CN107447016B - miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及miR‑24‑1‑5p在结直肠肿瘤中的应用。通过荧光定量PCR检测miR‑24‑1‑5p在结直肠肿瘤组织及5种结直肠肿瘤细胞系中的表达情况，发现miR‑24‑1‑5p在结直肠肿瘤组织和细胞中的表达发生明显下调，miR‑24‑1‑5p在结直肠肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调控作用。通过构建miR‑24‑1‑5p过表达载体，转染结直肠肿瘤细胞Caco2和HCT‑116细胞，MTT、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验探究miR‑24‑1‑5p对结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移影响，揭示miR‑24‑1‑5p能够显著抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移，能够用于直肠肿瘤治疗的生物制剂。

Description

miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用。
背景技术
微小RNA(miRNA)是具有长度为18-22nt的内源性小非编码RNA，其通过与靶mRNA的3'-UTR结合来干扰mRNA的翻译，从而调节基因表达，并最终诱导靶mRNA或编码蛋白的降解。miRNA在许多生物过程中起重要作用，如增殖，分化，凋亡，血管生成和各种类型肿瘤症中的细胞存活，包括结肠直肠肿瘤，乳腺肿瘤，膀胱肿瘤和非小细胞肺肿瘤等。许多人类肿瘤症表现出可以作为肿瘤抑制因子或致肿瘤基因的miRNA的异常表达。1993年Lee等在对线虫进行遗传分析时发现了第一个miRNA，即Lin-4，microRNA的发现或许为解决这一难题提供了新的根据。MiR-24由Lagos-Quintana等人2001年首次发现，在非脊椎动物和脊椎动物进行了研究，发现人miR-24表达分别为mir-24-1和mir-24-2，分别位于染色体9和19上。
结直肠肿瘤(CRC)是全球最常见的与肿瘤症有关的死亡原因之一，其中大约有10％的肿瘤症发生率和死亡率。尽管早期检测和预防CRC的重要努力正在进行中，但仍有证据表明大约有五分之一CRC患者在诊断时具有远程传播的能力，通常通过手术治疗，经常与辅助化疗联合治疗。然而，大多数患者最终对化学疗法有抗药性，导致随后的复发和转移。因此，期望新的预防目标或有效的治疗是基于RNA网络分析。最近的研究表明，命名为microRNA的小RNA分子的表达与CRC的形成和进展显着相关网络分析。2003年，Michael等最先报道了人结直肠肿瘤组织和正常结直肠黏膜中的差异表达的miRNA，检测到28种miRNAs表达发生了变化，包括miR-320、miR-321、miR-200c、miR-143、miR-145等。MiR-24减缓胆管肿瘤增殖；肿瘤抑制性微小RNA-24-1通过靶向膀胱肿瘤中的FOXM1抑制肿瘤细胞增殖；MicroRNA-24-3p通过靶向p27Kipl在乳腺肿瘤中促进肿瘤细胞增殖；然而，miR-24-1-5p在结肠直肠肿瘤中的功能尚不清楚。
发明内容
本发明的目的之一是公开miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的作用。
本发明采用的技术方案是：miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用。所述的miR-24-1-5p的成熟RNA序列为ugccuacugagcugauaucagu。所述的miR-24-1-5p，包括初始miR-24-1-5p、miR-24-1-5p前体和成熟miR-24-1-5p。
本发明的目的之二是公开miR-24-1-5p作为分子标志物在检测miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织中的表达中的应用。
方法如下：取结直肠肿瘤组织样本，提取RNA，以RNA为模板，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒对miRNA进行加Poly(A)尾并反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别加入针对mmu-miR-24-1-5p的特异性引物Fm和针对has-miR-24-1-5p的特异性引物Fh，分别在荧光定量PCR仪上进行扩增，U6作为内参基因；通过荧光定量PCR分别测定组织样本中miR-24-1-5p扩增的CT值；
所述的特异性引物Fm序列为：5'-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3'；
所述的特异性引物Fh序列为：5’-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3’；
内参基因U6的引物Fu序列为：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'。
Figure GDA0002447993230000021
PCR反应条件：95℃10分钟；95℃15秒；60℃1分钟，重复45个循环；
