ES2708750T3 - Secuencias de miARN de TTV como marcador temprano para el desarrollo futuro de cáncer y como diana para el tratamiento y la prevención del cáncer - Google Patents

Abstract

Un poli(ácido nucleico) de TTV que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos de TTV-HD14a-mir2 representada en la Tabla 1 y que contiene la secuencia de nucleótidos CAUCCYY (con Y: C o U); (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos de TTV-HD14a-mir2 representada en la Tabla 2 y que contiene la secuencia de nucleótidos CATCCYY (con Y: C o T); o (c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b).

Description

DESCRIPCION

Secuencias de miARN de TTV como marcador temprano para el desarrollo futuro de cancer y como diana para el tratamiento y la prevencion del cancer

La presente invencion se refiere a miARN de TTV, asf como a sondas y cebadores que comprenden parte de dicho poli(acido nucleico) de miARN de TTV. Finalmente, la presente invencion se refiere al uso de dichos compuestos como un marcador temprano de un futuro desarrollo del cancer.

El virus torque teno (TTV) es una especie de virus perteneciente a la familia Anelloviridae, genero Alphatorquevirus. Los virus clasificados en esta especie presentan un genoma de ADN circular monocatenario (ADNss) de 3,7-3,8 Kb de longitud, y no tienen envuelta [2, 3]. Fueron descubiertos por primera vez en 1997 en un paciente que presentaba hepatitis no A a G despues de una transfusion [1]. Se observa una alta divergencia en la secuencia de nucleotidos entre diferentes cepas de TTV, alcanzando en algunos casos mas de un 70%. Aunque la organizacion genomica es tambien variable, todos ellos contienen una region no codificante, que abarca 1,2 Kb [22]. Se ha demostrado que la region no codificante alberga un promotor en su extremo 3' [4] y una region altamente conservada de 70 pb dentro de ese extremo 3' se cree que es el origen de replicacion de los virus. Se estima que mas del 90% de los seres humanos estan infectados con una o varias cepas de TTV. La cantidad de diferentes cepas aisladas (mas de 200), su ubicuidad y la falta de tecnicas fiables y sencillas para diferenciarlas entre sf, han hecho que sea diffcil obtener una evidencia epidemiologica suficiente que apoye una relacion causal entre una infeccion con TTV y una enfermedad espedfica [23-28]. Los virus TTV son conocidos por infectar diversos tejidos humanos [21]. Estan disponibles unos datos limitados sobre el ciclo de replicacion, e incluso menos sobre la funcion de las protemas codificadas por estos virus.

El documento EP 2 399 928 describe una molecula quimerica de una region altamente conservada de TTV de 71 bases (HCR), y secuencias de ADN celular en lmeas celulares de cancer humano e inmortalizadas que se pueden utilizar para el diagnostico, la prevencion y el tratamiento del cancer y la autoinmunidad.

Los micro ARN (miARN) son moleculas pequenas de ARN que oscilan entre 19 y 29 nt y por lo general 22 nt de longitud. Median en el silenciamiento genico postranscripcional (PTGS) mediante la induccion de una escision, desestabilizacion o inhibicion de la traduccion de un ARN mensajero diana (ARNm) [9, 10, 11, 12]. Lo hacen guiando el complejo RISC hacia un ARNm concreto, interaccionando con el mediante el emparejamiento de bases. Se cree que esta interaccion esta mediada principalmente por un emparejamiento perfecto entre la region 3' no traducida del ARNm diana (UTR) y el miARN “semilla” (nucleotidos de 2 a 7) [7, 8, 80]. En contraste, hallazgos recientes sugieren que los emparejamientos no perfectos (sin emparejamiento de Watson y Crick o semillas que contienen un desemparejamiento) en esta region son mas abundantes que los emparejamientos perfectos [6]. El mismo estudio sugiere que los emparejamientos de miARN-ARNm en secuencias codificantes (CDS) son tan abundantes como los de las 3'UTR. Por otra parte, se demuestra que algunos miARN tienden a hibridarse con ARNm en una region totalmente diferente de la region semilla, y que todavfa son capaces de ejercer PTGS. Para aumentar aun mas la complejidad de la regulacion de la expresion genica basada en miARN, en los ultimos anos han aparecido algunos ejemplos de silenciamiento genico transcripcional (TGS) y activacion genica transcripcional (conocida como activacion del ARN (ARNa)) mediados por miARN [29-33]. Si bien los mecanismos que median en estos dos eventos son aun poco conocidos, no se descarta que el TGS y el ARNa sean caractensticas generales de algunos miARN. El numero de miARN humanos endogenos conocidos ha aumentado muy rapidamente en los ultimos anos. El numero de miARN maduros registrados en la miRBase es 2042 [13-16]. Adicionalmente, tambien se ha mostrado que una gran canti­ dad de miARN codificados de forma vmca utiliza la maquinaria celular de silenciamiento del miARN. Desde el descubrimiento del primer miARN humano codificado de forma vmca [5] su numero ha aumentado a 157 [13-16]. La mayona de estos miARN estan codificados por virus de ADN, especialmente los que pertenecen a las familias Herpesviridae y Polyomaviridae. Recientemente, se ha informado de que un virus de ARN oncogenico bovino (virus de la leucemia bovina) codifica 8 miARN maduros, lo que demuestra que este tipo de virus tambien los puede expresar. A pesar del gran numero de miARN vmcos descubiertos, la funcion de la mayor parte de ellos sigue siendo imprecisa, aunque en los ultimos anos algunas publicaciones han arrojado luz sobre este tema. Por ejemplo, los miARN codificados por los virus Polyoma y del herpes han demostrado que ayudan a estos virus a escapar de la respuesta inmune del hospedador, mediante una regulacion de la expresion proteica vmca [17] o del hospedador [18, 19]. Otro hallazgo importante se ha realizado hace algunos meses cuando se demostro que los miARN codificados por el virus Epstein-Barr son adecuados para transformar celulas por sf mismos [20], lo que sugiere que los miARN vmcos podnan ser capaces de mediar en un proceso oncogenico en condiciones adecuadas. Los miARN codificados por virus y sus funciones han sido revisados en Kincaid R.P., Sullivan C.S. (2012) PLOS Pathogens, vol. 8, n° 12, pagina e1003018. Muy recientemente, se ha mostrado que los TTV codifican miARN, y se demostro el papel de uno de estos miARN en la inhibicion de la senalizacion del interferon [78].

