JP2016523076A - 癌の将来の発生についての早期マーカーならびに癌の治療および予防のための標的としてのＴＴＶ ｍｉＲＮＡ配列 - Google Patents

Abstract

ＴＴＶ ｍｉＲＮＡ、および、前記ＴＴＶ ｍｉＲＮＡポリ核酸の一部を含むプローブ並びにプライマーについて記載する。癌または癌の疾病素質について診断するための前記化合物の使用についても記載する。

Description

本発明は、ＴＴＶ ｍｉＲＮＡ、ならびに、前記ＴＴＶ ｍｉＲＮＡポリ核酸の一部を含むプローブおよびプライマーに関する。最後に、本発明は、癌の将来の発生についての早期マーカーとしての前記化合物の使用に関する。

トルクテノウイルス（ＴＴＶ）は、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のアルファトルクウイルス属（Ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅｖｉｒｕｓ）に属するウイルス種である。この種に分類されるウイルスは、長さが３．７〜３．８Ｋｂの環状の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを提示し、非−エンベロープウイルスである［２：非特許文献１、３：非特許文献２］。それらは、輸血後非Ａ〜Ｇ型肝炎を呈する患者において１９９７年に初めて発見された［１：非特許文献３］。様々なＴＴＶ株間ではヌクレオチド配列内の高度の相違が観察され、相違は一部の場合には７０％超に達する。ゲノム機構もまた可変性であるが、それらの全部が１．２Ｋｂに及ぶ非−コーディング領域を含有している［２２：非特許文献４］。非−コーディング領域は、３’末端においてプロモーターを内部に含むことが証明されており［４：非特許文献５］、この３’末端内の７０ｂｐの高度に保存された領域はこれらのウイルスの複製起源であると仮説が立てられている。９０％を超えるヒトが一種以上のＴＴＶ株に感染していると推定されている。様々な単離体の（二百を超える）数、それらの遍在性およびそれらを区別するための信頼できる単純な技術が存在しないことは、ＴＴＶ感染と特定疾患との因果関係を支持する十分な疫学的証拠を得ることを困難にしている［２３〜２８：非特許文献６〜１１］。ＴＴＶウイルスは、数種のヒト組織に感染することが公知である［２１：非特許文献１２］。複製周期に関して入手できるデータは限られており、これらのウイルスによってコードされるタンパク質の機能に関するデータはさらに少ない。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが１９〜２９ｎｔの範囲内にあり、通常は２２ｎｔであるスモールＲＮＡ分子である。それらは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の切断、不安定化もしくは翻訳阻害を誘導することにより翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を媒介する［９、１０、１１、１２：非特許文献１３、１４、１５、１６］。それらは、塩基対形成によってＲＩＳＣ複合体と相互作用してＲＩＳＣ複合体を特定ｍＲＮＡに誘導することによって実施する。この相互作用は、主として、標的ｍＲＮＡ ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）とｍｉＲＮＡ「シード」（ヌクレオチド２〜７）との間の完全マッチによって媒介されると考えられる［７、８、８０：非特許文献１７、１８、１９］。これとは対照的に、近年の研究成果は、この領域内の非−完全マッチ（一つのミスマッチを含有するワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒｉｃｋ）対形成またはシードがない）は、完全マッチよりもはるかに豊富であることを示唆している［６：非特許文献２０］。同一研究は、コーディング配列（ＣＤＳ）内のｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ対形成が３’ＵＴＲ内におけるそれらと同程度に豊富であることを示唆している。さらに彼らは、一部のｍｉＲＮＡがそのシードとは完全に異なる領域内のｍＲＮＡとハイブリダイズする傾向があるが、それでもＰＴＧＳを発揮できることを証明している。ｍｉＲＮＡをベースとする遺伝子発現調節の複雑さをより一層増加させることに、近年の数年間にはｍｉＲＮＡにより媒介された転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）および転写遺伝子活性化（ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ））の幾つかの例が出現した［２９〜３３：非特許文献２１〜２５］。これらの二つの事象を媒介する機構は依然として不明な点が多いが、ＴＧＳおよびＲＮＡａが一部のｍｉＲＮＡの一般的特徴であることを放棄することはできない。公知の内因性ヒトｍｉＲＮＡの数は、最近数年間に極めて急速に増加してきた。ｍｉＲＢａｓｅで注解された成熟ｍｉＲＮＡの数は、２，０４２である［１３〜１６：非特許文献２６〜２９］。さらに、ウイルスによりコードされた極めて多数のｍｉＲＮＡが細胞ｍｉＲＮＡサイレンシング機構を使用することもまた証明されてきた。最初のヒトウイルスコード化ｍｉＲＮＡが発見されて［５：非特許文献３０］以降、その数は１５７に増加してきた［１３〜１６：非特許文献２６〜２９］。これらのｍｉＲＮＡの大多数は、特にヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）およびポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）に属するＤＮＡウイルスによりコードされる。近年、ウシ発癌性ＲＮＡウイルス（ウシ白血病ウイルス）は、八種の成熟ｍｉＲＮＡをコードすると報告されており、このタイプのウイルスもまたそれらを発現できることが証明された。極めて多数のウイルスｍｉＲＮＡが発見されたにもかかわらず、それらの大多数の機能は依然として謎のままであるが、近年には幾つかの報告がこの問題に光を当ててきた。例えば、ポリオーマウイルスおよびヘルペスウイルスの両方によりコードされるｍｉＲＮＡは、これらのウイルスがウイルス［１７：非特許文献３１］もしくは宿主［１８、１９：非特許文献３２、３３］タンパク質発現を調節することにより宿主免疫応答から逃げるのに役立つことが証明されてきた。また別の重要な観察所見は、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスコード化ｍｉＲＮＡが細胞を自然に形質転換させるために十分であることが証明された数カ月前に得られたが［２０：非特許文献３４］、これはウイルスｍｉＲＮＡは適正な条件下では発癌プロセスを媒介できる可能性があることを示唆していた。ごく最近、ＴＴＶはｍｉＲＮＡをコードすることが証明され、このｍｉＲＮＡの一つがインターフェロンシグナル伝達阻害において果たす役割が証明された［７８：非特許文献３５］。

