CN105087463A

CN105087463A - 维生素d的新应用

Info

Publication number: CN105087463A
Application number: CN201510495988.8A
Authority: CN
Inventors: 李冰燕; 王萍; 张鹤美; 张增利; 刘利芝; 侯永凤; 胡志勇
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2015-08-13
Filing date: 2015-08-13
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明涉及一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，通过每次传代以及每次更换培养基后添加活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)，以达到减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的目的；本发明还提供维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，通过长期使用低剂量的维生素D、25–羟维生素D或活性维生素D，可以有效减弱卵巢表面上皮细胞在裸鼠体内的致瘤能力。

Description

维生素D的新应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及维生素D的新应用。

背景技术

中国癌症协会2015年2月15日发布的新数据表明，仅2011年，中国卵巢癌发病人数与死亡人数分别为45,223和18,430人。卵巢表面上皮细胞(OvarianSurfaceEpithelialCell,OSEC)是包被在卵巢表面的一层立方-长方形细胞，位于卵巢韧带和腹膜间皮之间，起源于苗勒氏系统。在卵巢排卵后，起到修复卵巢表面破溃的作用。

按照起源，卵巢癌主要分为三种：1上皮-间质性；2性索-间质性；3生殖细胞肿瘤。目前研究认为，上皮性肿瘤约占所有卵巢肿瘤的60％，其中大约90％的恶性卵巢肿瘤被认为起源于正常的卵巢表面上皮(OvarianSurfaceEpitheliaOSE)细胞。卵巢表面上皮的恶性转化的原因基本可以分为三类，炎症因子的刺激、持续的促性腺激素刺激和持续不断的排卵。如果卵巢表面上皮细胞覆盖在一个不排卵的卵巢上面时它就会处在一个静止的间质状态，而同时具有上皮细胞与间质细胞的特点。当卵巢连续性排卵或者组织重建时，OSE就会发生一个去分化的过程，从上皮细胞向间质细胞转化(EMT)。此过程首次被发现是在胚胎发生时，并被认为是胚胎形成的关键。后来研究发现EMT过程与成人器官纤维化及肿瘤转移有关。有研究证明，EMT参与了卵巢癌发生过程中肿瘤细胞生长、生存、迁移、侵袭及耐药性的调节，并被认为是卵巢癌发展的一个关键性过程。

卵巢癌是一种病死率极高的妇科癌症，这主要与其三个特性有关：一是卵巢癌早期缺少有效的筛查与诊断措施；二是卵巢癌恶性程度高，晚期易发生转移；三是卵巢癌晚期，癌细胞对卡铂和紫杉醇等化疗药物易产生耐药性。卵巢癌极易发生远端转移，早期筛查及诊断率低，而且在晚期对放疗和化疗易产生耐受性，病死率极高，因此，对于卵巢癌的预防性治疗药物的发现迫在眉睫。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种有效减缓卵巢表面上皮恶性转化进程的方法，特别是维生素D在卵巢癌的预防性治疗药物上的新应用。

本发明第一方面涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞(MouseOvarianSurfaceEpithelialCell，MOSEC)体外恶性转化培养方法，包括以下步骤：

1)卵巢表面上皮细胞分离：取6-8周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，冲洗并剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜后，利用胰酶消化分离其卵巢表面上皮细胞，然后加入完全培养基以终止胰酶消化过程，离心弃上清液后再次加入选择性完全培养基并移入培养皿中在培养箱中孵育，孵育第2天避免移动培养皿，孵育第3天根据细胞生长情况采用半量换液法更换培养液，当卵巢表面上皮细胞密度达80％时，使用免疫荧光法检测上皮细胞标志物角化蛋白(Pan-keratin)的表达，当其阳性率达95％以上且鹅卵石样立方上皮细胞达80-85％以上时，进行下一步骤；

2)早期传代：接种代数小于15代的卵巢表面上皮细胞，使用半量换液法按2：3至3：2比例传代，传代时间间隔5-7天，培养液采用选择性完全培养基；

3)中期传代：接种代数在16至84代之间的卵巢表面上皮细胞，16-60代按1：2至1:4比例传代，60代后按1：5至1：8比例传代，传代时间间隔为3-5天，培养液采用完全培养基；

4)晚期传代：接种代数大于85的卵巢表面上皮细胞，按1：8至1：10比例传代，传代时间间隔为3-5天，培养液采用部分性完全培养基。

所述选择性完全培养基、完全培养基均为包括胎牛血清(FBS)、mEGF、以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液，所述部分性完全培养基为包括胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠且不含mEGF的DMEM/F12培养液；所述选择性完全培养基、完全培养基、部分性完全培养基中胎牛血清的浓度依次增大，所述选择性完全培养基中mEGF的浓度高于完全培养基中mEGF的浓度。

进一步的，接种代数在15代之前的卵巢表面上皮细胞，每次传代时使用胰酶溶液的消化时间为30-45s，所述胰酶溶液中胰酶浓度为0.1％且不含EDTA。

进一步的，所述选择性完全培养基为包括3-4％胎牛血清(FBS)、1-1.2％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)、8-10ng/mlmEGF、1-1.2％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液。

进一步的，所述完全培养基为包括6-8％胎牛血清(FBS)、1-1.2％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)、2-4ng/mlmEGF、1-1.2％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液。

进一步的，所述部分性完全培养基为包括8-10％胎牛血清(FBS)、1-1.2％青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)、1-1.2％胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液。

进一步的，所述卵巢表面上皮细胞分离步骤完成后，进行免疫荧光鉴定和/或免疫组化鉴定之后，当鉴定结果符合标准后进行早期传代步骤。

本发明第二方面涉及一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，采用前述的卵巢表面上皮细胞体外恶性转化方法、或采用其它能够使卵巢表面上皮细胞在体外恶性转化方法，以建立卵巢表面上皮细胞恶性转化模型；培养过程中，在卵巢表面上皮细胞每次传代及每次更换培养基时添加活性维生素D(1,25(OH)₂D3)；应当说明的是：所述减缓是指对卵巢表面上皮细胞由正常到恶性转化全过程中细胞恶性程度进展的减缓；此外，体外培养细胞与体内实验不同，只能通过添加活性维生素D以提高活性维生素D的终浓度，而人或动物体内由于含有维生素D代谢酶或合成代谢的完成系统，可以通过添加维生素D、25–羟维生素D(25(OH)D)或活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)以提高活性维生素D的终浓度。

优选的，减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，所使用的培养基中添加活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)、并使其终浓度维持在0.5～3nM；在小鼠卵巢上皮细胞恶性转化的三个阶段中，由于细胞性质的变化使得维生素D的代谢酶和维生素D受体的表达出现差异，在添加活性维生素D之后，其浓度值会在0.5-3nM之间波动。优选的，活性维生素D或代谢后的活性维生素D的终浓度维持在1±0.5nM。