El gen APC (Adenomatous Polyposis coli) es un supresor tumoral muy importante, especialmente en el contexto del cancer colorrectal. Practicamente todos los canceres colorrectales son portadores de mutaciones que inactivan el APC o cambios epigeneticos que inactivan la transcripcion de este gen. Su actividad supresora de tumores se cree que esta mediada por su funcion en la inhibicion de la senalizacion de wnt, aunque tambien se ha implicado en la migracion y el ensamblaje correcto del huso mitotico.

El problema tecnico subyacente de la presente invencion es proporcionar medios (o marcadores) para el diagnostico del cancer o el diagnostico de una predisposicion a dicha enfermedad. Otro problema tecnico es proporcionar me­ dios para prevenir el desarrollo del cancer y la recidiva del cancer mediante la inhibicion de una diana espedfica.

La solucion de dicho problema tecnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Se conocen pocos aspectos relacionados con la interaccion entre los TTV y su hospedador. En los estudios que dan lugar a la presente invencion, se aclaro que TTV codifica miARN, y su importancia para la infeccion y la patogenicidad de TTV, centrandose principalmente en su posible papel en el cancer. Se proporciona una evidencia que apoya la expresion de cuatro pre-miARN a traves de una cepa de TTV (TTV-HD14a) (Figura 1A-B). El miARN se transcribe a partir de la region no codificante del virus, en ambas orientaciones sentido y antisentido (del ingles, “sense and antisense”. Tambien se ha podido demostrar que algunos miARN codificados en ambas orientaciones pueden, direc­ ta o indirectamente, regular a la baja al supresor tumoral Adenomatous Polyposis Coli (APC) a nivel de ARNm. Sorprendentemente, los inventores han identificado una relacion entre TTV-HD14a y una regulacion de la supresion de tumores y este hallazgo sugiere un papel de TTV-HD14a en el desarrollo del cancer. Este trabajo representa el pri­ mer vinculo molecular entre TTV y el cancer. Por otra parte, se informa por primera vez de la expresion de miARN a traves de un virus de ADNss circular que infectar a los seres humanos.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Organizacion genomica de TTV-HD14a y ubicacion del pre-miARN

(A) TTV-HD14a. Los numeros sobre las lmeas indican el numero de nucleotido. NCR - region no codifican­ te. (B) Detalles de la region no codificante. Los numeros indican el numero de nucleotido. Las horquillas so­ bre la lmea indican el pre-miARN codificado en la orientacion sentido. Las horquillas debajo de la lmea indi­ can el pre-miARN codificado en la orientacion antisentido. Los nombres por encima y por debajo de las hor­ quillas son los nombres dados a los pre-miARN.

Figura 2: Representacion esquematica de los plasmidos usados para la transfeccion y las transferencias Nort­ hern que muestra el pre-miARN y el miARN maduro

(A) Representacion esquematica de los plasmidos que contienen el promotor de CMV y la region no codifi­ cante (NCR) en la orientacion sentido (+) o antisentido (-). Las estructuras artificiales se denominan pCD-NA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-Sense y pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-AntiSense, respectivamente. Los nu­ meros por encima y por debajo de las lmeas indican el numero de nucleotido. Las horquillas y las lmeas verticales indican el pre-miARN en la orientacion sentido o antisentido. Los nombres de los pre-miARN se escriben debajo de las lmeas.

(B-E) Transferencias Northern que muestran los resultados con las sondas y las transfecciones indicadas (Sentido - celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-Sense. Anti-sentido - celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-AntiSense. Simulado - celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)). Las secuencias de las sondas se indican en la Tabla 4.

Figura 3: Complementariedad de TTV-HD14a-mir-2-5p con ARNm de APC y TTV-HD14a-ASmir-2-3p con los promotores de APC y ARNm de APC regulado a la baja en celulas transfectadas

(A) Complementariedad entre TTV-HD14a-mir-2-5p (1, 2 y 3) TTV-HD14a-mir-2-3p (4) con ARNm de APC. Posiciones relativas a la variante 2 del transcrito de APC (NCBI numero de orden: n M_001127510.2).

(B, C y D) Complementariedad entre TTV-HD14a-ASmir-2-3p y los promotores de APC 1, 2 y 3, respecti­ vamente, tal y como se almacena en EPDNew Human. Las posiciones que se muestran se refieren al sitio de inicio de la transcripcion (TSS) haciendo referencia a EPD New Human (nombres de EPDNew Human: APC_1, APC_2 y APC_3).

(E) Niveles relativos de expresion de APC segun lo medido por qPCR (media para Sense = 0,747 y para AntiSense = 0,650). ACt se calculo respecto a HPRT. AACt se calculo respecto a celulas transfectadas de forma simulada. Los valores diferenciales se normalizaron a 1. Sentido - Valores relativos para celulas HEK 293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-Sense. Antisentido - Valores relativos para celu­ las HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-AntiSense. Simulado - Valores relativos para celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+). TTV-HD14a - Valores relativos para celulas trans­ fectadas con el virus TTV-HD14a de longitud completa. -SD; N = 6. La significacion estadfstica se calcula utilizando la Prueba T de Student no pareada de dos colas.

Figura 4: Expresion de GAPDH (vease el Ejemplo 6 para mas detalles) Niveles de expresion relativa de GAPDH, segun lo medido mediante qPCR. ACt se calculo respecto a HPRT. AACt se calculo respecto a ce­ lulas transfectadas de forma simulada. Los valores diferenciales se normalizaron a 1. Sentido - Valores rela­ tivos para celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-Sense. Antisentido - Valo res relativos para celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCR-AntiSense. Simulado - Valores relativos para celulas HEK293TT transfectadas con pCDNA3.1(+). TTV-HD14a - Valores relati­ vos para celulas transfectadas con el virus TTV-HD14a de longitud completa. -SD; N = 6. La significacion estadfstica se calcula utilizando la Prueba T de Student no pareada de dos colas.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a un poli(acido nucleico) de TTV que comprende: (a) una secuencia de nucleotidos de TTV-HD14a-mir2 representada en la Tabla 1 o 2; (b) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de nucleotidos de (a) y que contiene la secuencia de nucleotidos CATCCYY (con Y = C o T); o (c) una secuencia de nucleotidos que es complementaria a cualquiera de dichas secuencias de nucleotidos.

