CN111789957B - 敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了敲低lncBCAS1‑4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域。为了评价lncBCAS1‑4_1是否影响活性维生素D的抗肿瘤作用，本发明使用1α,25(OH)2D3处理lncBCAS1‑4_1功能缺乏和获得的肿瘤细胞模型。CCK‑8和平板克隆实验、划痕实验以及Transwell实验说明，减少lncBCAS1‑4_1明显促进活性维生素D的抗肿瘤作用，过表达lncBCAS1‑4_1显著抵抗活性维生素D的抗肿瘤作用。

Description

敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤 药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类生命健康最危险的疾病之一，在全球范围内，肿瘤已成为第二大死因，每年因患肿瘤死亡的人数大大超过了人类免疫缺陷病毒/后天免疫缺陷综合症，结核病和疟疾的总和。根据2018年国际癌症研究机构的统计，全球肿瘤发病率和死亡率明显增高，其中新增病例和死亡病例分别高达1810万和960万。肺癌是所有癌症中发病率和死亡率最高的。由于发病区域差异以及肿瘤分期的不同，肺癌病人的5年存活率仅在4％-17％之间。而卵巢癌作为女性特异性癌症，虽然发病率不是最高，但是其病死率却是各类妇科肿瘤的首位。尽管针对肿瘤治疗手段包括手术、放疗与化疗等的研究已经取得了很大的进展，但是，在肿瘤患者的治疗过程中仍然存在许多问题。例如，肺癌患者的总生存时间并没有得到显著的改善，肺癌晚期出现转移灶；卵巢癌患者前期难诊断、病情进展迅速、扩散快、复发率高、预后差等。
长链非编码RNAs(longnon-codingRNAs，lncRNAs)是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA，不具有编码蛋白质的能力。起初，它们被认定为“转录噪音”，不具有生物功能，但是，随着RNA测序技术的发展，科学家们发现lncRNAs能够参与多种生理和病理过程。
维生素D是一种脂溶性维生素，是维持人类生命所必须的营养素，可通过膳食或者阳光照射获得。维生素D3本身并不具有生理功能，它在体内需经过两次羟基化反应，生成具有活性的1α,25二羟基维生素D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3，1α,25(OH)2D3]才能发挥作用。
因此，提供敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
lncBCAS1-4_1作为分子标靶与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，敲低lncBCAS1-4_1与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，所述lncBCAS1-4_1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用，为了评价lncBCAS1-4_1是否影响活性维生素D的抗肿瘤作用，本发明使用1α,25(OH)2D3处理lncBCAS1-4_1功能缺乏和获得的肿瘤细胞模型。与1α,25(OH)2D3未处理的无意义序列阴性对照组相比，1α,25(OH)2D3显著抑制肿瘤细胞的存活和增殖、迁移以及侵袭能力；与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列阴性对照组相比较，减少lncBCAS1-4_1可以进一步降低肿瘤细胞的存活和增殖、迁移以及侵袭能力。反之，与1α,25(OH)2D3未处理的空载体阴性对照组相比，1α,25(OH)2D3显著抑制肿瘤细胞的存活和增殖、迁移以及侵袭能力；与1α,25(OH)2D3处理的空载体阴性对照组相比较，lncBCAS1-4_1的过表达明显抵抗了1α,25(OH)2D3对肿瘤细胞存活和增殖、迁移以及侵袭能力的抑制作用。以上实验结果说明，减少lncBCAS1-4_1明显促进活性维生素D的抗肿瘤作用，过表达lncBCAS1-4_1显著抵抗活性维生素D的抗肿瘤作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明3’RACE实验确认lncBCAS1-4_1的全长；
图2附图为本发明不同的siRNAs对A549细胞内lncBCAS1-4_1的干扰效率；*，p<0.05，***，p<0.001；
图3附图为本发明不同的siRNAs对OVCAR-8细胞内lncBCAS1-4_1的干扰效率；*，p<0.05，***，p<0.001；
图4附图为本发明GV315载体图谱；
图5附图为本发明腺病毒对Calu-1细胞内lncBCAS1-4_1的过表达水平；*，p<0.05；
图6附图为本发明腺病毒对SKOV-3细胞内lncBCAS1-4_1的过表达水平；****，p<0.0001；
