CN101855339A

CN101855339A - 人类癌症干细胞

Info

Publication number: CN101855339A
Application number: CN200880009078A
Authority: CN
Inventors: J·P·马瑟; P·罗伯茨
Original assignee: RAVAN BOITECHNOLOGIES Inc
Current assignee: RAVAN BOITECHNOLOGIES Inc; Raven Biotechnologies Inc
Priority date: 2007-01-22
Filing date: 2008-01-22
Publication date: 2010-10-06
Also published as: JP2010516259A; EP2109668A2; CA2675521A1; AU2008207945A1; KR20100033471A; CA2675521C; WO2008091908A3; IL199836A; US8309354B2; US20080175870A1; IL199836A0; WO2008091908A2; KR101523698B1; EP2109668A4

Abstract

本发明公开了分离的人类癌症干细胞群。还公开了表征、分离和培养人类癌症干细胞的方法。提供了人类癌症干细胞的应用。

Description

人类癌症干细胞

本申请要求以下临时申请的优先权：2007年1月22日提交的60/881,497、2007年3月23日提交的60/907,180、2007年5月4日提交的60/924,247、2007年7月19日提交的60/950,714、2007年9月14日提交的60/972,613，所有这些申请以引用的方式全文并入本文。

技术领域

本发明一般涉及人类癌症干细胞及其分离、表征和应用的方法。更具体地，本发明还涉及鉴定人类癌症干细胞的方法、其在疗法、靶/药物的发现、抗肿瘤疫苗及癌症诊断和治疗中的应用。

背景技术

从患者身体根除癌症是有挑战性的，因为尽管癌性细胞以不受控方式增殖，但这些细胞对身体不一定表现出是“外来的”，并因此难以靶向。现有的癌症治疗往往不足以对准癌细胞，而且对患者的健康组织具有破坏性。这种治疗通常包括X-射线、化疗、质子疗法和手术。能够激起身体免疫系统表现出针对这些癌细胞的阳性免疫应答的治疗将是优选的。

尽管癌细胞表达癌症相关抗原，但癌细胞通常能避开免疫应答，因为其隐藏癌症抗原不接触免疫系统的能力，和/或因为暴露的抗原是人类免疫系统通常能识别或耐受的正常、非突变的分化分子或蛋白质。还已报道癌症干细胞对现有的化疗和放射疗法有抗性。(参见例如，Targeted therapy forcancer stem cells：the patched pathway and ABC transporters(癌症干细胞靶向疗法：修补途径和ABC转运蛋白).Oncogene，(2007)26(9)：1357-60.；Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors(辐射抗性和脑肿瘤中的干样细胞).Cancer Cell(2006)；10(6)：454-6.；WNT/beta-catenin mediatesradiation resistance of mouse mammary progenitor cells(WNT/β-联蛋白介导小鼠乳腺祖细胞的辐射抗性).Proc Natl Acad Sci USA(2007)104(2)：618-23.Epub 2007 Jan 3.)

为了有效使用免疫疗法来治疗癌症，患者必须具有或被提供足够数目的癌症反应性淋巴细胞，所述淋巴细胞既可到达癌症位点又具有破坏癌细胞的效应机制。

当前研究的一些疗法一般来说目标在于提高免疫应答，并包括例如施用化学信使诸如细胞因子(如IL-2和/或IL-12)、端粒酶特异性淋巴细胞以及激发免疫系统的细菌提取物或药物。在为了使免疫应答对肿瘤细胞更具有特异性的尝试中，一些治疗施用自体肿瘤细胞，所述自体肿瘤细胞单独地或联合地与细胞因子如GM-CSF、γ干扰素或IL-2结合，或转染有编码这些细胞因子的基因。在细胞转移疗法已经观察到一些成功例子，其中离体地使自体淋巴细胞对癌细胞敏化并随后输回患者。类似方法使用肿瘤细胞系代替自体肿瘤细胞。

佐剂通常与癌症疫苗免疫疗法一起使用。一种方法使用树突细胞(DC)(其为高效的抗原呈递细胞)以激起患者阳性的抗癌免疫应答。树突细胞表达MHC I类和MHC II类分子、共刺激分子和粘附分子，它们提供信号以刺激初始T细胞(naive T cell)、CD4+T辅助细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)和胸腺衍生的自然杀伤细胞(NKT细胞)。DC具有获取各种类型分子的能力。因此DC可装载各种形式的肿瘤相关抗原(TAA)并作为疫苗施用。

一种基于DC的方法使用通过融合癌细胞和树突细胞产生的DC-癌细胞杂合体，把持续的癌症抗原表达同DC的抗原呈递及免疫刺激能力结合起来。在动物模型中，用DC-癌细胞杂合体免疫可提供一些形式的抗癌保护或根除已形成的疾病。已经显示，包括癌细胞系或原发性人类癌细胞(包括乳腺癌细胞)的自体DC杂合体在体外能够诱导针对自体癌细胞类型的CTL应答。治疗肾细胞癌和神经胶质瘤的临床研究已经证实，接种DC-癌细胞杂合体可安全地诱导患者的抗癌症免疫应答。

一种解释肿瘤如何生长和转移的假说是癌症干细胞假说，所述假说声称在每个肿瘤内有小的、不同的细胞亚群，所述肿瘤能够无限地自身更新和发展为更成熟的复制能力相对受限的肿瘤细胞。已经假设这些癌症干细胞(CSC)可能对化疗剂、辐射或其它毒性条件更有抗性，并因此在临床治疗后继续存在，后来生长为继发性肿瘤、转移瘤(metastases)或造成复发。已认为CSC可产生自组织干细胞或来自更分化的组织祖细胞。尽管关于此的支持数据对造血干细胞和祖细胞以及造血肿瘤是强有力的，但是关于实体肿瘤和其各自的CSC却知之甚少。

认为实体肿瘤产生在包含干细胞群的器官中。这些组织中的肿瘤由增殖和形成新肿瘤的能力显著不同的癌细胞异质群体组成；形成肿瘤能力的该差异已经就例如乳腺癌细胞和中枢神经系统肿瘤进行报道。尽管大多数癌细胞分裂能力有限，但最近的文献表示称为癌症干细胞的癌细胞群具有独一无二的广泛地自我更新和形成新肿瘤的能力。越来越多的证据表明，调节正常干细胞自身更新的途径在癌症干细胞中被解除调节或改变，造成自我更新癌细胞的持续扩张和肿瘤的形成。

已经表示，癌症患者的预后与干细胞表型/生物学相关。(参见例如Molecular profiling identifies prognostic subgroups of pediatric glioblastomaand shows increased YB-1expression in tumors(分子表达谱鉴定儿科胶质母细胞瘤的预后亚组并显示肿瘤中YB-1表达增加).J Clin Oncol.(2007)25(10)：1196-208；Cancer stem cells are central to metastasis，which accountsfor 90％of the lethality of cancer(癌症干细胞对转移是重要的，这造成90％的癌症致死率).Cell Res.(2007)17：3-14.)还已经观察到，对自身干细胞有自身免疫反应的患者显露了癌症进展的减缓。(参见例如“immunity tocancer stem cells may help protect people with a precancerous condition fromdeveloping the full-blown disease(对癌症干细胞的免疫性可有助于保护具有癌前疾患的人们免于产生充分发展的疾病)”J Exp Med(2007)204(4)：831-40.)

组织干细胞存在于特定的龛或微环境，这对将它们维持在适合的发育和代谢状态是关键的。还未完全理解这些微环境，但通过从遗传角度上敲除重要因子而破坏它们可导致发育期间和成体中干细胞的内稳态失调。在试图理解支持组织干细胞/祖细胞的微环境时，许多研究者已经采用衍生出的无血清培养条件的方法，其中培养基、基质和物理环境产生优化的环境以把特定的胎的和新生的组织干细胞/祖细胞(SPC)保持在SPC可复制但不能分化的限定状态(参见例如美国专利第6,436,704和6,416,999号)。对不同类型SPC而不同的优化培养基和培养条件可视为重新产生这些细胞在体内占据的干细胞龛。这些培养基和优化条件是为SPC特别定制的，因为它们特异性地选择出SPC而不支持组织中任何其它细胞类型的存活和/或生长。因此，非SPC细胞在SPC所偏好的条件下将不能存活和复制，并在培养和传代期间被除去，只留下纯的SPC群，即使当SPC只占起始培养物很少的百分比时。该条件还必须除去使SPC进一步分化的任何信号，以使其在培养物中维持较长的一段时间。

一种关于肿瘤如何起源的假说是肿瘤通过一系列突变事件从组织SPC产生。有数据表明在转移过程中当肿瘤细胞在身体上移动时，一些肿瘤细胞将“住进”特定的SPC龛。衍生出的以支持SPC存活和生长的培养基和优化培养条件可能也能优先支持CSC的生长和存活，从而当分散肿瘤被置于培养物中时选择这种类型的细胞。这样的培养基和优化培养条件可允许建立纯的CSC培养物，所述CSC培养物将能够长期或广泛地生长和维持罕见的CSC表型的特征。

已经假设了肿瘤干细胞，但还不存在可靠方式来鉴定这些细胞，且对于它们的所有特征也不存在共识。一些研究者已经提议，可基于标记表达来鉴定癌症干细胞(参见例如A1-Hajj等(2003)Proc Natl Acad Sci USA100：3983-3988；O’Brien等(2007)Nature 445：106-110；和Clarke等(2006)Cell 124：1111-5)。已经提议CD133为见于脑肿瘤中癌症干细胞和人类前列腺上皮干细胞的标记。假设不伴有或伴有低的CD24表达的CD44表达由一些实体癌症干细胞(如乳腺癌)表达。CD34是存在于血管和不成熟血细胞表面的标记，而且与造血干细胞相关联。

建立纯的CSC培养物在研究和理解肿瘤发生和转移的调节，以及在发现和开发针对CSC的癌症疗法方面将有很大益处。因此，存在对鉴定、分离、培养和表征癌症干细胞的方法的需要。

本文所述的发明克服了许多未满足的需要和上述的缺点，并提供人类癌症干细胞的分离、维持和生长方法。本发明还描述了癌症干细胞特征的荟萃，尤其是来自结肠、前列腺、肺、胰腺、乳腺、套细胞淋巴瘤和梅克尔肿瘤的具有CSC生物特征的新细胞群的特征。

经由施用本文所述的基于CSC的疫苗和治疗，本发明还提供简单、有效果和有效率的方法，用以治疗癌症、预防癌症、延迟癌症发病或延迟癌症进展。

附图

图1显示使用确定成分细胞培养基时，CSC集落从前列腺癌肿瘤(PRCA)的选择性生长。

图2显示衍生自基底细胞癌(BCCA1)的、在对这种癌症干细胞类型具有选择性的确定成分培养基中培养的一组CSC集落。

图3显示从结肠(图A-C、F)、梅克尔细胞(图D)和前列腺(图E)肿瘤生长出来的具有类似特色形态的CSC集落。图A和B显示衍生自结肠肿瘤的培养物：培养第42天的原代培养物(A)和3天后同一培养区域(B)。注意图A中明显的小圆细胞(箭头和插图)仍在分裂，而培养物中其它细胞死亡(B)。图3C显示传代了一次后的结肠CSC，其现在已经几乎完全变成干细胞。图A、B和D-F显示原代培养物，其中CSC开始变得明显，且肿瘤的非干细胞成分是静态、垂死或死亡。这些培养物随着持续传代已经全部变成本发明的CSC系，示为：CRCA1115(A、B)、RECA0515(C)、MCC(D)、PRCA0611(E)和CRCA0404(F)。

图4显示SCID小鼠肾被膜下从各种细胞系形成的肿瘤照片。左边是从2种结肠CRC各100个细胞生长7(A-RECA1208)或8(B-RECA0515)周形成的肿瘤。两种情况都可看到实质性肿瘤。中间的图显示植入5×10⁴个CRCA1115结肠CSC细胞(C)的动物在4.5周后形成的肿瘤，或植入高10倍(5×10⁵个)的非CSC RECA0705细胞(D)的动物在8周后形成的肿瘤。D中的白色纤维物质来自植入物中的胶原；高度反光物质是脂肪。此肿瘤的人类DNA出/入比(out/in ratio)＜1.0。图E是植入5×10⁵个来自CSC的前列腺肿瘤细胞后的肾。显示8周后CSC(E-PRCA0425)细胞衍生的肿瘤。这些细胞明显地比图C中见到的在4.5周时的结肠CSC生长更慢，但的确从100个细胞形成肿瘤。最后，图F是植入2.5×10⁵个PRCA0312-43STR细胞5周后的肾。没有可见的肿瘤。因此，使用该SRC异种移植模型，非CSC系明显地同CSC系区分开来。

图5显示使用本发明的结肠(CRCA0404)和梅克尔癌症干细胞系，被称为KID24的抗体减少了小鼠肾下被膜中建立的癌症干细胞转移模型中的肿瘤生长。

图6显示被称为KID24的抗体对转移瘤的作用，尤其是对从肾下被膜中建立的肿瘤转移到包括胰腺的多个器官的梅克尔细胞癌症的作用。使用实施例中描述的对huDNA的QPCR对转移瘤(mets)进行定量。