La expresion "poli(acido nucleico)" se refiere a una secuencia de acido nucleico de cadena sencilla o cadena doble. Un poli(acido nucleico) puede consistir en desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, analogos de nucleotidos o nu­ cleotidos modificados, o se puede haber adaptado para fines de diagnostico o terapeuticos. Un poli(acido nucleico) puede comprender tambien un clon de ADNc de cadena doble que se puede utilizar, por ejemplo, para fines de clonacion. A continuacion, las observaciones y comprobaciones realizadas a nivel de ADN se aplican a nivel de ARN en consecuencia y viceversa.

El poli(acido nucleico) de TTV de la invencion se puede preparar de acuerdo con metodos de rutina bien conocidos, por ejemplo, mediante (a) el aislamiento del ADN completo o, preferiblemente, el ARN a partir de una muestra, (b) la deteccion de la secuencia de TTV mediante hibridacion o PCR y (c) la clonacion de la secuencia de TTV en un vec­ tor (d) mediante la smtesis de los respectivos nucleotidos de la secuencia de miARN.

Tambien se incluyen en la presente invencion variantes de la secuencia del poli(acido nucleico) de la invencion que contienen o bien deleciones y/o inserciones de uno o varios nucleotidos, especialmente inserciones o deleciones de uno o varios codones, principalmente en los extremos de los oligonucleotidos (ya sea 3' o 5') y que muestran al me­ nos 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad con dicha secuencia de poli(acido nucleico) de la invencion y contienen la secuencia de consenso CATCCYY (con Y = C o T). Las secuencias de poli(acido nucleico) de acuerdo con la presente invencion que son similares a la secuencia de TTV-HD14a-mir2 como se muestra en la Tabla 1 o 2, se pueden caracterizar y aislar de acuerdo con cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica, tales como la amplificacion por medio de cebadores espedficos de secuencia, hibridacion con sondas espedficas de secuencia en condiciones mas o menos rigurosas, determinacion de la secuencia de la informacion genetica de TTV, etc. Las variantes y los fragmentos de las secuencias de poli(acido nucleico) de TTV de la presente invencion todavfa son capaces de interferir o de inhibir la expresion de su gen diana.

En una realizacion preferida particular, la secuencia de poli(acido nucleico) de TTV (si es ADN) contiene la secuen­ cia de consenso c At CCYY (con Y = C o T), es decir, CATCCCC, CATCc Ct , CATCCTC o Ca Tc CTT. En otra realizacion preferida particular, la secuencia de poli(acido nucleico) de TTV (si es ARN) contiene la secuencia de con­ senso CAUCCYY (con Y = C o U), es decir, CAUCCCC, CAUCCCU, CAUCCUC o CAUCCUU.

En una realizacion preferida particular, los inventores muestran como el motivo de semilla mas conservado (AUC-CUC) tiene tres sitios de interaccion posibles adicionales dentro del ARNm de APC, ademas del descrito previamente para TTV-HD14a-mir-2-3p.

Ademas, la presente invencion se refiere a un cebador oligonucleotido que comprende parte del poli(acido nucleico) de TTV de la presente invencion, siendo capaz dicho cebador de actuar como cebador para secuenciar espedficamente o amplificar espedficamente cierto miARN de TTV.

El termino "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleotidos de ADN de cadena sencilla capaz de actuar como un punto de iniciacion para la smtesis de un producto de extension del cebador que es complementario a la cadena de acido nucleico que se va a copiar. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales que permitan cebar espedficamente la smtesis de los productos de extension. Preferiblemente, el cebador tiene al menos aproximadamente 10, preferiblemente al menos 15 nucleotidos. La longitud y la secuencia espedficas dependeran de la complejidad de las dianas de ADN o ARN requeridas, asf como de las condiciones de uso del cebador, tales como temperatura, fuerza ionica, etc. Los cebadores para la amplificacion no tienen que coincidir exactamente con la se­ cuencia del molde correspondiente para garantizar una amplificacion adecuada. El metodo de amplificacion empleado puede ser o bien la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), la amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), el sistema de amplificacion basado en la transcripcion (TAS), la amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA) o la amplificacion por medio de la replicasa Qp o cualquier otro metodo adecuado para amplificar moleculas de acido nucleico usando la extension del cebador. Durante la amplificacion o la smtesis, los productos amplificados se pueden marcar convenientemente, ya sea usan­ do cebadores marcados o incorporando nucleotidos marcados. Los marcadores pueden ser isotopicos (32P, 35S, etc.) o no isotopicos (biotina, digoxigenina, etc.).

La presente invencion tambien se refiere a una sonda de oligonucleotido que comprende parte del poli(acido nuclei­ co) de TTV de la presente invencion, siendo capaz dicha sonda de actuar como una sonda de hibridacion para la deteccion espedfica de un determinado miARN de TTV in vitro e in vivo.

El termino "sonda" se refiere a oligonucleotidos espedficos de secuencia de cadena sencilla que tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia diana del poli(acido nucleico) de TTV que se va a detectar. Preferiblemente, esas sondas tienen aproximadamente de 5 a 50 nucleotidos de longitud, mas preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 nucleotidos. La sonda se puede fijar a un soporte solido, es decir, cualquier sustrato sobre el cual se puede acoplar una sonda de oligonucleotido, siempre que conserve sus caractensticas de hibridacion y siempre que el nivel de fondo de la hibridacion se mantenga bajo. Por lo general, el sustrato solido sera una placa de microtitulacion, una membrana (por ejemplo, de nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de la aplicacion sobre la membrana o la fijacion puede ser conveniente modificar la sonda de acido nucleico con el fin de facilitar la fijacion o mejorar la eficacia de la hibridacion. Tales modificaciones pueden incluir la formacion de colas de homopolfmeros, el acoplamiento con diferentes grupos reactivos tales como grupos alifaticos, grupos NHz, grupos SH, grupos carboxflicos, o el acoplamiento con biotina o haptenos.