图7附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制A549细胞的存活能力的影响；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；
图8附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制OVCAR-8细胞的存活能力的影响；**，p<0.01；***，p<0.001；
图9附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制A549细胞的增殖能力的影响的平板克隆直观图；
图10附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制A549细胞的增殖能力的影响的定量图；*，p<0.05；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图11附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制OVCAR-8细胞的增殖能力的影响的平板克隆直观图；
图12附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制OVCAR-8细胞的增殖能力的影响的定量图；**，p<0.01；***，p<0.001；
图13附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制A549细胞迁移率影响的划痕实验直观图；
图14附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制A549细胞迁移率影响的定量图；*，p<0.05；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图15附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制OVCAR-8细胞迁移率影响的划痕实验直观图；
图16附图为本发明敲低lncBCAS1-4_1对活性维生素D抑制OVCAR-8细胞迁移率影响的定量图；****，p<0.0001；
图17附图为本发明lncBCAS1-4_1敲低和活性维生素D共同处理对A549细胞侵袭能力影响的直观图；
图18附图为本发明lncBCAS1-4_1敲低和活性维生素D共同处理对A549细胞侵袭能力影响的定量图；*，p<0.05；****，p<0.0001；
图19附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的Calu-1细胞存活能力的影响；**，p<0.01；***，p<0.001；
图20附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的SKOV-3细胞存活能力的影响；**，p<0.01；
图21附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的Calu-1细胞增殖能力影响D的平板克隆直观图；
图22附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的Calu-1细胞增殖能力影响D的定量图；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图23附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的SKOV-3细胞增殖能力影响的平板克隆直观图；
图24附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的SKOV-3细胞增殖能力影响的定量图；**，p<0.01；***，p<0.001；
图25附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的Calu-1细胞迁移能力影响的划痕实验直观图；
图26附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的Calu-1细胞迁移能力影响的定量图；**，p<0.01；
图27附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的SKOV-3细胞迁移能力影响的划痕实验直观图；
图28附图为本发明过表达lncBCAS1-4_1对活性维生素D处理的SKOV-3细胞迁移能力影响的定量图；*，p<0.05；**，p<0.01；
图29附图为本发明lncBCAS1-4_1过表达和维生素D共同处理对SKOV-3细胞侵袭能力影响的直观图；
