胞在24小時指定化合物處理之後固定於4%多聚甲醛(paraformaldehyde)，於冰冷甲醇中進行滲透(permeabilized)，在室溫下與1ng/mL DAPI染色劑一起培育15分鐘，且隨後在螢光顯微鏡(DP80/BX53，Olympus)下觀測。藉由針對每種處理條件計數四次隨機場來定量細胞凋亡細胞。

12.粒線體膜電位(MMP)之分析

使用活體(vital)粒線體陽離子染料JC-1研究MMP，該染料以電位依賴性方式積聚於粒線體中。將細胞用1μM JC-1於新鮮培養基中處理且在37℃下培育30分鐘。隨後使用倒立螢光顯微鏡(DP72/CKX41，Olympus)對細胞形態進行觀測及攝影。在正常細胞中，JC-1保持為紅色螢光聚集體，而在細胞凋亡之誘導期間，粒線體電位崩潰且因此JC-1形成單體，產生綠色螢光。使用Image J軟體(NIH，Bethesda,MD)藉由螢光強度定量MMP。隨後，將來自對照細胞之標準化螢光強度水準設定為100%，以便比較測試組中螢光強度之相對表現水準。

13.藉由二氫乙錠(DHE)染色偵測ROS

DHE係用於偵測胞內超氧自由基陰離子之螢光試劑。將細胞於含有10μM DHE之新鮮培養基中處理，且在室溫下在暗處培育30分鐘。在30分鐘培育之後，丟棄染色培養基，且將細胞用PBS洗滌兩次，且隨後在 倒立螢光顯微鏡(DP72/CKX41)下觀測及攝影。使用Image J軟體(NIH，Bethesda,MD)藉由氧化DHE螢光強度確定ROS水準。隨後，將來自對照細胞之標準化螢光強度水準設定為100%，以便比較測試組中螢光強度之相對表現水準。

14.研究群體及血液樣品

根據經中山醫學大學醫烷(Chung Shan Medical University Hospital)之機構審查委員會(Institutional Review Board，IRB)批准的標準化程序(CSMUH編號：CS 13233)(圖20)自AD患者(n=7)及年齡匹配的健康個體(n=6)執行血液取樣。臨床AD診斷係由精神疾病診斷與統計手冊IV(DSM-IV)準則確定，且用簡短智能測驗(Mini-Mental State Examination，MMSE)及認知能力篩檢測驗(cognitive abilities screening instrument，CASI)測試完成。MMSE分數用作認知功能之粗略量測。介於1至100之CASI分數用於對注意力、集中力、定位力、短期記憶、長期記憶、語言能力、視覺建構、思緒流暢度(list-generating fluency)、抽象化及判斷力進行定量評估。AD患者(n=7，平均年齡80.0±4.9歲，範圍74-86歲)及年齡匹配的健康個體(n=6，平均年齡80.0±5.9歲，範圍72-86歲)之詳細概述總結於圖20中。多個AD患者(n=7，女性/男性=4/3)在MMSE(平均量表=19.3±2.6，範圍16-23)及CASI(平均量表=65.1±10.3，範圍49-79)量測量表下具有中度癡呆，展示AD患者與年齡匹配的健康對照組(n=6，女性/男性=3/3)之間的大多數差異(圖20)。年齡匹配的健康個體於臺灣臺中之中山醫學大學之老年醫學研究組(Aging Research Unit)由當地廣告招募。在所有測試的健康個體中偵測到既無認知障礙亦無任何癡呆病症。AD 患者及年齡匹配的健康個體皆係根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)及經IRB批准之方案已自所有參與者及/或其最近親屬獲得書面知情同意書之自願者。自每個測試個體獲得約20mL靜脈周邊血液單核細胞(PBMC)，且隨後用Qiagen RNeasy套組(Qiagen，Germantown,MD,USA)自每個血液樣品分離總RNA，且將其進一步遵循製造商之指示用於分光光度法定量。

15.反轉錄(RT)及定量PCR(qPCR)