发明公开内容

本发明涉及肿瘤生物学和细胞生物学领域。一方面，本发明涉及从肿瘤组织培养的癌症干细胞的分离群。该细胞可在无血清营养培养基中培养，并可具有基本上不含血清生物分子的细胞表面。该细胞可在培养中维持很长一段时间而不衰老或丧失生长能力。

本发明的癌症干细胞可用于药物筛选，用作患病组织基因组和蛋白质组表达谱(体外、体内和转移状态)、多价癌症干细胞疫苗、癌症相关抗原的诊断和成像以及鉴别诸如抗体和药物等治疗剂的工具。

本发明的另一方面涉及分离可在培养中维持而不衰老或丧失生长能力(自身更新能力)的大致纯的人类癌症干细胞群的方法。这些方法基于在已经为其生长而优化的环境中培养人类癌症干细胞。用于培养人类癌症干细胞的营养培养基基于已经为支持相应的胎祖细胞/干细胞生长而优化的培养基配方。

本发明另一方面涉及通过功能测定来表征这样的大致纯的人类癌症干细胞群的方法。这种方法是本领域已知的并适于表征本发明的人类癌症干细胞。通常这种方法是在免疫妥协的宿主动物中由植入少量人类癌症干细胞而形成肿瘤的异种移植模型。

本发明另一方面提供表征肿瘤(癌症)干细胞培养物的方法。这种表征可包括表达包括但不限于CD34的特定标记，所述CD34是此前已与造血干细胞关联的标记。

在本发明又另一方面，本发明涉及通过将人类癌症干细胞群引入非人类的哺乳动物接受者而产生人类肿瘤异种移植模型的方法。

在本发明另一方面，本发明涉及使用人类癌症干细胞或其片段作为免疫原的方法，和用来适当地提供分离的癌症干细胞以作为免疫原的方法。这些方法可用于产生抗癌症干细胞治疗剂和诊断剂，和用作疫苗以加强个体的免疫应答。可治疗性地或预防性地使用所述疫苗。向患有癌症的受治疗者施用治疗性疫苗以治疗癌症。在患有癌症的受治疗者的情况中，疫苗可从受治疗者自身癌细胞、或从同种异体癌细胞或肿瘤细胞系制备。向无癌症的受治疗者施用预防性疫苗以减少受治疗者发展癌症的风险。

本发明另一方面提出了提供人类癌症干细胞来源作为生物成分用于开发医药药物的方法，其中人类癌症干细胞培养物被用作癌症干细胞生物成分的来源，这些人类癌症干细胞生物成分中的一种或多种是开发中的药物的靶。

在本发明另一方面，本发明涉及提供人类癌症干细胞培养物用于开发生物测定的方法。人类癌症干细胞培养物可用于生物测定以鉴别可影响人类癌症干细胞生长和/或存活的因子、试剂或化合物。这种效应可包括生长促进、生长阻滞、停滞、死亡、凋亡、代谢变化、基因表达的变化、蛋白质表达的变化或生长/代谢途径的改变。癌症干细胞可用于生物测定和/或药物发现以理解肿瘤发生、肿瘤建成、肿瘤生长和转移的分子途径。

发明详述

为了帮助本领域技术人员实施本发明而提供下文的发明详述。不应将该详述解释成对本发明的限制，因为本领域普通技术人员可以在不违背本发明的精神和范围的情况下修改本文公开的实施方案。在整篇公开中，引用了多种出版物、专利、和已发行的专利说明书作为参考。据此，将这些出版物、专利、和已发行的专利的公开内容以其整体通过引用并入本公开。

除非另有说明，本发明的实施将采用免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，它们属于本领域的技术范围之内。参见例如，Molecular Cloning：a laboratory manual(《分子克隆实验指南》)第2版，Sambrook等(1989)；Current Protocols In Molecular Biology(《最新分子生物学实验方法汇编》)，F.M.Ausubel等编辑(1987)；the series MethodsIn Enzymology(《酶学方法》丛书)，Academic Press，Inc.；PCR 2：A PracticalApproach(《PCR 2：实用方法》)，M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)，Antibodies，A Laboratory Manual(《实验室抗体手册》)，Harlow和Lane编辑(1988)，Adult and Pediatric Urology(《成人和小儿泌尿科学》)，J.Gillenwater等编辑(2002)和Animal Cell Culture(《动物细胞培养》)，R.I.Freshney编辑(1987)。

在用于说明书和权利要求书时，除非文章另外清楚说明，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指称。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，还包括它们的混合物。

在用于说明书和权利要求书时，术语“癌症干细胞”和“CSC”可互换并指实体癌症干细胞。CSC是哺乳动物来源的，并且在优选的实施方案中，这些CSC是人类来源的，但它们不意为限于这些。在用于本文时“肿瘤干细胞”通常指从实体人类肿瘤分离和培养的细胞，并与癌症干细胞互换使用。

癌症干细胞被定义和功能上表征为来自肿瘤的小细胞亚群，它们在合适条件下在体外可无限生长(自身更新的能力)，并能够使用仅少量细胞在体内形成肿瘤。表征CSC的其它常用方法包括细胞表面标记的形态和检查、转录谱和药物响应。

在本发明的实施方案中，多个CSC系已从多种肿瘤类型建立。这些CSC共有一些特征性细胞表面抗原，而另一些细胞表面抗原则截然不同。本发明CSC系的一些实施方案可无限生长并在体内由＜20个细胞形成肿瘤。一些CSC在肾下被膜动物模型或同位异种移植物中自发地转移。本发明的CSC系和衍生自CSC转移瘤的细胞系在细胞表面标记的表达如CD34和CD44的表达中具有特征性的变化。标记的表达可随着培养条件和细胞系在动物中的传代而变化。

已经检查了本文所述的癌症干细胞系的细胞表面抗原的差异展示，细胞表面抗原展示型式也在细胞系于动物中传代后不同，在不同培养条件中(有或没有动物衍生产物)不同，以及在从原发肿瘤到转移肿瘤中不同，但当细胞被维持在所述优选培养基中时，经多次体外传代后仍稳定。细胞表面抗原和细胞标记变化的这一型式可用于鉴定和表征本发明的癌症干细胞。

“抗体”是能够结合抗原的免疫球蛋白分子。在用于本文时，该术语不仅涵盖完整的免疫球蛋白分子，还包括抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、人源化蛋白和包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修饰。

“单克隆抗体”是指单一性的抗体群，其中单克隆抗体包括参与抗原选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体高度特异性地针对单一的抗原位点。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，还包括其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、含有抗体部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和包括所需特异性的抗原识别位点和结合抗原能力的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。不预期在抗体来源或制备抗体的方式(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)方面受到限制。

“人源化”抗体是指一种分子，其具有来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人类免疫球蛋白结构和/或序列的分子的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包含与恒定结构域融合的完整可变结构域，或只包含移植进可变结构域中合适框架区的互补决定区(CDR)。

术语“抗原”是可包含抗体能够结合的一个或多个抗原决定簇或表位的分子。抗原是可具有免疫原性即诱导免疫应答的物质。抗原被认为是一类免疫原。在用于本文时，术语“抗原”意欲指全长蛋白质及其含有或包括一个或多个表位的肽片段。抗原还可包括一个或多个抗原决定簇的位点，或包括这种位点的一种或多种片段、这种位点的变体或这种位点的类肽(peptidomimetics)。抗原可以是蛋白质、部分蛋白质或非蛋白质。这些化合物可被糖基化。

术语“表面抗原”和“细胞表面抗原”在本文中可以互换使用，指细胞的质膜成分。这些成分包括但不限于整合膜蛋白和外周膜蛋白、糖蛋白、多糖、脂类、和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)连接的蛋白质。“整合膜蛋白”是穿越细胞质膜脂双层的跨膜蛋白质。典型的整合膜蛋白由至少一个跨膜区段组成，它通常包含疏水的氨基酸残基。外周膜蛋白不伸入脂双层的疏水内部，它们通过与其它膜蛋白的非共价相互作用而结合在膜表面。GPI连接的蛋白质是通过插入脂双层的脂尾而停留在细胞表面的蛋白质。

“免疫原”指诱导免疫应答的任何物质。将作为免疫原的物质描述成是“免疫原性的”。诱导免疫应答包括但不限于激活体液应答(如生成抗体)或细胞应答(如引发细胞毒性T细胞)、炎症应答(如募集白细胞)、和分泌细胞因子和淋巴因子。

术语“异源的”在指称用于免疫或移植的细胞时指细胞衍生自基因型与接受者不同的实体。例如，异源细胞可以衍生自相对于接受者的不同物种或相同物种的不同个体。衍生自一种物种的个体的胚胎细胞与相同物种的成体是异源的。“异源的”在指称接受者时指接受者是基因型与被导入接受者的细胞的来源不同的实体。

当在至少约50％的人类癌症干细胞表面、更优选至少约75％的人类癌症干细胞表面、甚至更优选至少约90％的人类癌症干细胞表面、最优选至少约95％的人类癌症干细胞表面上，没有衍生自血清的、结合于细胞表面使得抗原性位点或抗体结合位点受到束缚或不能用于经由抗体或抗体部分的抗原性识别的血清生物分子时，细胞表面是“基本上不含血清生物分子”的。可以通过显微镜或流式细胞术测量细胞大小，来确定细胞表面。例如，各种已知大小的合成珠子常用于校准流式细胞术。可以将少量的校准珠子与癌症干细胞混合，并通过流式细胞术分析产生的群体。然后可以将人类癌症干细胞与校准珠子的大小进行比较。由于珠子的大小是已知的，那么就可以实现细胞表面量的计算。

在用于本文时，“衰老”指细胞丧失分裂能力的现象。

在用于本文时，“大致纯的”细胞群是包含至少约85％、优选至少约90％、甚至更优选约95％或更多的目标细胞的细胞群。

“血清”在用于本文时指哺乳动物血液在血液凝结后剩余的流体相(fluid phase)。

“血清生物分子”在用于本文时指在血清中发现的生物组合物。实例包括但不限于白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g-球蛋白。血清生物分子包括在血清中自然发现的或衍生自对血清的加工和处理的生物组合物(全部或部分)。

术语“哺乳动物”或“哺乳动物的”指温血脊椎动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、猿猴、运动动物(sport animal)和宠物。

癌症干细胞抗原

在本发明的实施方案中，已经在本文公开的癌症干细胞表面上检测到某些抗原。这些包括已知抗原、新型抗原和此前未与组织或癌症干细胞关联的抗原。通过示例但并不局限于此，这些抗原包括B7H3(各种表位)、CD46、运铁蛋白受体、CD112(脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2)、ephA2受体、EGFR、ALCAM(CD166)、α-V-β-5、JAM3、丙酰辅酶A羧化酶α、羧肽酶M、羧肽酶C、LDL-受体、桥粒芯糖蛋白2、ADAM9、CEA CD66e、制瘤素M受体β、α2整联蛋白和前列腺蛋白。表达这些抗原的细胞系特别优选用于本发明的方法。

分离和获得这些癌症干细胞抗原的方法是常用的。优选的方法使用针对这些抗原的抗体。以下公开提供了针对一些这样抗原的抗体的实例：B7H3(PCT WO 2004/001381和US 60/733,041，尤其是抗体TES7、PTA-7093)、CD46(US 7,148,038，尤其是抗体PA7、PTA-3706)、运铁蛋白受体(PCT WO 05/121179，尤其是抗体LUCA31、PTA-6055)、ephA2受体(PCT WO 06/084226，尤其是抗体SPL1、PTA-6059)、JAM3(PCT WO06/084078，尤其是抗体PACA4、PTA-6510)、羧肽酶M(PCT WO 06/076584，尤其是抗体KID31、PTA-6516)、ADAM9(PCT WO 06/084075，尤其是抗体KID24、PTA-5174)和制瘤素M受体β(PCT WO 06/084092，尤其是抗体LUCA38、PTA-6511)。根据本文的教导，这些抗体尤其可用作癌症干细胞标记。

这些抗原是期望的标记，一般用在鉴定癌症干细胞、发现新的癌症干细胞或鉴定癌症干细胞的所选亚群，诸如组织特异性或发育阶段特异性的癌症干细胞。本发明公开迄今还未被认为是癌症干细胞特异性的多组抗原，从而实现能够描述细胞和鉴定其干细胞性的方法。可使用流式分析和其它常用已知手段，基于本文公开的一些或所有干细胞标记单独或联合其它已知标记的存在，从细胞群中将细胞选出来。常规实验用于确定本文公开的抗原在细胞表面的存在，以允许为特定组织、细胞或细胞培养物收集独特的癌症干细胞抗原“指纹”。

发明人已经鉴定来自实体肿瘤的绝大多数癌症干细胞上存在的一组标记。这些组包括以上鉴定的一些或所有抗原。它们并非专有地仅存在于癌症干细胞上；使用本文教导的方法，这些标记将结合(到某程度)于正常组织干细胞、正常组织、肿瘤组织或子细胞。许多这些抗原存在于正常和癌症干细胞上。一些抗原存在于本文公开的癌症干细胞系中的至少五种上，诸如B7H3(所有表位)。预期实体肿瘤衍生的癌症干细胞的标记谱将不同于衍生自造血细胞的癌症干细胞的标记谱。