优选的，培养过程中，在避光条件下添加活性维生素D。

优选的，培养过程中，在低温环境下添加活性维生素D，优选为-30～-20℃的环境下，例如在冰箱里完成活性维生素D添加过程后立即放入37℃培养箱，或是添加时才从冰箱中将活性维生素D取出。

本发明第三方面涉及维生素D在制备减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的试剂上的应用，所述维生素D为包括维生素D₂(麦角钙化醇,VD₂)、维生素D₃(胆钙化醇,VD₃)、维生素D类似物、25–羟维生素D(25(OH)D)、以及活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)在内的一种或多种，所述试剂在卵巢表面上皮细胞每次传代及每次更换培养基时添加。所述试剂若为包含活性维生素D的试剂，可以在细胞培养过程中直接添加至培养基中，所述试剂若为不包含活性维生素D的试剂，在细胞培养过程中，则需通过其它方式将其转化为活性维生素D后再加入至培养基中，例如采用细菌发酵法、或者采用添加特定的维生素D相关酶来实现。

优选的，所述试剂添加后，培养基中的活性维生素D或代谢后的活性维生素D的终浓度达到0.5～3nM。优选的，活性维生素D或代谢后的活性维生素D的终浓度达到1±0.5nM。

优选的，所述维生素D选用活性维生素D。

优选的，所述含活性维生素D的试剂在避光条件下完成添加过程。

优选的，所述含活性维生素D的试剂在-30～-20℃环境下完成添加过程，例如在冰箱里完成活性维生素D添加过程，或是添加时才从冰箱中将活性维生素D取出。

本发明第四方面涉及维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，所述维生素D为包括维生素D₂(麦角钙化醇,VD₂)、维生素D₃(胆钙化醇,VD₃)、维生素D类似物、25–羟维生素D(25(OH)D)、以及活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)在内的一种或多种。

优选的，所述卵巢癌为起源于卵巢表面上皮的上皮型卵巢癌。

优选的，所述维生素D为活性维生素D。

优选的，所述药物为预防性治疗卵巢癌的药物。

优选的，所述药物包括维生素D及化疗药物，所述化疗药物包括紫杉醇；卵巢癌对紫杉醇易产生耐药性，使用维生素D长期处理后可以增加卵巢癌对紫杉醇的敏感性。

优选的，所述药物包括注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒剂。

优选的，所述药物的使用剂量标准为使肿瘤区域的活性维生素D或代谢后的活性维生素D的终浓度达到0.5～3nM；该使用剂量标准由体外卵巢表面上皮细胞恶性转化试验结果推论得到，虽然体外和体内环境有所不同，但是体外试验足以模拟肿瘤区域活性维生素D的终浓度对于肿瘤细胞的影响；活体情况下，视具体使用方法和活体质量，相对应的依照上述标准调整药物的使用剂量。例如，当使用片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒剂时，由于需要体内对维生素D进行代谢，且活性维生素D的半衰期较短，为了达到特定浓度的活性维生素D，可以使用维生素D₂(麦角钙化醇,VD₂)、维生素D₃(胆钙化醇,VD₃)、维生素D类似物、25–羟维生素D(25(OH)D)，并提高浓度；当采用注射剂型时，可将药物直接注入肿瘤区域，因而可采用活性维生素D，并可准确控制活性维生素D的终浓度范围。优选的，活性维生素D或代谢后的活性维生素D的终浓度达到1±0.5nM。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：1)活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程(1)体外增殖能力：根据活性维生素D对MOSEC的细胞形态、增殖能力、迁移能力的作用，将活性维生素D对MOSEC的恶性转化作用阶段分为三期，即Ⅰ期(P20-P60)、Ⅱ期(P70-P90)、Ⅲ期(P100-P120)。平板克隆实验结果显示，随着MOSEC恶性转化过程，活性维生素D虽然增大了Ⅱ和Ⅲ期细胞的克隆直径(P<0.05)，但是抑制了三个阶段细胞的克隆形成率(P<0.05)。软琼脂克隆实验结果表明:活性维生素D抑制Ⅰ期和Ⅲ期细胞的克隆形成率(P<0.05)，但是却促进了Ⅱ期细胞的软琼脂克隆形成率(P<0.05)。2)体内致瘤性：由于活性维生素D促进了Ⅱ期MOSEC的体外增殖能力，因此，本研究使用体内致瘤实验比较分析P90对照组与处理组细胞在裸鼠体内成瘤能力的变化。与对照组细胞相比较，活性维生素D减弱了处理组细胞的成瘤能力，具体表现为肿瘤转移灶减少(P<0.05，5.5827±0.905862vs1.521767±0.727383g)，肿瘤组织新生血管的生成和不规则的多核细胞减少，腹水形成量减少(P<0.05，12.16667±0.763763vs4.266667±0.929157)，腹水细胞中的肿瘤细胞减少，并且抑制了腹水细胞N-cadherin、MMP3与CYP24A1的表达(P<0.01)，以上实验结果说明活性维生素D长期处理的卵巢表面上皮细胞在裸鼠体内的致瘤能力减弱。3)MOSECP90对化疗药物的敏感性：随着紫杉醇浓度的增加，对照组和维生素D处理组MOSEC的存活率都呈现下降趋势，并且在紫杉醇浓度为50nM时，细胞存活率最小。同时发现在同一个浓度下，1,25(OH)₂D₃处理组MOSEC的细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)。实验结果说明性活性维生素D增强了卵巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性。4)体外迁移能力：在MOSEC自发恶性转化过程中，虽然活性维生素D对P60、P70细胞的迁移能力没有影响(P>0.05)，但是抑制了其余各代数细胞的迁移，并且减弱了P40细胞在12、24、48h三个时间点的划痕愈合能力(P<0.05)，说明活性维生素D抑制了卵巢表面上皮细胞的体外迁移能力。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是不同浓度1,25(OH)₂D₃对MOSEC细胞生长曲线的影响；

图2是活性维生素D对MOSEC平板克隆形成能力的影响图：

其中，A克隆形成情况直观图；B关于两组MOSEC每个代数克隆形成率的线图,从图中可以看出：随着代数的增加，克隆形成率递增，活性维生素D抑制了克隆的形成率(除过渡期P70)；C两组MOSEC形成的克隆直径的线图，P80以后活性维生素D促进了克隆直径的增加；

图3是MOSEC软琼脂克隆形成率图：

其中，A.软琼脂克隆镜下图；B.P70后克隆较大，成球形，中心因折射率低而显黑色，放大倍数40倍；统计分析结果：P50(t＝21.68，P<0.05)，P60(t＝3.16，P<0.05)，P70(t＝0.85，P＝0.4445)，P80(t＝-7.5，P<0.05)，P90(t＝-20.08，P<0.05)，P100(t＝14.35，P<0.05)，P110(t＝19.51，P<0.05)；