图30附图为本发明lncBCAS1-4_1过表达和维生素D共同处理对SKOV-3细胞侵袭能力影响的定量图；*，p<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)：GIBCO，美国；RPMI-1640培养基：Hyclone，美国；青霉素-链霉素：碧云天，中国；0.25％含EDTA胰酶细胞消化液：碧云天，中国；二甲亚砜(DMSO)：生工，中国；DEPC水：碧云天，中国；RNA提取液Trizol：Life Technologies，美国；逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT MasterMix)：TaKaRa，日本；MonAmpTMChemoHS qPCR Mix(Low Rox)：莫纳生物，中国；Real-time PCR引物：南京金斯瑞生物科技有限公司，中国；无水乙醇：永华化学股份有限公司，中国；活性维生素D(1α,25(OH)2D3)：Sigma，美国；3’-FullRACE Core Set with PrimeScriptTM RTase：TaKaRa，日本。A549细胞、OVCAR-8细胞、Calu-1细胞、SKOV-3细胞均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。
实施例1
lncBCAS1-4_1位于染色体20q13.2，全长380nt(52781087to52779119，Genomeassembly:hg19)，属于内含子非编码RNA，其序列如下：
GGGAGGATGATGGTCACTCCAGTCGAGCTGCACAAGAGCCTCAACACCAAGGTCTGGCAGGACCACACTCTGGCCTGGGACACCATTTTCAAATCAGTCAAAGCTTGTATCGACAACCGGTTAGAGAAGTATTCTCAGCAGCCTAGTGCAGATTTCCTTTGTGACATTTATCACCAGAATCGGCTTTCAAAGAAAGAATTGTATGCTGCTGTCACAGAGCTCCAGCTGGCTGCGGTGGAAACGGTAAGGGTGGGCTGGATTTGAGTTTGCTAAATGAACGGTCTGTACCATTTTTAGATGACAGATTTTAAATAGTAATTCATCTCATTCATTTCACTGGGATTCACTAGCATCAACTCCACAAAAATGAAAAGTCTCAT；SEQ ID NO.1。
lncBCAS1-4_1包含两个外显子，Exon1在52780991-52781087之间，Exon2在52779119-52779401之间，利用CPC预测得分为2.19985，提示lncBCAS1-4_1可能具有编码能力，可能编码85个氨基酸，氨基酸序列如下：
MMVTPVELHKSLNTKVWQDHTLAWDTIFKSVKACIDNRLEKYSQQPSADFLCDIYHQNRLSKKELYAAVTELQLAAVETVRVGWI；SEQ ID NO.2。
为了验证lncBCAS1-4_1的全长及其是否具备成为lncRNAs的特点--3’端polyA尾，本发明用100nM的1α,25(OH)2D3处理卵巢癌细胞SKOV-3以富集lncBCAS1-4_1，并利用3’RACE实验对其全长进行扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳实验证实，它能从3’端进行扩增并且长度与预测结果一致，见图1。说明lncBCAS1-4_1具有polyA尾，的确是一条长链非编码RNA。
为了明确lncBCAS1-4_1在细胞内的亚定位，本发明使用核质分离实验确定lncBCAS1-4_1的细胞内分布情况。实验发现，在SKOV-3细胞中，lncBCAS1-4_1主要分布于细胞核；而在A549细胞中，lncBCAS1-4_1在细胞核与细胞质均有分布。当使用活性维生素D处理后，lncBCAS1-4_1在两种细胞内的分布都以细胞核为主。以上实验结果说明，lncBCAS1-4_1在细胞内的定位具有细胞特异性，但是活性维生素D处理后以细胞核分布为主。
实施例2细胞培养
(1)细胞培养条件
A549和OVCAR-8细胞用含有10％FBS不含双抗的RPMI-1640培养液培养。Calu-1和SKOV-3细胞用含有10％FBS和1％青霉素及链霉素的RPMI-1640培养液培养。所有细胞均置于温度为37℃，体积分数为5％的CO2的无菌培养环境中。
(2)细胞换液
预热培养基与PBS至室温，将培养皿置于超净台内，弃去原培养基，加入1ml PBS，轻轻晃动培养皿后弃去。PBS清洗三次后，加入5ml新鲜培养基于直径为60mm的培养皿中，放入培养箱中继续培养。每种细胞单独进行换液以避免细胞之间的交叉污染。
(3)细胞传代
当细胞融合度至80％-90％时，预热培养基、PBS和胰酶至室温，弃去原培养基，加入1ml PBS，轻轻晃动培养皿后弃去，PBS清洗三次后加入1ml胰酶。晃动培养皿使胰酶均匀覆盖至全部细胞后，吸去剩余胰酶，室温消化至细胞呈圆形白色亮点，加入1ml培养基终止其消化。放入低速离心机，1000rpm/min离心5min后，吸去上清，加入1ml新鲜培养基重悬细胞，按照1:4的比例传代，放入培养箱中培养。每种细胞单独进行传代以避免细胞之间的交叉污染。
(4)细胞复苏
预热水浴锅至37℃以及培养基至室温。从-80℃冰箱取出冻存的细胞，迅速放入水浴锅中，快速晃动直至融化。放入低速离心机，1000rpm/min离心5min后，弃去上清，加入新鲜培养基重悬细胞，吹打混匀悬液后接种于含有4ml新鲜培养基的直径为60mm的培养皿内。混匀后放入培养箱内培养。
(5)细胞冻存