本发明的目的之三是公开miR-24-1-5p在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。
miR-24-1-5p的制备方法包括如下步骤：
1)提取DNA；
2)以提取的DNA为模板，以特异性引物FORWARD和REVERSE进行PCR扩增，得到PCR产物，获得的PCR产物的RNA序列如SEQ ID NO.1所示；
FORWARD序列为：5'-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3'；
REVERSE序列为：5’-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGTGTGAAATCATGTGGTA-3’
Figure GDA0002447993230000022
PCR反应条件：94℃3分钟；98℃10秒；65℃1分钟；72℃10分钟重复35个循环；
3)将PCR产物和表达载体在XholⅠ和BglⅡ酶切位点进行双酶切，经酶切连接转化入表达载体，得到含miR-24-1-5p的重组质粒；所述的表达载体为病毒表达载体或真核表达载体，优选的，所述的真核表达载体为pCMV-myc、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA3.1-HA表达载体；
4)将含miR-24-1-5p的重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得重组菌种，对重组菌种进行抗性筛选，得到稳定表达重组质粒的菌种。
miR-24-1-5p作为抑制结直肠肿瘤的应用，miRNA为miR-24-1-5p的初始miRNA、miR-24-1-5p的前体miRNA或成熟的miR-24-1-5p中的一种或多种。
miR-24-1-5p作为抑制结直肠肿瘤的应用，所述成熟的miR-24-1-5p为RNA序列、添加化学基团修饰的RNA序列或DNA序列中的一种或多种。
本发明的有益效果在于：
1.本发明，通过可靠的基因芯片及miRNA荧光定量PCR方法，筛选发现新的miRNA标志物miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织中的表达发生明显下调。与传统的蛋白标志物相比，该标志物的灵敏度高，特异性强，可作为结直肠肿瘤早期诊断的临床诊断标志物。
2.本发明，通过大量的实验数据证明，miR-24-1-5p在结肠肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调控作用，miR-24-1-5p能够显著抑制肝肿瘤细胞的增殖和迁移，miR-24-1-5p可望用于制备防治结肠肿瘤的药物。
3.本发明，通过基因芯片筛查正常小鼠和结直肠肿瘤小鼠中具有差异表达的microRNA，且通过荧光定量PCR检测miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织及5种结直肠肿瘤细胞系中的表达情况，发现miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织和细胞中的表达发生明显下调，miR-24-1-5p在结直肠肿瘤的发生和发展过程中起着重要的调控作用，揭示miR-24-1-5p可作为结直肠肿瘤早期诊断的分子标志物。通过构建miR-24-1-5p的过表达载体，转染结直肠肿瘤细胞Caco2和HCT-116细胞，MTT、细胞划痕、Transwell、平板克隆实验探究miR-24-1-5p对结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移影响，揭示miR-24-1-5p能够显著抑制结直肠肿瘤细胞的增殖和迁移，miR-24-1-5p能够用于直肠肿瘤治疗的生物制剂。
附图说明
图1a是差异筛选分析图；
其中，下调的miRNA以蓝色表示，上调的miRNA以红色表示。
图1b是组织miRNA阵列；
其中，绿色：下调；红色：上调。
图2a是具有或不具有BRB花青素的小鼠结直肠肿瘤组织中miR-24-1-5p表达图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图2b是具有或不具有BRB花青素的5种CRC细胞中的miR-24-1-5p表达图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3a是RT-qPCR检测转染HCT-116后相对表达水平；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3b是RT-qPCR检测转染Caco2后相对表达水平；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3c是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞HCT-116过表达miR-24-1-5p 24h细胞存活情况；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3d是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞Caco2过表达miR-24-1-5p 24h细胞存活情况；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4a是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞HCT-116间隙距离表明通过伤口愈合测定评估细胞迁移；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4b是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞Caco2间隙距离表明通过伤口愈合测定评估细胞迁移；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