ＡＰＣ（腺腫性結腸ポリポーシス症）遺伝子は、特に大腸癌の状況においては極めて重要な腫瘍抑制因子である。実質的にすべての大腸癌は、ＡＰＣ不活性化突然変異またはこの遺伝子の転写を不活性化する後成的変化を有している。その腫瘍抑制活性は、ｗｎｔシグナル伝達の阻害におけるその機能によって媒介されると考えられているが、これはさらに移動および正確な有糸分裂紡錘体集合にも関連付けられてきた。

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本発明の基礎にある技術的問題は、癌を診断するための、または上記疾患の素因を診断するための手段（もしくはマーカー）を提供することである。また別の技術的問題は、特定標的を阻害することによって癌の発生および癌の再発を予防するための手段を提供することである。

上記技術的問題に対する解決は、特許請求の範囲において特徴付けられた実施形態を提供することにより達成される。

ＴＴＶとそれらの宿主との間の相互作用に関する態様は、ほとんど知られていない。結果として本発明を生じた研究では、ＴＴＶがｍｉＲＮＡをコードすること、および主として、それらが癌において果たせると考えられる役割に焦点を当て、それらのＴＴＶ感染および病原性に対する有意性が解明された。ＴＴＶ株（ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ）による四つのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの発現を支持する証拠が提供されている（図１のＡ〜Ｂ）。ｍｉＲＮＡは、センスおよびアンチセンス方向の両方でウイルスの非コーディング領域から転写される。さらに、両方の方向にコードされた一部のｍｉＲＮＡは、直接的もしくは間接的に、ｍＲＮＡレベルで腫瘍抑制因子である腺腫性結腸ポリポーシス症遺伝子（ＡＰＣ）をダウンレギュレートできることもまた証明することができた。驚くべきことに、本発明者らは、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａと腫瘍抑制因子調節との間の連関を同定し、この観察所見は、癌の発生においてＴＴＶ−ＨＤ１４ａが役割を果たすことを示唆している。この研究は、ＴＴＶと癌との間に分子的連関があることを初めて明言する。さらに、ヒトに感染する環状ｓｓＤＮＡウイルスによるｍｉＲＮＡの発現を初めて報告している。

ＴＴＶ−ＨＤ１４ａゲノム機構およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの位置（Ａ）ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ。線の上方の数はヌクレオチド番号を示している。ＮＣＲ− 非−コーディング領域。（Ｂ）非−コーディング領域の詳細。数はヌクレオチド番号を示している。線の上方のヘアピンはセンス方向にコードされたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを示している。線の下方のヘアピンは、アンチセンス方向にコードされたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを示している。ヘアピンの上方および下方の名称はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに与えられた名称である。 トランスフェクションのために使用されたプラスミドの略図ならびにｐｒｅ−ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡを示しているノーザンブロットを示す図である。（Ａ）センス（＋）もしくはアンチセンス（−）方向にＣＭＶプロモーターおよび非コーディング領域（ＮＣＲ）を含有するプラスミドの略図。構築物は各々、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−センスおよびｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−アンチセンスと名付けられている。線の上方および下方の数はヌクレオチド番号を示している。ヘアピンおよび垂直線はセンスまたはアンチセンス方向におけるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを示している。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの名称は線の下方に記載されている。（Ｂ〜Ｅ）指示したプローブおよびトランスフェクションでの結果を示しているノーザンブロット（センス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−センスを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞。アンチ−センス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−アンチセンスでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞。偽− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞）。プローブ配列は表４に列挙した。 ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−５ｐとＡＰＣ ｍＲＮＡ、および、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＡＳｍｉｒ−２−３ｐとＡＰＣプロモーターとの相補性、および、トランスフェクト細胞におけるＡＰＣ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示す図である。（Ａ）ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−５ｐ（１、２および３）およびＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−３ｐ（４）とＡＰＣ ｍＲＮＡとの間の相補性。ＡＰＣ転写変異体２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１２７５１０．２）に比較した位置。（Ｂ、Ｃ、およびＤ）ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＡＳｍｉｒ−２−３ｐとＥＰＤＮｅｗ Ｈｕｍａｎに貯蔵されたＡＰＣプロモーター１、２および３各々との間の相補性。図示した位置はＥＰＤ Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ（ＥＰＤＮｅｗ Ｈｕｍａｎ名：ＡＰＣ＿１、ＡＰＣ＿２およびＡＰＣ＿３）を参照した転写開始位置（ＴＳＳ）に関する。（Ｅ）ｑＰＣＲによって測定したＡＰＣの相対的発現レベル（センスについての平均値＝０．７４７およびアンチセンスについての平均値＝０．６５０）。ΔＣｔはＨＰＲＴに比して計算した。ΔΔＣｔは偽トランスフェクト細胞に比して計算した。差分値は１に正規化した。センス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−センスでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。アンチセンス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−アンチセンスでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。偽− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ− 全長ＴＴＶ−ＨＤ１４ａウイルスでトランスフェクトした細胞についての相対値。±ＳＤ；Ｎ＝６。対応のない両側（ｕｎｐａｉｒｅｄ）Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して計算した統計的有意性。 ＧＡＰＤＨ発現（詳細については実施例６を参照されたい）を示す図である。ｑＰＣＲによって測定されたＧＡＰＤＨの相対的発現レベル。ΔＣｔはＨＰＲＴに比して計算した。ΔΔＣｔは、偽トランスフェクト細胞に比して計算した。差分値は１に対して正規化した。センス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−センスでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。アンチセンス− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−アンチセンスでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。偽− ｐＣＤＮＡ３．１（＋）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＴＴ細胞についての相対値。ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ− 全長ＴＴＶ−ＨＤ１４ａウイルスでトランスフェクトした細胞についての相対値。±ＳＤ；Ｎ＝６。対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して計算した統計的有意性。 ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ｍｉＲＮＡ’ｓによるＷｎｔアップレギュレーションを示す図である。ＨＥＫ２９３ＴＴは、２４ウエルフォーマット内で３００ｎｇのＴＴＶ−ＨＤ１４ａウイルスまたはｐＣＤＮＡ−３．１（−）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ（２８２０−３５１６）センス（グラフ内では「センス」と称する）またはｐＣＤＮＡ−３．１（−）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＲ（３５１６−２８２０）−アンチセンス（グラフ内では「アンチセンス」と称する）またはｐＣＤＮＡ３．１（−）（グラフ内では「ベクター」と称する）またはサイレンサーｓｉＡＰＣ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）＋６０ｎｇのＴＯＰＦＬＡＳＨベクター（Ｍ．Ｂｏｕｔｒｏｓ ｌａｂによって提供される）および５ｎｇのＣＭＶ−レニラでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション７２時間後に測定した。（Ａ）レニラルシフェラーゼに正規化した蛍光ルシフェラーゼユニット、（Ｂ）ベクターに比した倍率変化。

