CN109966496B - miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及miRNA‑5571或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。本发明经研究发现，通过转染miR‑5571或其模拟物，可以有效地抑制结直肠肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。本发明首次发现了miR‑5571对结直肠肿瘤的抑制作用，对降低结直肠肿瘤的死亡率具有重要的意义。

Description

miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体的，涉及miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。

背景技术

结直肠肿瘤是全球最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的发病率和死亡率，已成为严重威胁民众卫生健康的重要公共问题。据2016年中国癌症统计报道，结直肠肿瘤是癌症发病率的前五位，近10年来发病率仍呈上升趋势。尽管近年来肿瘤的诊治技术不断进步，但我国结直肠肿瘤诊治形势仍然十分严峻，结肠癌5年生存率仅为57.6％，直肠癌仅为56.9％，低于邻近东亚国家及欧美国家。大部分I期的结直肠肿瘤患者可以通过手术治愈，但仍有大约30％的进展期结直肠肿瘤患者会发生肿瘤复发转移，发生远处转移的患者5年生存率仅为12.5％，结直肠肿瘤的侵袭转移依旧是威胁结直肠肿瘤患者生存的重要原因。目前，结直肠肿瘤的治疗是以手术为主，辅以放、化疗，其中药物治疗包括化学药物治疗和靶向药物治疗，但是一旦肿瘤细胞产生耐药性，化疗药物就不能发挥完全的抗肿瘤作用杀死肿瘤细胞，即使大多数的肿瘤细胞被杀死，而这一小部分具有抗药性的肿瘤细胞依然会继续生长，造成肿瘤复发，因此肿瘤耐药等问题大大限制了结直肠肿瘤化疗方案的治疗效果。因此寻找新的具有高效抗结直肠肿瘤的药物迫在眉睫。

miRNAs是大小约20-23bp广泛存在于真核生物中的一类内源性的非编码单链小分子RNA，它们通过与靶基因3'端非编码区域结合在转录后水平对基因表达进行调控，从而参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢等过程。miRNAs的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关，并在肿瘤的发生、发展过程中充当着抑癌基因或癌基因的角色。研究表明基于miRNA的基因治疗方法可以作为一种有效的肿瘤治疗手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制结直肠肿瘤发展的miRNA分子药物在制备治疗结直肠肿瘤药物中的应用。

发明人在对结直肠肿瘤的发展研究过程中发现miRNA-5571在结直肠肿瘤细胞中表达显著性低，同时发现过表达miRNA-5571能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本发明的上述目的通过以下的技术手段实现：

一方面，本发明提供了miRNA-5571或其模拟物或其促进剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。

其中，所述的miRNA-5571的任意一个或多个核糖核苷酸被修饰。

其中，所述的miRNA-5571可以是成熟的miRNA(mature miRNA)，也可以是前体RNA(pri-miRNA)或初级转录物(pre-miRNA)。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从几百到几千个碱基不等，带有5'帽子和3'polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。Pri-miRNA经剪切产生约70个碱基的miRNA前体，即pre-miRNA。pre-miRNA为单一发夹结构，5'带有磷酸基团，3'有两个突出碱基，并带有3'羟基。pre-miRNA经进一步剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。

MiR-5571是一个位于22号染色体的miRNA，其前体miRNA为转录本序列为：

>hsa-mir-5571MI0019115：

SEQ ID NO.1

AUCUGACACAAAAUGUGAACCAAGCAAUUCUCAAAGGAGCCUCCCAGGAAAUUCACUUUAGGAAGUCCUAGGAGGCUCCUCUGAGAGUUGCUAAAACAAAACAUUGAGAGUCC。

前体MiR-5571在细胞质中经过Dicer酶识别加工后，最终形成单链miR-5571-5p(SEQ ID NO.2CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC)和miR-5571-3p(SEQ IDNO.3GUCCUAGGAGGCUCCUCUG)，其中miR-5571-3p为无义链被降解，最终生成了miRNA-5571-5p，miRNA-5571-5p的核心序列为GCCUCCC(SEQ ID NO.4)。