这些抗原还可用于评估细胞表面随时间的变化。在未显示的数据中，使用一组抗体和三对癌症干细胞系进行比较和差异结合测定：在第11和12次传代评估乳腺癌干细胞系BRCA1103以显示测定的可重复性；在第10和16次传代评估直肠癌癌症干细胞系RECA0515以显示细胞系的稳定性，并且结肠直肠癌癌症干细胞系CRCA0404用于比较亲代细胞系和来自该系的克隆。RECA0515的第10代对比第16代的抗原谱差异为13％，BRCA1103的第11代对比第12代差异为2％，并且CRACA0404对比克隆抗原谱差异为6％。

如本文公开的，选择癌症干细胞标记组以优化选择具有期望特征的细胞；例如，子细胞、转移沉积处的细胞、或已经在体内传代的细胞的标记谱将不同于来自组织或原代细胞培养物的癌症干细胞的标记谱。

某些抗原不会在肿瘤组织的所有细胞上表达，但将在该肿瘤的癌症干细胞上存在；本领域通常已知确定这类差异表达的方法。

本文公开的使用这些癌症干细胞抗原作为标记的方法有效地联合用于鉴定癌症干细胞的其它方法，诸如使用细胞培养方法选择、评估表型或形态。

这些特别优选的抗原是期望的疫苗成分，它存在于多价疫苗、联合治疗组合物，或作为单独治疗组合物来预防、治疗或诊断疾病。结合于这些癌症干细胞抗原的试剂可用于对癌症干细胞的靶向治疗或诊断部分。

本发明的各方面包括具有癌症干细胞形态、并与以下抗体中的一种或多种结合的分离的癌症干细胞：TES7、PA7、LUCA31、SPL1、PACA4、KID31、KID24和LUCA38。

本发明的癌症干细胞还用于发现和筛选抗原，所述抗原被配体结合时调节细胞因子诸如血管生成因子和生长因子的产生。例如，本文称为TES7的针对B7-H3异构体(isoform)的癌症干细胞结合抗体，减少基质细胞和癌症干细胞分泌血管生成因子VEGF和MIP-1α(CCL3)。TES7和本文称为KID24的抗体已经显示具有调节细胞因子途径和细胞因子信号转导的能力。这为能够驱动肿瘤生长的信号转导机制提供了新见解，且本发明的癌症干细胞提供鉴定生长调节性抗体的能力，这在标准生长测定中是会被忽略的。根据本发明的教导，针对本发明癌症干细胞上存在的抗原而产生的抗体被用于细胞因子测定以确定抗体/抗原是否调节细胞因子信号转导。适合用于实施本发明的大量细胞因子测定是本领域熟知的。

实体癌症干细胞的分离和维持

在优选的实施方案中，从实体人类肿瘤组织分离出本发明的人类癌症干细胞。以下方法是示例性的而不是限制性的；其它通常已知的方法在实施本发明时是可被接受的。

用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗实体人类肿瘤组织，优选地数次。PBS可含有抗生素和/或抗真菌剂，诸如但不限于庆大霉素。将实体人类肿瘤组织切碎为大约1mm的立方体，悬浮在解离培养基中。解离培养基是补充了细胞解离剂的基础培养基。可使用多种解离剂，包括但不限于EDTA、EGTA、胰蛋白酶和胶原酶-分散酶。优选的解离剂是在允许细胞从切碎的肿瘤组织部分解离的浓度下使用的胶原酶-分散酶。优选的浓度是10％(重量/PBS体积)。解离培养基中还可包括胰蛋白酶抑制剂的使用。优选的胰蛋白酶抑制剂是以适合的浓度使用的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)。作为非限制性实例，STI的一种典型的适合浓度是10％(v/v)。

在37℃将细胞孵育在解离培养基中。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当细胞团块大小为10-20个细胞时终止酶促活性。离心使细胞成粒状沉淀并以基础培养基洗涤，再离心使细胞成粒状沉淀。除去上清液，将组织重悬于基础培养基，随后转到培养盘。

多种基础培养基用于保持液体的pH在促进人类实体癌症干细胞存活的范围。非限制性实例包括F12/DMEM、Ham’s F10(Sigma)、CMRL-1066、最小必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma)、OPTI-(GIBCO BRL)和Iscove改良的Eagle培养基(IMEM)。此外，还可使用描述于以下的任何基础营养培养基：Ham和Wallace(1979)Meth.Enz.，58：44，Barnes和Sato(1980)Anal.Biochem.，102：255，或Mather，J.P.和Roberts，P.E.(1998)“Introduction to Cell and TissueCulture(细胞和组织培养导言)”，Plenum Press，New York。在一些情形下，基础培养基可使用果糖作为糖源，诸如在专利申请公布WO 2005/028626中描述的培养基中。

将基础培养基加入培养盘并在37℃潮湿环境孵育组织。在促进癌症干细胞存活和生长的优选实施方案中，加入多种营养以补充基础培养基，从而产生“营养培养基”。将人类癌症干细胞团块置于该培养基，而在一优选实施方案中，CSC迁移离开细胞团块并进入培养基且锚定于培养盘或所提供的其它锚定材料上。切碎的组织的不贴附于培养盘或锚定材料的残余物将在培养基中流动并在培养一小段时间如1-2周后通过更换培养基而被除去。

在另一优选实施方案中，置于营养培养基的来自人类癌细胞团块的细胞全部贴附于培养盘，而且人类癌症干细胞在来自人类肿瘤的其它细胞类型之中缓慢地建立和生长。最终，人类癌症干细胞将形成大致纯的细胞群，而其它污染细胞类型将不再存在于培养物中。培养过程和环境将不支持污染细胞类型的复制和/或存活，并将促进人类癌症干细胞的存活和生长，从而产生大致纯的人类癌症干细胞群。人类癌症干细胞群能够在培养中长期生长，并能够广泛增殖和生长而不衰老。

人类癌症干细胞可生长在未包被或以不同基质包被的组织培养容器(如烧瓶、板等)中。可使用的基质的非限制性实例包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原、聚赖氨酸、硝化纤维素、尼龙和聚四氟乙烯。组织培养容器的大小与置于容器中的人类肿瘤组织的量成比例。本领域技术人员可通过逐步增加置于组织培养容器中的肿瘤组织而确定组织培养容器的适当大小。当首次将人类肿瘤组织置于组织培养容器中时，培养基的总浊度通常是清澈的。当细胞迁移出并离开肿瘤组织块时，培养基将变得更不透明和更浑浊。在培养基高度浑浊时的时间点，通过加入更新鲜的培养基或完全更换培养基，将更营养的培养基放入组织培养容器以补充人类肿瘤细胞消耗的营养。此外或选择性地，当培养基变得浑浊时，可从组织培养容器取出少量细胞并检查细胞存活力，例如用台盼蓝染色。已经有太多细胞泛滥的组织培养容器将开始显示减少的细胞存活力。

持续培养人类癌症干细胞通常涉及转移细胞到一个或多个新培养容器。优选地，这种转移在培养容器中细胞泛滥(例如由细胞存活力减少而证实)之前进行。细胞可转移到更大的其它容器(如更大的立方体积)以容纳数量增加的细胞。或者，细胞可“分配(split)”到具有新鲜营养培养基的若干个不同组织培养容器(也称为“传代培养”)。以这种方式，可获得和繁殖大致纯的人类癌症干细胞群。

优选地通过酶处理来将细胞从塑料组织培养容器表面和/或所用的基质(如纤连蛋白、层粘连蛋白等)解脱而完成从组织培养容器移出细胞。在更优选的实施方案中，诸如胶原酶-分散酶的酶以从组织培养瓶侧面解离人类癌症干细胞的有效量使用。有效量是至少约10％，更优选地至少约1％，和最优选地至少约0.1％的胶原酶-分散酶(按体积计)。从组织培养容器表面解脱细胞后，以基础培养基、优选地以本文公开的营养培养基洗去酶，然后将细胞置于具有营养培养基、优选地具有本文公开的营养培养基的新培养容器中。营养培养基可包括生长因子和化合物，所述生长因子和化合物在为与人类癌症干细胞有相同组织来源的胎干细胞/祖细胞而优化的营养培养基中可见。

喂养人类癌症干细胞的频率取决于细胞营养代谢速率以及所加入的激素和生长因子的稳定性。营养代谢速率越高，细胞需要被喂养得更频繁。通常，随着细胞代谢培养基中的营养，培养基酸度将增加。一些营养培养基(如RPMI-1640、DMEM、EMEM等)含有指示酸度的pH敏感染料，以使培养基变成酸性时改变颜色。随后可加入营养培养基以将现有培养基的酸度变为将维持细胞生命和促进细胞生长的酸度。或者，可从组织培养容器取出少部分细胞并评估细胞存活力，例如以台盼蓝染色。如果营养培养基已经被代谢，细胞存活力将变差(例如少于50％)。促进人类癌症干细胞在无血清的确定成分培养基中存活和生长的优选喂养频率约为一周两次。本发明的人类癌症干细胞能够在培养中长期生长而不衰老。

人类结肠直肠癌干细胞(CRCA)

从人类结肠直肠癌组织分离人类结肠直肠癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于结肠直肠癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类结肠直肠癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、硒、三碘甲腺原氨酸(T3)、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松和I-生育酚(维生素E)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类结肠直肠癌干细胞的存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/ml EGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1×10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-11M氢化可的松和不超过1×10^-7M氢化可的松，更优选地1×10^-9M；至少100ng/ml维生素E和不超过100μg/ml维生素E，更优选地5μg/ml维生素E。抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类结肠直肠癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。这种基质的实例包括但不限于胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、基质胶(Matrigel)等等。尤其优选的实施方案是在包被有纤连蛋白或层粘连蛋白的培养盘上生长和传代人类结肠直肠癌干细胞。

人类直肠癌干细胞(RECA)

从人类直肠癌组织分离人类直肠癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于直肠癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类直肠癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选的实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松、维生素E和猪垂体提取物(PPE)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类直肠癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/ml EGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M；至少1x10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-11M氢化可的松和不超过1×10^-7M氢化可的松，更优选地1×10^-9M；以及至少100ng/ml维生素E和不超过100μg/ml维生素E，更优选地5μg/ml维生素E。

其它生长因子可加入营养培养基以促进人类直肠癌干细胞的生长和存活。这种生长因子可包括但不限于来自动物垂体的垂体提取物。有许多本领域已知的动物垂体提取物。优选的垂体提取物的实例包括但不限于人类垂体提取物(HPE)、牛垂体提取物(BPE)和猪垂体提取物(PPE)。制备垂体提取物是本领域熟知的并可适于本发明人类癌症干细胞的分离和生长。

一种制备猪垂体提取物的优选方法包括使用100克猪垂体并加入250ml的0.15M的NaCl。在冷冻食品处理器中将垂体和NaCl混合物振动几次并随后在食品处理器中成泥大约10分钟或直到达到期望稠度。随后将混合物转入烧杯并在磁力搅拌器上搅拌大约90分钟。随后将混合物转入适合的管并以18,000rpm在4℃离心45分钟。倾析上清液并以20,000rpm在4℃离心上清液45分钟。将上清液过滤通过0.8μm滤器，随后通过0.45μm滤器，最后通过0.22μm滤器。PPE的浓度(总蛋白/ml)可使用本领域已知的标准方法确定。优选地，蛋白质浓度应为大约15mg/ml的PPE。所得的猪垂体提取物可分等份并冷冻直到需要。

上述方法中制备的猪垂体提取物可加入营养培养基以促进本发明的人类直肠癌干细胞的存活和生长。在一优选实施方案中，为了本发明的人类直肠癌干细胞的存活和生长，加入至少7μg PPE总蛋白/ml营养培养基但不超过7mg PPE总蛋白/ml营养培养基，更优选地大约75μg PPE总蛋白/ml营养培养基。

抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类直肠癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。尤其优选的实施方案是在包被有纤连蛋白、层粘连蛋白或纤连蛋白和层粘连蛋白混合物的培养盘上生长和传代人类直肠癌干细胞。

人类肺癌干细胞

从人类肺癌组织分离人类肺癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将该组织置于肺癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类肺癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒和猪垂体提取物(PPE)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类肺癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/mlEGF，更优选地5ng/ml EGF；至少约1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；以及至少7μg PPE总蛋白/ml和不超过7mg PPE总蛋白/ml，更优选地75μg PPE总蛋白/ml。抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类肺癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。这种基质的实例包括但不限于胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、基质胶等等。尤其优选的实施方案是在包被有纤连蛋白的培养盘上生长和传代人类肺癌干细胞。