使用Qiagen RNeasy套組(Qiagen)分別自患者之PBMC及細胞提取總RNA，且進一步以分光光度法定量。使用1μg總RNA且遵循ABI High-Capacity cDNA Archive套組(ABI)之方案執行RT-qPCR。隨後，發明人將所得cDNA稀釋為十倍，且僅使用5μl經稀釋cDNA根據製造商之指示以所提供之Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)、ROX溶液(Thermo)於Applied Biosystems 7300 Real Time PCR系統上運行每次三重複qPCR。用SDS軟體版本1.2.3(序列偵測系統(Sequence Detection Systems)1.2.3-7300 Real Time PCR系統，Applied Biosystems)獲取相對mRNA或miRNA表達水準，且隨後用同一樣品中之管家GAPDH表達水準進一步標準化。將對照細胞或正常健康個體之標準化mRNA水準設定為100%，以便比較測試組中mRNA表達之相對表達水準。

16.統計分析

重複每個實驗至少三次(n>3)。所有資料均呈現為平均值±平均值之標準誤差(S.E.M)。在細胞存活率測試中，將對照細胞之平均群體數目設定為100%，以便比較其他測試細胞之存活率。在西方墨點法中，將每次轉印(blotting)中所量測之蛋白質水準首先用管家β-肌動蛋白蛋白 質之表達水準標準化，且隨後與對照細胞中表達之蛋白質之標準化水準比較，隨後將其對照蛋白質水準設定為100%以便進一步比較。在RT-qPCR中，將所測量之mRNA表達值首先用管家GAPDH之表現水準標準化，且隨後與對照細胞或正常健康個體之標準化mRNA水準比較，將其對照mRNA水準設定為100%，以便比較測試組中mRNA之相對表達水準。為了量測螢光強度，將對照細胞之標準化螢光強度水準設定為100%，以便比較測試組中螢光強度之相對表達水準。藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance，ANOVA)、多重比較遵循鄧尼特事後測試(Dunnett’s post-hoc test)用SPSS統計軟體(SPSS,Inc.，Chicago,IL,USA)以及雙尾學生t測試(two-tailed Student's t-test)，測定比較組之間的差異之統計顯著性。視個別實驗而定，分別<0.05或<0.01之概率值(probability value)視為指示統計顯著性，且因此顯著水準設定在* p<0.05或** p<0.01。p<0.05之概率值視為顯著。所有p值均由雙尾測試測定。

參考文獻：

1. Lin SL, Chang D, Chang-Lin S, Lin CH, Wu DTS, Chen DT及Ying SY. (2008) Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA 14, 2115-2124。

2. Lin SL及Ying SY. (2008) Role of mir-302 microRNA family in stem cell pluripotency and renewal. Ying SY. (Ed.) Current Perspectives in MicroRNAs. Springer Publishers press, New York, 第167-185頁。

3. Lin SL, Chang D, Ying SY, Leu D及Wu DTS. (2010) MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenecity of human pluripotent stem cells by coordinate suppression of CDK2 and CDK4/6 cell cycle pathways. Cancer Res. 70, 9473-9482。

4. Lin SL, Chang D, Lin CH, Ying SY, Leu D及Wu DTS. (2011) Regulation of somatic cell reprogramming through inducible mir-302 expression. Nucleic Acids Res. 39, 1054-1065。

5. Lin,S.L. (2011) Deciphering the mechanism behind induced pluripotent stem cell generation. Stem Cells, 29, 1645-1649。

6. Lin,S.L.及Ying,S.Y. (2012) Mechanism and method for generating tumor-free iPS cells using intronic microRNA miR302 induction. Shao-Yao Ying (Ed.) MicroRNA Protocols, 第2版 第295-324頁, Springer Publishers press, New York。

7. Lin,S.L.及Chen,J. (2013) Mechanism of miR-302-mediated iPS cell generation. Sell S (Ed.) Stem Cells Handbook. 第119-127頁, Springer Publishers press, New York。

8. Chen,S.K.J.及Lin,S.L. (2013) Recent patents on microRNA-induced pluripotent stem cell generation. Recent Patents on Regenerative Medicine, 3, 5-16。

9. McDowell等人, (1994) Determination of intrinsic transcription termination efficiency by RNA polymerase elongation rate. Science 266, 822-825。