作为优选的实施方式，所述的miRNA-5571为成熟的miRNA(mature miRNA)，更具体地，为miR-5571-3p或miR-5571-5p。作为更优选的实施方式，所述的miRNA-5571为miR-5571-5p。

其中，所述的miRNA-模拟物(miRNA mimics)是模拟生物体内源的miRNA，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。具体地，所述的miR-5571模拟物为针对miR-5571的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA，作用与miR-5571的是一样，可以上调细胞内相应miR-5571的含量，增强内源性miR-5571的功能。

作为一种可选的实施方式，本发明采用的miR-5571模拟物含有GCCUCCC(SEQ IDNO.4)和/或其互补序列；作为优选的实施方式，本发明采用的miR-5571模拟物含有CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC(SEQ ID NO.2)和/或其互补序列。

其中，所述的miRNA-5571促进剂为增加miRNA-5571表达量或活性的物质或基因工具。所述增加miRNA-5571的表达量或活性的物质或基因工具，可以是在miRNA-5571正常表达的情况下，进一步增加miRNA-5571表达量或活性；也可以是在miRNA-5571受到抑制时，解除miRNA-5571抑制的物质或物质工具；还可以是遗传物质突变，导致miRNA-5571不能正常表达时，修复miRNA-5571正常表达的物质或者基因工具。总之，那些能够增加miRNA-5571表达量或者提高miRNA-5571活性的物质或者基因工具，无论是通过直接作用的方法，还是间接作用的方式，都可以称为本发明中的miRNA-5571促进剂。

作为一种优选的实施方式，所述的miRNA-5571促进剂为含有miRNA-5571核酸片段的载体；

作为一种更优选的实施方式，所述的含有miRNA-5571片段的表达载体为含有miRNA-5571核酸片段的质粒。

上述的载体或质粒可以转染到需要治疗的细胞中，提高细胞中miRNA-5571的表达量。

另一方面，本发明还提供了一种治疗结直肠肿瘤的药物组合物。所述的药物组合物含有上述的miRNA-5571或其模拟物或其促进剂。

作为优选的实施方式，所述的药物组合物含有miRNA-5571模拟物；作为更优选的实施方式miR-5571模拟物含有GCCUCCC(SEQ ID NO.4)和/或其互补序列；更为优选地，本发明采用的miR-5571模拟物含有CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC(SEQ ID NO.2)和/或其互补序列。

作为优选的实施方式，所述的药物组合物还可以含有化疗剂，以增强miRNA-5571或其模拟物或其促进剂的疗效。

作为优选的实施方式，所述的药物组合物还可以含有药学上可接受的载体。如miRNA-5571模拟物可采用脂质体作为载体，把miRNA导入目标细胞。

所述的药物组合物或药品套装的制剂形式包括但不限于冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂等等。

现有技术中，已有关于miRNA-5571-5P在结直肠癌中下调的报道【Pu Q,Huang Y,Lu Y,et al.Tissue-specific and plasma microRNA profiles could be promisingbiomarkers of histological classification and TNM stage in non-small celllung cancer[J].Thoracic cancer,2016,7(3):348-354.】，然而，miRNA的异常表达(下调或者是上调)的原因很复杂，涉及到miRNA的转录、运转，降解等各个步骤。某些miRNA的下调或上调，只是肿瘤发生发展的伴随现象，而不一定是肿瘤发展的驱动原因，更加不一定就是良好的治疗性靶点。如miRNA-34a-5p被报道在肠癌中高表达【Carcinogenesis,2016,Vol.37,No.3,245–261】，但是功能研究显示过表达却能够抑制结直肠癌细胞株的增殖、迁移和侵袭【miR-34a-5p suppresses colorectal cancer metastasis and predictsrecurrence in patients with stage II/III colorectal cancer】。

本发明则首次发现，在结直肠肿瘤发生发展过程中，可以通过过表达miRNA-5571来抑制结直肠肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，从而发挥抗肿瘤作用，这对于结直肠的治疗具有重要的意义。

附图说明

图1为mimics能够模拟miR-5571-5p在结直肠肿瘤细胞中的表达。其中，(A)为miR-5571-5p mimics转染HCT 116细胞后，Q-PCR检测到miR-5571-5p的表达量上升；(B)为miR-5571-5p mimics转染SW 480细胞后，Q-PCR检测到miR-5571-5p的表达量上升。