图4c是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞HCT-116过表达miR-24-1-5p(24h)侵袭图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图4d是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞Caco2过表达miR-24-1-5p(24h)侵袭图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5a是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞HCT-116克隆形成图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图5b是miR-24-1-5p抑制人结肠直肠肿瘤细胞Caco2克隆形成图；
其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
本发明所述的“miR-24-1-5p”除非另有所指，当提及miR-24-1-5p时，其包括初始miR-24-1-5p(pri-miRNA)、miR-24-1-5p前体(pre-miRNA)和成熟miR-24-1-5p。
以下通过实施例进一步描述本发明，其中包括使用材料及具体来源。但应当理解的是，这些只是示例性的，而非限制本发明。与如下组织、细胞、试剂、仪器的类型及型号、或性质或功能相似或相同的材料均可以用于本发明的实施。下述示例中的方法如无特殊说明均为普通方法。
实施例1
本实施例证明miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织和细胞中低表达，用BRB花青素处理的组织和CRC细胞系中表达上调。
1.动物模型构建：
小鼠分为三组，正常组小鼠(6只)，模型组小鼠(10只)，黑树莓治疗组(10只)，模型组和黑树莓治疗组的五周C57小鼠(18-20g)，在适应一周后，给小鼠(6周龄)单次腹膜内注射AOM(10mg/kg体重)。从注射后1周开始，动物在饮用水中接受2％DSS持续1周，然后正常水再持续2周(该周期重复2次)。在此期间正常组小鼠和模型组小鼠喂食正常饲料，黑树莓治疗组喂食含10％黑树莓饲料，检测来自小鼠的肠中的肿瘤以确认该模型的建立。在第12周结束时，将小鼠断颈处死，取一半结肠直肠组织用芯片为Agilent Mouse miRNA(8*60K，Design ID：070155)芯片，完成15个样本检测和分析，取一半结肠直肠组织基因芯片，另一半储存在-80℃。
2.细胞培养：
人结直肠肿瘤细胞系HCT-116、Lovo、HT29、SW480和Caco2在DMEM和MEM培养基(北京鼎国，中国)中进行培养。培养基中含有10％胎牛血清(Meilunbio，China)、青霉素(100U/mL)和链霉素。所有细胞置于37℃培养箱、5％CO2条件下培养。细胞均分三组：空白对照组，加入25ug/ml和50ug/ml的黑树莓花青素溶液。
3.RNA提取：
3.1)待步骤2中五种细胞生长状态良好、饱和度达到80％时，收集培养细胞，PBS缓冲液冲洗2次，将细胞悬液移至1.5ml EP的管中(EP管是RNase-free)，离心弃上清后，收集沉淀。
3.2)取收集的沉淀和30mg步骤1中-80℃储存的结肠直肠组织，分别加入1mlTrizol，充分震荡裂解。室温静置5min后加入0.2ml氯仿，用力震荡15s后室温孵育2-3min，4℃12000rpm离心15min，小心吸取上层无色水相至一新的RNase-free的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇(0.5ml)沉淀RNA，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇充分洗涤沉淀，4℃12000rpm离心3min，洗涤两遍，弃上清，凉干RNA沉淀，加入适量DEPC水(RNascfree-water)溶解，核酸定量仪进行RNA浓度和纯度的检测，抽提好的RNA放-80℃低温保存。
4.荧光定量PCR检测miR-24-1-5p水平
分别取2μg组织和五种结直肠癌细胞中RNA作为模板，以U6为对照组，使用针对miRNA的miRNA cDNA第一链合成试剂盒对miRNA进行加Poly(A)尾并反转录成cDNA。以cDNA为模板，分别加入针对mmu-miR-24-1-5p的特异性引物Fm和针对has-miR-24-1-5p的特异性引物Fh，分别在荧光定量PCR仪上进行扩增，U6作为内参基因。在ABI 7500荧光定量PCR仪上分别进行扩增。
特异性引物Fm序列为：5'-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3'；