10. Cholerton B, Baker LD及Craft S. (2011) Insulin resistance and pathological brain ageing. Diabet Med. 28, 1463-1475。

11. Spielman LJ, Little JP及Klegeris A. (2014) Inflammation and insulin/IGF-1 resistance as the possible link between obesity and neurodegeneration. J Neuroimmunol 273, 8-21。

12. Williamson R, McNeilly A及Sutherland C. (2012) Insulin resistance in the brain: an old-age or new-age problem? Biochem Pharmacol 84, 737-745。

13. Butterfield DA. (2002) Amyloid beta-peptide (1-42)-induced oxidative stress and neurotoxicity: implications for neurodegeneration in Alzheimer's disease brain. A review. Free Radic Res 36, 1307-1313。

14. Li HH, Lu FJ, Hung HC, Liu GY,Lai TJ及Lin CL. (2015) Humic Acid Increases Amyloid beta-Induced Cytotoxicity by Induction of ER Stress in Human SK-N-MC Neuronal Cells. Int J Mol Sci 16, 10426-10442。

15. Lesne SE, Sherman MA, Grant M, Kuskowski M, Schneider JA, Bennett DA及Ashe KH. (2013) Brain amyloid-beta oligomers in ageing and Alzheimer's disease. Brain 136, 1383-1398。

16. Kornelius E, Lin CL, Chang HH, Li HH, Huang WN, Yang YS, Lu YL, Peng CH及Huang CN. (2015) DPP-4 Inhibitor Linagliptin Attenuates Abeta-induced Cytotoxicity through Activation of AMPK in Neuronal Cells. CNS Neurosci Ther 21, 549-557。

17. Hernandez F, Lucas JJ及Avila J. (2013) GSK3 and tau: two convergence points in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 33 Suppl 1, S141-144。

18. Bhat NR及Thirumangalakudi L. (2013) Increased tau phosphorylation and impaired brain insulin/IGF signaling in mice fed a high fat/high cholesterol diet. J Alzheimers Dis. 36, 781-789。

19. Majewski N, Nogueira V, Robey RB及Hay N. (2004) Akt inhibits apoptosis downstream of BID cleavage via a glucose-dependent mechanism involving mitochondrial hexokinases. Mol Cell Biol. 24, 730-740。

20. Surh YJ, Kundu JK及Na HK. (2008) Nrf2 as a master redox switch in turning on the cellular signaling involved in the induction of cytoprotective genes by some chemopreventive phytochemicals. Planta Med. 74, 1526-1539。

21. Kwon SH, Ma SX, Hwang JY, Lee SY及Jang CG. (2015) Involvement of the Nrf2/HO-1 signaling pathway in sulfuretin-induced protection against amyloid beta neurotoxicity. Neuroscience 304, 14-28。

22. Alva JA, Lee GE, Escobar EE及Pyle AD. (2011) Phosphatase and tensin homolog regulates the pluripotent state and lineage fate choice in human embryonic stem cells. Stem Cells 29, 1952-1962。

23. Kuijk EW, van Mil A, Brinkhof B, Penning LC, Colenbrander B及Roelen BA. (2010) PTEN and TRP53 independently suppress Nanog expression in spermatogonial stem cells. Stem Cells Dev 19, 979-988。

24. Han J, Mistriotis P, Lei P, Wang D, Liu S及Andreadis ST. (2012) Nanog reverses the effects of organismal aging on mesenchymal stem cellproliferation and myogenic differentiation potential. Stem Cells 30, 2746-2759。

25. Houbaviy等人(2003) Developmental Cell 5, 351-358, Tablet 1。

26. Simonsson S及Gurdon J. (2004) DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nat Cell Biol. 6, 984-990。

27. Lin之歐洲專利第2198025號。

28. Lin之美國專利申請案第12/149,725號。

29. Lin之美國專利申請案第12/318,806號。

30. Lin之美國專利申請案第12/792,413號。

31. Gossen之美國專利第5,464,758號。

32. Buechler之美國專利第7,959,926號。

33. Mehta之美國專利第7,968,311號。

34. Kim之PCT公開案第WO 2005/056797號。

序列表

(1)總體資訊：

(iii)序列數：6

(2)SEQ ID NO：1之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：17個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：線性