收集消化并重悬好的细胞悬液，计数并调整细胞至适宜浓度，按照900μl细胞悬液：100μl DMSO的比例，将二者混匀后加入冻存管中，并再冻存管上标记冻存日期、细胞名称和细胞代数。细胞冻存依照梯度降温的程序冻存，程序为：4℃20min，-20℃2h，-80℃长期冻存。
(6)细胞计数
取10μl细胞悬液于EP管中，再加入10μl台盼蓝细胞活性染料，吹打混匀后，取10μl混合液于细胞计数板中，放入细胞计数器，得出每毫升细胞数目。每次计数将活细胞数目占总细胞数目的90％以上视为有效。
实施例3siRNAs转染
(1)针对lncBCAS1-4_1的沉默，设计了三条干扰序列，分别为si-BCAS1，si-BCAS2和si-BCAS3。
采用广州锐博生物科技有限公司研发的siRNAs冻干粉及riboFECTTMCP转染试剂。瞬时离心siRNAs冻干粉后用DEPC水溶解，配制成浓度为20μM的储存液并分装，冻存于-20℃。针对lncBCAS1-4_1设计了三条干扰序列，分别是si-BCAS1(GCTAAATGAACGGTCTGTA；SEQID NO.3)、si-BCAS2(GCTGCGGTGGAAACGGTAA；SEQ ID NO.4)、si-BCAS3(GGATTCACTAGCATCAACT；SEQ ID NO.5)。riboFECTTMCP转染试剂包含riboFECTTMCP Buffer(10×)和riboFECTTMCP Reagent两种试剂。其中，riboFECTTMCP Buffer(10×)使用前需用PBS稀释为1×，现配现用。
取细胞融合度为80％，处于对数生长期的A549/OVCAR-8细胞进行消化，加入2ml无双抗培养基终止消化并计数。以6孔板为例，接种1.5×105个细胞于不同的培养皿/板中，当细胞贴壁且融合度达30％-50％时，进行转染。每孔转染方法为：①用120μl riboFECTTMCPBuffer(1×)稀释5μl 20μM的siRNAs，轻轻混匀；②加入12μl riboFECTTMCP Reagent至①中，轻轻吹打混匀，室温孵育10-15min，制成转染复合物；③向转染复合物中加入1863μl无双抗培养基，轻轻吹打混匀，从而稀释siRNAs至使用浓度50nM，形成2ml转染体系；④弃去6孔板中旧培养基，加入混合液③；⑤将6孔板放入培养箱培养24h，弃去含有转染复合物的培养基，换入无双抗的新鲜培养基继续培养细胞。不同规格的培养皿/板按照培养皿/板的面积成倍增加或减少siRNAs以及转染试剂的用量。
(2)提取RNA
从培养箱中取出待抽提RNA的细胞，弃去培养基，PBS清洗三次。根据不同规格的培养皿/板加入不同量的Trizol。于冰上裂解细胞5min，收集裂解后的液体于1.5ml EP管中，按照Trizol:氯仿＝1:0.2的比例加入氯仿，上下颠倒混匀数次。静置5min，4℃，15000rpm，离心15min后，吸取上层水相即RNA于新EP管中，按照Trizol:异丙醇＝1:0.5的比例加入异丙醇以沉淀RNA，上下颠倒混匀数次，静置10min，4℃，15000rpm，离心15min。取出EP管，弃去上层液体，加入1ml冰乙醇清洗RNA沉淀，轻轻晃动，放入离心机，4℃，7500rpm，离心5min并弃去上清，重复清洗三次。室温干燥RNA沉淀5min后，根据沉淀量加入适宜的DEPC水溶解沉淀，充分溶解后于-80℃保存。使用Nano Drop检测RNA浓度和质量。当OD260/OD280在1.8-2.0之间时，RNA可用于后续实验。
(3)逆转录RNA(RT-PCR)
取出TaKaRa逆转录试剂盒和RNA样品于冰上融化，瞬时离心后吹打混匀。制备逆转录体系：5×PrimeScript RT MasterMix 2μl，RNA 1000ng，RNase Free dH2O补加至10μl。逆转录程序为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，冷却。逆转录的产物为cDNA，-20℃冷冻保存。
(4)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
取出SYBR Green试剂盒、cDNA样品和引物于冰上融化，瞬时离心后吹打混匀。制备扩增体系：MonAmpTM SYBRGreen qPCR Mix 10μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，cDNA模板200ng，Nuclease-Free Water补加至20μl。
GAPDH的引物序列如下：
正向引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’；SEQ ID NO.6；
反向引物：5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’；SEQ ID NO.7；
LncBCAS1-4_1(针对三条干扰序列)的引物序列如下：
正向引物：5’-GGTAAGGGTGGGCTGGATTT-3’；SEQ ID NO.8；
反向引物：5’-TGGAGTTGATGCTAGTGAATCCC-3’；SEQ ID NO.9。
扩增反应程序为：95℃，10min；95℃，10s；60℃，20s；72℃，30s；共40个循环。检测基因的转录水平表达以GAPDH为内参，按照相对定量(2－ΔΔCT)的方法进行分析。