人类胰腺癌干细胞

从人类胰腺癌组织分离人类胰腺癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于胰腺癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类胰腺癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选的实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松、孕酮、毛喉素、调蛋白和抑酶肽(aprotinin)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类胰腺癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/mlEGF，更优选地5ng/ml EGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1×10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-11M氢化可的松和不超过1×10^-7M氢化可的松，更优选地1×10^-9M；至少1×10^-10M孕酮但不超过1×10^-6M孕酮，更优选地1×10^-8M孕酮；至少10nM毛喉素但不超过100μM毛喉素，更优选地约5μM毛喉素；至少10pM调蛋白(HRG)但不超过100nM调蛋白，更优选地1-3nM调蛋白；以及至少500ng/ml抑酶肽但不超过500μg/ml抑酶肽，更优选地25μg/ml抑酶肽。抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类胰腺癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。在尤其优选的实施方案中，在包被有纤连蛋白的培养盘上生长和传代人类胰腺癌干细胞。可每天监控人类胰腺癌干细胞培养物。可收集培养基以补充随后培养物的营养培养基。在一优选实施方案中，每三天收集人类胰腺癌干细胞的培养基并以0.22μm滤器过滤。该条件培养基可以以至少1％(v/v)但不超过80％(v/v)以及更优选地20％v/v的浓度加入随后的培养物。

人类胰腺癌干细胞在开始铺板后7-10天内形成上皮样集落，且这些上皮样集落将在非分裂的基质样细胞间延展。人类胰腺癌干细胞可传代和继代培养。本领域技术人员可确定人类胰腺癌干细胞是否准备好传代培养。在一优选实施方案中，人类胰腺癌干细胞可在开始铺板后至少14天和在开始铺板后不超过40天，更优选地在开始铺板后21-24天继代培养。当传代培养人类胰腺癌干细胞时，可以以至少1∶2的比例但不超过1∶25的比例，更优选地以1∶3的比例将它们继代培养到纤连蛋白包被的盘上。当在抑酶肽的存在下不能观察到进一步的生长刺激时，可从培养物中去掉该生长因子。

人类梅克尔细胞癌干细胞

从人类梅克尔细胞癌组织分离人类梅克尔细胞癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于梅克尔细胞癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类梅克尔细胞癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松、毛喉素、孕酮和猪垂体提取物(PPE)。任选地，可向基础培养基加入神经生长因子β(NGF-β)作为补充营养。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类梅克尔细胞癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/ml EGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1×10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-11M氢化可的松和不超过1×10^-7M氢化可的松，更优选地5×10^-6M；至少10nM毛喉素和不超过500μM毛喉素，更优选地1-5μM毛喉素；至少1×10^-10M孕酮和不超过1×10^-6M孕酮，更优选地10×10^-8M孕酮；以及至少7μg PPE总蛋白/ml和不超过750μg PPE总蛋白/ml，更优选地约75μgPPE总蛋白/ml。当在PPE的存在下不能观察到进一步的生长刺激时，可从培养物中去掉该生长因子。

在一些情形下，可将神经生长因子β(NGF-β)加入营养培养基以促进梅克尔细胞癌干细胞的生长。当使用NGF-β时，使用至少100pg/ml的NGF-β和不超过1μg/ml的NGF-β，更优选地10ng/ml的NGF-β。当在NGF-β的存在下观察不到进一步的生长刺激时，可从培养物中去掉该生长因子。抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类梅克尔细胞癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。在尤其优选的实施方案中，在包被有纤连蛋白的培养盘上生长和传代人类梅克尔细胞癌干细胞。

人类前列腺癌干细胞(PRCA)

从人类前列腺癌组织分离人类前列腺癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于前列腺癌干细胞维持营养培养基并允许CSC生长。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类前列腺癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基，不含添加钙。补充营养的实例包括但不限于钙、胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松、睾酮和猪垂体提取物(PPE)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类前列腺癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/ml EGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1×10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-11M氢化可的松和不超过1×10^-7M氢化可的松，更优选地1-5×10^-9M；至少50pg/ml睾酮和不超过5μg/ml睾酮，更优选地50ng/ml睾酮；以及至少150ng PPE总蛋白/ml和不超过150μgPPE总蛋白/ml，更优选地约15μgPPE总蛋白/ml。在另一优选实施方案中，没有向营养培养基加入睾酮。本领域技术人员可确定加入睾酮对人类前列腺癌干细胞的生长是否有利。在建立和维持人类前列腺癌干细胞中，钙水平也可变化。在一些情形下，营养培养基中不含添加钙对于建立人类前列腺癌干细胞有利。在其它情形下，低水平的添加钙对于建立人类前列腺癌干细胞有利。当在营养培养基中使用低水平的添加钙时，使用至少1nM钙和不超过100mM钙，更优选地0.1mM钙。本领域技术人员能够确定使用钙对于人类前列腺癌干细胞的分离和/或生长是否有利。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类前列腺癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。在尤其优选的实施方案中，在包被有层粘连蛋白的培养盘上生长和传代人类前列腺癌干细胞。

人类乳腺癌干细胞(BRCA)

从人类乳腺癌组织分离人类乳腺癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于乳腺癌干细胞维持营养培养基。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类乳腺癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松、前列腺素E1和猪垂体提取物(PPE)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类乳腺癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/mlEGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1×10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-10M氢化可的松和不超过1×10^-6M氢化可的松，更优选地1-5×10^-8M；至少10pg/ml前列腺素E1(PGE1)和不超过100μg/ml PGE1，更优选地100ng/ml PGE1；以及至少150ng PPE总蛋白/ml和不超过150μg PPE总蛋白/ml，更优选地约15μgPPE总蛋白/ml。抗生素和/或抗真菌剂诸如庆大霉素、青霉素和/或链霉素也可加入培养基，但优选地抗生素/抗真菌剂仅在培养的开始阶段(例如头2至5天)期间加入。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类乳腺癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。在尤其优选的实施方案中，在包被有纤连蛋白的培养盘上生长和传代人类乳腺癌干细胞。

人类乳腺癌干细胞在培养物中建立后，可使用本领域已知的常规方法将细胞冷冻。当解冻冷冻的人类乳腺癌干细胞用于培养时，在培养的开始阶段(例如头1至5天)期间加入胎牛血清(FBS)可利于培养物的建立。本领域技术人员能够确定在解冻人类乳腺癌干细胞后在培养的开始阶段期间加入胎牛血清是否是有利的。在一优选实施方案中，解冻人类乳腺癌干细胞后在培养的开始阶段期间将2％FBS(v/v)加至营养培养基。2-5天后更换营养培养基并去掉FBS。在最初的解冻之后，胎牛血清对于人类乳腺癌干细胞的生长不是必需的。

人类基底细胞癌干细胞(BCCA)

从人类基底细胞癌组织分离人类基底细胞癌干细胞。清洁、切碎和解离肿瘤组织后，将其置于基底癌干细胞维持营养培养基。该营养培养基是适合的基础培养基，包括为人类基底细胞癌干细胞的生长和繁殖而优化的营养。优选实施方案使用F12/DMEM(50∶50)基础培养基。补充营养的实例包括但不限于胰岛素、运铁蛋白、EGF、硒、T3、乙醇胺、磷酸乙醇胺、氢化可的松和猪垂体提取物(PPE)。在一优选实施方案中，以下量的营养用于促进人类基底细胞癌干细胞存活和生长：至少约10ng/ml胰岛素和不超过约1mg/ml胰岛素，更优选地约10μg/ml胰岛素；至少约1μg/ml运铁蛋白和不超过约100μg/ml运铁蛋白，更优选地约10μg/ml运铁蛋白；至少约500pg/ml表皮生长因子(EGF)和不超过5μg/ml EGF，更优选地5ng/mlEGF；至少1×10^-10M硒和不超过1×10^-6M硒，更优选地2.5×10^-8M硒；至少1x10^-14M三碘甲腺原氨酸(T3)和不超过1×10^-10M T3，更优选地1×10^-12M T3；至少1×10^-8M乙醇胺和不超过1×10^-4M乙醇胺，更优选地1×10^-6M乙醇胺；至少1×10^-8M磷酸乙醇胺和不超过1×10^-4M磷酸乙醇胺，更优选地1×10^-6M磷酸乙醇胺；至少1×10^-10M氢化可的松和不超过1×10^-6M氢化可的松，更优选地1×10^-8M；以及至少7μg PPE总蛋白/ml和不超过750μgPPE总蛋白/ml，更优选地约75μg PPE总蛋白/ml。

细胞可在本领域熟知的多种培养容器中生长和传代。优选的实施方案是人类基底细胞癌干细胞被培养在已包被有基质的培养盘。有多种本领域已知的培养基质。在尤其优选的实施方案中，在包被有纤连蛋白的培养盘上生长和传代人类基底细胞癌干细胞。

人类癌症干细胞的表征

以本文公开的方式分离的本发明的人类癌症干细胞具有几个定义性的特征。首先，人类癌症干细胞可由其生长潜能(自我更新能力)表征。人类癌症干细胞适合在细胞培养中长期生长而不失去它们的增殖能力。

本发明的人类癌症干细胞可在为其生长而优化的配制的基础营养培养基中维持而不失去它们的增殖能力。本文公开的优选的营养培养基可用于在体外培养人类癌症干细胞。不同类型的基质或组织培养板可用于增进一些人类癌症干细胞的生长。

如本领域普通技术人员熟知的，通常把血清加入到营养培养基以进一步增进细胞生长。血清和其它动物衍生的蛋白质或培养基添加剂含有血清生物分子，且尤其优选地，本发明的人类癌症干细胞生长在不添加或添加最少量血清生物分子的条件下。本文提供的无血清确定成分培养基被优化以选择CSC。培养基提供CSC生长必需的营养和生长因子，并除去血清中可能存在的任何不同信号。

本发明的人类癌症干细胞可维持在长期培养中并继代培养。正如本文公开的，在培养中任意所选时间和任何传代后，人类癌症干细胞可以作为免疫原，用于生物测定以建立异种移植模型中的人类肿瘤模型，或用于药物发现和/或开发。

使用标记表征人类癌症干细胞

本发明中人类癌症干细胞的另一特征是其特异性标记的表达。已报道有多种标记在人类癌症干细胞中表达，包括CD24、CD34、CD133和CD44。在一优选实施方案中，本发明的人类癌症干细胞表达CD34。CD34是已被报道在造血癌症干细胞上表达的标记。此前还未观察到培养中的实体人类癌症干细胞表达CD34。本发明的特征是实体肿瘤细胞中表达的CD34作为鉴定实体癌症干细胞的标记。本发明优选的人类癌症干细胞表达可检测水平的CD34。

由形态表征人类癌症干细胞

形态学特征可鉴别以本文公开的方式分离的本发明的人类癌症干细胞。如本文公开的，人类癌症干细胞在体外生长为贴壁细胞或以悬浮培养物，取决于人类癌症干细胞所分离自的肿瘤来源。人类癌症干细胞的形态是小的，大小大约8-15μm。当以本文公开的方式分离人类癌症干细胞时，人类癌症干细胞可因其小的尺寸区别于其它细胞类型。人类癌症干细胞可以簇或岛样生长，最终形成单层培养物。当生长为贴壁细胞时，人类癌症干细胞可具有立方形外表，尽管人类癌症干细胞的外表可根据所述人类癌症干细胞所分离自的肿瘤来源和培养条件而变化。当生长为悬浮培养物时，人类癌症干细胞可为圆形和囊样簇，且单个细胞可具有发射状物(projectile)。

人类癌症干细胞的功能表征

人类癌症干细胞的另一特性是由异种移植物中少量细胞在体内形成肿瘤的能力。数种异种移植模型适用于功能表征癌症干细胞并且是本领域熟知的。两种优选的异种移植模型是在免疫妥协小鼠皮下植入细胞和在免疫妥协小鼠肾脏被膜(或肾被膜)下植入细胞。

当在异种移植模型植入人类癌症干细胞时，基质可用来便于操纵少量细胞。适合的基质的实例包括但不限于胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和基质胶。人类癌症干细胞可封装入基质，所得的“塞子”可直接植入宿主动物。

植入宿主动物后，允许人类癌症干细胞生长一段适合的时间。如果使用皮下异种移植模型，所致的肿瘤形成可在一段适合的时间后在动物中目视或触诊。如果使用肾下被膜异种移植模型，在一段适合的时间后将宿主动物处死并可目视检查肾的肿瘤形成的存在。检测肿瘤形成的其它方法也是本领域已知的并且可以是适合的。例如，可使用人类特异性引物对切除的肾进行定量PCR(QPCR)。可将人类DNA的量定量以确定肿瘤形成的程度。

检测肿瘤形成的另一方法是切除肿瘤并在组织学上确定形成的肿瘤是否是人类细胞来源的。如果关于肿瘤表型的其它信息是重要的，那么该方法尤其优选。

人类癌症干细胞的应用

免疫原

人类癌症干细胞的一种用途是作为免疫原。如本发明公开的，独特的无血清培养条件允许人类癌症干细胞的细胞表面保持不含可能结合于表面的血清蛋白质或血清生物分子。通过使用所公开的无血清分离和培养技术，避免了抗原性位点可能被血清生物分子的结合所“掩蔽”的潜在问题。因此，可以生成针对最近才能够获得的、在使用含血清培养条件时被“掩蔽”的抗原的一组抗体。