图4是裸鼠体重及体温的变化图：

其中，A.各组免疫缺陷小鼠体重变化，P90组体重最高；B.各组免疫缺陷小鼠体温变化；

图5是MOSEC的体内成瘤能力图：

其中，A.裸鼠直观图：腹腔注射10⁵个MOSECP90与P90+VD，与对照组相比，8周时，裸鼠腹部膨大，皮肤显青紫色；裸鼠腹水图：腹膜下，可见裸鼠腹腔内充满血性腹水，肠壁肥厚，肿胀；B，C，D，E.裸鼠腹腔肿瘤图：裸鼠腹腔解剖，可见大量葡萄状的转移结节，白色，表面光滑，透亮；触及较硬，表面光滑，不规则，附近肠壁肥厚，肿胀，且P90比P90+VD的转移较多越严重；F.裸鼠腹水细胞涂片HE染色结果：两组细胞均主要为淋巴细胞、白细胞，可见少量核巨大而核不规则的肿瘤细胞主要见于N90(P90注射到裸鼠腹腔内，8周时所形成的腹水细胞)；G.腹水细胞的体外培养：腹水细胞明显呈长梭形的间质细胞形状，N90细胞形成了大块的恶性转化灶，而N90+VD细胞形态小比之下比较规则；H.裸鼠成瘤腹腔转移组织HE染色的图片，P90组肿瘤组织中有血管形成，且有大核，多核细胞，核浆比大；P90+VD组肿瘤组织没有血管形成，但是与P90组相比较核大，多核，核浆比也较大的细胞数量较少；

图6是裸鼠腹水中细胞的间质性相关基因表达图：

其中，用RT-PCR检测P90，P90+VD，N90和N90+VD四组细胞中N-cadherin，β-catenin，Snail，MMP3(图6A)和CYP24A1(图6B)的表达情况；先用方差分析检验四组细胞表达量有无差异结果显示：N-cadherin(F＝15.32，P＝0.0011)，β-catenin(F＝1.77，P＝0.058)，Snail(F＝0.6，P＝0.6315)，MMP3(F＝11.13，P＝0.0032)，CYP24A1(F＝404，P＝0.0011)，将有差异表达的基因进一步用SNK法两两比较；注：‘*’表示该组细胞表达量和其他三组之间有统计学差异；‘**’不仅与其他组有统计学差异，还与‘*’组有统计差异；

图7是活性维生素D抑制MOSEC的体外迁移能力图：

其中，A1是Transwell小室在40倍显微镜下的照片，(注：深色表示被染上的细胞；吸光度值测取方法：将小室拍照后用1ml的乙醇洗脱10min，然后在酶标仪上面用250nm的波长测其各自的吸光度值)；A2：是对A1吸光度值的做的线图，统计分析后P40(t＝4.5，P＝0.0108)，P50(t＝6.4，P＝0.031)，P80(t＝5.6，P＝0.033)，P90(t＝11.48，P＝0.0003)，P100(t＝14.37，P＝0.0001)，P110(t＝12.72，P＝0.0002)对照组的迁移能力大于各自的处理组细胞；P20(t＝1.93，P＝0.126)，P60(t＝2.21，P＝0.10)，P70(t＝7.02，P＝0.249)两组之间没有差异性；)B1：P40与P40+VD的划痕实验结果，分别在12h，24h，48h后测量其划痕的宽度，并且拍照；统计分析后三个时间点均有统计学意义；12h(t＝5.32，P＝0.006)，24h(t＝12.48，P＝0.0002)，48h(t＝9.2，P＝0.0008)(注：迁移指数(migrationindex，％)＝(初始划痕宽度—愈合后划痕宽度)/初始划痕宽度)；

图8是活性维生素D增强MOSEC对化疗药物的敏感性结果图：

其中，横坐标为紫杉醇的浓度，纵坐标为450nm波长下的吸光度值与细胞数量成正比，注‘**’P<0.01,‘*’P<0.05。对照组与处理组t检验后发现10nmol/L组(t＝16.94,P＝0.0001)，50nmol/L组(t＝41.10,P＝0.0001),100nmol/L组(t＝10.05,P＝0.0006)；

图9是活性维生素D对MOSEC自发恶性转化过程中EMT相关蛋白表达的影响图：

其中，A、用WestenBlotting检测与EMT相关蛋白的表达，其中A1-A5是WestenBlotting结果的定量柱状图；上皮细胞标志物E-cadherin在P20表达很强，1,25(OH)₂D₃促进了E-cadherin的表达；1,25(OH)₂D₃对其相对应的间质细胞标志物N-cadherin在每个代数的表达都有抑制作用；在MOSEC细胞的每个代数，1,25(OH)₂D₃对间质细胞标志蛋白Vimentin的表达没有影响；与对照组MOSEC的每个代数相比较，1,25(OH)₂D₃抑制了EMT转录因子Snail与β-catenin的表达；B、是E-cadherin、Snai和β-catenin的免疫荧光结果；显示E-cadherin在每个代数表达都很弱，但是1,25(OH)₂D₃促进其表达；对照组MOSEC随着代数的增加Snail表达逐渐加强，1,25(OH)₂D₃抑制了Snail的表达；β-catenin在每一个代数的表达量没有差异性，但是1,25(OH)₂D₃抑制了其向核内转移的进程；

图10是与EMT相关的基因在MOSEC中的表达图：

其中，A、骨桥蛋白1(SPP1)在MOSEC中的表达，在P30，P90，P110和P120时对照组与1,25(OH)₂D₃处理组细胞中的表达的差异性有统计学意义(P<0.05，t检验)。横向比较对照组P110比其他代数细胞表达高(均有P<0.05，方差分析；P<0.05后用SNK法进行两两比较)。处理组P90的表达量高于其他各个代数(每个P<0.05，统计方法如前)。B、基质金属蛋白酶3(MMP3)的表达，在P20与P60代1,25(OH)₂D₃处理的MOSEC的表达量大于与其对应的对照组(P<0.05，t检验)P90，P110和P1201,25(OH)₂D₃抑制了MMP3的表达(P<0.05，t检验)。横向比较对照组各个代数之间P90比其他各个代数的表达都高，均有统计学意义(P<0.05，检验方法同前)处理组各个代数之间没有统计学意义(P>0.05，方差分析P>0.05)；C、P80，P110和P120在对照组与处理组的表达有差异性(P<0.05)横向比较结果显示对照组P20代与其他代数之间有差异(F＝10.8，P<0.05，SNK法两两比较均有P＜0.05)处理组P20同样和其他各个代数之间的表达有统计学差异(F＝10.8，P<0.05，SNK法两两比较P均小于0.05)；D、雌激素受体1(ESR1)的表达，在P30，P90，P100对照组与处理组之间的表达有统计学差异(P<0.05)在P30与P100，活性维生素D是促进Esr1的表达，在P90是促进表达。横向比较对照组P40与其他各个代数之间的表达有统计学的差异(F＝9.6，P<0.001)处理组P40与P100代的表达明显高于其他各个代数的表达(F＝8.6，P<0.001)；