Real-time PCR结果显示，与无意义序列(不会对lncBCAS1-4_1基因产生影响)对照组相比，干扰序列si-BCAS1和si-BCAS3可以显著减少OVCAR-8和A549细胞lncBCAS1-4_1的表达水平(图2和图3)，而si-BCAS2则不能沉默lncBCAS1-4_1的表达。因此，后续实验使用si-BCAS1和si-BCAS3减少lncBCAS1-4_1的表达。上述实验结果表明，lncBCAS1-4_1敲低的细胞模型建立成功。
实施例4过表达腺病毒的转染
本发明使用的腺病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。构建过程如下：利用限制性内切酶Age I/Nhe I消化载体GV315(载体图谱见图4)，获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段lncBCAS1-4_1，使得扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。
其中，引物序列如下：
lncBCAS1-4_1-F：5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTGGGAGGATGATGGTCACTCCAG-3’；SEQID NO.10；
lncBCAS1-4_1-R：5’-ACATTCCACAGTTAGCTAGCATGAGACTTTTCATTTTTGTGG-3’；SEQID NO.11。
以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接转化入感受态细胞，随后挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒抽提，获得高纯度质粒GV315-lncBCAS1-4_1，用于下游病毒包装。吉凯采用Frank L.Graham教授建立的AdMax腺病毒包装系统进行腺病毒包装，将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组(E1/E3缺失)的辅助包装质粒共转染HEK293细胞，利用Cre-loxP(或FLP/frt)重组酶切割系统，即可产生携带外源基因的非复制型重组腺病毒。转染过程为：取细胞融合度为80％，处于对数生长期的Calu-1/SKOV-3细胞进行消化并计数，以6孔板为例，接种1×105个细胞，当细胞贴壁且融合度达30％-50％时，进行转染。转染方法为：①取出冻存于-80℃的腺病毒于冰上融化，按照MOI值为20确定每孔病毒量；②将所需病毒加入至2ml新鲜培养基中，轻轻吹打混匀；③弃去6孔板内旧培养基，换入含有腺病毒的培养基，放入培养箱中培养；④培养24h后，弃去含有腺病毒的培养基，加入新鲜培养基，继续培养。所需病毒体积＝(每个细胞所需的病毒数×细胞总数)/病毒滴度。
提取RNA、逆转录RNA、实时荧光定量PCR的操作步骤同实施例3。Real-time PCR结果显示，与空载体阴性对照组相比，Calu-1和SKOV-3细胞内lncBCAS1-4_1的表达水平分别升高了12.83倍和1044.33倍(图5和图6)。上述实验结果表明，lncBCAS1-4_1过表达的细胞模型建立成功。
注：1α,25(OH)2D3的使用：1α,25(OH)2D3溶解于无水乙醇并避光储存于-80℃，使用时需全程避光。本发明使用的1α,25(OH)2D3储存液浓度为1×10-5mol/L，工作浓度为1×10- 7mol/L(即100nM)。以6孔板为例，使用时，在避光条件下将20μl浓度为1×10-5mol/L的1α,25(OH)2D3加入1980μl新鲜培养基中，吹打混匀，制成浓度为1×10-7mol/L的1α,25(OH)2D3。弃去孔板内的旧培养基后，加入混合液，放入培养箱培养，每隔24h需重新换上浓度为100nM的1α,25(OH)2D3。对照组则加入同等体积的无水乙醇于培养基中。
实施例5细胞生物学效应
细胞生物学效应实验采用肺癌A549和Calu-1细胞、以及卵巢癌OVCAR-8和SKOV-3细胞进行转染，并设置转染与1α,25(OH)2D3共同处理组，1α,25(OH)2D3在转染时稀释于培养基中，工作浓度为100nM。不进行1α,25(OH)2D3处理的组，则按照同样的方法加入同体积的无水乙醇。其中A549和OVCAR-8细胞使用siRNAs进行敲低转染，实验分组为NC组、si-BCAS1组、si-BCAS3组、NC+VD组、si-BCAS1+VD组、si-BCAS3+VD组。Calu-1和SKOV-3细胞使用腺病毒进行过表达转染，实验分组为NC组，OE组、NC+VD组，OE+VD组。
(1)CCK-8实验：取对数生长期的细胞消化后计数，按照A549/OVCAR-8细胞3×103个/孔，Calu-1/SKOV-3细胞2.5×103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μl培养基。96孔板四周每孔加入100μl培养基以防止过度挥发影响细胞生长，轻震孔板后放入培养箱培养。24h后，取出96孔板，弃去原有培养基，根据实验分组，转染细胞后，放入培养箱继续培养。每隔24h进行换液，处理72h后，吸弃旧培养基，每孔加入10μl CCK-8试剂和100μl培养基，放入培养箱孵育1h后，使用酶标仪在450nm及630nm处检测每孔的吸光度值。细胞相对活力＝(A处理/450-A处理/630)/(A对照/450-A对照/630)。其中，450nm为CCK-8试剂最大吸收波长，630nm为CCK-8试剂最小吸收波长。