通过本文公开的方法分离和培养的人类癌症干细胞可以作为施用于异源接受者的免疫原使用。将人类癌症干细胞作为免疫原施用于异源接受者的方法包括但不限于：免疫接种、通过直接接触(诸如擦拭或刮涂装置)施用于膜、通过气溶胶施用于粘膜和口服施用。正如本领域众所周知的，免疫接种可以是被动的或主动的免疫接种。可以通过不同途径来执行免疫接种方法，包括但不限于腹膜内注射、皮内注射、爪垫注射和局部注射。免疫接种的受治疗者可包括哺乳动物，诸如小鼠。免疫接种的途径和程序通常遵循已建立的和常规的用于抗体刺激和生成的技术。虽然此实施方案采用小鼠，但是可以依照本发明的步骤操纵任何哺乳动物受治疗者包括人或由此而来的抗体生成细胞，作为生成哺乳动物杂交瘤细胞系的基础。通常，在小鼠腹膜内接种免疫原性量的人类癌症干细胞，然后用相似量的免疫原进行加强。在一优选的实施方案中，通过爪垫注射为小鼠接种免疫原性量的人类癌症干细胞(有或没有佐剂)，然后用相似量的免疫原进行加强。或者，通过外科手术将在非生物膜基质上生长的细胞腹膜内植入到宿主哺乳动物。在最后一次加强后几天，收集淋巴样细胞(优选来自小鼠的脾淋巴样细胞)，并由此制备细胞悬浮液用于融合。

使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256：495-497的一般体细胞杂交技术，依照Buck，D.W.等人(1982)In Vitro，18：377-381的修改方案，由淋巴细胞和永生化骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可以利用的骨髓瘤系，包括但不限于X63-Ag8.653和来自美国加利福尼亚州圣迭戈市细胞分配中心(CellDistribution Center)索尔克研究所(Salk Institute)的骨髓瘤系，可用于杂交。该技术包括使用融合剂诸如聚乙二醇或者通过本领域技术人员众所周知的电手段来融合骨髓瘤细胞和淋巴样细胞。融合后，将细胞与融合培养基分开，并在选择性生长培养基诸如HAT培养基中培养，以消除未杂交的亲代细胞。本文所述任何培养基都可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为细胞融合技术的另一种变通，可以将EBV永生化B细胞用于生成本发明的单克隆抗体。如果需要，将杂交瘤进行扩增和亚克隆，并通过常规免疫测定程序(如放射免疫测定法、酶免疫测定法或荧光免疫测定法)对上清液测定抗免疫原活性。

可以使用已知程序在体外或在体内培养生成这些抗体的杂交瘤。如果需要，可以通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析和超滤，由培养基或体液分离单克隆抗体。若存在非期望活性，则可以通过例如使制剂流过由免疫原附着于固相而制成的吸附剂并从免疫原洗脱或释放期望抗体而消除。

还可以用重组DNA的方法制备单克隆抗体，诸如美国专利第4,816,567号中描述的方法。使用常规程序可易于分离和测序编码本发明单克隆抗体的DNA(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离后，可将DNA置入表达载体，随后将表达载体转染入不以其他方式产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以获得在重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。原核宿主诸如大肠杆菌也适于本文抗体的重组产生。还可修饰DNA，例如，通过以人类重链和轻链恒定域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利第4,816,567号)或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分共价连接于免疫球蛋白编码序列。这种非免疫球蛋白多肽可取代通过使用本发明细胞作为免疫原产生的抗体的恒定域，或可取代使用本发明细胞产生的抗体的一个抗原结合位点的可变域以产生嵌合二价抗体。

以这种方式，可以使用本发明的人类癌症干细胞，生成针对人类癌症干细胞特异性细胞表面抗原的一组新抗体。通过本文公开的方法生成了针对人类癌症干细胞上的细胞表面抗原的单克隆抗体后，抗体具有几种用途。

为了产生重组抗体或人源化抗体，可以将抗体测序和克隆。人类癌症干细胞特异性抗体的其它用途包括但不限于生物学测试和纯化(如通过流式细胞术或淘选来分离人类癌症干细胞)、治疗性用途(如通过抗体与靶细胞的结合来促进或阻滞细胞的生长，或者通过抗体与靶细胞的结合来促进或阻滞细胞块的生长)、生物标记(如其它人类癌症干细胞的鉴定)和临床诊断(如人类癌症干细胞的鉴定)。

疫苗

本发明包含公开的癌细胞疫苗用于主动和被动免疫接种。可用作疫苗的免疫原性组合物可最容易地从免疫原性肽和所选癌细胞制备。癌细胞将来自宿主癌细胞或来自相同类型的癌细胞，它们可从适合的细胞系或从非自体肿瘤细胞获得。

本发明的肿瘤细胞可用于产生细胞疫苗。本领域已知的用于产生细胞疫苗的多种方法是可适用的(参见例如，美国申请第20050136066、20050106130和20050260208号)。尤其是，一种类型的抗原呈递细胞即树突细胞最近已经在癌症免疫疗法领域中引发兴趣。树突细胞是骨髓衍生的细胞，其可内化抗原和加工抗原以使其在MHC I类复合体和MHC II类复合体的背景中呈递。在一些方面，在本发明中使用的树突细胞能够激活CD8+T细胞(其为主要的细胞毒性T淋巴细胞)和CD4+T细胞(其为主要的辅助性T细胞)。应理解的是，任何能够呈递衍生自I类和II类MHC上内化抗原的肽的细胞是本发明的树突细胞(Steinman，Annu.Rev.Immunol.9：271-296(1991))。以该能力，树突细胞可用于呈递目标抗原于T细胞。已经采用若干种方法来直接把肿瘤抗原负载在树突细胞上，包括将肿瘤肽冲击(pulse)到成熟的树突细胞上(Avigan，Blood Reviews 13：51-64(1999))。已经发现离体负载有肿瘤抗原且作为细胞疫苗施用的分离的树突细胞，可以在实验动物上诱导保护性和治疗性抗肿瘤免疫(Timmerman等，Annu.Rev.Med.50：507-529(1999)。

在一方面，允许CSC体内或离体地接触抗原呈递细胞，诸如树突细胞。树突细胞获取CSC的抗原后，预期细胞疫苗由抗原向其呈递的其它淋巴细胞产生。除了树突细胞，可用于呈递试剂的其它细胞包括但不限于巨噬细胞、B细胞和与本发明CSC融合的其它细胞。

在其它实施方案中，用于疫苗接种的治疗组合物或与本发明其它方法一起使用的治疗组合物不是完整的CSC，相反是纯化的细胞膜制品，该制品作为疫苗诱导或增大对受治疗者肿瘤的内源响应。这些实施方案中的免疫原由质膜片段或囊泡组成，优选地以正确侧向外(right side out)定向，并以诱导患有癌症的患者对表位的免疫应答的方式施用于患者，该表位是免疫原的来源细胞和患者自身癌细胞共有的。

产生质膜囊泡(PMV)的细胞包括本发明的CSC，所述CSC表达通常被起源类型的肿瘤表达的多种癌胚抗原。或者它们可以是胎组织干细胞而不是癌症干细胞。

癌细胞疫苗将通常制备为注射液(injectables)，以悬浮液形式。细胞悬浮液可与药物上可接受的和与细胞相容的赋形剂混合。适合的赋形剂包括例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物和其组合。此外，如果需要，疫苗可含有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或增强疫苗效力的佐剂。

疫苗常规地通过肠胃外注射施用，例如皮下注射或肌内注射，并以与剂量制剂相容的方式施用，施用的量将在治疗上是有效和免疫原性的。或者，皮内注射疫苗可为优选的。待施用的量取决于被治疗的受治疗者，包括例如宿主免疫系统合成抗体的能力和期望的保护程度。所需转化细胞的准确量将在某种程度取决于医师的判断和宿主的年龄、健康、性别等。然而，适合的剂量范围可从动物模型和初始临床研究确定。通常，预期将需要10⁶数量级的转化细胞。

在宿主免疫系统被弱化或妥协的情形下，佐剂可为优选的。通常使用的佐剂包括诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)等试剂、与糖的合成聚合物的混合物(Carbopol RTM)、疫苗中通过热处理(如70-101℃)的蛋白质聚集物。还可采用重新活化胃蛋白酶处理的(Fab)抗体与白蛋白的聚集物、与细菌细胞诸如微小隐孢子虫(C.parvum)或革兰氏阴性菌的内毒素或脂多糖成分的混合物、在生理上可接受的植物油媒介物诸如二缩甘露醇单油酸酯(ArlacelA)中的乳液或以20％全氟化碳(Fluosol-DA.RTM)溶液用作封闭替代品的乳液。其它佐剂是本领域熟知的。

在某些例子中，期望施用多剂量疫苗，通常不超过十次疫苗接种，更通常不超过四次，以及优选地一次或多次，通常两次或三次。疫苗接种将通常间隔两周到十二周，更通常间隔三周到五周。可能会需要间隔1-5年、通常三年的周期性加强剂，以维持抗体和记忆T细胞的保护性水平。

药物疫苗组合物

含有癌细胞疫苗的药物组合物优选地在肠胃外、腹膜内、皮内或肌内施用。适于注射的药物形式包括临时制备的溶液或分散液的无菌水性溶液或分散液。在所有情形该形式必须无菌，且流动性必须达到存在易于注射性的程度。它必须在制造和储存条件下稳定并必须对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用保存。载体可为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇和类似物)、其适合的混合物和植物油。通过使用包衣诸如卵磷脂、通过维持分散液情形中所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。防止微生物作用可由各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞和类似物实现。在许多情形下，可包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可带来可注射组合物的延长的吸收。

通过以需要的量将活性化合物和如所需的以上列举的各种其它成分并入适合溶剂，随后过滤灭菌而制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒介物而制备分散液，所述无菌媒介物包含基础分散介质和所需的来自以上列举的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术可从此前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其它期望成分的粉末。

本文所用的“药物上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂和类似物。使用用于药物活性物质的这种介质和试剂是本领域熟知的。除非任意常规介质或试剂与活性成分不相容，否则都预期其在治疗组合物中的应用。补充的活性成分也可并入所述组合物。

短语“药物上可接受的”是指当施用于人类时，不产生过敏性或类似不当反应的分子实体和组合物。制备包含蛋白质作为活性成分的水性组合物是本领域熟知的。通常，将这种组合物制备为液态溶液或悬浮液的注射液；也可制备为适于在注射前在液体中形成溶液或悬浮液的固态形式。还可将制剂乳化。

配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和治疗上有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，优选地作为可注射溶液。

对于以水性溶液肠胃外施用，例如，如果需要的话该溶液应适合地缓冲，且液态稀释剂首先以足够的盐水或葡萄糖致使等渗。这些特定水性溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下、皮内和腹膜内施用。在这方面，鉴于本公开，本领域技术人员将知道可采用的无菌水性介质。例如，可将一剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中并加至1000ml皮下输液或在提议的输注位点注射(参见例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷氏药学原理)”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于被治疗的受治疗者的状态，剂量的一些改变将必要地发生。负责施用的人士在任何情况下应确定对个体受治疗者适合的剂量。而且，对人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准局(FDA Office of Biologics standards)所要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

药物发现

人类癌症干细胞的另一种用途涉及药物发现。因为此前尚未以公开的方式分离或培养本文公开的分离的人类癌症干细胞群或根据本发明的教导获得的人类癌症干细胞群，那么它们是新的并可能在其表面展示、表达或分泌迄今尚未发现或表征的蛋白质。使用血清的先前培养技术可能抑制蛋白质在细胞表面上的展示和/或蛋白质的分泌。此外，血清蛋白质或血清生物分子可导致CSC表型的变化并结合于癌症干细胞表面，干扰针对内源CSC抗原的单克隆抗体的产生。或者，当这些蛋白质被分泌并与血清生物分子相互作用时，它们的功能、构象或活性可能发生变化。生长在确定成分的无血清培养基中的人类癌症干细胞展示或分泌的蛋白质，受到来自血清生物分子的干涉最少，因而可能在生理学和拓扑学上更准确。因此，人类癌症干细胞表面上表达、分泌或展示的蛋白质是药物开发的期望的靶。在一个实施方案中，将药物制成靶向人类癌症干细胞和/或体内从其处理或分化的细胞上的特异蛋白质。药物结合可改变人类癌症干细胞的生长能力。在又另一实施方案中，人类癌症干细胞用于开发或发现与人类肿瘤细胞相互作用的小分子或其它治疗剂。这些小分子可为合成的或天然的，并可用于终止、抑制或促进人类肿瘤细胞的生长。

治疗方法

本发明另一方面包括以癌症干细胞(全部或部分)或存在于本发明肿瘤干细胞表面上的靶抗原的调节剂(包括但不限于抗体)治疗疾病状态。

另一方面，本发明提供包括向诊断为患有疾病的受治疗者施用一定量的放疗剂和CSC或CSC细胞表面抗原的调节剂的方法。在优选实施方案中，放疗剂选自放射性同位素(如At^-211、I^-131、I^-125、y^-90、Re^-186、Re^-188、Sm^-153、Bi^-212、p^-32和Lu的放射性同位素)组成的组，尽管在其它实施方案中施用其它剂，诸如化疗剂、毒素诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素(包括其片段和/或变体)、自由基、电荷、局部缺血、氧化损伤、热休克、心脏肥大、发热、炎症、代谢疾病、感染、细胞因子、生长因子、激素、病原体(如细菌、寄生虫、细胞内寄生虫、真菌、病毒、朊病毒和类病毒)、细胞-细胞相互作用、可溶因子、和其它原因的细胞和组织受损。