图11是活性维生素D合成酶-CYP27B1在MOSEC中的表达图：

其中，A用RT-PCR检验CYP27B1在两组MOSEC中的表达情况；‘o’表示对照组的MOSEC各个代数之间先用卡方检验有统计学意义后(P<0.05)，再用SNK法进行两两检验后与其他各组之间有统计学意义；‘△’表示处理组各个代数比较后(P<0.05)，P70+VD和各个代数之间有统计学意义；‘*’同一个代数两组之间的T检验结果，P20，P30，P70和P90处理组与对照组之间比较(P<0.05)；B交互作用结果图，横坐标细胞代数，纵坐标CYP27B1的相对表达量，两条线分别表示对照组与处理组MOSEC随着代数变化表达量的变化，用SAS的‘GLM’过程验证是否存在交互作用结果显示P＝0.012，‘+’表示协同作用，‘—’表示拮抗作用；CCYP27B1的免疫荧光定位结果；

图12是活性维生素D代谢酶-CYP24A1在MOSEC中的表达图：

其中，在MOSEC中CYP24A1的表达，编码活性维生素D代谢酶24-羟化酶，‘**’表示表达量最高与‘*’标志的有统计学差异性(P>0.05)，没有任何标志的与他们两组都没有差异性(P>0.05)；A对照组各个代数CYP24A1的表达，先用方差分析来验证各个代数表达量之间是否有差异性，结果显示(P>0.05)接下来用SNK法来检验两两之间的差异性，结果显示P70高于P20，P50，P80与P110的表达量；B1,25(OH)₂D₃处理组MOSEC各个代数CYP24A1的表达量；应用的统计学方法与A一样，统计学结果显示P60-P90比P50、P30、P20的表达量都要高(P<0.05),与其他的代数之间的表达量没有统计学的差异性；CMOSEC代数的增加与1,25(OH)₂D₃加入对CYP24A1表达量的交互作用影响结果，‘+’表示两因素之间的协同作用，‘—’表示两因素之间的拮抗作用；显示P70-P90之间同时上升与下降，是值得研究的区间，而且在P80的时候都有着明显的下降；D免疫荧光法对CYP24A1的表达的定位，P60+VD中CYP24A1在细胞核内表达，随后进入细胞核外，而1,25(OH)₂D₃处理组直到P110才进入核内表达；

图13是VDR在MOSEC中的表达图：

其中，A白色柱子表示MOSEC对照组细胞VDR的表达量，柱子上面的不同形状的符号表示先用方差分析多组比较P<0.05，接着做两两之间的SNK多重比较，上面符号一样的表示这几个代数的细胞的VDR的表达水平是在同一个档次，与其他符号的都有统计学差异，没有任何符号的和各个组之间都没有统计学差异性；从上图可知P70(***)的表达量最高与其他各个代数之间有统计学差异性(P<0.05)，接下来是P80(**)比P70低(P<0.05)，比其他高(P<0.05)；接下来是P40低于P70和P80(P<0.05)，但是大于其他的代数(P<0.05)；之后是P50和P60的表达量小于P70、P80、P40(P<0.05)但是大于其他代数的表达；然后是P20、P30、P100和P120他们的表达量最低小于P70、P80、P40、P50和P60的表达；其中P100与P90与其他各个代数之间没有差异性(P>0.05)；黑色柱子表示1,25(OH)₂D₃处理组各个代数VDR的表达经过方差分析后没有意义(P>0.05)；就是各个代数的表达没有差异性；B与之前一样对VDR也要进行交互作用的分析，GLM交互分析后发现P<0.05，就说明两个因素之间存在交互作用，‘+’表示协同作用，‘-’表示拮抗作用；并且显示从P80-P120之间一直是协同作用，统计学提示这个区域值得研究；C用免疫荧光测定VDR的表达位置图，可以看出不管是对照组还是处理组VDR的表达位置始终在细胞质，并没有发生变化；

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1活性维生素D抑制卵巢表面上皮细胞的体外增殖能力

1.1活性维生素D对MOSEC平板克隆形成能力的影响

克隆形成实验或集落形成实验是测定是单个细胞长成集落的能力，可反映细胞群体依赖性和增殖能力。为了检测1,25(OH)₂D₃对MOSEC恶性转化过程中的细胞平板克隆形成能力是否有影响，本发明每隔10代取对照组与活性维生素D处理组细胞，比较两组细胞集落形成能力的差异。MOSEC在体外的早期培养阶段，细胞生长极其缓慢，需要半量换液。本实验从第20代开始(使用P20表示，以下类推)开始，使用1nM的1,25(OH)₂D₃处理MOSEC，代表活性维生素D处理组，以相同代数的MOSEC添加相同体积的乙醇为对照组，同时做平板克隆实验，应当说明的是，活性维生素D由乙醇作为溶剂配制而成。

对于1,25(OH)₂D₃浓度的选择，如图1所示，通过不同浓度1,25(OH)₂D₃和DMBA对MOSE细胞生长的影响，发现高浓度的1,25(OH)₂D₃(10nM、100nM)对于细胞本身的生长过程影响较为显著，减缓了细胞的生长过程；浓度在1nM时，MOSEC细胞保持持续增殖趋势，表明较低浓度1,25(OH)₂D₃对细胞生长有促进作用，进一步的实验证明，1,25(OH)₂D₃浓度在0.5～3nM时，实验结果与1nM的变化不显著；因此，本实验选择1nM的1,25(OH)₂D₃研究其对MOSEC细胞体外恶性转化的保护作用；另外，应当说明的是，在实际培养过程中，培养基中1,25(OH)₂D₃的终浓度稳定的保持在1±0.5nM即可，实验结果基本不受影响。

应当说明的是，体外培养细胞与体内实验不同，只能通过添加活性维生素D以提高活性维生素D的终浓度，而人或动物体内由于含有维生素D代谢酶系统，可以通过添加维生素D、25–羟维生素D(25(OH)D)或活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)以提高活性维生素D的终浓度。本实施例及后续实施例中，若涉及动物体内实验的，可以采用添加维生素D、25–羟维生素D(25(OH)D)的方式，也可采用直接添加活性维生素D(1,25(OH)₂D₃)的方式，后续实施例不再赘述。