(2)细胞增殖实验
取对数生长期的细胞消化后计数，按照A549/OVCAR-8细胞3×104个/孔，Calu-1/SKOV-3细胞2.5×104个/孔的密度接种于6孔板中，每孔2ml培养基。待细胞贴壁后，取出6孔板，弃去旧培养基，用siRNAs转染A549/OVCAR-8细胞，腺病毒转染Calu-1/SKOV-3细胞，放入培养箱中继续培养。孔板每隔24h进行换液，72h后，取出孔板，吸弃旧培养基。PBS清洗三遍后，用75％的乙醇固定细胞10-15min，弃去乙醇，继续用甲基紫染色15-20min后，弃去甲基紫，流水清洗孔板至无紫色出现，倒扣孔板，室温干燥。接着，每孔加入400μl33％的乙酸并置于摇床晃动5-10min，以促进甲基紫的溶解。将充分溶解且混匀的溶液按100μl/孔加入96孔板中，平行3个复孔，空白对照组为33％的乙酸。最后，使用酶标仪在585nm处测定吸光度值。细胞增殖比例＝(A处理-A空白)/(A对照-A空白)。
(3)细胞迁移实验
取对数生长期的细胞消化后计数，按照A549/OVCAR-8细胞2×105个/孔，Calu-1/SKOV-3细胞1.5×105个/孔的密度接种于6孔板中，每孔2ml完全培养基，放入培养箱培养。24h后，弃去旧培养基，A549/OVCAR-8细胞加入含有1％FBS的无双抗培养基饥饿细胞6h，Calu-1/SKOV-3细胞加入含有1％FBS的含双抗培养基饥饿6h。饥饿结束后，用200μl的枪头在6孔板底部划一道笔直的无细胞区域，吸弃孔内培养基，PBS清洗三遍后，按照siRNAs和腺病毒的转染方法，分别处理细胞，并用显微镜拍摄划痕区域，每孔拍摄三个视野，放入培养箱继续培养。细胞每隔24h进行拍摄并换液，直至细胞划痕区域接近愈合。划痕区域的宽度用ImageJ进行统计，每张图片统计三次。细胞迁移率(％)＝(不同时间点的划痕宽度-初始划痕宽度)/初始划痕宽度×100％。
(4)细胞侵袭实验
取对数生长期的细胞，消化后计数，按照A549细胞1×105个/孔，SKOV-3细胞1.5×105个/孔的密度接种于直径为60mm的培养皿中，每皿5ml培养基，放入培养箱中培养。待细胞贴壁后，弃去原有培养基，按照实验分组，进行siRNAs和腺病毒的转染，继续培养。细胞每隔24h换液，72h后进行侵袭实验。
侵袭实验前4个小时，将置于冰上融化的Matrixgel与无血清培养基按照1:8的比例稀释，用预冷的枪头吹打混匀。将所需Transwell小室(孔径为8μm)放入24孔板内，每个小室的上室加入60μl混合液，加入时避免气泡的产生，随后放入培养箱使胶凝固3-4h。实验前2h，取出培养皿，换上无血清培养基进行饥饿。饥饿2h后，吸弃培养皿内的培养基，PBS清洗三遍，消化细胞，无血清培养基重悬细胞后计数。调整各组细胞浓度为3×105个/ml，取出24孔板，每个上室加入100μl该细胞悬液，下室则加入600μl含10％FBS的培养基，放入培养箱。小室底部聚碳酸酯膜上下应避免气泡产生。
培养24h后，取出24孔板，吸弃上室和下室的培养液，PBS清洗上下室三遍，下室加入75％的乙醇固定20min。随后，吸弃乙醇，倒扣小室待乙醇挥发，再用甲基紫染色20min。PBS清洗3遍后，擦去上室细胞，倒扣小室室温晾干。在显微镜下拍摄染色细胞图片，并用ImageJ进行细胞数的统计。相对侵袭比例＝处理组侵袭的细胞数/对照组侵袭的细胞数。
(5)统计学方法
使用GraphPad Prism8进行数据的统计分析，结果用(平均值±标准差)表示。两组之间进行比较时，当数据符合正态分布且方差齐时，使用T检验；当数据符合正态分布而方差不齐时，使用校正后的T检验；当数据不符合正态分布时则使用非参数法Wiloxcon秩和检验。当多组之间比较时，数据先用方差分析，而后采用SNK法进行两两比较。当p<0.5时，被认定具有统计学意义。
(一)敲低lncBCAS1-4_1增强活性维生素D的抗肿瘤作用
(1)敲低lncBCAS1-4_1增强活性维生素D对肿瘤细胞增殖能力的抑制作用
使用siRNAs和1α,25(OH)2D3联合处理肿瘤细胞72h，通过CCK-8实验和平板克隆实验检测肿瘤细胞增殖能力，评价lncBCAS1-4_1是否影响1α,25(OH)2D3抑制肿瘤细胞增殖能力的作用。图7显示，与1α,25(OH)2D3未处理的无意义序列对照组相比较，1α,25(OH)2D3显著降低了肺癌A549细胞的存活能力达51.9％；与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列对照组相比较，si-BCAS1和si-BCAS3使细胞存活能力分别进一步减少了13.9％和22.2％。同样地，在卵巢癌OVCAR-8细胞中，与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列对照组相比较，lncBCAS-4_1的敲低使得卵巢癌细胞的存活能力进一步降低(图8)。平板克隆实验也表明，lncBCAS1-4_1的减少和1α,25(OH)2D3的共同处理可以进一步降低1α,25(OH)2D3对A549和OVCAR-8细胞的增殖(图9-图12)。以上实验结果表明，lncBCAS1-4_1的减少显著促进活性维生素D对肿瘤细胞增殖能力的抑制作用。