したがって、本発明は、（ａ）表１、２Ａもしくは２Ｂに表示したヌクレオチド配列、（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の同一性を有し、ヌクレオチド配列ＣＡＴＣＣＹＹ（Ｙ＝ＣまたはＴ）を含有するヌクレオチド配列、（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列のフラグメントでありヌクレオチド配列ＣＡＴＣＣＹＹ（Ｙ＝ＣまたはＴ）を含有するフラグメント、または（ｄ）上記ヌクレオチド配列の何れかと相補性であるヌクレオチド配列を含むＴＴＶポリ核酸に関する。

用語「ポリ核酸」は、一本鎖もしくは二本鎖核酸配列を意味する。ポリ核酸は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドからなってよい、または診断もしくは治療目的のために適合させられていてよい。ポリ核酸はさらに、例えばクローニング目的のために使用できる二本鎖ｃＤＮＡクローンを含んでいてもよい。下記では、ＤＮＡレベルに関する記述および得られた観察所見はＲＮＡレベルに当てはまり、したがってその逆もまた同様である。

本発明のＴＴＶポリ核酸は、周知のルーチン方法にしたがって、例えば、（ａ）全ＤＮＡ、もしくは好ましくはＲＮＡをサンプルから単離する工程、（ｂ）ハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲによってＴＴＶ配列を検出する工程、および（ｃ）ｍｉＲＮＡ配列の各ヌクレオチドを合成する工程（ｄ）によりＴＴＶ配列をベクター内にクローニングする工程によって調製することができる。

さらに本発明の中に含まれるのは、主としてオリゴヌクレオチドの末端（３’もしくは５’の何れか）で一つ以上のヌクレオチドの欠失および／または挿入の何れか、特に一つ以上のコドンの挿入もしくは欠失を含有する、および本発明の上記ポリ核酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％の同一性を示し、コンセンサス配列ＣＡＴＣＣＹＹ（Ｙ＝ＣまたはＴ）を含有する本発明のポリ核酸の配列変異体である。表１、２Ａもしくは２Ｂに示した配列に類似する本発明によるポリ核酸配列は、当分野において公知の技術の何れか、例えば配列特異的プライマーによる増幅、配列特異的プローブを用いた多少ともストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション、ＴＴＶの遺伝子情報の配列決定などによって特徴付けて単離することができる。本発明のＴＴＶポリ核酸配列の変異体およびフラグメントは、依然としてそれらの標的遺伝子の発現を妨害または阻害することができる。

特に好ましい実施形態では、ＴＴＶポリ核酸配列は、（ＤＮＡであれば）コンセンサス配列ＣＡＴＣＣＹＹ（Ｙ＝ＣまたはＴ）、すなわちＣＡＴＣＣＣＣ、ＣＡＴＣＣＣＴ、ＣＡＴＣＣＴＣもしくはＣＡＴＣＣＴＴを含有する。また別の特に好ましい実施形態では、ＴＴＶポリ核酸配列は、（ＲＮＡであれば）コンセンサス配列ＣＡＵＣＣＹＹ（Ｙ＝ＣまたはＴ）、すなわちＣＡＵＣＣＣＣ、ＣＡＵＣＣＣＵ、ＣＡＵＣＣＵＣもしくはＣＡＵＣＣＵＵを含有する。これに関連して、特に以下の表２Ｂを参照されたい。

特に好ましい実施形態では、本発明者らは、最も保存されたシードモチーフ（ＡＵＣＣＵＣ）が、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−３ｐについて以前に記載されたものに加えてどのようにＡＰＣ ｍＲＮＡ内に三つの追加の可能性のある相互作用部位を有するのかを証明する。これに関連して、特に以下の表８を参照されたい。

さらに本発明に含まれるのは、他のヒトＴＴウイルスタイプおよび変異体、ならびに、ヒトもしくは動物起源の構造が類似の一本鎖ＤＮＡウイルス内の、ｍｉＲＮＡアナログである。アネロウイルス属（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）は、一部にはヒトＴＴウイルスと類似のヌクレオチド配列を備える家畜動物において証明されている［７７］。

さらに、本発明は、本発明のＴＴＶポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーに関するが、上記プライマーは所定のＴＴＶ ｍｉＲＮＡを特異的にシークエンシングする、または特異的に増幅させるためのプライマーとして作用することができる。

用語「プライマー」は、複製すべき核酸鎖と相補的でありプライマー伸長産物を合成するための開始点として作用できる一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーの長さおよび配列は、それらが伸長産物の合成を特異的に始動させることを許容するようでなければならない。好ましくは、プライマーは、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の長さおよび配列は、必要とされるＤＮＡもしくはＲＮＡ標的の複雑度、ならびに例えば温度、イオン強度などのプライマー使用の条件に左右されるであろう。増幅プライマーは、適正な増幅を保証するために対応する鋳型配列と正確にマッチする必要はない。使用する増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、鎖置換増幅システム（ＳＤＡ）もしくはＱβレプリカーゼの手段による増幅またはプライマー伸長を使用して核酸分子を増幅させるための任意の他の適切な方法の何れかであってよい。増幅もしくは合成中、増副産物は、従来法で標識プライマーを使用する工程、または標識ヌクレオチドを取り込む工程の何れかで標識することができる。標識は、同位体性（^３２Ｐ、^３５Ｓなど）または非同位体性（ビオチン、ジゴキシゲニンなど）であってよい。