具体培养方法为：

每隔一天换一次新鲜的培养基，倒掉一半旧的培养基，加入一半新鲜的。等到细胞长到85％以上的时候传代，一般按照1：2的比例传代，此期活性维生素D对细胞生长的抑制率基本是100％，所以在20代(P20)之前没有用活性维生素D处理细胞。从20代以后细胞的性状基本稳定，每隔一天换一次新鲜的培养基，先用PBS洗3次，再加入新鲜培养基，同时加入1,25(OH)₂D₃，使其在培养基中的浓度达到1nM。同时对照组加入同等体积的乙醇。等到细胞密度达到85％以上时，对MOSEC进行传代。首先用PBS洗3次，再将0.25％Trypsin+EDTA轻轻滴入细胞100mm培养皿1mL，室温1min后用细胞培养基终止消化。细胞悬液离心，弃上清，加入DMEM/F12完全培养基，轻轻吹打3-5次，将细胞悬液转移到新的培养皿中培养，同时在新培养皿中的培养基中加入1,25(OH)₂D₃使其终浓度达到1nM(此过程避光)。注：1,25(OH)₂D₃对温度也很敏感，所以在准备加的时候才能从低温冰箱中取出来，加完后立即放回冰箱。对照组加入同等体积的乙醇，其他操作步骤与处理组一样。此期1,25(OH)₂D₃对其的抑制率下降。这也是决定加活性维生素D处理的时间的一个重要考虑因素。20代之前MOSEC生长速度慢、易老化、不易成活，据研究，传代时间、传代后细胞密度将会直接影响早期MOSEC生存能力。20-30代1,25(OH)₂D₃明显抑制了MOSEC的生长与对照组相比较。30代以后两组细胞的生长速度相当。

平板克隆形成能力测定具体方法为：分别取对数生长期的MOSEC对照组与处理组细胞，用胰酶消化后，细胞稀释，取10μl的细胞悬液与10μl的台盼蓝混合后，吸取10μl的混合物滴在细胞计数板上面，在细胞计数器上面计数，每组细胞分别取500个种入60mm的细胞培养皿中，每组做3个平行样。置于37℃含有5％CO₂的培养箱中培养，培养其间不换液，每3-5天加入新鲜培养基。14天后，倒掉培养基，用PBS洗3次，用甲基紫甲醇固定液固定并染色3min，随后用PBS吸干净多余的甲基紫。随后放入化学发光成像系统(GeneCompanyLimitedGboxXR-5,中国香港)中用计数克隆的功能计数克隆的数目并且拍照。在仪器中设定只计数直径大于2mm的克隆。计算克隆形成率，克隆形成率＝(克隆形成数/500)×100％，每10代测量一次，最后以两组MOSEC代数为横坐标，克隆形成率为纵坐标绘制线图，观察MOSEC恶性转化过程活性维生素D对MOSEC克隆形成率的影响。

结果如图2A显示，MOSEC在P40以前不能形成克隆，之后随着MOSEC体外传代次数的增加，1,25(OH)₂D₃影响了其克隆形成能力。如图2B与表1的克隆形成率的结果显示：除了P50(P>0.05)外，其余各个代数的克隆形成率对照组与处理组都有统计学意义。P70代t值是负值表明活性维生素D促进了克隆的形成率，而其他代数1,25(OH)₂D₃处理组的克隆形成率明显低于对照组(P<0.05)。如图2C与表2，克隆形成大小的结果显示：在P70以前，两组MOSEC形成的克隆大小没有明显差异(P>0.05)，但是，从P80开始1,25(OH)₂D₃处理组细胞的克隆直径明显大于对照组(P<0.0005)。以上结果说明1,25(OH)₂D₃的处理影响了卵巢表面上皮细胞的克隆形成能力。

表1平板克隆形成率的统计处理表

注：MOSEC在各个代数，平板克隆形成率＝(克隆形成数/500)×100％，每个样品至少重复3次。每个代数都将对照组与处理组的克隆形成率用均数±标准差来表示。然后用t检验做统计分析，求得对应的P值。从表中可以看出除了P50(P>0.05)外，其余各个代数的对照组与处理组都有统计学意义。P70代t值是负值而且P<0.05,可知活性维生素D促进了克隆的形成率。

表2平板克隆直径大小的数据处理表

如上表所示，两组MOSEC每个代数的克隆直径用均数±标准差来表示，单位是(mm)，通过两组之间的t检验得出，P70以前两组之间比较的P>0.05,克隆直径没有差异性，P80以后，活性维生素D促进了克隆的大小。

上述统计分析过程及后续实施例采用的统计分析过程为：

用SAS19.0进行数据的统计分析，结果用表示。多组之间比较先用方差分析，如果结果显示有差异性再用SNK法进行两两比较。单纯的两组之间的比较当统计资料符合正态性和方差齐时，对照组与处理组之间用t检验，当统计资料符合正态性而方差不齐时，采用校正后的t检验。当不符合正态性时采用非参数法Wiloxcon秩和检验。当P<0.05时，认为存在统计学意义。

1.2锚着独立生长能力

1.2.1实验方法包括以下步骤：

A.准备下层胶

用双蒸水配与琼脂糖制出1.4％低熔点琼脂糖液(Agar)，高压灭菌后，置于40℃水浴锅中平衡温度45min。同时将2×的培养基(2×DMEMF12+20％FBS)放在40℃水浴锅中均衡温度45min。将等体积的上述两种液体混匀，以制备0.7％Agar+(1×DMEMF12+10％FBS)。

将1.5ml的混合液缓缓注入35mm皿中，避免气泡产生，等待1h以使胶完全凝固(此过程也可将细胞培养皿置于装有冰的饭盒上面，以使下层胶更好的凝固，且不需要那么久的时间。同时一定要保证饭盒是无菌的)

B.制备上层胶

用双蒸水配制出0.7％Agar，高压灭菌后，置于40℃水浴锅中平衡温度45min。将(2×DMEM+20％FBS)在40℃水浴锅中均衡温度45min。

消化各组细胞，台盼蓝染色后用细胞计数板计数，此实验需要细胞10,000个/皿。用培养基调整体积使细胞数为40,000个/ml。

将1ml细胞悬液加入15ml离心管中，然后加入3ml(2×DMEMF12+20％FBS)与3ml的0.7％Agar。轻柔吹打混匀。

在皿的底层胶的上面缓缓注入1.5ml上述混匀液，避免气泡产生，每组设定3个平行样。每次仅制备铺制一组细胞，以免上层胶过早凝固。置于超净台中(室温25℃)90min，待上层胶凝固后，在上层轻轻滴入500μL培养基。

C.将皿置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，期间每隔3天，补加500μL培养基。培养14天后，把平皿置于倒置显微镜下，计数>20个细胞的克隆数。每组设定3个平行样，独立实验重复3次。