(2)敲低lncBCAS1-4_1增强活性维生素D对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用
图13和图14划痕实验结果表明，与1α,25(OH)2D3未处理的无意义序列对照组相比，100nM的1α,25(OH)2D3处理肿瘤细胞72h显著抑制细胞的迁移能力；与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列对照组相比，当使用1α,25(OH)2D3处理的同时减少lncBCAS1-4_1表达时，si-BCAS1和si-BCAS3两条序列分别使肺癌A549细胞的迁移率进一步降低11.75％和17.59％。图15和图16显示，与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列对照组相比较，1α,25(OH)2D3和敲低的联合处理进一步降低了卵巢癌OVCAR-8细胞的迁移率。以上实验结果表明，lncBCAS1-4_1的减少明显促进活性维生素D对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用。
(3)敲低lncBCAS1-4_1增强活性维生素D对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用
如图17-18所示，与1α,25(OH)2D3未处理的无意义序列对照组相比较，1α,25(OH)2D3处理A549细胞后，细胞的侵袭能力明显减弱，说明1α,25(OH)2D3可以抑制肺癌细胞的侵袭能力。因此，为了研究lncBCAS1-4_1是否能够促进1α,25(OH)2D3对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用，进一步使用lncBCAS1-4_1敲低和1α,25(OH)2D3共同处理的细胞进行Transwell实验，结果显示，与1α,25(OH)2D3处理的无意义序列对照组相比，敲低lncBCAS1-4_1和1α,25(OH)2D3的处理使A549细胞侵袭的细胞数目进一步减少。这表明，敲低lncBCAS1-4_1显著增强活性维生素D对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。
(二)过表达lncBCAS1-4_1抵抗活性维生素D的抗肿瘤作用
(1)过表达lncBCAS1-4_1抵抗活性维生素D对肿瘤细胞增殖能力的抑制作用
为了确认lncBCAS1-4_1在1α,25(OH)2D3抗肿瘤作用中的功能，采用功能获得型细胞模型进行验证。图19和图20发现，与1α,25(OH)2D3未处理的空载体阴性对照组相比，1α,25(OH)2D3的处理显著降低了肺癌Calu-1和卵巢癌SKOV-3细胞的存活能力；当过表达lncBCAS1-4_1和活性维生素D联合处理时，与1α,25(OH)2D3处理的空载体阴性对照组相比，过表达lncBCAS1-4_1使1α,25(OH)2D3抑制Calu-1和SKOV-3细胞的存活能力分别上升了70％和51％。平板克隆实验也表明，与活性维生素D处理的空载体阴性对照组的相比，lncBCAS1-4_1的过表达使1α,25(OH)2D3抑制Calu-1和SKOV-3细胞的增殖能力显著增强(图21-图24)。以上实验结果表明，lncBCAS1-4_1的过表达显著抵抗活性维生素D对肿瘤细胞增殖能力的抑制作用。
(2)过表达lncBCAS1-4_1抵抗活性维生素D对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用
划痕实验结果表明(图25-图28)，1α,25(OH)2D3可以降低Calu-1和SKOV-3细胞的迁移能力；当使用1α,25(OH)2D3的同时过表达lncBCAS1-4_1，可以使1α,25(OH)2D3抑制的Calu-1细胞的迁移率回升19.9％。与1α,25(OH)2D3处理的空载体阴性组相比，1α,25(OH)2D3和过表达lncBCAS1-4_1的联合处理使SKOV-3细胞的划痕愈合能力增强，迁移率上升了24.5％。以上实验结果表明，过表达lncBCAS1-4_1明显抵抗活性维生素D对肿瘤细胞迁移能力的抑制作用。
(3)过表达lncBCAS1-4_1抵抗活性维生素D对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用