特异性引物Fh序列为：5’-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3’；
内参基因U6的引物Fu序列为：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；
Real-Time PCR反应体系及条件如表1，总体积为25μl：
表1
Figure GDA0002447993230000061
PCR反应条件：95℃10分钟；95℃15秒；60℃1分钟，重复45个循环。
测得样本miR-24-1-5p扩增的CT值，以内参基因U6的CT值进行标准化校正，所得CT值使用2-ΔΔCT法进行计算，比较不同样本间miR-24-1-5p含量的差异。
5.结果
如图1a和图1b所示，miR-24-1-5p在结直肠癌组织表达下调。
如图2a所示，在结直肠中组织中miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中低表达，与基因芯片结果相符。
如图2b所示，miR-24-1-5p在5种结直肠肿瘤细胞中低表达，给予黑树莓花青素miR-24-1-5p表达上调，结果与基因芯片结果相符，得出结论：miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中低表达，但可以BRB花青素上调其表达。数值表示为平均值±SEM。
实施例2 miR-24-1-5p在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用
1、miR-24-1-5p重组质粒的制备
1.1)按照基因组DNA提取试剂盒提取HCT-116细胞中基因组DNA；
1.2)查询miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)获得hsa-miR-24-1-5p前体序列(CUCCGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAUUUUACACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGAG)，其中hsa-miR-24-1-5p成熟序列(ugccuacugagcugauaucagu)(22个bp)通过NCBI查询其基因组信息，获得其侧翼序列，包括成熟序列5’端上游196bp和3’端下游196bp。Primer5.0软件设计miR-24-1-5p引物，其上游引物FORWARD的5’端引入XholⅠ酶切位点，下游引物REVERSE的5’端引入内酶切BglⅡ酶切位点，即，
FORWARD序列为：5'-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3'；
REVERSE序列为：5’-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGTGTGAAATCATGTGGTA-3’；从而使插入片段全长共460bp，PCR仪上进行扩增。
PCR反应体系如表2：
表2
Figure GDA0002447993230000071
PCR反应条件：94℃3分钟；98℃10秒；65℃1分钟；72℃10分钟重复35个循环；
以1.1)提取的DNA为模板，以特异性引物FORWARD和REVERSE进行PCR扩增，得到PCR产物，得到PCR产物的序列如下：
CAACAGGGTTTTCCAAGTCTACAAACCCCCACGCCGCAGGAGCACATGCAGATGACTGGCACCGTGCTGCCGCCGGGCCGGGGTGGACGCAGGGTGGACGCGGGCCTGTCTGCCGCGAGTGGGAGCCCCAGCTCTCCTGAGCCTCGGGCACTTACAGACACGAAGGCTTTTTGCTCAAGGGCTCGACTCCTGTTCCTGCTGAACTGAGCCAGTGTGTAAAATGAGAACTGATATCAGCTCAGTAGGCACCGGAGGGCGGGTCCAATCGACAGCCCGGAGAAGCAGCGCCTCAGCTGGGAGCTCCGTGGGCACCGTCTGCTGGCGCAGGAGACGCGAAGGCCTGGACTGCAAATACAAGAGAGAGTTCACCGCGCCCAGAACAACAGGAGCTCCTCCGAAAGCCCCGCCCCGCCCCGCTCACAGCCATGAGCTACCACATGATTTCACACGACTTAGGTGA。
经琼脂糖胶电泳分析及基因测序结果比对，证明PCR产物的准确性。
1.3)将PCR产物按照PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化，对纯化后的PCR产物和pcDNA3.1-HA表达载体在XholⅠ和BglⅡ酶切位点进行双酶切，经酶切连接转化入pcDNA3.1-HA表达载体，得到含miR-24-1-5p的重组质粒。
1.4)将含miR-24-1-5p的重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得重组菌种，通过对重组菌种进行抗性筛选从而得到稳定表达重组质粒的菌种，进行后续实验。
2.细胞转染
(1)将人结直肠癌Caco2和HCT-116细胞接种于6孔板中，分别用MEM和DMEM培养基培养24小时，待细胞长到90％-95％覆盖时，方可进行转染。