本发明的治疗方法可采用本文公开的多种治疗组合物，或联合本领域任何已知的治疗。在一实施方案中，抗体群和/或产生这种抗体的杂交瘤用于治疗疾病状态。

在另一实施方案中，本发明的治疗组合物有效地使得患病的或受损的细胞对补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或其它宿主监视免疫更敏感。

在另一实施方案中，本发明的治疗组合物联合相同或不同分类的其它剂使用。联合治疗可一致地发生或一种治疗可先于另一种治疗。需要其的受治疗者在治疗的不同时间点可循环地接受不同治疗组合物。

本发明另一方面包括使用本发明的治疗组合物的个人化治疗，其中确定受治疗者患病细胞上表达的抗原，并随后根据本文所述的方法把调节特定受治疗者抗原的本发明治疗组合物施用于受治疗者。在一实施方案中，本发明的治疗组合物用于个人化治疗。

肿瘤性疾患的治疗

肿瘤性疾患包括良性或恶性肿瘤(如肾癌(renal carcinomas)、肝癌(livercarcinomas)、肾癌(kidney carcinomas)、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinomas)；肉瘤；胶质母细胞瘤；和各种头颈肿瘤)，白血病和淋巴恶性肿瘤，其它病症诸如神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺的、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症，以及炎症、血管生成、免疫病症和病原体导致的病症。以本发明治疗组合物和方法治疗的尤其优选的靶是肿瘤性疾患。

本发明提供治疗数种特异性肿瘤性疾患的方法。在某些实施方案中，肿瘤性疾患选自包括但不限于以下的组：肾上腺肿瘤、AIDS相关癌症、腺泡状软组织肉瘤(alveolar soft part sarcoma)、星形细胞肿瘤、膀胱癌(鳞状细胞癌和移行细胞癌)、骨癌(釉质瘤、动脉瘤样骨囊肿、骨软骨瘤、骨肉瘤)、脑和脊索癌、转移脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、子宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、骨骼外粘液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性结构不良、胆囊和胆管癌、妊娠期滋养层疾病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌(肾母细胞瘤、乳头状肾细胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪肿瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪肿瘤、肝癌(肝母细胞瘤、肝细胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌等)、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症、外周神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、后葡萄膜黑素瘤、罕见血液疾病、肾转移癌、杆状肿瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移癌和子宫癌(子宫颈癌、子宫内膜癌和平滑肌瘤)。在某些优选实施方案中，癌性细胞选自实体肿瘤组，包括但不限于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、肉瘤、肾转移癌、甲状腺转移癌和透明细胞癌。

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。甲状腺癌包括分化的肿瘤(乳头状或滤泡性)和低分化的肿瘤(髓状或退行发育性)。阴道癌包括鳞状细胞癌、腺癌、黑素瘤和肉瘤。睾丸癌广泛地分为精原细胞瘤和非精原细胞瘤类型。

胸腺瘤是胸腺上皮肿瘤，所述胸腺可能被或可能未被非肿瘤性淋巴细胞彻底浸润。术语胸腺瘤习惯上用于描述不显示明显的异型的上皮成分的肿瘤。展现边界清楚的细胞学异型和不再对胸腺有特异性的组织学特征的胸腺上皮肿瘤称为胸腺癌(也称为C型胸腺瘤)。

在一优选实施方案中，本发明提供治疗乳腺癌诸如乳腺中导管组织中导管癌、髓样癌、胶样癌、管状癌和炎性乳腺癌的方法。对这些乳腺癌患者可用的现有治疗是手术、免疫疗法、放疗、化疗、内分泌疗法或其组合。可在以这些治疗中的任何一种或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在某些实施方案中，可在以一种或多种化疗方案诸如多柔比星、环磷酰胺、甲氨蝶呤、紫杉醇、塞替派、米托蒽醌、长春新碱或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在其它实施方案中，可在以一种或多种内分泌疗法药剂诸如他莫昔芬、醋酸甲地孕酮、氨鲁米特、氟甲睾酮、亮丙瑞林、戈舍瑞林和泼尼松治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

在另一实施方案中，本发明提供对包括上皮卵巢肿瘤诸如卵巢中腺癌和已经从卵巢迁移到腹腔的腺癌的卵巢癌的治疗。可在以包括免疫疗法、放疗、化疗、内分泌疗法的现有治疗中的任何一种或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在某些实施方案中，可在以一种或多种化疗方案诸如环磷酰胺、依托泊苷、六甲蜜胺和异环磷酰胺治疗受治疗者之后施用所述治疗组合物。在其它实施方案中，可在以一种或多种激素治疗剂诸如他莫昔芬治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

此外，本发明提供治疗子宫颈癌诸如子宫颈上皮中腺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)的方法。子宫颈癌可用的主要疗法是手术(冷冻手术、子宫切除术和根治性子宫切除术)、免疫疗法、放疗(外线束放疗或近距离放疗)和化疗。在某些实施方案中，可在以一种或多种化疗方案诸如顺铂、卡铂、羟基脲、伊立替康、博来霉素、长春新碱、丝裂霉素、异环磷酰胺、氟尿嘧啶、依托泊苷、甲氨蝶呤或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

本发明还提供对前列腺癌的治疗，诸如选自以下的前列腺癌：腺癌或已经迁移到骨的腺癌。手术、免疫疗法、放疗、冷冻手术、激素疗法和化疗是前列腺癌患者可用的一些治疗。一些放疗选择是外线束放疗，包括三维适形放疗、强度调制的放疗和适形质子束放疗。近距离放疗和冷冻手术是用于治疗前列腺癌的其它可能方法。可在以这些治疗中的任何一种或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在某些实施方案中，可在以一种或多种激素治疗剂包括促黄体素释放素(LHRH)类似物诸如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林和组氨瑞林以及LHRH拮抗剂诸如阿巴瑞克治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在其它实施方案中，可在受治疗者经受雄激素剥夺疗法或雄激素阻遏疗法包括睾丸切除术之后施用本发明的治疗组合物。在其它实施方案中，可在以抗雄激素剂诸如氟他米特、比卡鲁胺和尼鲁米特治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在其它实施方案中，可在以一种或多种化疗剂诸如多柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、米托蒽醌、长春碱、紫杉醇、多西紫杉醇、卡铂、泼尼松或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

本发明进一步提供治疗胰腺癌诸如胰管组织中上皮样癌和胰管中腺癌的方法。可在以包括化疗和放疗的现有治疗中的任何一种或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。可在以一种或多种化疗剂诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、丝裂霉素、异环磷酰胺、多柔比星、链唑霉素、氯脲菌素或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

本发明提供治疗膀胱癌症诸如膀胱移行细胞癌、尿道上皮癌(移行细胞癌)、膀胱内衬的尿道上皮细胞中肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌的另外方法。在某些实施方案中，可在以一种或多种免疫治疗剂诸如卡介苗(BCG)、干扰素和糖蛋白治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。在其它实施方案中，可在以一种或多种化疗剂诸如塞替派、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、卡铂、顺铂、异环磷酰胺、吉西他滨或其组合治疗受治疗者之后施用本发明的治疗组合物。

此外，本发明提供对诸如非小细胞肺癌(NSCLC)等肺癌的治疗，所述肺癌分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌和小细胞肺癌。肺癌的治疗选择包括手术、免疫疗法、放疗、化疗、光动力学疗法或其组合。治疗肺癌症的一些可能手术选择是部分或楔形切除术、叶切除术或肺切除术。放疗可为外线束放疗或近距离放疗。在某些实施方案中，可在以一种或多种化疗剂诸如顺铂、卡铂、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春碱、吉非替尼、异环磷酰胺、甲氨蝶呤或其组合治疗受治疗者之前、之后或同时施用本发明的治疗组合物。

本发明的治疗方法可特别有效地抑制肿瘤性细胞生长，尤其是对于此前已经接触抗癌剂的肿瘤性细胞。本发明的方法还可有效地维持或增加细胞对抗癌症治疗剂的敏感性。

本发明提供治疗数种特异性天然和诱导的免疫缺陷状态的方法。例如，天然和诱导的免疫缺陷状态包括B细胞(抗体)缺陷、联合的T细胞和B细胞(抗体)缺陷、T细胞缺陷、吞噬细胞缺陷、补体缺陷和由于施用免疫遏制剂导致的缺陷。

施用方法

根据已知方法，诸如快速注射或通过持续输注一段时间的静脉内施用，肌内、腹膜内、跨粘膜、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将本发明的治疗组合物施用于哺乳动物，优选地施用于人类。静脉内施用抗体是优选的。本发明的治疗组合物可如上所述联合治疗性治疗如化疗剂施用。治疗剂可由相同或不同施用途径施用。

治疗性治疗可先于或迟于抗原调节剂治疗，或可同时发生。可由常规测试确定治疗剂的有效量。共施用包括同时施用，或两种剂以任何顺序的连续施用。

联合施用可包括以同一剂型同时施用两种或更多种剂，以单独剂型同时施用，和分开施用。也就是说，本发明的治疗组合物和另一治疗剂可在同一剂型中配制在一起并同时施用。或者，本发明的治疗组合物和另一治疗剂可同时施用，其中这两种剂在单独制剂中存在。在另一选择中，可施用治疗剂后紧跟着施用另一治疗剂或反之亦然。在分开施用的方案中，本发明的治疗组合物和另一治疗剂可间隔几分钟、间隔几小时或间隔几天地施用。

关于肿瘤性疾患治疗，取决于肿瘤性疾患的阶段，肿瘤性疾患治疗包括以下疗法的一种或组合：手术除去肿瘤性组织、放疗和化疗。本发明的治疗方法改善治疗剂诸如化疗的治疗指数，并从而允许减少待施用的有效剂量。因此，本文的治疗方法尤其有用于治疗老年患者和不能对化疗的毒性和副作用耐受良好的其它人，并有用于其中放疗的用处有限的转移疾病。

其它治疗方案可与施用抗癌剂如治疗组合物和化疗剂联合，例如，有待以这种抗癌剂治疗的患者还可接受放疗和/或可经受手术。

为了预防或治疗疾病，治疗组合物如本文抗体的适合剂量将取决于如上定义的待治疗的疾病类型、疾病严重度和进程、施用该剂是为了预防或治疗目的、此前的治疗、患者的临床史和对该剂的响应以及主治医师的判断。该剂适合地一次或经一系列治疗施用于患者。

制剂

本发明治疗组合物的各种制剂可用于施用。在一些实施方案中，治疗组合物可未掺杂的(neat)施用。除药理学活性剂外，本发明的组合物可包含合适的药物上可接受的载体(包括赋形剂和辅助剂)，所述载体为本领域公知并且是相对惰性的物质，所述惰性物质促进药理学有效物质的施用或促进将活性化合物加工进制剂中，所述制剂可用于药物递送至作用位点。例如，赋形剂可给予形状或稠度，或作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、湿润剂和乳化剂、用于改变克分子渗压浓度的盐、成囊剂(encapsulating agent)、缓冲剂和皮肤穿透促进剂。

用于肠胃外施用的合适的制剂包括水溶性形式(如水溶性盐)的活性化合物的水溶液。另外，可施用适用于油性注射悬浮液的活性化合物的悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可包含提高悬浮液粘度的物质，并包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含稳定剂。还可使用脂质体使剂成囊用于递送进细胞。

根据本发明用于全身施用的药物制剂可经配制用于肠内、肠胃外或局部施用。实际上所有三种类型的制剂可同时使用以实现活性成分的全身施用。用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂描述于Remington，The Science and Practice of Pharmacy(雷氏药学理论和实践)第20版.MackPublishing(2000)。

适用于口服施用的制剂包括硬或软明胶胶囊、丸剂、片剂(包括包衣片剂)、酏剂、悬浮液、糖浆剂或吸入剂及其控释形式。

通常，这些剂配制用于注射施用(例如腹膜内、静脉内、皮下、肌内等)，尽管也可使用其它施用形式(例如口服、粘膜等)。因此，治疗组合物优选地与药物上可接受的媒介物(例如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液及类似物)结合。

具体的给药方案(即剂量、时间安排和重复)将取决于具体的个体和该个体的医疗史。通常对于抗体，施用剂量为至少约100ug/kg体重，更优选至少约250ug/kg体重，甚至更优选至少约750ug/kg体重，甚至更优选至少约3mg/kg体重，甚至更优选至少约5mg/kg体重，甚至更优选至少约10mg/kg体重。

根据经验的考虑(如半衰期)通常会对决定剂量有所帮助。至于与人类免疫系统相容的抗体(例如人源化抗体或完全人类抗体)，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。施用频率可在治疗过程中决定并调整，并基于减少肿瘤性细胞数量、保持肿瘤性细胞的减少、减少肿瘤性细胞增殖或延迟转移进展。或者，本发明治疗组合物的持续缓释(sustained continuous release)制剂可以是合适的。多种用于实现持续释放的制剂和设备为本领域已知。