La presente invencion tambien se refiere a un vector que contiene un poli(acido nucleico) de TTV, un cebador de oligonucleotido o una sonda de oligonucleotido de la invencion que permite, por ejemplo, la expresion, mutagenesis o modificacion de una secuencia mediante una recombinacion de las secuencias de ADN. Preferiblemente, los vectores son plasmidos, cosmidos, virus, bacteriofagos y otros vectores usados habitualmente en el campo de la ingeniena genetica. Los vectores adecuados para el uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a los mismos, el vector de expresion basado en T7 para la expresion en celulas de mairnfero y vectores obtenidos a partir de baculovirus para la expresion en celulas de insecto. Preferiblemente, el poli(acido nucleico) de la invencion o parte del mismo esta ligado funcionalmente a los elementos reguladores en el vector recombinante de la invencion que garantizan la transcripcion y la smtesis de un ARNm en celulas procariotas y/o eucariotas que se puede traducir. La secuencia de nucleotidos que se va a transcribir puede estar ligada funcionalmente a un promotor, tal como un pro­ motor de T7, metalotionema I o polihedrina.

La presente invencion tambien se refiere a celulas hospedadoras recombinantes de forma transitoria o estable que contienen el poli(acido nucleico) de TTV (o fragmentos del mismo) o vectores de la invencion. Una celula hospedadora se entiende que es un organismo que es capaz de aceptar ADN recombinante in vitro y, si es el caso, sintetizar los polipeptidos codificados por los polinucleotidos de la invencion. Preferiblemente, esas celulas son celulas proca­ riotas o eucariotas, por ejemplo, celulas de m ai^ero, celulas bacterianas, celulas de insecto o celulas de levadura.

La presente invencion tambien se refiere a un kit de diagnostico que contiene un poli(acido nucleico) de TTV, un cebador de oligonucleotido o una sonda de oligonucleotido de la presente invencion.

Para los ensayos basados en la hibridacion, de acuerdo con la solucion de hibridacion (SSC, SSPE, etc.), las son­ das se deben hibridar de forma rigurosa con la diana (con o sin amplificacion previa) a su temperatura apropiada para alcanzar una especificidad suficiente. Sin embargo, modificando ligeramente el polinucleotido, las sondas (ADN y/o ARN), ya sea mediante una adicion o delecion de uno o unos pocos nucleotidos en sus extremos (ya sea 3' o 5'), o mediante la sustitucion de algunos nucleotidos no esenciales (es decir, nucleotidos que no son esenciales para discriminar entre los tipos) por otros (incluyendo nucleotidos modificados o inosina), se puede provocar que esas sondas o variantes de las mismas se hibriden espedficamente en las mismas condiciones de hibridacion (es decir, la misma temperatura y la misma solucion de hibridacion). Tambien el cambio de la cantidad (concentracion) de la sonda utilizada, puede ser beneficioso para obtener unos resultados de la hibridacion mas espedficos.

Los metodos de ensayo adecuados para los fines de la presente invencion para detectar hnbridos formados entre las sondas de oligonucleotidos y un poli(acido nucleico) de TTV en una muestra, pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo conocidos en la tecnica, tales como el formato convencional de transferencia de manchas, la hibridacion de tipo sandwich o la hibridacion inversa. Por ejemplo, la deteccion se puede realizar utilizando un forma­ to de transferencia de manchas, en donde la muestra amplificada sin marcar se une a una membrana, en donde la membrana se incorpora con al menos una sonda marcada en condiciones de hibridacion y condiciones de lavado adecuadas, y se puede supervisar la presencia de una sonda unida. Un metodo alternativo y preferido es un formato de transferencia de manchas "inverso", en el que la secuencia amplificada contiene un marcador. En ese formato, las sondas de oligonucleotidos sin marcar se unen a un soporte solido y se exponen a la muestra marcada en condi­ ciones rigurosas de hibridacion y condiciones de lavado posteriores adecuadas. Se ha de entender que tambien se puede emplear cualquier otro metodo de ensayo que se base en la formacion de un hubrido entre los acidos nucleicos de la muestra y las sondas de oligonucleotidos de acuerdo con la presente invencion.

La presente invencion tambien se refiere al uso de un poli(acido nucleico) de TTV, un cebador de oligonucleotido o una sonda de oligonucleotido de la presente invencion como un marcador temprano para un futuro desarrollo del cancer, preferiblemente de cancer colorrectal.

Finalmente, la presente invencion tambien se refiere al uso de un poli(acido nucleico) de TTV de la presente invencion como un componente principal para el desarrollo de un medicamento para la prevencion o el tratamiento del cancer, preferiblemente el cancer colorrectal. Estos medicamentos pueden ser inhibidores de cualquier interaccion entre los miARN y genes supresores tumorales para evitar un desarrollo del cancer o una recidiva y el tratamiento del cancer. Por lo tanto, el miARN del virus TT espedfico o de sus derivados o de miARN relacionados, es util para aplicaciones de diagnostico, prevencion o terapeuticas en el campo del cancer.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion y no se interpretaran como cualquier limitacion de la invencion.

Ejemplo 1

Materiales y metodos

(A) Cultivo celular y transfecciones

Las celulas HEK293TT [76] se cultivaron en medio Eagle modificado con Dulbeco (DMEM Sigma) complementado con 10% de FBS, 1% de Glutamax y 1% de NGAA. Las celulas se transfectaron cuando teman 50% de confluencia, 24 h despues de la siembra (7 millones por matraz T-75 y 800.000 por pocillo para una placa de 6 pocillos). Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamina y reactivo Plus (Life Technologies, n° de catalogo 11514 y 18324) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

(B) Construccion de plasmidos

La NCR de TTV-HD14a se amplifico mediante PCR usando los cebadores TT-ON9 y TT-ON10 (Tabla 4) usando pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a como molde (un plasmido que contiene TTV-HD14a linealizado de longitud completa y clonado en el sitio Xbal). El producto de la p Cr se hizo correr sobre un gel de agarosa al 1% y el ADN se tino usan­ do bromuro de etidio. Las bandas correspondientes al tamano esperado (-1200 pb) se cortaron y posteriormente se extrajeron desde la agarosa usando el kit de extraccion en gel QlAEXII (QIAGEN). Se cortaron 4 |jg de pCDNA3.1(+) (Life Technologies) usando Kpnl y se desfosforilaron utilizando FastAP (Thermo Scientific). El producto de la PCR se corto utilizando el mismo procedimiento, pero no se desfosforilo. El plasmido cortado y los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de extraccion en gel QIAEXII.