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「天然」

(iii)假想：否

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

(2)SEQ ID NO：2之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：720個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：多個髮夾

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「重組」

(iii)假想：否

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

(2)SEQ ID NO：3之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：69個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：髮夾

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「重組」

(iii)假想：是

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

(2)SEQ ID NO：4之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：73個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：髮夾

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「重組」

(iii)假想：是

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

(2)SEQ ID NO：5之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：68個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：髮夾

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「重組」

(iii)假想：是

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

(2)SEQ ID NO：6之資訊：

(i)序列特徵：

(A)長度：68個鹼基對

(B)類型：核酸

(C)股型：單股

(D)拓樸：髮夾

(ii)分子類型：RNA

(A)描述：/desc=「重組」

(iii)假想：是

(iv)反義：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

<110> 林志立(Lin,Chih-Li) 李欣樺(Li,Hsin-Hua) 賴德仁(Lai,Te-Jen) 林希龍(Lin,Shi-Lung)

<120> 使用MIR-302前驅物作為治療阿茲海默症之藥物的組合物及方法

<150> US 62/262,280

<151> 2015-12-2

<150> PCT/US2016/018774

<151> 2016-02-19

<160> 6

<170> PATENTIN VERSION 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 17

<223> 化學合成

<400> 1

<210> 2

<211> 720

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 720

<223> 化學合成

<400> 2

<210> 3

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 69

<223> 化學合成

<400> 3

<210> 4

<211> 73

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 73

<223> 化學合成

<400> 4

<210> 5

<211> 68

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 68

<223> 化學合成

<400> 5

<210> 6

<211> 68

<212> RNA

<213> 人工序列

<220> 68

<223> 化學合成

<400> 6

Claims (13)

1. 一種以髮夾型pre-miRNA模擬物在體外保護人類腦部神經元免於A β誘發神經毒性之方法，其包含：(a)以包含SEQ.ID.NO.2的至少一載體在體外轉染至少一神經元，其中，該些載體經通過一真核啟動子表達，能夠產生至少一髮夾型pre-miRNA模擬物；以及(b)在經轉染之該些神經元中表達該些載體，以自該些載體表達產生該至少一髮夾型pre-miRNA模擬物。
2. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物係為選自由microRNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)、其前驅物及同源物以及其組合所組成之群組之結構構形的miR-302前驅物(pre-miR-302)。
3. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物係包含具個別序列為SEQ.ID.NO3、SEQ.ID.NO4、SEQ.ID.NO5、及SEQ.ID.NO6之髮夾型pre-miRNA模擬物。
4. 如請求項1所述之方法，其中該些載體為pLenti-EF1alpha/CMV-RGFP/GFP-miR302。
5. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物之表達在該些神經元中產生miR-302a、miR-302b、miR-302c、及miR-302d。
6. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物誘導Akt訊號活化。
7. 如請求項6所述之方法，其中該Akt訊號活化在神經元中改善胰島素阻抗。
8. 如請求項7所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物作用以抑制p-307 IRS-1絲氨酸磷酸化、或增加IRS-1酪氨酸磷酸化、或抑制p-307 IRS-1絲氨酸磷酸化並增加IRS-1酪氨酸磷酸化。
9. 如請求項6所述之方法，其中該Akt訊號活化進一步刺激Nanog表達以增加胰島素訊號敏感性。
10. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物誘導Nrf2/HO-1表達，以降低Aβ誘發之細胞內ROS堆積及凋亡。
11. 如請求項1所述之方法，其中該些髮夾型pre-miRNA模擬物係能夠用於開發治療阿茲海默症之療法。
12. 一種藉由靜默至少一基因來誘導Akt訊號活化而在體外保護人類腦部神經元的方法，其包含：(a)以包含SEQ.ID.NO.2的至少一載體在體外轉染至少一神經元，其中，該些載體經通過一真核啟動子表達，能夠產生至少一髮夾型pre-miRNA模擬物；以及(b)在經轉染之該些神經元中表達該些載體，以自該些載體表達產生該至少一髮夾型pre-miRNA模擬物。
13. 如請求項12所述之方法，其中該至少一基因包含PTEN基因。

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