软琼脂克隆形成率(colonyformingefficiency,CFE)＝克隆形成数/接种细胞数×100％。

1.2.2实验结果如下：

本发明实验观察了1,25(OH)₂D₃对P20-P120之间细胞的软琼脂克隆形成率的影响，并且以人卵巢癌细胞系SKOV-3为阳性对照。如图3所示，P40以前两组的MOSEC在半固体环境中无克隆形成，之后两组MOSEC可在软琼脂中形成直径大于15μm的克隆。在实验中可观察到，1,25(OH)₂D₃处理组MOSEC与其相对应的对照组相比较克隆直径明显减小。通过统计学分析可以得知：P80-P90之间1,25(OH)₂D₃促进软琼脂克隆的形成率(P<0.001)，P50-P60，P100-P110代1,25(OH)₂D₃抑制克隆的形成率(P<0.05)。P70两组之间克隆形成数量没有差异性是个过渡的阶段(P>0.05)。

上述平板克隆、锚着独立生长能力的实验结果表明，1,25(OH)₂D₃在P70以前都是抑制MOSEC的增殖，对P70细胞的影响是一个过渡期，在P80-P90之间1,25(OH)₂D₃对MOSEC的增殖又起到促进作用。在这之后的P100-P110,1,25(OH)₂D₃抑制MOSEC的增殖。所以，本研究根据活性维生素D对不同代数细胞增殖能力的作用不同，把P20-P120的MOSEC分为三期，即Ⅰ期MOSEC(P20-P60)、Ⅱ期MOSEC(P70-P90)和Ⅲ期MOSEC(P100-P120)。

实施例2活性维生素D减弱了卵巢表面上皮细胞的体内致瘤能力

2.1实验方法

实验动物

选用SPF级免疫缺陷BALB/C小鼠，4-6周龄，饲养于12小时光照/12小时黑暗规律的动物房，提供充足的水和饲料。SPF级BALB/C裸鼠来源于苏州大学实验动物中心。饲养于苏州大学SPF实验动物中心，适应性饲养2周，然后剪耳、标记、分组。腹腔注射细胞后，一周测一次体重、体温，观察小鼠一般体征，活动情况，以及肿瘤发展情况，并且做记录。

体内成瘤实验

裸鼠成瘤实验按照IACUC(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的协议执行。实验分组：DMEM/F12对照组、阳性对照SKOV-3组、P90组和P90+VD组。每组腹腔内注射10⁵个细胞。每周称体重、体温，观察腹水情况及其肿瘤的大小，裸鼠的一般情况，接种细胞8周后麻醉处死裸鼠。

腹水涂片与腹水细胞的培养

A腹水涂片的步骤

分别取P90与P90+VD的MOSEC成瘤的裸鼠腹水，用无菌的一次性注射器抽取腹水，于15ml的离心管里面离心，上层为上清液，下层为腹水细胞。取上清液于无菌的EP管中备用。

用移液器吸取10μl的腹水细胞，滴到粘附载玻片上面，用另外一个干净的玻片将载玻片上的腹水细胞均匀涂成单细胞层。随后立即用4％的甲醇固定(此过程一定要注意不要把载玻片上面的腹水细胞吹散)然后准备HE染色。

B腹水细胞的培养

将A中提及的剩余的两组腹水细胞分别种入DMEMF12培养基中(含有10％EBS)，37℃，5％CO₂的培养箱中培养,其细胞分别取名为N90，N90+VD。

2.2裸鼠生存期、体重及体温的变化

取对数生长期MOSECP90—对照组与1,25(OH)₂D₃处理的MOSECP90(P90+VD)—处理组，注射10⁵个细胞于裸鼠腹腔，人卵巢癌细胞系SKOV-3为阳性对照组，DMEM/F12培养基组为阴性对照。如图4A所示，是裸鼠的体重随着时间的变化而变化的趋势，与培养基对照相比较，MOSECP90、P90+VD和阳性对照SKOV-3的裸鼠体重随着时间增加逐渐增高，P90组在第5周后体重最高，这可能与这组裸鼠腹腔腹水形成较多有关。P90+VD与SKOV-3的体重变化基本同步，而且没有差异性，可能是由于他们的成瘤情况相近。在第8周时，P90、P90+VD和SKOV-3的体重增加明显(增加10g左右)，对成瘤情况的观察可知，在7-8周之间，腹水一周内迅速增加，可能是腹水增加导致体重增加的缘故。裸鼠的体温变化基本处于一个平稳的趋势，但是在第7周的时候P90与P90+VD体温突然升高，第8周成瘤时，体温平稳，而此时SKOV-3裸鼠体温升高。因为此组裸鼠活动明显减少，而且成瘤裸鼠体温偏高(图4B)。由于部分裸鼠一般状况较差，腹水已经很明显，因此观察至第8周时处死裸鼠。在致瘤实验观察期，未发现各组裸鼠生存期的改变。

2.3腹腔注射观察致瘤性

裸鼠在接种P90和P90+VD细胞后7周时，腹部明开始膨胀，但是不明显，且皮肤呈青紫色，体表未触及肿块，运动减少，精神不佳，疑似形成腹水，在第8周时，腹部增大很明显，腹膜血管清晰可见，且小鼠消瘦。解剖后发现，P90组小鼠腹腔内约有13ml血性腹水，P90+VD组约4ml，随后将腹水细胞分离培养，发现种植P90对照组细胞的裸鼠腹水细胞(N90)生长很快，且形成很多恶性转化灶，相比之下接种活性维生素D处理组细胞P90+VD的裸鼠腹水细胞(N90+VD)生长缓慢，且形状规则(如图5G)。用裸鼠体内形成的腹水细胞涂片后，HE染色发现腹水中主要是淋巴细胞和红细胞，N90细胞出现多核，不规则的肿瘤细胞，N90+VD在镜下并没有发现异形核的肿瘤细胞(如图5F)。腹腔内肠系膜出现大量转移灶，P90的裸鼠(图5B)腹腔的肠系膜转移成葡萄状，表面光滑，透亮，触及较硬，数量很多，无法计数，重量共5.1561g(见图5D)。再重复进行两次实验，结果分别为：4.9689g和4.6231g。相比之下P90+VD注射的裸鼠转移较少，肠系膜转移共1.2335g(如图5E)，再重复进行两次实验，结果分别为:0.9829和2.1349。将转移的组织做石蜡切片，HE染色后发现，P90在裸鼠体内形成的肿瘤组织细胞大小不一，细胞核不规则，核浆比大，组织中有血管形成，而P90+VD组的肿瘤组织了没有血管形成，也有不规则的肿瘤细胞，但是与P90组相比较数量较少(见图5H)。以上结果说明，1,25(OH)₂D₃虽然不能完全抑制P90的MOSEC成瘤性，但是可以减弱其成瘤能力。具体表现为：使其肿瘤转移灶减少，腹水细胞中的肿瘤细胞减少，腹水形成量减少。

2.4活性维生素D抑制裸鼠腹水细胞的间质性状

为了进一步研究MOSECP90对照组与P90+VD活性维生素D处理组细胞接种裸鼠后形成腹水细胞(分别使用N90与N90+VD表达)的性状差异，选择P90、N90以及P90+VD和N90+VD四组细胞，通过提取四组细胞的RNA做实时荧光定量PCR，检测间质细胞标志因子N-cadherin、EMT转化因子Snail和β-cantenin、基质金属蛋白酶3(MMP3)以及与维生素D代谢相关基因CYP24A1的表达，从而全方位的分析这四组细胞之间的差异性。