La ligacion del plasmido y el fragmento amplificado correspondiente a la NCR de TTV-HD14a se realizo utilizando ADN ligasa de T4 (Thermo Scientific). El producto de la ligacion se transformo en celulas competentes NovaBlue Singles (Merck Millipore) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se sembro en placas de agar con LB complementadas con ampicilina como marcador de la seleccion. Las placas se incubaron 20 horas a 37°C. Las colonias individuales se seleccionaron y se sembraron en medio LB complementado con ampicilina. Estos cultivos se incubaron 20 horas. El plasmido fue extrafdo por medio del kit PureLink Quick Plasmid Miniprep (Life Technolo­ gies). 1 jg de cada plasmido se corto de forma doble con SacI y Nhel (Thermo Scientific). Los productos cortados de dejaron correr en geles de agarosa al 1%. La estrategia de restriccion permitio distinguir entre clones insertados en la orientacion sentido y antisentido. Dos plasmidos positivos, uno que contema el inserto con la orientacion sentido y el otro con la antisentido, se eligieron y se enviaron para realizar una secuenciacion. Despues de confirmar la secuencia, los plasmidos se prepararon para la transfeccion mediante el uso del kit Plasmid Maxi (Qiagen).

(C) Extraccion del ARN y tratamiento con ADNasa

Las celulas se recogieron 48-72 horas despues de la transfeccion. Las celulas se homogeneizaron usando QiaShreder (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los lisados se sometieron a continuacion a una extrac­ cion del ARN usando el mini kit miRNAeasy o el mini kit RNAeasy (Qiagen), dependiendo de la finalidad del ARN (para transferencia Northern o para RT-qPCR, miARN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Despues de la elucion, las muestras de ARN se trataron con ADNasa RQ1 (Promega) de acuerdo con las instruccio­ nes del fabricante, con la adicion de RNasin (Promega). Se realizo la extraccion con fenol-cloroformo seguida de precipitacion con etanol, y el sedimento resultante se resuspendio en agua DEPC. La calidad del ARN y la concentracion se sometieron a ensayo usando NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).

(D) Marcado de las sondas

Los oligos de ADN apropiados se encargaron a Sigma (Tabla 4). Las sondas se marcaron en 3' con biotina. Se incu­ baron 10 pmoles de cada sonda con 4 U de desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y 2, 5 nanomoles de biotina-11-dUTP (Thermo Scientific) en tampon 1X TdT, durante la noche. Las sondas se sometieron a una extraccion con alcohol isoairnlico-cloroformo y se utilizo el volumen total para una hibridacion posterior.

(E) Transferencia Northern

Se separaron 30-50 jg del ARN total por muestra mediante electroforesis usando geles de 15% de poliacrilamida (29:1) vertidos en urea 7 M y tamponados con 1xTBE usando una celda de MiniProtean (Bio-Rad). El tampon de la electroforesis era 0,5x TBE. Los geles se tineron con EtBr.

Para la transferencia, los geles se colocaron sobre una membrana de hibridacion de hoja de nailon (Hybond-NX®, Amersham/Pharmacia) humedecida previamente en 0,5x TBE. Despues, la misma se intercalo entre hojas de papel de filtro 3MM de Whatman (una capa debajo de la membrana y tres sobre el gel), tambien humedecidas previamente en 0,5x TBE y se colocan en una celda de transferencia semiseca Trans-Blot SD (Bio-Rad). El exceso de lfquido y las burbujas de aire se eliminaron presionando el sandwich, haciendo rodar una pipeta sobre la superficie. La trans­ ferencia electroforetica del ARN desde el gel a la membrana se realizo a 400 W durante 60-90" min. Despues de la transferencia, el ARN se reticulo con la membrana mediante una exposicion a radiacion ultravioleta usando Strata linker (Stratagene).

Las membranas se cortaron segun fue necesario y se hibridaron con la sonda adecuada marcada con biotina (Tabla 4) una noche en tampon Ultrahyb Oligo (Life Technologies) a 42°C. Despues de la hibridacion, se realizaron 4 lavados; el primero con 2X SSC 30 minutos a 42°C, el segundo con 2x SSC 0,5% de SDS 30 min a 42°C y los dos ultimos con 2X SSC 0,5% de SDS 30 min a 55°C. Las senales de la hibridacion se detectaron utilizando el kit BrightStar BioDetect (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pelicula utilizada: (Fiji).

(F) RT-qPCR

Se empleo 1 ^g de ARN para preparar el ADNc con superscript III y RNaseOUT (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se diluyo 1:10. La qPCR se realizo utilizando una mezcla maestra rapida de Taqman y ensayos de expresion de Taqman, en un aparato StepOne plus para qPCR (Applied Biosystems).

(G) Prediction de pre-miARN y prediction de miARN maduro

V-mir se establecio como configuration por defecto, cambiando el tipo de secuencia a circular. El CID-miARN se ejecuto en la herramienta basada en la web, utilizando la configuracion de ejecucion por defecto para Homo sapiens. Mature Bayes se ejecuto en la herramienta basada en la web.

(H) Predicciones de la diana de miARN

DIANA microT 3.0 se ejecuto en la herramienta basada en la web (no se dan opciones para ese programa). El ARN hibrido se ejecuto utilizando una configuracion de nucleotido limitada, desde el nucleotido 2 a 8 del miARN. Se permitieron las parejas G:U.

Tabla 1

Pre-miARN previsto procedente de TTV-HD14a empleando CID-miARN y V-mir que se ajusta a tres criterios: estar previsto por ambos programas, tener una puntuacion superior a 150 para V-mir y estar localizado en la region no codificante del virus.

de secuencia.

Tabla 3

Genes previstos para ser regulados a la baja por TTV-HD14a y al menos otros dos miARN de cepas de TTV. Observese que algunas cepas tienen mas de un miARN putativo que esta previsto que regule a la baja algunos de los genes.