在一个实施方案中，已给予一种或多种施用的个体中治疗组合物的剂量可根据经验确定。给予个体增加剂量的如本文所述制备的治疗组合物。为了评价有效抗体，可随后跟踪特定疾病、病症或疾患的标记。在个体患有癌症的实施方案中，这些包括通过触诊或目测直接测量肿瘤尺寸，通过X射线或其它成像技术间接测量肿瘤尺寸；通过直接肿瘤活组织检查和镜检肿瘤样品评估改善；测量间接肿瘤标记(例如对前列腺癌用PSA)或根据本文所述方法鉴别的抗原，疼痛或麻痹的减少；改善的言语、视觉、呼吸或其它肿瘤相关的失能；提高的食欲；或通过公认的检测测量的生活质量提高或生存延长。对于本领域技术人员明显的是，剂量会依赖于个体、肿瘤性疾患类型、肿瘤性疾患阶段、肿瘤性疾患是否开始转移至个体中其它位置和过去及目前使用的治疗而变化。

其它制剂包括本领域已知的合适的递送形式，包括但不限于载体如脂质体。脂质体制剂包括但不限于细胞转染剂、多层囊泡和单层囊泡。

在一些实施方案中，可存在多于一种治疗组合物。这类组合物可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的治疗组合物。

制品

在本发明另一实施方案中，提供含有单独或联合治疗剂或调节剂的本文治疗组合物的制品。该制品包括容器和标签。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可从多种材料诸如玻璃或塑料制成。该容器容纳有效治疗靶向的疾病状态的组合物并可具有无菌入口(access port)(例如该容器可为静脉溶液袋或具有皮下注射针可刺透的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是抗原调节剂，优选地为抗体。容器上或所带的标签标示组合物用于诊断或治疗所选的疾病状态。该制品将进一步在相同或单独容器中包括治疗剂和任选地药物上可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。该制品可进一步包括从商业和使用者角度期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、注射器和带有使用指导的包装说明书。

异种移植模型

人类癌症干细胞的另一种用途是在非人类哺乳动物中构建人类组织模型。在一些实施方案中，将人类癌症干细胞置于异种移植物接受者肾被膜下并允许生长。在另一实施方案中，将人类癌症干细胞置于接受者动物皮下并允许生长。通过首先使用本文公开的方法分离人类癌症干细胞，然后将其植入期望的异种移植位点，本领域技术人员能够以逐步方式确定最佳组合。

在另一实施方案中，将人类癌症干细胞置于接受者动物中同位位点。通过首先使用本文公开的方法分离人类癌症干细胞，然后将其植入期望的同位位点，本领域技术人员能够以逐步方式确定最佳组合。该程序的实例是本领域公知的，以非限制性示例的方式包括将乳腺癌干细胞置于乳腺脂肪垫中。

用于异种移植物的人类癌症干细胞可首先与基质结合。许多适合的基质是本领域熟知的并包括但不限于纤连蛋白、基质胶、胶原和层粘连蛋白。适合的接受者哺乳动物包括但不限于小鼠和大鼠。通常，在移植情况下，供体组织容易受到接受者免疫系统的攻击。为了减轻移植排斥，使用了几种技术。一种方法是以亚致死剂量的辐射来照射接受者，以破坏可能攻击移植物的免疫细胞。另一种方法是给予接受者环孢菌素或其它T细胞免疫遏制药物。在使用小鼠作为接受者哺乳动物时，有多种方法可能减轻移植排斥。一种这样的方法是使用免疫缺陷小鼠(裸的或重度联合免疫缺陷或SCID)。人类癌症干细胞异种移植物可用于研究体内肿瘤形成和/或生长或用在药物发现或开发。

生物测定

本文公开的人类癌症干细胞可用于多种生物测定。在一实施方案中，将人类癌症干细胞用于测定哪种生物因子影响人类癌症干细胞的生长能力。通过以逐步方式并联合不同生物化合物(诸如激素、特定生长因子等)评价人类癌症干细胞，可发现诱导人类癌症干细胞的生长能力或潜能改变或变化的一种或多种特定生物化合物。

癌症干细胞在生物测定中的其它用途是差异显示(如mRNA差异显示)和使用来自癌症干细胞的分泌蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用。可以通过诸如酵母双杂交系统等技术来测定蛋白质-蛋白质相互作用。来自人类癌症干细胞的蛋白质可用于鉴定与癌症干细胞相互作用的其它未知蛋白质或其它细胞类型。这些未知蛋白质可以是下列中的一种或多种：生长因子、激素、酶、转录因子、翻译因子和肿瘤阻抑基因。涉及人类癌症干细胞和这些细胞形成的蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-蛋白质或甚至细胞-细胞接触的效果的生物测定可用于确定这些细胞如何促进肿瘤在体内的建立、生长和形成。下列实施例提供了分离、表征和使用人类癌症干细胞的详述。这些实施例并非意欲以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1.

结肠直肠癌细胞(CRCA)的分离和培养

将来自结肠直肠癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、表皮生长因子(EGF)(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、三碘甲腺原氨酸(T3)(1×10^-12M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、氢化可的松(5×10^-8M)、维生素E(5μg/mL)和任选地庆大霉素(50μg/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个100mm层粘连蛋白或纤连蛋白包被的盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件下孵育各盘。

结肠直肠癌干细胞以松散的簇生长并具有上皮细胞形态。与培养物中其它细胞相比，结肠直肠癌干细胞大小更小并因此使用该形态学特征进一步区分。当开始置于培养时，来自结肠直肠癌组织的细胞迅速(8-24小时)贴附于培养盘。规则地(优选地每3天)更换培养基，并在显微镜下观察培养物直到可看到小的密集堆积的干细胞集落。数周后，肉眼可见小的、松散簇的结肠直肠癌干细胞。结肠直肠癌干细胞立即开始以指数速率生长，培养约另外2周后，可在相同培养基继代培养细胞以获得大致纯化的结肠直肠癌干细胞培养物，其可作为建立的细胞系在相同培养基持续继代培养。此时，使用本领域已知的标准技术来分配和传代结肠直肠癌干细胞，使用胶原酶-分散酶以使细胞从培养盘脱离(lift)而不是消化到单个细胞的程度。一种结肠直肠癌干细胞培养物已经传代超过30次而没有衰老迹象。

实施例2.

直肠癌细胞(RECA)的分离和培养

将来自直肠癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、T3(1×10^-9M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、氢化可的松(5×10^-8M)、维生素E(5μg/mL)和猪垂体提取物(PPE)(75μg PPE总蛋白/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个100mm层粘连蛋白/纤连蛋白(50∶50)包被的盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在以上对结肠癌培养物所述的标准孵育条件孵育各盘。产生干细胞并在所述培养基中由继代培养选择后，可如下操作该细胞系。每2-3天更换生长培养基，直到细胞80-95％融合并准备好继代培养。使用本领域已知的标准条件来传代人类直肠癌干细胞，使用胶原酶-分散酶以使细胞从培养盘脱离。一种直肠癌干细胞系已经传代超过50次而没有衰老迹象。

实施例3.

肺癌干细胞的分离和培养

将来自肺腺癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、牛垂体提取物(BPE)或PPE(75μg PPE总蛋白/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个100mm纤连蛋白包被的盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘。

每2-3天更换生长培养基，直到细胞80-95％融合并准备好继代培养。使用本领域已知的标准条件来传代人类肺癌干细胞，使用胶原酶-分散酶以使细胞从培养盘脱离。一种人类肺癌干细胞培养物已经传代超过25次而没有衰老迹象。

实施例4.

胰管癌干细胞的分离和培养

将来自胰管癌的组织简短地在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、T3(1×10^-12M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、毛喉素(1-5μM)、氢化可的松(1×10^-9M)、孕酮(1×10^-8M)、调蛋白(HRG)(1-3nM)和抑酶肽(25μg/mL))。

转移细胞悬浮液并分到三个100mm纤连蛋白包被(5μg/mL)的盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘。每3天收集用过的培养基，以0.22μm滤器过滤，并加入(20％v/v)以重构细胞。开始铺板7-10天内，仅形成数个上皮样集落，并且这些集落开始在非分裂的基质样细胞间延展。在另14天中，使用本领域已知的标准方法，以亚融合继代培养培养物并1∶3地分配到纤连蛋白包被的100mm盘。在培养中建立胰管癌干细胞后(第二或第三次传代后)，使用以前培养物的条件培养基不再必需。基于观察细胞的生长和外表，本领域技术人员将能够确定何时不再需要使用条件培养基。当从抑酶肽的存在不能观察到进一步生长刺激时，不再将该因子加至培养基。随后生长研究表示倍增时间为26小时。一种胰管癌干细胞培养物已经传代超过60次而没有衰老迹象。

实施例5.

梅克尔细胞癌干细胞的分离和培养

将来自梅克尔细胞癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、T3(1×10^-12M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、毛喉素(5μM)、氢化可的松(1×10^-9M)、孕酮(1×10^-8M)、PPE(15μg PPE总蛋白/ml))。已经建立培养物后，梅克尔细胞癌干细胞的一些培养物不需要PPE用于生长。这可在第三次或第四次传代梅克尔细胞癌干细胞培养物后测试。在一些情形下，加入神经生长因子β(NGF-β)对梅克尔细胞癌干细胞培养物的生长可为有利的。已经建立培养物后，NGF-β可以10ng/ml的浓度使用。

转移细胞悬浮液并分到五个纤连蛋白包被的100mm盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘，每3天更换培养基直到干细胞集落变得明显(参见图1-3)。此时大多数非干细胞已经死亡且干细胞集落可生长到足够的细胞密度(@50％)以便以1∶3的密度继代培养。

梅克尔细胞癌干细胞培养物约85-95％融合后，使用TrypLE Express(Invitrogen)使细胞从培养盘脱离，继代培养培养物。取决于用途，将细胞以1∶5至1∶20的比例分配。在传代之间，每2-3天更换生长培养基。一种梅克尔细胞癌干细胞培养物已经传代超过30次而没有衰老迹象。

实施例6.

前列腺癌干细胞的分离和培养

将来自前列腺癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清无钙的F12/DMEM，补充有钙(0.1mM)、胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、T3(1×10^-12M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、氢化可的松(1×10^-8M)、睾酮(50ng/mL)和PPE(约15μg PPE总蛋白/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个层粘连蛋白包被的100mm盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘。

前列腺癌细胞的初始培养物在培养三天后贴附不良好。当改变这些细胞的培养基时，收集用过的培养基并使用胶原酶-分散酶除去任何贴壁细胞。离心用过的培养基和细胞，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于10ml新鲜生长培养基并铺板到新的层粘连蛋白包被的培养盘。将10ml新鲜生长培养基也置于最初的盘板并使盘(以及随后使用过的盘)带有每2-3天更换的培养基直到产生建立的前列腺癌干细胞培养物。原代前列腺癌症培养物中出现前列腺癌干细胞集落的平均时间为4-6周。

图1A显示培养约5周后培养物中其它细胞类型长出的前列腺癌干细胞小集落。每2-3天更换培养基但不将细胞进行传代或分配。如白色圆圈中标出的，前列腺癌干细胞可由形态区分于培养物中的其它细胞。它们优先以紧密集落生长并具有上皮细胞的形态。与培养物中其它细胞比较时，前列腺癌干细胞尺寸更小，并因此进一步使用该形态学特征区分。

建立小集落后，通常前列腺癌干细胞随后将在优化生长培养基中进入指数生长期。图1B显示小集落的前列腺癌干细胞开始指数生长期。图1C显示指数生长期三天后前列腺癌干细胞的相同集落。图1D显示在指数生长期6天后前列腺癌干细胞的相同集落。最终，前列腺癌干细胞形成分离的、大致纯的细胞群，且其它细胞类型不存在于培养物中。

建立大致纯的前列腺癌干细胞群后，使用本领域已知的标准技术使用胶原酶-分散酶使细胞从培养盘脱离而传代细胞。传代之间每3天更换培养基。一种前列腺癌干细胞系已经传代超过30次而没有衰老迹象。

实施例7.

基底细胞癌干细胞的分离和培养

将来自基底细胞癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、三碘甲腺原氨酸(T3)(1×10^-12M)、氢化可的松(1×10^-8M)、和PPE(约75μgPPE总蛋白/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个纤连蛋白包被的100mm盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘。每3天更换培养基直到具有小的紧密堆积形态的干细胞(参见图1-3)变得明显。此时，如同其它癌症类型一样，干细胞开始更快速生长。随后可继代培养它们，并在数次继代培养后它们将是培养物中保留的唯一细胞类型。

基底细胞癌干细胞培养物约85-95％融合后，使用TrypLE Express(Invitrogen)使细胞从培养盘脱离，继代培养培养物。或者，还可使用胰蛋白酶或胶原酶-分散酶。取决于用途，将细胞以1∶3至1∶5的比例分配。在传代之间，每3天更换生长培养基。一种基底细胞癌干细胞培养物已经传代超过15次而没有衰老迹象。

实施例8.