图2为miR-5571-5p能够抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。其中，(A)为过表达miR-5571-5p能够抑制HCT 116细胞的增殖能力；(B)为过表达miR-5571-5p能够抑制SW 480细胞的增殖能力。

图3为miR-5571-5p能够抑制结直肠肿瘤细胞的迁移能力。其中，(A)为过表达miR-5571-5p能够抑制HCT 116细胞的迁移能力；(B)为过表达miR-5571-5p能够抑制SW 480细胞的迁移能力。

图4为miR-5571-5p能够抑制结直肠肿瘤细胞的侵袭能力。其中，(A)为过表达miR-5571-5p能够抑制HCT 116细胞的侵袭能力；(B)为过表达miR-5571-5p能够抑制SW 480细胞的侵袭能力。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

本发明中，所述的“互补”可以是完全互补，也可以是部分互补。所述完全互补是指序列完全匹配且不形成粘性末端。所述部分互补是指序列完全匹配，但形成粘性末端。

本发明中的RNA为微小RNA(microRNA，或miRNA)，其是指单链的寡核糖核苷酸。核糖核苷酸是由核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。核糖核苷酸分子由一分子碱基、一分子核糖和磷酸构成。

所述碱基，可以是无修饰碱基，也可以是修饰碱基。其中，所述修饰碱基，是指碱基连接基团包括但不限于NH2、生物素、胺基、低级胺基烷基、低级烷基、NHCOCH₃、乙酰基、2'-氧基-甲基(2'O-Me)、DMTO、荧光素、硫醇或吖啶。

所述核糖，可以是无修饰核糖，也可以是修饰核糖。所述修饰核糖，是指核糖连接基团包括但不限于低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、Cl、Br、CN、OCN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环氨基烷基、氨基烷基、聚氨基烷基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、嵌入剂、用于改善微小RNA的药代动力学性质的基团或用于改善微小RNA的药效学性质的基团，以及具有相似性质的其它取代基。另外的糖取代基包括2'-O-2-甲氧基乙基(2'-OCH₂CH₂OCH₃)、2'-二甲基氨氧基乙氧基[2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₃)₂]、烯丙基(-CH₂-CH═CH₂)、O-烯丙基(-O-CH₂-CH-CH₂)、甲氧基(-O-CH₃₎、氨基丙氧基(-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和氟(F)等。

本发明中，所述“修饰”，是指本发明提供的RNA分子链或其互补链中的核糖和/或碱基连接任何一种或多种基团或其组合。

1)结直肠肿瘤细胞培养

将人结直肠肿瘤细胞HCT 116和SW 480(购买于ATCC，即美国模式培养物保藏所)培养于含有10％FBS的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞汇合度达80％-90％时用0.25％胰酶对细胞进行消化传代。

2)细胞转染：用

RNAiMAX转染试剂将miRNA-5571-5p的模拟物miR-5571-5p mimics和阴性对照NC mimics分别转染HCT 116和SW 480细胞。

1.将生长状态良好的、处于对数生长期的HCT 116和SW 480细胞用胰酶消化后，分别按HCT116细胞每孔3×10⁵个、SW480细胞每孔4×10⁵个的细胞密度种于六孔板，培养在RPMI-1640培养基中，并置于二氧化碳培养箱内培养24小时。

2.培养过夜后，用125μl的Opti-MEM培养液稀释5μl RNAiMAX；用125μl的Opti-MEM培养液稀释1μl mimics。

3.将稀释后的mimics加入稀释后的RNAiMAX中，总体积为250μl，轻轻吹吸3次混匀，室温静置15min，以便形成脂质体复合物。将250μl的脂质体复合物滴加入对应的六孔板中(miRNA模拟物的终浓度为10nM)，左右前后轻柔摇晃培养板，放入培养箱培养过夜。