Tabla 4 - Sondas y cebadores

Ejemplo 2

Prediccion del miARN

Para abordar la cuestion de una posible funcion de la region no codificante (NCR) de los TTV mas alla de su actividad como promotor, los inventores tuvieron la idea de que tambien genera ARN no codificantes, tales como miARN. Por lo tanto, se utilizaron algoritmos de prediccion de miARN disponibles, con los que se identificaron varios premiARN candidatos en la NCR de algunos TTV. Los inventores optaron por utilizar dos de tales algoritmos: ClD-miRNA [34] y Vmir [35-36]. El primero fue elegido debido a su alta especificidad y el segundo debido a su mayor sensibilidad. Para considerar una estructura de pre-miARN como candidata, se empleo el criterio de que deberia estar prevista por ambos programas, con un valor de corte superior a 125 para el programa V-mir y que tenia que estar situada en la NCR del virus. Despues de filtrar, solo se consideraron 4 candidatos de pre-miARN (Tabla 1 y Figura 1B), dos con la orientacion sentido y dos con la orientacion antisentido, como pre-miARN putativos y se evaluaron adicionalmente.

Con el fin de comprobar la conservacion de las secuencias de los pre-miARN entre las diferentes cepas aisladas de TTV, los inventores realizaron la mismo prediccion en siete cepas diferentes: TTV-HD16a, TTV-C3T0F, TTV-HD23a, TTV-YonKc197, TTV-SANBAN, TTV-Sle2057 y TTV-tth8 (numeros de orden de GenBank: FR751476.1, AB064597.1, FR751500.1, AB038624.1, AB025946.2, AM712030.1, AJ620231.1). A continuation, se agruparon los pre-miARN resultantes en diferentes clases (Tabla 2), de acuerdo con la similitud de su secuencia. Como se puede observar, la conservacion de las secuencias es bastante pobre, siendo extrana la identidad total entre dos premiARN de diferentes cepas.

Ejemplo 3

TTV-HD14a puede transcribir cuatro miARN precursores codificados en su NCR

Para abordar la cuestion de si los pre-miARN previstos se podfan procesar, la NCR de TTV-HD14a se clono aguas abajo del promotor CMV, con la orientacion sentido o antisentido, utilizando el plasmido pCDNA3.1(+)-zeo como armazon (Figura 2A). Los inventores transfectaron a continuacion celulas HEK293TT con esos plasmidos y realizaron una hibridacion de la transferencia Northern con sondas espedficas contra el brazo 3' o 5' de cada pre-miARN putativo (Tabla 4) (Figura 2B-E). Los inventores pudieron detectar claramente bandas que coincidfan con el tamano esperado para un pre-miARN con las sondas dirigidas contra el brazo 3' y 5' de TTV-HD14a-mir-2 y TTV-HD14a-ASmir-2. Ademas, los inventores fueron capaces de detectar un transcrito que se correspondfa con el tamano espe­ rado de un miARN maduro dentro del brazo 5' de TTV-HD14a-mir-2. Por otra parte, los inventores fueron capaces de detectar transcritos que se correspondfan con los tamanos esperados de las sondas dirigidas contra el brazo 3' solo de TTV-HD14a-mir-1 y TTV-HD14a-ASmir-1.

Estos resultados demuestran que TTV-HD14a codifica varios miARN precursores con ambas orientaciones; y al menos uno de ellos se puede procesar en un miARN maduro.

Ejemplo 4

Prediccion de las dianas

Es bien sabido que la caractenstica principal del miARN es la regulacion a la baja de la expresion genica de una manera postranscripcional. Tambien se sabe que este efecto es debido a la forma madura de los miARN, y no a sus precursores. Aunque los inventores no fueron capaces de observar ningun miARN maduro para tres de los premiARN, piensan que los bajos niveles de expresion de estos miARN en lugar de su ausencia, podna ser la razon de ello. En cualquier caso, es necesario identificar la secuencia de los miARN maduros para realizar predicciones precisas, y esto es diffcil de determinar mediante metodos experimentales diferentes de miRNA-seq. Para superar este problema, los inventores decidieron utilizar un factor predictor de miARN maduro in-silico, Mature Bayes [37]. Este programa predice el miARN maduro a partir de una secuencia de pre-miARN. Despues de hacer esto con todos los precursores de miARN previstos (Tabla 2), utilizaron DIANA-microT-3.0 [38-39] para predecir las posibles dianas. Se razono que, a pesar de la variabilidad de sus secuencias, los miARN maduros putativos de TTV deben tener algunas dianas en comun. Por tanto, despues de realizar las predicciones, los inventores compararon los resultados entre las diferentes cepas de TTV y consideraron como candidatas adecuadas las dianas que se habfan previsto para algunos miARN pertenecientes a TTV-HD14a y, al menos, dos cepas mas de TTV. Las dianas candidatas se indican en la Tabla 3.

Ademas de este enfoque, los inventores realizaron una comparacion directa del miARN maduro previsto procedente de TTV-HD14a, con las regiones CDS, 3'UTR y promotoras de varios genes supresores tumorales utilizando RNA Hybrid [40]. Este programa permite detectar directamente la secuencia complementaria de un miARN dado dentro de un gen, independientemente de la conservacion o localizacion de la secuencia complementaria. Esto es util, ya que la mayona de los otros programas de prediccion no tienen en cuenta la region CDS o promotora de los genes, aunque se ha demostrado que un emparejamiento de la semilla con la primera region puede mediar en el PTGS y con la segunda puede causar TGS o ARNa [11, 12, 29-33]. Los inventores encontraron una complementariedad de la semilla entre el gen de APC y TTV-HD14a-mir-2-5p en tres puntos diferentes dentro de la secuencia del ARNm de APC, dos en CDS y una en 3'UTR (Figura 3A - 1, 2 y 3). Ademas, un posible sitio de interaccion entre TTV-HD14amir-2-3p y el ARNm de APC estaba presente en CDS (Figura 3A - 4). Los inventores tambien encontraron comple­ mentariedad entre TTV-HD14a-ASmir-2-3p y tres de los cuatro promotores indicados para APC en la base de datos de promotores eucariotas New Human (e Pd New Human) [59] (nombres de registro APC_1, APC_2, APC_3 y APC_4) (Figura 3B-D).

Ejemplo 5

APC se regula a la baja despues de la transfeccion con pCDNA3.1(+)-TTVHD14a-NCR-Sense

Para comprobar la posible regulacion a la baja de APC mediada por el miARN de TTV-HD14a, los inventores trans­ fectaron de forma transitoria celulas HEK293TT con las estructuras artificiales que codifican el miARN, con el virus de longitud completa TTV-HD14a o las transfectaron de forma simulada, seguido por RT-qPCR (Figura 3E). La regu­ lacion a la baja de APC por el propio miARN, asf como por el genoma de longitud completa (que codificaba el miARN) es significativa en comparacion con la transfeccion simulada.