(2)在无菌条件下，分别吸取3ug和5μg miR-24-1-5p表达质粒和对照质粒于4个1.5ml离心管中，各加入150μl Opti-MEM培养基，轻轻混匀。
(3)在无菌条件下，吸取6μl Lipofectamine 2000于2个3μg miR-24-1-5p表达质粒和对照质粒1.5ml离心管中，吸取10μl Lipofectamine 2000于2个5μg miR-24-1-5p表达质粒和对照质粒1.5ml离心管中，加入150μl Opti-MEM培养基，轻轻混匀。
(4)放置5分钟后，将含有miR-24-1-5p表达质粒和对照质粒的培养基分别与含有Lipofectamine 2000的培养基轻轻混合，室温静置20分钟。
(5)将6孔板中的细胞培养基更换为新的MEM和DMEM培养基，之后分别加入miR-24-1-5p表达质粒或对照质粒与Lipofectamine 2000的混合液，设置3个复孔。
(6)将细胞置于CO2培养箱中室温湿润培养24h，收细胞。
3.MTT法检测细胞存活率
将人结直肠肿瘤Caco2和HCT-116细胞按每块板3×105个细胞接种于96孔板中，培养24小时后，按照转染方法转染24小时后，对每孔细胞进行拍照，之后向每孔中加入10μlMTT，置于细胞培养箱中反应4小时，之后吸掉每孔中的液体，再每孔加入100μl DMSO，震荡反应10分钟后，通过酶标仪读取吸光值，根据对照组计算出细胞存活率。重复3次平行试验。
结果如图3a-图3d所示，实时转染miR-24-1-5p表达质粒可以有效上调miR-24-1-5p的表达。在HCT-116和Caco2细胞中转染miR-24-1-5p质粒24小时后，miR-24-1-5p处理的细胞的存活率在HCT-116和Caco2细胞中分别为56％和52％，而对照细胞存活力是100％，这表明与对照细胞相比miR-24-1-5p可以显著降低CRC细胞的增殖率。
4.划痕实验
将人结直肠肿瘤Caco2和HCT-116细胞接种于12孔板中，培养24小时后，用无菌的枪头沿每孔的直径划出一道划痕，之后PBS洗cell碎片，后加1ml培养基并拍照，计算出划痕的间距。转染miR-24-1-5p后置于细胞培养箱中培养24小时，之后拍照，计算出划痕的间距。
结果如图4a-图4b所示，Caco2–vector培养0h和24h时，划痕距离分别为9.5cm和3.5cm；Caco2–miR-24-1-5p培养0h和24h时，划痕距离分别为9cm和6cm。HCT-116-vector培养0h和24h时，划痕距离分别为9cm和4cm；HCT-116–miR-24-1-5p培养0h和24h时，划痕距离分别为9.5cm和7.5cm。可以看出miR-24-1-5p转染的细胞中观察到划痕距离明显增加，说明miR-24-1-5p能够显著的抑制细胞迁移作用。
5.细胞小室实验
将细胞小室安装在24孔板上，将人结直肠肿瘤Caco2和HCT-116细胞接种于上室，培养24小时后，上室下室分别用无血清培养基润洗1-2min，目的在于除去血清的干扰。分别向上室加入300μl细胞(细胞的培养用无血清培养基吹悬)，下室加入500μl含2％血清的培养基，置于细胞培养箱中24小时。转染miR-24-1-5p 24小时后，取出小室，用酒精棉轻轻地将上室的细胞清除，再将穿过膜后的细胞用4％多聚甲醛固定，进行细胞核染色，在荧光显微镜下观察随机选5个视野拍照，统计穿膜细胞数，重复3次平行试验。
结果如图4c-图4d所示，miR-24-1-5p转染的细胞组中在荧光显微镜下能观察到的细胞数明显减少，由此证明miR-24-1-5p显著的抑制CRC侵袭。
6.平板克隆形成实验
取生长状态良好的细胞用胰酶消化成单个细胞，计数后，接种于6孔板中，按每孔接种200个细胞计算。置37℃、5％CO2培养箱中培养14天。培养结束后，1xPBS润洗3次，甲醇固定30min，用吉姆萨染液进行染色，在显微镜下观察细胞的克隆形成数(≥50个细胞为一个克隆)，此实验重复进行3次。
结果如图5a-图5b所示，HCT-116-vector克隆形成数为386.3个，HCT-116–miR-24-1-5p克隆形成数为130个，Caco2–vector克隆形成数为607.3个，Caco2–miR-24-1-5p克隆形成数为31个，说明miR-24-1-5p能抑制CRC细胞克隆形成率。
结果：转染miR-24-1-5p表达质粒降低结直肠肿瘤Caco2和HCT-116细胞存活率、抑制划痕愈合以及细胞转移数量，同时抑制Caco2和HCT-116结直肠肿瘤细胞克隆形成能力。说明miR-24-1-5p在结直肠肿瘤的发病中可能扮演了抑肿瘤基因的角色。
统计学分析：所有数据取三次独立重复实验的平均值，标准差(SD)利用GraphPadPrism 5中的方法进行数据分析。P<0.05认为具有统计学意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 辽宁大学
<120> miR-24-1-5p在结直肠肿瘤中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 成熟 miR-24-1-5p()
<400> 1
ugccuacuga gcugauauca gu 22
<210> 2
<211> 68
<212> RNA
<213> hsa-miR-24-1-5p前体人工序列()
<400> 2
cuccggugcc uacugagcug auaucaguuc ucauuuuaca cacuggcuca guucagcagg 60