本発明はさらに、本発明のＴＴＶポリ核酸の一部を含むオリゴヌクレオチドプローブに関するが、上記プローブは所定のＴＴＶ ｍｉＲＮＡをインビトロおよびインビボで特異的に検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして作用することができる。

用語「プローブ」は、検出すべきＴＴＶポリ核酸の標的配列に相補的である配列を有する一本鎖配列特異的オリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、これらのプローブは長さが約５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜２５ヌクレオチドである。プローブは、固体支持体に、すなわちそれにオリゴヌクレオチドプローブを結合させることのできる任意の基質に、それがハイブリダイゼーション特徴を保持することを前提に、およびハイブリダイゼーションのバックグラウンドレベルが低いままにあることを前提に固定することができる。通常、固体基質はマイクロタイタープレート、メンブレン（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース）またはマイクロスフェア（ビーズ）であろう。メンブレンへの塗布もしくは固定の前に、固定を促進するため、またはハイブリダイゼーション効率を改善するために核酸プローブを修飾するのが都合がよいことがある。そのような修飾は、例えば、ホモポリマーテーリング、例えば脂肪族基、ＮＨ_２基、ＳＨ基、カルボン酸基などの様々な反応性基との結合、またはビオチンもしくはハプテンとの結合を含んでいてよい。

本発明はさらに、本発明のＴＴＶポリ核酸、オリゴヌクレオチドプライマーもしくはオリゴヌクレオチドプローブを含有するベクターであって、ＤＮＡ配列の組換えによる配列の発現、突然変異誘発、もしくは修飾を可能にするベクターに関する。好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学の分野において通常使用されるその他のベクターである。本発明において使用するために適切なベクターには、哺乳動物細胞内で発現させるためのＴ７ベースの発現ベクターおよび昆虫細胞内で発現させるためのバキュロウイルス由来ベクターが含まれるがそれらに限定されない。好ましくは、本発明のポリ核酸もしくはその一部は、翻訳されることのできる原核細胞および／または真核細胞内でのｍＲＮＡの転写および合成を保証する本発明の組換えベクター内の調節エレメントに機能的に連結している。転写されるべきヌクレオチド配列は、Ｔ７、メタロチオネインＩもしくはポリへドリンプロモーターのようなプロモーターに機能的に連結させることができる。

本発明はさらに、本発明のＴＴＶポリ核酸（もしくはそのフラグメント）またはベクターを一過性もしくは安定して含有する組換え宿主細胞に関する。宿主細胞は、インビトロ組換えＤＮＡを取り込むことができる、および、場合により本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを合成することができる生物体であると理解されている。好ましくは、これらの細胞は、原核細胞もしくは真核細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞もしくは酵母細胞である。

本発明はさらに、本発明のＴＴＶポリ核酸、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、ポリペプチドおよび／または抗体を含有する診断キットに関する。

ハイブリダイゼーション溶液（ＳＳＣ、ＳＳＰＥなど）によるハイブリダイゼーションベースアッセイのためには、プローブは、十分な特異性を達成するためにそれらの適切な温度で標的に（事前の増幅を行って、または行わずに）ストリンジェントにハイブリダイズしなければならない。しかし、一つもしくは数個（ａ ｆｅｗ）のヌクレオチドをそれらの末端（３’または５’の何れか）で付加する、または欠失させる工程、もしくは幾つか（ｓｏｍｅ）の非必須ヌクレオチド（すなわち、タイプ間を識別するために必須ではないヌクレオチド）を他のもの（修飾ヌクレオチドもしくはイノシンを含む）と置換する工程の何れかによってポリヌクレオチド、（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）プローブをわずかに修飾することによって、これらのプローブもしくはそれらの変異体が同一ハイブリダイゼーション条件（すなわち、同一温度および同一ハイブリダイゼーション溶液）下で特異的にハイブリダイズすることを誘発できる。さらに使用するプローブの量（濃度）を変化させる工程は、より特異的なハイブリダイゼーション結果を得るために有益な場合がある。

サンプル中でオリゴヌクレオチドプローブとＴＴＶポリ核酸との間で形成されたハイブリッドを検出するための本発明の目的に適合するアッセイ法は、例えば従来型ドット−ブロットフォーマット、サンドイッチハイブリダイゼーションもしくはリバースハイブリダイゼーションなどの当分野において公知のアッセイフォーマットの何れかを含んでいてよい。例えば、検出は、未標識増幅サンプルがメンブレンに結合させられ、メンブレンが少なくとも一つの標識プローブとともに適切なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で取り込まれ、および、結合プローブの存在が監視されるドット−ブロットフォーマットを使用して実施することができる。代替かつ好ましい方法は、増幅配列が標識を含有する「リバース」ドット−ブロットフォーマットである。このフォーマットでは、未標識オリゴヌクレオチドプローブは固体支持体に結合させられ、そして、適切なストリンジェントな条件およびその後の洗浄条件下で標識サンプルに曝露させられる。サンプルの核酸と本発明によるオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリッドの形成に依拠する任意の他のアッセイ法もまた使用されてよいことを理解されたい。

本発明はさらに、癌、好ましくは結腸直腸癌の将来の発生についての早期マーカーとしての本発明のＴＴＶポリ核酸、オリゴヌクレオチドプライマー、またはオリゴヌクレオチドプローブの使用に関する。

最後に、本発明はさらに、癌、好ましくは結腸直腸癌を予防もしくは治療するための医薬品を開発するための主要成分として本発明のＴＴＶポリ核酸の使用に関する。これらの医薬品は、癌の発生または再発を回避するため、及び癌の治療のために、ｍｉＲＮＡと腫瘍抑制遺伝子との間の何らかの相互作用の阻害剤であってよい。そこで、特異的ＴＴウイルスｍｉＲＮＡもしくはその誘導体または関連ｍｉＲＮＡは、癌の分野における診断、予防もしくは治療用途のために有用である。