Ejemplo 6

Regulacion al alza de GAPDH a traves de miARN de TTV

Despues de la transfeccion con pCDNA3.1(+)-TTV-HD14a-NCZ-Sense, que esta destinada a producir 4 miARN maduros (TTV-HD14a-mir-1-5p, TTV-HD14a-mir-1-3p, TTV-HD14a-mir-2-5p y TTV-HD14a-mir-2-3p), los inventores pueden observar un aumento estadfsticamente significativo del transcrito de GAPDH:

GAPDH (Gliceraldehndo-3-fosfato-deshidrogenasa) es un gen que generalmente se usa como control interno (gen de mantenimiento), a nivel de ARNm y proteico, debido a que sus niveles de expresion son muy constantes bajo condiciones muy diferentes.

GAPDH se regula al alza en la mayona de los canceres y en condiciones de hipoxia [72, 73, 74]. Los inventores sugieren que la regulacion al alza de GAPDH dependiente del miARN de TTV esta mediada indirectamente por la regulacion a la baja de APC.

Ejemplo 7

Un analisis con micromatrices revela el cuadro de alteraciones inducidas con los miARN de TTV-HD14a Despues de 72 h de la transfeccion de las celulas con las dos estructuras artificiales diferentes, se aislo el genoma de TTV HD14a de longitud completa o se aislo un ARN plasirndico vado y se realizo un analisis con micromatrices. La Tabla 5 incluye todos los genes que se desregularon consecuentemente entre la transfeccion con las estructuras artificiales y el virus de longitud completa.

Tabla 5

Genes expresados de forma diferencial entre celulas transfectadas con un plasmido que codifica TTV-HD14a NCR con orientacion sentido en comparacion con celulas transfectadas de modo simulado

Con estos genes tambien se realizaron analisis de ontologfa de los genes. El miARN de TTV podna estar desregulando varias vfas importantes para la progresion del cancer.

Ejemplo 8

Cribado de TCGA en busca de miARN de TTV asociado con el cancer

El TCGA (The Cancer Genome Atlas) es una iniciativa del NIH. Los datos almacenados dentro de este deposito consisten en la secuenciacion de conjuntos de datos procedentes de tejido cancengeno y normal extrafdo a partir de pacientes. En este sentido, los datos extrafdos mediante este analisis se pueden considerar "in vivo", ya que provienen directamente de tumores de pacientes. En un esfuerzo por establecer una relacion entre el miARN de t Tv y el cancer, los datos de la secuenciacion de ARN pequeno para el adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de mama y carcinoma hepatocelular de la iniciativa TCGA, se cartografiaron frente a todos los genomas TTV de longitud completa, incluidos en la base de datos del NCBI, mas varios TTV identificados recientemente en el laboratorio de los inventores. Para excluir artefactos, los miARN tomados en consideracion cumplfan lo siguiente: cartografiado con 2 desajustes o menos frente a genomas de TTV y cartografiado en una region en la que se habfa previsto que el ARN iba a adquirir la estructura de horquilla caractenstica de un pre-miARN (Tabla 7).

Tabla 7

Conjuntos de datos de la secuenciacion de ARN pequeno procedente de pacientes con diferentes tumo­ res malignos, se escrutaron en busca de la presencia de miARN de TTV. Los pacientes se consideraron positivos para TTV cuando teman al menos una lectura en la que se cartografiaba un miARN de TTV. Los pacientes positivos para TTV que codificaban un miARN maduro que presentaban la "secuencia de consenso" se consideraron cuando teman al menos una lectura en la que se cartografiaba una cepa de TTV que codificaba un miARN maduro que contema la "secuencia de consenso". La "secuencia de consenso" para los nucleotidos 1 a 7 (que comprende la semilla (nt 2-7)) es CATCCYY y las cepas de TTV que se encontraron en el TCGA que conteman la secuencia de consenso, son TTV-HDl4a y TTV-HD18a.

Tipo de cancer Numero total Pacientes % de pacientes Pacientes positivos %

de pacientes positivos positivos para para TTV que codifiescrutados para TTV TTV can un miARN madu­

ro que presenta la

"secuencia de consenso"

Carcinoma de co­ 421 76 18,05225653 53 12,5890736 lon

Carcinoma hepato- 147 19 12,92517007 9 6,12244898 celular

adenocarcinoma de 213 25 11,7370892 9 4,22535211 pulmon (en curso)

Carcinoma de ma­ 141 11 7,80141844 1 0,70921986 ma (en curso)

miARN analogos de TTV-HD14a-2-3p (es dedr, con un 80% de homologfa o mas en los nucleotidos 1 a 7 del miARN, que comprenden la semilla) se encontraron en una frecuencia mas alta en pacientes con cancer de colon que en los otros tres tipos de cancer que se habfan escrutado hasta el momento.

Las ligeras diferencias en la semilla respecto a TTV-HD14a-mir-2-3p no alteran los sitios de union previstos en el ARNm de APC, lo que sugiere que son capaces de regular a la baja APC.

Semilla de un miARN: los nucleotidos 2 a 7 de la forma madura del miARN [80]

A pesar de los polimorfismos de nucleotido unico (SNP) encontrados en la semilla de diversos miARN de TTV res­ pecto a la semilla de TTV-HD14a-mir-2-3p, el sitio de interaccion previsto con el ARNm de APC mostrado en la figura 3 (A.4) estana conservado. El motivo de semilla mas conservado (AUCCUC) tiene tres sitios adicionales para posibles interacciones dentro del ARNm de APC, ademas del descrito previamente para TTV-HD14a-mir-2-3p.

Esto apoyana un papel causal para este tipo de miARN de TTV en esa enfermedad o, al menos, una asociacion con el mismo.

Se ha demostrado un aumento significativo en la carga de TTV en pacientes con cancer en comparacion con los controles normales [44]. En el caso de cancer de colon, este aumento en la carga viral estana representado presumiblemente, principalmente por las cepas de TTV que codifican un miARN analogo al de TTV-HD14a.