4.次日，更换培养基，根据需要进行相关功能实验。

实施例1.Q-PCR检测miR-5571-5p的表达水平

用NC/miR-5571-5p mimics分别转染HCT 116细胞和SW 480细胞后，提取RNA，进行加尾逆转，用Q-PCR检测其表达量。本实验中的NC/miR-5571-5pmimics(为双链RNA片段)购自于吉玛基因公司。序列分别为

NC mimics：

SEQ ID NO.5 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'

SEQ ID NO.6 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'

miR-5571-5p mimics:

SEQ ID NO.2 5'-CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC-3'

SEQ ID NO.7 5'-GAGGCUCCUUUGAGAAUUGUU-3'

实验步骤：

1.用Trizol试剂分别收集转染48小时后的HCT 116和SW 480细胞，提取RNA。

2.吸掉孔板中的培养基，用PBS洗2-3遍，尽量去除残留培养基，然后每孔加入1mlTrizol试剂对细胞进行裂解，用移液器不停地吹打均匀至清亮，将裂解液移入1.5ml离心管中，室温放置5min。

3.每管加入200μl氯仿，充分混合，室温静置3min。

4.4℃、12000rpm离心10min，吸取上层水相至另一新的1.5ml离心管中。

5.每管加入0.5ml异丙醇混匀，4℃静置20min。

6.4℃、12000rpm离心20min，弃上清，RNA沉于管底。

7.每管加入0.5ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，轻柔倾斜弃去上清。

8.每管再加入0.5ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，12000rpm离心5min，弃上清。

9.室温倒扣晾干约10min，用适量DEPC水溶解RNA。

10.用超微量生物检测仪检测RNA浓度。

11.用试剂盒Mir-X^TM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR Kit(Takara)逆转录miRNA。

表1配制10ul逆转录反应体系

逆转录反应条件：37℃60min，85℃5min。

12.使用SYBR Green的Real-time PCR法检测miR-5571-5p的表达水平，按照Mir-X^TM miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR Kit(Takara)试剂盒的说明书进行操作。使用ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。

表2配制样本Real-time PCR反应体系

表3配制内参U6Real-time PCR反应体系

Real-time PCR反应条件：预变性95℃30sec；45个循环95℃5sec，60℃30sec；溶解曲线95℃60sec，55℃30sec，95℃30sec。

实验结果：如图1A/图1B所示，qPCR仪器分析出HCT 116miR-5571-5p的Mean C_t值为13.23，SW 480miR-5571-5p的Mean C_t值为11.72，利用相对定量法，计算相对模板量(2^-△△Ct)分别为382830.98(标准差为22150.54)和239126.37(标准差为15421.03)。结果表明，miR-5571-5p mimics转染HCT116和SW 480后细胞中miR-5571-5p表达量显著性上升，证明mimics能够模拟miR-5571-5p的表达。

实施例2.miR-5571-5p抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力

用NC/miR-5571-5p mimics分别转染HCT 116细胞和SW 480细胞后，采用xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统分析细胞增殖能力。

实验步骤：

在E-Plate 16板的孔中加入100μl培养基后，将E-Plate 16板置于RTCA DP仪器上，检测基线，确保所有孔的接触正常(所有孔的Cell Index低于0.063。)。

1.取出E-Plate 16板，将转染后的HCT 116和SW 480细胞消化并接种于E-Plate16板中，HCT 116和SW 480细胞接种量分别为3000个和4000个。

2.将E-Plate 16板置于培养箱中放置30min。

3.将加入细胞的E-Plate 16板置于RTCA DP仪器上，并在培养箱连续观察7天，进行实时动态的细胞增殖检测。

表4RTCA程序设置如下：

实验结果：如图2A/图2B所示，RTCA实时细胞分析系统显示，HCT 116细胞铺板后NC和miR-5571-5p处理细胞分别在132h和180h进入平台期，细胞指数分别为3.14和3.12；SW480细胞铺板后NC和miR-5571-5p处理细胞192h仍未进入平台期，但miR-5571-5p的增殖曲线的细胞指数读值比NC低，细胞指数分别为3.55和2.13。结果表明，miR-5571-5p能够显著性抑制结直肠肿瘤细胞的增殖能力。