以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の制限であるとは見なされない。

（実施例１）
材料および方法
（Ａ）細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞を１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘおよび１％のＮＧＡＡが補給されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）中で培養した［７６］。細胞は、播種２４時間後に、５０％のコンフルエントになった時点でトランスフェクトした（Ｔ−７５フラスコについては７，０００，０００個および６ウエルプレートについては８００，０００個／ウエル）。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｐｌｕｓ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、製品番号１１５１４および１８３２４）を製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。

（Ｂ）プラスミドの構築
ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ＮＣＲは、プライマーＴＴ−ＯＮ９およびＴＴ−ＯＮ１０（表４）を使用し、鋳型としてｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ（線形化しＸｂａＩ部位にクローニングした全長ＴＴＶ−ＨＤ１４ａを含有するプラスミド）を使用してＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル上でランし、ＤＮＡは臭化エチジウムを使用して染色した。予測されたサイズ（約１，２００ｂｐ）に対応するバンドを切断し、引き続いてＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してアガロースから抽出した。４μｇのｐＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）はＫｐｎＩを使用して切断し、ＦａｓｔＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して脱リン酸化した。ＰＣＲ産物は同一手順を使用して切断したが、脱リン酸化はしなかった。切断プラスミド及びＰＣＲ産物はＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キットを使用することにより精製した。

プラスミドおよびＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ＮＣＲに対応する増幅フラグメントのライゲーションはＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して実施した。ライゲーション産物は、製造業者の取扱説明書にしたがってＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓコンピテント細胞（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に形質転換させ、選択マーカーとしてのアンピシリンが補給されたＬＢ寒天プレート内に播種した。プレートは３７℃で２０時間インキュベートした。単一コロニーを採集し、アンピシリンを補給したＬＢ培地中に播種した。これらの培養物を２０時間インキュベートした。プラスミドはＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｑｕｉｃｋプラスミドミニプレップキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して抽出した。１μｇの各プラスミドは、ＳａｃＩおよびＮｈｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて二重切断した。切断産物は、１％アガロースゲル中でランした。制限戦略により本発明者らは、センスおよびアンチセンス方向におけるインサートクローン間を識別することができた。一つはセンスもう一つはアンチセンスインサートを含有する二つの陽性プラスミドを選択し、シークエンシングのために出した。配列を確証した後、プラスミドは、プラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してトランスフェクションのために準備した。

（Ｃ）ＲＮＡの抽出およびＤＮＡｓｅの処理
細胞は、トランスフェクションの４８〜７２時間後に採取した。細胞はＱｉａＳｈｒｅｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用してホモジナイズした。次に溶解物は、製造業者の取扱説明書にしたがって、ＲＮＡの目的（ｍｉＲＮＡノーザンブロットもしくはＲＴ−ｑＰＣＲのため）に応じてｍｉＲＮＡｅａｓｙミニキットもしくはＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＲＮＡ抽出に供した。

溶出後、ＲＮＡサンプルは、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加して、製造業者の取扱説明書にしたがってＲＱ１ Ｄｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて処理した。フェノール−クロロホルム抽出、その後にエタノール沈降法を実施し、生じたペレットをＤＥＰＣ水中に再懸濁させた。ＲＮＡの品質および濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して試験した。

（Ｄ）プローブの標識化
特注ＤＮＡオリゴをＳｉｇｍａ社に注文した（表４）。プローブは３’ビオチン標識した。１０ｐｍｏｌｅの各プローブは、４Ｕの末端デオキシヌクレオチド転換酵素（ＴｄＴ）および２．５ナノモルのビオチン−１１−ｄＵＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）と１×ＴｄＴバッファー中でインキュベートした。プローブをイソアミルアルコール−クロロホルム抽出に供し、全量をその後のハイブリダイゼーションのために使用した。

（Ｅ）ノーザンブロット
１サンプル当たり３０〜５０μｇの全ＲＮＡは、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して、７Ｍ尿素中に流し込み、１×ＴＢＥを用いて緩衝した１５％ポリアクリルアミド（２９：１）ゲルを使用する電気泳動法により分離した。電気泳動バッファーは、０．５×ＴＢＥであった。ゲルはＥｔＢｒを用いて染色した。

ブロッティングのためには、ゲルは、０．５×のＴＢＥ中で予備湿潤させたナイロンハイブリダイゼーションメンブランのシート（Ｈｙｂｏｎｄ−ＮＸ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の上方に配置した。これを次に、同様に０．５×のＴＢＥ中で予備湿潤させて、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ半乾燥転移細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中に配置した３ＭＭ製ワットマン濾紙（膜の下に一層およびゲルの上方に三層）間にサンドイッチした。過剰の液体および気泡は、表面をピペットで回転させることによってサンドイッチから絞り出した。ゲルからメンブランへのＲＮＡの電気泳動転移は、４００Ｗで６０〜９０分間にわたり実施した。転移後、ＲＮＡはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用した紫外線曝露によりメンブランへ架橋結合させた。

メンブランを必要に応じて切断し、４２℃で一晩Ｕｌｔｒａｈｙｂ Ｏｌｉｇｏバッファー（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内の適切なビオチン標識プローブ（表４）を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、第一回は２×のＳＳＣを用いて４２℃で三十分間、第二回は２×のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて４２℃で三十分間および最後の二回は２×のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて５５℃で三十分間の四回の洗浄を実施した。ハイブリダイゼーションシグナルは、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ ＢｉｏＤｅｔｅｃｔキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して検出した。使用したフィルム：（Ｆｕｊｉ社）。

（Ｆ）ＲＴ−ｑＰＣＲ
１μｇのＲＮＡを使用してｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩおよびＲｎａｓｅＯＵＴ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用してｃＤＮＡを作成した。ｃＤＮＡは１：１０で希釈した。ｑＰＣＲはＴａｑｍａｎ高速マスターミックスおよびＴａｑｍａｎ発現アッセイをｑＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ ＳｔｅｐＯｎｅ ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）中で用いて実施した。