Ejemplo 9

Activacion de Wnt a traves de un miARN de TTV

APC ejerce su actividad supresora de tumores mediante una regulacion a la baja de la via Wnt canonica, aunque se han sugerido otros papeles putativos para esa protema. Este efecto esta mediado por su participacion en el "complejo de destruccion". El complejo de destruccion esta formado por APC, AXIN y GSK3-beta, entre otros. Este complejo fosforila la beta-catenina, lo que permite su ubicuitinacion y la degradacion por el proteasoma. En ausencia de cualquiera de las protemas del complejo de destruccion, su funcion se ve afectada. El resultado final es la acumulacion citoplasmatica de beta-catenina, que entonces se puede traslocar al nucleo, en donde activa la transcripcion de sus genes diana, junto con el factor de transcripcion TCF4 o LEF1. Esta bien documentado que esta via esta regulada al alza en varias enfermedades malignas, asf como en otras enfermedades. Por consiguiente, pensamos que la regu­ lacion a la baja de APC podna conducir a una activacion de la via de Wnt. Para comprobar esto, se utilizo un enfoque de gen informador. Se transfectaron celulas HEK293TT con los plasmidos que codifican el miARN de TTV-HD14a ((pCDNA-3.1(-)-TTV-HD14a-NCR(2820-3516)Sense o pCDNA-3.1(-)-TTV-HD14a-NCR(3516-2820)-AntiSense, con el genoma completo de TTV-HD14a, o transfectadas de manera simulada, junto con un plasmido que codificaba luciferasa de luciernaga bajo el control de un promotor mmimo y siete sitios de union para el complejo TCF4/beta catenina (plasmido TOPFLASH). Ademas, la luciferasa de renilla bajo el control del promotor CMV se utilizo para fines de normalizacion. Una regulacion al alza de la via Wnt aparecio en celulas en las que el plasmido codificaba el miARN sentido o con el virus TTV-HD14a, en comparacion con celulas transfectadas de forma simulada.

Conclusiones

Los resultados anteriores ponen de relieve la importancia de los hallazgos experimentales como un metodo de diagnostico para la infeccion con TTV e identifican el miARN de TTV como una diana prometedora para la prevencion, el tratamiento o la recidiva del cancer.

Se sabe que TTV se replica en varios tejidos [21], pero solo se replica en celulas mononucleares de sangre periferica cuando esas celulas estan activadas [42]. Se ha demostrado recientemente que TTV se replica de manera mas eficaz cuando son celulas coinfectadas con el virus de Epstein Barr [41].

Se conocen muy pocas cosas sobre los mecanismos moleculares que median en la infeccion, la replicacion y la interaccion virus-hospedador de los TTV. En este contexto, los inventores proporcionan una evidencia que apoya el que diversos TTV codifiquen miARN y que algunos de ellos tienen un papel biologicamente relevante, especialmente en relacion con el desarrollo del cancer.

Se ha mostrado en la presente invencion que el miARN codificado de TTV-HD14a puede regular a la baja APC, un importante supresor tumoral. Por lo tanto, una infeccion con cualquiera de los TTV que codifican los miARN que se incluyen en la presente invencion, podna representar un factor de riesgo para el desarrollo de cancer de colon, asf como muchos otros tipos de cancer.

Para respaldar estos hallazgos, los inventores detectaron miARN de TTV que regulaban a la baja APC con una frecuencia mas alta en pacientes con adenocarcinoma de colon, en comparacion con otros tres tipos de cancer (adenocarcinoma de pulmon, carcinoma hepatocelular y carcinoma invasivo de mama). En consecuencia, los miARN de TTV presentados en este documento representan una diana para la prevencion del cancer de colon, asf como un biomarcador putativo para la deteccion temprano de un subconjunto de estos canceres.

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un poli(acido nucleico) de TTV que consiste en:

(a) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de nucleotidos de TTV-HD14a-mir2 representada en la Tabla 1 y que contiene la secuencia de nucleotidos CAUCCYY (con Y: C o U);

(b) una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de nucleotidos de TTV-HD14a-mir2 representada en la Tabla 2 y que contiene la secuencia de nucleotidos CATCCYY (con Y: C o T); o

(c) una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia de nucleotidos de (a) o (b).

2. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1(a), que contiene una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo que consiste en CAUCCCC, CAUc Cc U, CAUCCUC y CAUCCUU.

3. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1(b), que contiene una secuencia de nucleotidos seleccionada a partir del grupo que consiste en CATCCCC, CATCCCT, CATCCTC y CATCCTT.

4. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, en donde el poli(acido nucleico) comprende un micro ARN maduro (miARN) que comprende la secuencia de nucleotidos CAUCCYY (con Y: C o U).

5. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 4, en el que la secuencia de nucleotidos CAUCCYY (con Y: C o U) comprende la semilla AUCCUC de un miARN maduro.

6. Un cebador de oligonucleotido o una sonda de oligonucleotido que tiene la secuencia de nucleotidos de HD14amir-2-5p o HD14a-mir-2-3p como se representa en la Tabla 4.

7. Un vector que contiene un poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, un cebador de oligonucleotido segun la reivindicacion 6 o una sonda de oligonucleotido segun la reivindicacion 6.

8. Una celula hospedadora transfectada con el vector segun la reivindicacion 7.

9. Un kit de diagnostico que contiene un poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, un cebador de oligo­ nucleotido segun la reivindicacion 6 o una sonda de oligonucleotido segun la reivindicacion 6.

10. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, un cebador de oligonucleotido que comprende parte del poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1(b) y que contiene la secuencia de nucleotidos CATCCYY (con Y: C o T), en donde dicho cebador es capaz de actuar como cebador para secuenciar espedficamente o amplificar espedficamente el acido nucleico de una determinada cepa aislada de TTV que contiene una secuencia de nucleotidos segun la reivindicacion 1(b), o una sonda de oligonucleotido que comprende un poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, en donde dicha sonda es capaz de actuar como una sonda de hibridacion para una deteccion espedfica del poli(acido nucleico) segun la reivindicacion 1, para uso como un marcador temprano de un desarrollo futuro del cancer.

11. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 1, para uso como un componente principal para el desarrollo de un medicamento para la prevencion o el tratamiento del cancer.

12. El poli(acido nucleico) de TTV segun la reivindicacion 11, en donde el cancer es cancer de colon.