实施例3.MiR-5571-5p抑制结直肠肿瘤细胞的迁移能力

用NC/miR-5571-5p mimics分别转染HCT 116细胞和SW 480细胞，采用transwell小室迁移实验验证细胞的迁移能力。

实验步骤：

将转染后的HCT 116和SW 480细胞消化后，用无血清培养基重悬细胞，离心去培养基，再使用无血清培养基重悬细胞，对细胞进行计数，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

1.在transwell板上室分别加入100μl HCT 116和SW 480细胞悬液，将transwell板置于培养箱中静置30min。

2.在transwell板下室加入600μl含10％血清的培养基。

3.将transwell板置于培养箱中培养24h。

4.24h后用甲醛固定细胞，考马斯亮蓝染色观察细胞的迁移穿膜能力。

5.在高倍显微镜下用4X镜观察、拍照并计算膜下表面的细胞面积。每个样本取4个视野进行计数后取均值。

实验结果：如图3A/图3B所示，利用Image-Pro Plus软件分析，取四个视野的细胞面积计数，HCT 116NC和miR-5571-5p面积平均值分别为60532(标准差为9262.193)和18357.25(标准差为7168.031)，SW 480NC和miR-5571-5p面积平均值分别为55785.25(标准差为2697.52)和13483.25(标准差为3781.713)。结果表明，miR-5571-5p mimics能够抑制结直肠肿瘤细胞的迁移能力。

实施例4.MiR-5571-5p抑制结直肠肿瘤细胞的侵袭能力

用NC/miR-5571-5p mimics分别转染HCT 116细胞和SW 480细胞，采用transwell小室侵袭实验验证细胞的侵袭能力。

实验步骤：

1.将转染后的HCT 116和SW 480细胞消化后，用无血清培养基重悬细胞，离心去培养基，再用无血清培养基重悬细胞，对细胞进行计数，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

2.在预先铺好matrigel的transwell板上室分别加入100μl HCT 116和SW480细胞悬液，将transwell板置于培养箱中静置30min。

3.在transwell板下室加入600μl含10％血清的培养基。

4.将transwell板放置于培养箱中培养24h。

5.24h用甲醛固定细胞，考马斯亮蓝染色观察细胞的侵袭穿膜能力。

6.在高倍显微镜下用4X镜观察、拍照并计算膜下表面的细胞面积。每个样本取4个视野进行计数后取均值。

实验结果，如图4A/图4B所示，利用Image-Pro Plus软件分析，取四个视野的细胞面积计数，HCT 116NC和miR-5571-5p面积平均值分别为52418(标准差为1800.134)和25119(标准差为1876.347)，SW 480NC和miR-5571-5p面积平均值分别为15422(标准差为1095.931)和8614.25(标准差为1799.018)。结果表明，miR-5571-5p mimics能够抑制结直肠肿瘤细胞的侵袭能力。

序列表

<110> 中山大学

中山大学附属第六医院

<120> miRNA-5571在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> RNA

<213> homo

<400> 1

aucugacaca aaaugugaac caagcaauuc ucaaaggagc cucccaggaa auucacuuua 60

ggaaguccua ggaggcuccu cugagaguug cuaaaacaaa acauugagag uc 112

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> homo

<400> 2

caauucucaa aggagccucc c 21

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> homo

<400> 3

guccuaggag gcuccucug 19

<210> 4

<211> 7

<212> RNA

<213> homo

<400> 4

gccuccc 7

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> homo

<400> 9

gaggcuccuu ugagaauugu u 21

Claims (5)

1.miRNA-5571模拟物在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用；

所述的miRNA-5571模拟物为双链RNA片段，序列分别为：SEQ ID NO.2 ：CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC和SEQ ID NO.7 ： GAGGCUCCUUUGAGAAUUGUU。

2.一种治疗结直肠肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含miRNA-5571模拟物；所述的miRNA-5571模拟物为双链RNA片段，序列分别为SEQ ID NO.2 ： CAAUUCUCAAAGGAGCCUCCC和SEQ ID NO.7 ：GAGGCUCCUUUGAGAAUUGUU。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有化疗剂。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括药学上可接受的载体。

5.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的制剂形式为注射剂、片剂、胶囊或贴剂。

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