（Ｇ）ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの予測および成熟ｍｉＲＮＡの予測
Ｖ−ｍｉｒを配列タイプが環状に変化するデフォルト構成に設定した。ＣＩＤ−ｍｉＲＮＡは、ホモサピエンスについてのデフォルトラン構成を使用してウェブベースツール上でランした。Ｍａｔｕｒｅ Ｂａｙｅｓをウェブベースツール上でランした。

（Ｈ）ｍｉＲＮＡ標的の予測
ＤＩＡＮＡ ｍｉｃｒｏＴ ３．０は、ウェブベースツール上でランした（このプログラムについての選択肢は与えられない）。ＲＮＡハイブリッドは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８のコンストレインツヌクレオチドコンフィギュレーション（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を使用してランした。Ｇ：Ｕ対が許容された。

（実施例２）
ｍｉＲＮＡの予測
ＴＴＶの非コーディング領域（ＮＣＲ）がプロモーター活性を超える可能性のある機能についての問題を解決するために、本発明者らは、それが、例えばｍｉＲＮＡなどの非コーディングＲＮＡもまた生成するという考えを抱いた。このため、本発明者らは、利用可能なｍｉＲＮＡ予測アルゴリズムを使用し、それを用いて一部のＴＴＶのＮＣＲ内において幾つかの候補ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを同定した。本発明者らは、そのようなアルゴリズムの内の二つ、ＣＩＤ−ｍｉＲＮＡ［３４］およびＶｍｉｒ［３５−３６］を使用するのに選択した。第一のものは高特異性であるために選択し、第二のものはより高い感受性を備えるために選択した。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ構造を一つの候補として見なすために、本発明者らは、Ｖ−ｍｉｒプログラムについては１２５を超えるカットオフ値を備える両方のプログラムによって予測しなければならない、およびウイルスのＮＣＲ内に所在しなければならないという基準を使用した。フィルタリング後、センス方向にある二つおよびアンチセンス方向にある二つの計四つのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ候補（表１および図１Ｂ）だけを推定ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであると見なし、詳細に評価した。

様々なＴＴＶ単離体間のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列の保存性を調査するために、本発明者らは、七種の異なる株、ＴＴＶ−ＨＤ１６ａ、ＴＴＶ−Ｃ３Ｔ０Ｆ、ＴＴＶ−ＨＤ２３ａ、ＴＴＶ−ＹｏｎＫｃｌ９７、ＴＴＶ−ＳＡＮＢＡＮ、ＴＴＶ−Ｓｌｅ２０５７およびＴＴＶ−ｔｔｈ８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＦＲ７５１４７６．１、ＡＢ０６４５９７．１、ＦＲ７５１５００．１、ＡＢ０３８６２４．１、ＡＢ０２５９４６．２、ＡＭ７１２０３０．１、ＡＪ６２０２３１．１）において同一予測を実施した。本発明者らは次に、結果として生じたｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを配列類似性にしたがって異なるクラス（表２）へ分類した。観察できるように、配列の保存はむしろ不良であり、二つのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ間の完全同一性は異なる株とは相当に異なる。

（実施例３）
ＴＴＶ−ＨＤ１４ａは、そのＮＣＲ内でコードされた四つの前駆体ｍｉＲＮＡを転写させられる
予測ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓがプロセシング（ｐｒｏｃｅｓｓ）されるかどうかという問題を解決するために、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａのＮＣＲをＣＭＶプロモーターの下流にセンスもしくはアンチセンス方向にスカフォールドとしてプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ｚｅｏを使用してクローニングした（図２Ａ）。本発明者らは次に、ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞をこれらのプラスミドでトランスフェクトし、各推定ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの３’もしくは５’アームに対して特異的プローブを用いてノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施した（表４）（図２Ｂ−Ｅ）。本発明者らは、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２およびＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＡＳｍｉｒ−２の３’および５’アームに対して向けられたプローブを用いてｐｒｅ−ｍｉＲＮＡについての予測サイズにマッチするバンドを明白に検出することができた。さらに、本発明者らは、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２の５’アーム内の成熟ｍｉＲＮＡについての予測サイズにマッチする転写産物を検出することができた。他方、本発明者らは、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−ｌおよびＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＡＳｍｉｒ−１の３’アーム単独に対して向けられたプローブを用いて予測サイズにマッチする転写産物を検出することができた。

これらの結果は、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａが両方の方向に幾つかの前駆体ｍｉＲＮＡをコードすることを証明しており、それらの少なくとも一つは成熟ｍｉＲＮＡ内にプロセシングされることができる。

（実施例４）
標的の予測
ｍｉＲＮＡの主要な特徴は転写後性に遺伝子発現をダウンレギュレートすることであるのは周知である。さらに、この作用はｍｉＲＮＡの成熟形によって誘発されるがそれらの前駆体によっては誘発されないことも公知である。本発明者らは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの三つについては成熟ｍｉＲＮＡを全く見ることができなかったが、本発明者らはこれの理由はそれらの非存在よりむしろこれらのｍｉＲＮＡの低い発現レベルである可能性があると考えている。どんな場合でも、正確な予測を実施するために成熟ｍｉＲＮＡの配列を同定することが必要であるが、これはｍｉＲＮＡ−ｓｅｑとは異なる実験方法によって決定するのが困難である。この問題を克服するために、本発明者らは、コンピューター上で成熟ｍｉＲＮＡ予測因子Ｍａｔｕｒｅ Ｂａｙｅｓを使用することを決定した［３７］。このプログラムは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列から成熟ｍｉＲＮＡを予測する。全部の予測ｍｉＲＮＡ前駆体を用いてそれを実施した（表２）後、本発明者らは、ＤＩＡＮＡ−ｍｉｃｒｏＴ−３．０［３８−３９］を使用して可能性のある標的を予測した。本発明者らは、それらの配列における変動性にも関わらず、推定ＴＴＶ成熟ｍｉＲＮＡが共通して一部の標的を有しているはずであると理由付けした。そこで、予測を実施した後、本発明者らは、様々なＴＴＶ株間で結果を比較し、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａに属する一部のｍｉＲＮＡ、および少なくとも二つ以上のＴＴＶ株について予測された標的を優れた候補であると見なした。候補標的は、表３に列挙した。