图29-图30表明，1α,25(OH)2D3可以显著抑制细胞的侵袭能力，与1α,25(OH)2D3处理的空载体阴性对照组相比较，过表达lncBCAS1-4_1使1α,25(OH)2D3抑制的SKOV-3细胞侵袭的细胞数目明显增多。实验结果提示，过表达lncBCAS1-4_1显著抵抗活性维生素D对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 敲低lncBCAS1-4_1细胞株与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gggaggatga tggtcactcc agtcgagctg cacaagagcc tcaacaccaa ggtctggcag 60
gaccacactc tggcctggga caccattttc aaatcagtca aagcttgtat cgacaaccgg 120
ttagagaagt attctcagca gcctagtgca gatttccttt gtgacattta tcaccagaat 180
cggctttcaa agaaagaatt gtatgctgct gtcacagagc tccagctggc tgcggtggaa 240
acggtaaggg tgggctggat ttgagtttgc taaatgaacg gtctgtacca tttttagatg 300
acagatttta aatagtaatt catctcattc atttcactgg gattcactag catcaactcc 360
acaaaaatga aaagtctcat 380
<210> 2
<211> 85
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Met Val Thr Pro Val Glu Leu His Lys Ser Leu Asn Thr Lys Val
1 5 10 15
Trp Gln Asp His Thr Leu Ala Trp Asp Thr Ile Phe Lys Ser Val Lys
20 25 30
Ala Cys Ile Asp Asn Arg Leu Glu Lys Tyr Ser Gln Gln Pro Ser Ala
35 40 45
Asp Phe Leu Cys Asp Ile Tyr His Gln Asn Arg Leu Ser Lys Lys Glu
50 55 60
Leu Tyr Ala Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Ala Ala Val Glu Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Gly Trp Ile
85
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctaaatgaa cggtctgta 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gctgcggtgg aaacggtaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggattcacta gcatcaact 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agccacatcg ctcagacac 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcccaatacg accaaatcc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ggtaagggtg ggctggattt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tggagttgat gctagtgaat ccc 23
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gaggatcccc gggtaccggt gggaggatga tggtcactcc ag 42
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
acattccaca gttagctagc atgagacttt tcatttttgt gg 42

Claims (2)

1.敲低lncBCAS1-4_1的siRNAs与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述lncBCAS1-4_1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述siRNAs为si-BCAS1和si-BCAS3；所述si-BCAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述si-BCAS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的敲低lncBCAS1-4_1的siRNAs与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，敲低lncBCAS1-4_1细胞株的siRNAs与活性维生素D联用在制备抗肿瘤药物中的应用。
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