实验方法为：

A提取细胞RNA

分别收集MOSECP90、P90+VD、N90和N90+VD的细胞，加入1mL的trizol，1min后用移液器轻轻的吹打细胞悬液混匀，而后移入一个干净的不含DNA、RNA酶的1.5ml的EP管里面，在室温下静置5min，在装入裂解物的离心管里面加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5)震荡混匀15s，室温下静置2-3min。离心12000rpm，15min，4℃。分为三层液相，最上面一层是RNA，1ml的裂解物产生的上清液为0.4-0.5ml。小心用移液器吸取上清液，移入到另一个EP管里面。在上清液中加入0.5ml的100％异丙醇，震荡混匀30s，室温静置10min，随后离心12000rpm，10min，4℃，此时RNA沉淀将来离心管底的侧面形成，小心吸取上清液避免触及底部的RNA沉淀，离心管加入75％预冷的乙醇震荡混匀30s，离心7500rpm，5min，4℃，重复以上清洗3次后，干燥RNA，加入DEPC水，检测浓度与纯度，备用。

B逆转录为cDNA

取RNA2μg并且参照TranscriptorFirstStrandcNDASynthesisKit(roche公司)的逆转录试剂盒的说明对RNA逆转录。逆转录反应条件为：37℃60min，85℃5min。

CPCR

逆转录获得的cDNA稀释5倍后进行RT-PCR反应。RT-PCR的体系使用20μl，SYBRGreen10μl，CDNA2μl，上下游引物分别1.5μl，水5μl。反应体系参照SYBRGreenINucleicAcidGelStain的说明书，反应条件为：95℃10min，95℃10s，60℃20s，72℃30s，45个循环。所有反应均设3个复孔。记录每个反应管中样品的CT值，实验结果采用相对定量法△△CT进行分析，以2-△△CT表示1,25-(OH)2D3处理组表达量相对于对照组表达量的变化倍数。内参选用β-actin。

结果如图6所示：N90细胞基因N-cadherin，MMP3和CYP24A1表达量都高于其他三组(P<0.05)，Snail和β-catenin的表达四组之间没有差异性。P90+VD组CYP24A1的表达高于P90与N90+VD组，并且低于N90组细胞。以上实验结果说明接种对照组细胞后形成腹水细胞的间质性较强，而且恶性程度也较高，而活性维生素D可以抑制了腹水细胞的恶性程度。

实施例3活性维生素D抑制卵巢表面上皮细胞的体外迁移能力

为了观察1,25(OH)₂D₃是否在长期处理过程中抑制MOSEC的迁移能力，本发明使用Transwell与划痕实验来检测MOSEC的迁移能力。实验方法如下：

Transwell迁移实验

应用微滤膜培养小室，来检验MOSEC的迁移能力，以及活性维生素D的长期处理的对迁移能力的影响。滤膜上面有8μm的微孔可允许细胞穿过到达膜下面，这些穿过去的细胞可粘附于膜下面，通过粘附细胞的数量来反映迁移情况。具体的实验步骤：分别对两组MOSEC于实验前一天进行饥饿处理，第二天消化饥饿处理过的细胞，计数，分别取1000个细胞溶于700μl无血清的DMEM/F12培养基中。种入小室内，小室放入24孔板孔中，24孔板中加入1ml放入含有10％的FBS的DMEM/F12。注意小室底部与24孔板培养基之间不能有气泡。随后放入37度，5％CO2的培养箱培养12h。然后取出小室，用PBS洗后，用4％的甲醇固定3min，后用PBS洗3次，甲基紫染色3min后，再用PBS洗后，在显微镜下拍照。随后在24孔板中加入100％的乙醇，将小室放入其中，在摇床上摇10min，随后酶标仪检测450nm处各孔处吸光度值(A)。迁移实验至少重复3次。

细胞划痕实验

取对数生长期的各组细胞，消化制成单细胞悬液，台盼蓝与细胞计数板在细胞计数器上面染色计数数后，取5×10⁵个细胞接种于35mm培养皿中，12h贴壁后。换用无FBS的培养基继续培养24h。使用100μL的枪头在细胞单层面划过，用预温的PBS轻轻漂洗4次洗去细胞碎屑，以形成一个无细胞区域的条带。用含10％FBS的培养基继续培养细胞，于划痕后的0h，12h，24h，48h在显微镜下(40×)观察拍照并测量宽度。各组选取3个不同的位置，利用以下公式计算分析细胞迁移能力。每组设定3个平行样，独立实验重复3次。迁移指数(migrationindex，％)＝(初始划痕宽度-愈合后划痕宽度)/初始划痕宽度。

结果显示：在MOSEC自发恶性转化过程中，虽然1,25(OH)₂D₃对P60、P70的MOSEC的迁移能力没有影响(P>0.05)，但是对其余各代数都是抑制MOSEC的迁移(图7A1和图7A2)。接着用划痕实验来验证Transwell实验结果，选取P40的两组MOSEC，分别在划痕后12h，24h，48h测量划痕愈合能力，结果如图7B1和7B2所示。统计分析后发现，1,25(OH)₂D₃抑制了MOSECP40三个时间点的划痕愈合能力(P<0.05)。以上实验结果表明活性维生素D可以抑制卵巢表面上皮细胞的迁移能力。

实施例4活性维生素D增强II期卵巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性

本发明用10nM，50nM和100nM的紫杉醇分别处理MOSECP90与MOSECP90+VD细胞，48h后检测紫杉醇对细胞生长的抑制作用。具体实验方法如下：

A制备细胞

分别取对数生长期的MOSECP90对照组与1,25(OH)2D3处理组细胞，消化后计数取2×10³个细胞接种于96孔板的一个孔，一个样品接种需要种36个孔(因为一个化疗药物剂量组需要6个重复)。需要种3个板(每个时间点需要重复测量)

B实验条件

置37℃，5％CO2培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基，用PBS洗3遍，然后加入含不同浓度Taxol的培养基200μl，同时对照组加入同体积的含有无水乙醇的10％胎牛血清DMEM/F12培养基；实验组培养基中加入不同浓度Taxol(10，50，100nM)。每组设六个复孔。将细胞置培养箱培养48h后吸掉培养基。然后加100μl新鲜培养基和10μlCCK-8检测液，37℃孵育1h，酶标仪检测450nm处各孔处吸光度值(A)，从而来说明对照组与处理组的MOSEC对抗癌药物的敏感性差异。