このアプローチに加えて、本発明者らは、ＲＮＡハイブリッドを使用してＴＴＶ−ＨＤ１４ａ由来の予測成熟ｍｉＲＮＡと数個の腫瘍サプレッサー遺伝子のＣＤＳ、３’ＵＴＲおよびプロモーター領域との直接比較を実施した［４０］。このプログラムは、一つの遺伝子内の所定のｍｉＲＮＡの相補的配列を相補的配列の保存もしくは局在化とは無関係に直接的に検出することを許容する。これは、他の予測プログラムの大多数は遺伝子のＣＤＳもしくはプロモーター領域を考慮に入れないので有用であるが、一方、第一のものとのシードペアリングはＰＴＧＳを媒介することができ、第二の領域とのシードペアリングはＴＧＳもしくはＲＮＡａを誘発できることが証明された［１１、１２、２９−３３］。本発明者らは、二つはＣＤＳ内および一つは３’ＵＴＲ内にあるＡＰＣ ｍＲＮＡ配列内の三つの異なる位置でＡＰＣ遺伝子とＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−５ｐとのシード相補性を見いだした（図３のＡ−１、２および３）。さらに、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−３ｐとＡＰＣ ｍＲＮＡとの間の可能性のある相互作用部位はＣＤＳ内に存在した（図３のＡ−４）。本発明者らはさらに、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＡＳｍｉｒ−２−３ｐとＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ（ＥＰＤ Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ社）［５９］においてＡＰＣについて列挙された四つのプロモーターセッション名ＡＰＣ＿１、ＡＰＣ＿２、ＡＰＣ＿３およびＡＰＣ＿４）の内の三つとの間の相補性も見いだした（図３のＢ〜Ｄ）。

（実施例５）
ＡＰＣはｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶＨＤ１４ａ−ＮＣＲ−センスでのトランスフェクション後にダウンレギュレートされる
ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ｍｉＲＮＡにより媒介される可能性のあるＡＰＣダウンレギュレーションをチェックするために、本発明者らはｍｉＲＮＡをコードする構築物、全長ＴＴＶ−ＨＤ１４ａウイルスを用いてＨＥＫ２９３ＴＴ細胞を一過性でトランスフェクトし、またはそれらを偽トランスフェクトし、その後にＲＴ−ｑＰＣＲを実施した（図３のＥ＋Ｆ）。ｍｉＲＮＡ自体による、ならびに全長ゲノム（ｍｉＲＮＡをコードする）によるＡＰＣダウンレギュレーションは、偽トランスフェクションに比較して有意である。

（実施例６）
ＴＴＶ ｍｉＲＮＡによるＧＡＰＤＨのアップレギュレーション
四つの成熟ｍｉＲＮＡ（ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−１−５ｐ、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−１−３ｐ、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−５ｐおよびＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−３ｐ）を生成することが意図されるｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ＮＣＺ−センスでのトランスフェクション後、本発明者らは、ＧＡＰＤＨ転写産物の統計的有意な増加を観察することができる。

ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ）は、その発現レベルが極めて様々な条件間で極めて一定であるので、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでの内部コントロール（ハウスキーピング遺伝子）として通例使用される遺伝子である。

ＧＡＰＤＨは、大多数の癌において、および、低酸素条件下でアップレギュレートされる［７２、７３、７４］。本発明者らは、ＧＡＰＤＨのＴＴＶ ｍｉＲＮＡ依存性アップレギュレーションはＡＰＣダウンレギュレーションにより間接的に媒介されることを示唆している。

（実施例７）
マイクロアレイ分析は、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ｍｉＲＮＡ誘導性変化の状況を解明する
二つの異なる構築物での細胞のトランスフェクション７２時間後、全長ＴＴＶ ＨＤ１４ａゲノムもしくはエンプティプラスミドＲＮＡを単離し、マイクロアレイ分析を実施した。表５は、構築物および全長ウイルスでのトランスフェクション間で一貫して脱調節された全遺伝子を含んでいる。

これらの遺伝子を用いて、遺伝子オントロジー分析もまた実施した。結果は、表６に示した。表から明らかなように、ＴＴＶ ｍｉＲＮＡは癌進行にとって重要な幾つかの経路を脱調節する可能性がある。

（実施例８）
癌に関連するＴＴＶ ｍｉＲＮＡについてのＴＣＧＡのスクリーニング
ＴＣＧＡ（癌ゲノムアトラス：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）はＮＩＨ主導の事業体である。この収蔵場所内に保管されたデータは、患者から抽出された癌および正常組織からのシークエンシングデータセットからなる。この関連で、この分析により抽出されたデータは、患者の腫瘍に直接的に由来するので、「インビボ」と見なすことができる。ＴＴＶ ｍｉＲＮＡと癌との関係を確立する努力において、ＴＣＧＡ事業体からの結腸腺癌、肺腺癌、乳癌および肝細胞癌についてのスモールＲＮＡシークエンシングデータを、ＮＣＢＩデータベース＋本発明者らの研究所からの数個の新規に同定されたＴＴＶを含む全ての全長ＴＴＶゲノムに対してマッピングした。アーチファクトを除外するために、考慮に入れたｍｉＲＮＡは下記に適合していた。ＴＴＶゲノムへ２以下のミスマッチを備えるマッピングおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの特徴的なヘアピン構造を獲得するためにＲＮＡが予測される領域内のマッピング（表７）。

ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−２−３ｐアナログｍｉＲＮＡ（シードを含むｍｉＲＮＡの１〜７のヌクレオチドにおいて８０％以上の相同性を備えることを意味する）（表２Ｂ）はこれまでにスクリーニングされている他の三つの癌のタイプにおけるより結腸癌患者においてより高頻度で見いだされた。

ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ−ｍｉｒ−２−３ｐに関するシードにおけるわずかな差は、ＡＰＣ ｍＲＮＡ内の予測結合部位を変化させないが、これはそれらがＡＰＣをダウンレギュレートできることを示唆している（表８）。