aacaggag 68
<210> 3
<211> 460
<212> RNA
<213> miR-24-1-5p人工序列()
<400> 3
caacagggtt ttccaagtct acaaaccccc acgccgcagg agcacatgca gatgactggc 60
accgtgctgc cgccgggccg gggtggacgc agggtggacg cgggcctgtc tgccgcgagt 120
gggagcccca gctctcctga gcctcgggca cttacagaca cgaaggcttt ttgctcaagg 180
gctcgactcc tgttcctgct gaactgagcc agtgtgtaaa atgagaactg atatcagctc 240
agtaggcacc ggagggcggg tccaatcgac agcccggaga agcagcgcct cagctgggag 300
ctccgtgggc accgtctgct ggcgcaggag acgcgaaggc ctggactgca aatacaagag 360
agagttcacc gcgcccagaa caacaggagc tcctccgaaa gccccgcccc gccccgctca 420
cagccatgag ctaccacatg atttcacacg acttaggtga 460

Claims (8)

1.miR-24-1-5p在制备诊疗结直肠肿瘤生物制剂中的应用，其特征在于，所述的miR-24-1-5p的成熟RNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，miR-24-1-5p作为分子标志物在检测miR-24-1-5p在结直肠肿瘤组织中的表达中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，方法如下：取结直肠肿瘤组织样本，提取RNA，以RNA为模板，使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒对miRNA进行加Poly(A)尾并反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别加入针对mmu-miR-24-1-5p的特异性引物Fm和针对has-miR-24-1-5p的特异性引物Fh，分别在荧光定量PCR仪上进行扩增，U6作为内参基因；通过荧光定量PCR分别测定组织样本中miR-24-1-5p扩增的CT值；
所述的特异性引物Fm序列为：5'-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3'；
所述的特异性引物Fh序列为：5’-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3’；
内参基因U6的引物Fu序列为：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'；
Figure FDA0002510546530000011
PCR反应条件：95℃ 10分钟；95℃ 15秒；60℃ 1分钟，重复45个循环。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，miR-24-1-5p在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的miR-24-1-5p的制备方法包括如下步骤：
1)提取DNA；
2)以提取的DNA为模板，以特异性引物FORWARD和REVERSE进行PCR扩增，得到PCR产物；
FORWARD序列为：5'-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3'；
REVERSE序列为：5’-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGTGTGAAATCATGTGGTA-3’
Figure FDA0002510546530000012
Figure FDA0002510546530000021
PCR反应条件：94℃ 3分钟；98℃ 10秒；65℃ 1分钟；72℃ 10分钟重复35个循环；
3)将PCR产物和表达载体在XholⅠ和BglⅡ酶切位点进行双酶切，经酶切连接转化入表达载体，得到含miR-24-1-5p的重组质粒；
4)将含miR-24-1-5p的重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，得重组菌种，对重组菌种进行抗性筛选，得到稳定表达重组质粒的菌种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)获得的PCR产物的RNA序列如SEQ IDNO.3所示。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的表达载体为病毒表达载体或真核表达载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的真核表达载体为pCMV-myc、pcDNA3.0、pcDNA3.1或pcDNA3.1-HA表达载体。
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