结果如图8，随着紫杉醇浓度的增加，对照组和维生素D处理组MOSEC的存活率都有下降的趋势，并且在50nM浓度时，紫杉醇对细胞活力的影响最大。同时发现在同一个浓度下，1,25(OH)₂D₃处理组MOSEC的细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)。实验结果说明紫杉醇可以抑制恶性转化的卵巢表面上皮细胞生长，并且活性维生素D增强了恶性转化的卵巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性。

实施例5维生素D减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的机制

5.1活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程与调控EMT有关

(1)细胞形态的改变：体外长期连续培养过程中，对照组MOSEC由上皮细胞的“鹅卵石形”转化成间质细胞样的“纺锤梭形”。活性维生素D在Ⅰ、Ⅲ期抑制这种转化进程，而在Ⅱ期却促进了此进程。

(2)EMT标志蛋白的表达：Western-blotting的实验结果如图9所示，随着MOSEC体外恶性转化过程，活性维生素D抑制了EMT相关蛋白N-cadherin、Snail和β-catenin的表达，促进了E-cadherin的表达。免疫荧光与此一致，同时还显示活性维生素D抑制了β-catenin向核内转移。说明活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程与调控EMT标志蛋白有关。

(3)EMT相关基因的表达：如图10所示，在MOSEC的Ⅰ期，活性维生素D促进了MMP3、ESR1的表达，抑制了SPP1的表达，对COL3A1的没影响，说明活性维生素D通过下调SPP1、上调ESR1来抑制I期细胞的EMT进程。在Ⅱ期，活性维生素D促进了SPP1、COL3A1的表达，抑制了MMP3与ESR1的表达。说明活性维生素D在此期通过下调MMP3抑制EMT，通过上调SPP1、COL3A1与下调ESR1的表达促进细胞的增殖能力。在Ⅲ期，活性维生素D通过下调SPP1和MMP3、上调ESR1抑制III期细胞的EMT。以上实验结果说明在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段，活性维生素D调控的EMT相关基因也不同，这可能是它对不同阶段细胞增殖能力影响不同的原因之一。

5.2活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化与维生素D代谢关键酶的变化有关

如图11至13所示，Real-timeQ-PCR的实验结果显示，在MOSEC的自发恶性转化过程中，对照组中活性维生素D合成基因CYP27B1、失活基因CYP24A1与维生素D受体(VitaminDReceptor，VDR)的表达都呈现一个正态分布曲线的趋势，并且在II期细胞P70时达到最大值。活性维生素D处理刺激了每一个代数细胞中CYP24A1的表达剧增(P<0.05)，最高者达到了15000倍。但是处理组CYP24A1增长的幅度不同，P60和P90的表达量明显高于其他代数，也就是说CYP24A在Ⅱ期细胞的表达比Ⅰ和Ⅲ期高。同时实验发现处理组Ⅱ期细胞CYP27B1与VDR的表达下降，结合此期相对较高表达的CYP24A1的结果，说明II期活性维生素D的有效作用量减少。与同一代数对照组的MOSEC比较，Ⅰ期处理组细胞CYP27B1与VDR的表达升高，与此期相对较低表达的CYP24A1的结果结合分析，说明I期活性维生素D的有效作用量增加。同理，Ⅲ期细胞CYP27A1与VDR的表达没有变化，而CYP24A1的表达相对较低结合发现，说明III期活性维生素D的有效作用量增加。研究还表明，CYP24A1抑制剂与骨化三醇即活性维生素D联合给药增强了活性维生素D的抗肿瘤细胞增殖作用，并且提高全身活性维生素D利用率，促进胱天蛋白酶独立凋亡通路的激活。以上实验结果说明，在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段，虽然加入同样浓度的活性维生素D干预，但是由于维生素D代谢酶和VDR表达的变化，导致每一阶段活性维生素D的有效作用量不同，对细胞增殖能力的影响也不同。

综上所述：在MOSEC恶性转化的Ⅰ期，由于1,25(OH)₂D₃合成基因CYP27B1表达上升，降解基因CYP24A1表达下降，从而使得活性维生素D在Ⅰ期的有效作用量增加，而且此期VDR也是高表达的一个状态，所以1,25(OH)₂D₃很好地发挥了生物学效应，通过上调上皮细胞标志物E-cadherin、下调间质细胞标志物N-cadherin、EMT转录因子β-catenin和Snail等的表达抑制了I期细胞的EMT进程，同时增加ESR1的表达，减少SPP1的表达。使得在此期1,25(OH)₂D₃抑制细胞的增值和迁移能力的可能机制。

在MOSECⅡ期，1,25(OH)₂D₃的长期处理诱导CYP24A1的表达持续上升了近15000倍，降解1,25(OH)₂D₃使其失活，1,25(OH)₂D₃的失活又负反馈性调节合成基因CYP27B1的表达上升，但是其上升的倍数远低于降解基因CYP24A1的上升幅度。所以此期1,25(OH)₂D₃的有效作用量实际是下降的，而且受体VDR的表达量也同时下降，这就使得活性维生素D对MOSEC的效应减低，这也是1,25(OH)₂D₃促进II期细胞增值能力的主要原因。当然在Ⅱ期，1,25(OH)₂D₃也表现出抑制MOSEC的EMT进程，下调MMP3的表达，，并且抑制了体外细胞的迁移能力和体内的致瘤能力和转移能力，增强了细胞对紫杉醇的敏感性。

在MOSEC的Ⅲ期，1,25(OH)₂D₃合成基因CYP27B1的表达没有变化，但是降解基因CYP24A1的表达下降，而且VDR的表达没有变化，从而使得1,25(OH)₂D₃的有效作用量上升。因此，此期的1,25(OH)₂D₃同样抑制了MOSEC的EMT进程，上调ESR1、下调SPP1和MMP3的表达，。所以1,25(OH)₂D₃对Ⅲ期MOSEC的增殖和迁移能力均表现为抑制作用。

以上实验结果说明，在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段，虽然加入同样浓度的活性维生素D干预，但是由于维生素D代谢酶和VDR表达的变化，导致每一阶段活性维生素D的有效作用量不同，对细胞增殖能力的影响也不同。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，其特征在于：卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，每次传代及每次更换培养基时添加活性维生素D。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，所使用的培养基中添加活性维生素D、并使其终浓度维持在0.5～3nM。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化，所使用的活性维生素D的终浓度维持在1±0.5nM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养过程中，在-30～-20℃环境下添加活性维生素D。

5.维生素D在制备减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的试剂上的应用，其特征在于：所述维生素D为包括维生素D₂、维生素D₃、维生素D类似物、25–羟维生素D、以及活性维生素D在内的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述维生素D选用活性维生素D。

7.维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，其特征在于：所述维生素D为包括维生素D₂、维生素D₃、维生素D类似物、25–羟维生素D、以及活性维生素D在内的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述维生素D为活性维生素D。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包括维生素D及化疗药物，所述化疗药物包括紫杉醇。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述卵巢癌为起源于卵巢表面上皮细胞的上皮型卵巢癌。