これは、この疾患においてこのタイプのＴＴＶ ｍｉＲＮＡが果たす因果的役割または少なくともそれらの間の関連を支持している。

正常コントロールに比較した癌患者におけるＴＴＶ負荷の有意な増加が証明されている［４４］。結腸癌の場合は、ウイルス負荷におけるこの増加はおそらくＴＴＶ−ＨＤ１４ａのそれに類似するｍｉＲＮＡをコードするＴＴＶ株により主として表されるであろう。

（実施例９）
ＴＴＶ ｍｉＲＮＡによるＷｎｔ活性化
ＡＰＣは、古典的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ経路をダウンレギュレートすることによって腫瘍抑制活性を発揮するが、このタンパク質についての他の推定上の役割が示唆されてきた。この作用は、「分解複合体（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）」への関与によって媒介される。分解複合体は、特にＡＰＣ、ＡＸＩＮおよびＧＳＫ３−βによって形成される。この複合体はβ−カテニンをリン酸化し、プロテアソームによるユビキチン化および分解を可能にする。分解複合体のタンパク質の何れかの非存在下では、その機能は損なわれる。最終成果は、その後に転写因子ＴＣＦ４もしくはＬＥＦ１とともにその標的遺伝子の転写を活性化する場所である核内に転座させることのできるβ−カテニンの細胞質の蓄積である。この経路が数種の悪性腫瘍ならびに他の疾患においてアップレギュレートされることは明確に証明されている。結果として、本発明者らは、ＡＰＣのダウンレギュレーションはＷｎｔ経路の活性化をもたらすことができると考えた。これを調査するために、遺伝子レポーターアプローチを使用した。ＨＥＫ２９３ＴＴ細胞はＴＴＶ−ＨＤ１４ａ ｍｉＲＮＡをコードするプラスミド、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａ完全ゲノムでトランスフェクトし、または、偽トランスフェクトし、このとき、最小プロモーターおよびＴＣＦ４／β−カテニン複合体についての七つの結合部位の制御下でホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼをコードするプラスミド（ＴＯＰＦＬＡＳＨプラスミド）と一緒にトランスフェクトした。さらに、ＣＭＶプロモーターの制御下でのウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼを正規化目的に使用した。ｗｎｔ経路のアップレギュレーションは偽トランスフェクト細胞に比較してセンス−ｍｉＲＮＡをコードするプラスミドまたはＴＴＶ−ＨＤ１４ａウイルスを備える細胞を生じさせた（図５）。

結論
上記の結果は、ＴＴＶ感染についての診断方法としての実験的所見の重要性を強調しており、ＴＴＶ ｍｉＲＮＡを癌の予防、治療もしくは再発についての前途有望な標的であると同定している。

ＴＴＶが数種の組織中で複製することは公知であるが［２１］、それらは末梢血単核細胞中ではこれらの細胞が活性化された場合にのみ複製する［４２］。近年、ＴＴＶは、それらがエプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウイルスを有する細胞に共感染している場合により効率的に複製することが証明されている［４１］。

ＴＴＶの感染、複製およびウイルス−宿主相互作用を媒介する分子機構に関してはほとんど何も知られていない。本明細書では、本発明者らは、数個のＴＴＶがｍｉＲＮＡをコードすることおよび特に癌の発生に関連してそれらの一部が生物学的に重要な役割を有することを支持する証拠を提供する。

本発明では、ＴＴＶ−ＨＤ１４ａのコードされたｍｉＲＮＡが重要な腫瘍抑制因子であるＡＰＣをダウンレギュレートできることが証明されている。そこで、本発明に含まれるｍｉＲＮＡをコードするＴＴＶの何れかに感染することは結腸癌ならびに多数の他の癌のタイプの発生についてのリスク因子を表すことができた。

これらの観察所見を支持するために、本発明者らは、他の三つのタイプの癌（肺腺癌、肝細胞癌および侵襲性乳癌）に比較して結腸腺癌患者においてより高頻度でＡＰＣをダウンレギュレートするＴＴＶ ｍｉＲＮＡを検出した。結果として、ＴＴＶ ｍｉＲＮＡｓは本明細書では結腸癌を予防するための標的を表し、ならびに、これらの癌サブセットの早期検出のための推定バイオマーカーを表す。

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Claims (10)

1. （ａ）表１、２Ａもしくは２Ｂに図示したヌクレオチド配列、
   （ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の同一性を有し、各々ヌクレオチド配列ＣＡＴＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＴである）またはＣＡＵＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＵである）を含有するヌクレオチド配列、
   （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のヌクレオチド配列フラグメントであって、各々ヌクレオチド配列ＣＡＴＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＴである）またはＣＡＵＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＵである）を含有するフラグメント、または、
   （ｄ）ヌクレオチド配列（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）に相補的であるヌクレオチド配列を含むＴＴＶポリ核酸。
2. 請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸の一部を含み、各々ヌクレオチド配列ＣＡＴＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＴである）またはＣＡＵＣＣＹＹ（ＹはＣもしくはＵである）を含有するオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含有する所定のＴＴＶ単離体の核酸を特異的にシークエンシングする、または特異的に増幅させるためのプライマーとして作用できるオリゴヌクレオチドプライマー。
3. 請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含有する所定のＴＴＶ単離体の核酸を特異的に検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして作用できるオリゴヌクレオチドプローブ。
4. 表４に記載のヌクレオチド配列を有する請求項２または３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ。
5. 請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸、請求項２もしくは４に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、または、請求項３もしくは４に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含有するベクター。
6. 請求項５に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
7. 請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸、請求項２もしくは３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、または、請求項３もしくは４に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含有する診断キット。
8. 請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸、請求項２もしくは３に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、または、請求項３もしくは４に記載のオリゴヌクレオチドプローブの癌の将来の発生についての早期マーカーとしての使用。
9. 癌は、結腸直腸癌である請求項８に記載の使用。
10. 癌を予防または治療するための医薬品を開発するための主要成分としての、請求項１に記載のＴＴＶポリ核酸の使用。

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