乳腺癌干细胞的分离和培养

将来自乳腺癌的组织简短地在含有100μg/mL庆大霉素的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中漂洗，置于100mm组织培养盘，并切碎成小(＜1mm)块。将切碎的组织悬浮于5mL解离培养基(含有100μg/mL庆大霉素和200μL胶原酶-分散酶(PBS中10％wt/vol)和大豆胰蛋白酶抑制剂(STI，10％(v/v))的F12/DMEM)并在37℃孵育。以五分钟的间隔吹吸悬浮液以松动细胞团块。当10-20个细胞的团块表现从组织解离时终止酶促活性。

通过离心(900rpm、4分钟)以F12/DMEM洗涤悬浮液，并将所得的细胞粒状沉淀重悬于培养基(无血清F12/DMEM，补充有胰岛素(10μg/mL)、运铁蛋白(10μg/mL)、EGF(5ng/mL)、硒(2.5×10^-8M)、T3(1×10^-12M)、乙醇胺(1×10^-6M)、磷酸乙醇胺(1×10^-6M)、氢化可的松(1×10^-8M)、前列腺素E1(PGE1)(100ng/mL)和PPE(约15μg PPE总蛋白/mL))。

转移细胞悬浮液并分到五个纤连蛋白包被的100mm盘。加入培养基至每盘终体积10mL并在标准孵育条件孵育各盘。建立培养物后可使用标准方法冷冻人类乳腺癌干细胞。当融化细胞并将它们放回培养时，少量胎牛血清(约2％(v/v))可有益于确保人类乳腺癌干细胞存活。初始融化和培养(如1-2天)后，可除去带有胎牛血清的培养基并以无血清培养基代替。胎牛血清对于持续培养人类乳腺癌干细胞不是需要的或优选的。已经显示含有大于2％FBS的培养条件抑制人类乳腺癌干细胞的生长。

可继代培养人类乳腺癌干细胞。吸去用过的培养基，且5ml的DME/F12培养基用于洗涤细胞。吸去洗涤培养基且向细胞加入1ml胰蛋白酶并在37℃孵育细胞直到细胞从板上解脱(大约5分钟)。加入一毫升大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)以中和胰蛋白酶，收集细胞并离心以成粒状沉淀。将细胞粒状沉淀重悬于新鲜生长培养基，并且取决于用途，将细胞以1∶3至1∶5的比例分配到纤连蛋白包被的盘。每2-3天更换生长培养基并当细胞80-90％融合时，将细胞传代或继代培养。一种乳腺癌干细胞培养物已经传代超过25次而没有衰老迹象。

实施例9.

人类癌症干细胞的表征

进行表征人类癌症干细胞的实验，期待据报道将在一些癌细胞上表达的标记的细胞表面表达。使用流式细胞术对形态学上鉴定为癌症干细胞的细胞进行CD24、CD34、CD44和CD133表达分析。

使用2ml 0.2％胶原酶/分散酶处理5分钟或直到细胞从烧瓶解离或释放，使细胞从烧瓶脱离。使用5ml移液管研磨细胞以消除任何细胞丛，随后转到15ml锥形管并以1200rpm持续5分钟旋转沉降(spin down)。除去上清液并将细胞重悬于1ml/T75烧瓶或5ml/T175烧瓶的分析缓冲液(含有1％BSA的汉克氏平衡盐溶液)。使用血球计将细胞计数。

将50,000至100,000个细胞与一抗和对照以下列浓度混合：

1.抗-CD24/PE以100μl/10⁸个细胞(Miltenyi)

2.抗-CD44/PE以100μl/10⁸个细胞(Miltenyi)

3.抗-CD34/PE以10μl/10⁵个细胞(Miltenyi)

4.抗-CD133/PE以2μl/5x10⁴个细胞(Miltenyi)

5.同种型对照

6.FC Block以100μl/10⁸个细胞(Miltenyi)

随后将细胞在黑暗中以4℃孵育20分钟。

孵育后，以分析缓冲液将体积调至200μl，并以1200rpm持续5秒钟旋转沉降。除去上清液并将细胞重悬于200μl新鲜分析缓冲液中。就在分析存活/死亡门控之前将5μl 7-氨基放线菌素-D(7-AAD)或碘化丙锭加至细胞。使用FACSCalibur或Guava机器分析细胞。

CD24、CD34、CD44和CD133在细胞系上表达的结果概述于下表1和表2。在这些表中，“+”表示荧光强度变化一个log或更高，“中”表示荧光强度变化0.5至1个log，“低”表示荧光强度变化至多0.5个log和“-”表示荧光强度无变化。

如表1所示，大多数癌症干细胞表达CD34，而CD34是已知的造血干细胞标记，此标记此前没有与实体癌症干细胞关联。由于还已知CD34在内皮细胞上表达，检查了另一内皮细胞标记(CD141)的表达作为对照。这些癌症干细胞都不表达CD141，因此它们不可能是内皮细胞或造血细胞。

为了研究转移对癌症干细胞标记的作用，在动物异种移植实验中转移的癌症干细胞上进行CD24、CD34和CD44表达分析。将梅克尔细胞癌干细胞和9926(胰腺癌干细胞)植入免疫妥协小鼠宿主的肾下被膜中。约6-8周后处死动物并检查肿瘤形成。除了梅克尔和9926细胞在宿主肾上形成的原代肿瘤，在宿主体腔中观察到自发转移瘤。除去这些转移瘤并培养在最初生长培养基中。细胞在培养中已经生长后，根据上述方法分散细胞并使用流式细胞术分析CD24、CD34和CD44的表达。这些实验的结果概述于下表2。

以梅克尔和9926细胞类型，母体细胞显示细胞表面标记表达的型式不同于来自转移沉积物的细胞上的标记型式。衍生自转移瘤的梅克尔细胞癌系显示CD44高表达、CD24低表达和CD34不表达。通过比较，梅克尔母体细胞(还未经动物传代)不表达CD44，不表达CD24和高表达CD34(参见表1)。类似结果还见于9926胰腺癌转移瘤，其中CD44表达高和CD34表达低，相比之下母体9926胰腺癌干细胞无CD44表达和CD34高表达。

为了研究动物传代对癌症干细胞标记的作用，还对经由动物宿主中异种移植物传代的癌症干细胞进行CD24、CD34和CD44表达分析。三种人类癌症干细胞培养物(梅克尔细胞癌、CRCA0404和PRCA629a)各自作为异种移植物置于小鼠宿主中(在肾下被膜或皮下)，允许形成肿瘤，随后除去原代肿瘤并培养在对各细胞类型适合的培养基。在培养中生长后，分散细胞，并使用流式细胞术分析它们的CD24、CD34和CD44表达水平。结果概述于下表2。

新的原代肿瘤当与其母体相比时观察到细胞表面标记表达改变。来自梅克尔细胞癌和CRCA0404结肠直肠癌的原代肿瘤的细胞显示丧失CD34表达(与母体癌症干细胞相比)和获得CD44表达。来自PRCA629a肿瘤(体内生长非常缓慢)的细胞保持高的CD34表达并具有低的CD44表达。这些实验结果说明经由动物传代可改变已经与其相应的癌症干细胞关联的标记的细胞表面表达。

在未显示的其它数据中，改变细胞培养条件还可能对细胞表面标记具有影响；存在毛喉素时，与不存在毛喉素时其水平相比，乳腺癌细胞系BRCA1103显示CD44和CD24细胞表面标记的减少。

实施例10.

人类肿瘤异种移植模型：人类癌症干细胞的肿瘤发生潜力

癌症干细胞定义为能够自身更新并具有从少量细胞在体内形成肿瘤的能力的小的肿瘤细胞亚群(由培养条件最初选择)。测试了癌症干细胞的肿瘤形成潜能。

对于这些实验，将细胞数目范围从20个细胞至5×10⁴个细胞/胶原纽扣(button)植入免疫缺陷小鼠。使用I型大鼠尾胶原制备胶原纽扣。制备I型大鼠尾胶原是本领域公知的。简单地说，取成熟繁殖的大鼠的尾并分离腱和称重。1克的腱产生100ml胶原溶液，且每条尾获得大约1克至1.5克的腱。为了提取胶原，将腱置于含有青霉素、链霉素和两性霉素的稀乙酸溶液(100ml水中每克腱需200μl冰乙酸)并在4℃轻轻搅拌至少一周。随后离心溶液并将胶原上清液储存在4℃直到使用。

对于本研究，通过在含有Earle’s平衡盐溶液(EBSS)、NaOH和NaHCO₃的设定溶液(setting solution)中聚合大鼠尾胶原，制备50μl胶原纽扣。聚合后，向每胶原纽扣加入不同细胞数目(从20至200)。在植入之前，于37℃在胶原中孵育细胞过夜。

对于在肾被膜下植入细胞，以三溴乙醇完全麻醉小鼠。在肾被膜中产生一个袋(pocket)以允许放入细胞，该袋由腰旁手术方法对右肾和/或左肾产生。手术后，允许动物在热表面上恢复并观察直到完全从麻醉恢复。手术后十天除去伤口夹。细胞在动物中6-12周后，取出动物肾并目视检查肿瘤形成。还使用人类Alu特异性序列引物对肾进行定量PCR(QPCR)以证实和定量肿瘤形成。结果概述于下表3。

所有癌症干细胞在接种体为约200个细胞时能够在免疫缺陷小鼠中形成肿瘤。这些肿瘤通常是目视可见的并使用QPCR证实。目前，测试的所有癌症干细胞可由20个细胞的接种体形成肿瘤(参见表3)。在所有实验中，在100％的植入人类癌症干细胞的动物中观察到肿瘤形成。通常，每种条件至少三只动物用于每个实验。这些结果与表征这些细胞为癌症干细胞一致，由于它们从很少量细胞在体内形成肿瘤的能力。

相反，2种癌症衍生的培养物未形成肿瘤(参见图4)。如果分散的前列腺肿瘤细胞生长在含有血清(10％)的培养基2-4周而不是如所述的选择培养基，所得到的培养物以高达250,000细胞/胶原纽扣植入时在SRC中将不形成肿瘤。一种结肠培养物产生具有不同形态、生长特征和细胞表面蛋白质结合特征的反常细胞系(CRCA0705)。这些细胞在任何接种体＜200至500,000细胞/胶原纽扣时将不形成肿瘤(参见图4)。

图4显示在SCID小鼠肾被膜下从各种细胞系形成的肿瘤的照片。如此图所显示的，使用该肾下癌症异种移植模型，癌症干细胞系明显地可区分于非癌症干细胞系。

实施例11.

人类肿瘤异种移植模型：人类癌症干细胞的转移潜能

本研究设计为使用在人类肿瘤异种移植模型中从梅克尔细胞癌(皮肤的神经内分泌癌症)培养的梅克尔细胞癌干细胞。当在肾下被膜植入MCC细胞时，将形成会自发地转移到腹膜和胸腔中多个器官的肿瘤。转移瘤肉眼可见，或使用针对人类DNA的QPCR定量。

使用上述方法制备I型大鼠尾胶原。对于本研究，通过在含有Earle’s平衡盐溶液(EBSS)、NaOH和NaHCO₃的设定溶液中聚合大鼠尾胶原，制备50μl胶原纽扣。聚合后，向每胶原纽扣加入5×10⁵个梅克尔细胞。在植入之前，于37℃在胶原中孵育细胞过夜。

对于在肾被膜下植入细胞，以三溴乙醇完全麻醉小鼠。在肾被膜中产生一个袋以允许放入细胞，该袋由腰旁手术方法对右肾和/或左肾产生。在一些研究中，两肾都接受异种移植物。手术后，允许动物在热表面上恢复并观察直到完全从麻醉恢复。手术后十天除去伤口夹。

允许肿瘤生长大约5-8周。在研究终点，处死小鼠并取出肿瘤。在小鼠中发现显著量的转移瘤。转移瘤可见于被植入梅克尔细胞癌细胞培养物的小鼠的网膜、隔膜、脾脏、卵巢和肺。通常，转移瘤的尺寸大并易于被裸眼察觉。

使用RECA0515细胞和CRCA1115细胞进行相似的实验。这两种细胞类型将从肾下被膜转移到多个部位。使用9926胰腺癌干细胞的实验导致从肾下被膜向小鼠其它部位转移。而且，与在肾被膜下植入相比，植入到小鼠前列腺时，9926胰腺癌干细胞以更高频率转移。作为整体考虑，这些结果显示人类癌症干细胞培养物可用在成功的异种移植模型以理解人类肿瘤在体内的建立、生长和转移。

有趣的是，在相似实验中，PRCA系中的4种也在4至12周后在动物中自发地从SRC转移，甚至当(在一些情形下)植入很少(＜500)细胞时。

已经预测癌症干细胞是肿瘤中向远处部位转移的细胞类型[参见Li，F.Tiede，B.，Massague，J.&Kang，Y.(2007)Cell Res 17，3-14]。考虑到这一点，有趣的是注意到本文所述的前列腺CSC中的四种将自发地从植入SRC的细胞生长的肿瘤转移到多个器官。此外，CRCA1115结肠肿瘤衍生的系、梅克尔衍生的系和CTLY(皮肤T细胞淋巴瘤衍生的系)都从SRC肿瘤转移。PACA胰腺衍生的系将从同位植入胰腺的肿瘤转移。因此这些CSC系通常表现从原代实体肿瘤异种移植物自发转移的特性，该特性很少见于ATCC肿瘤衍生的细胞系和大多数其它系。根据本发明教导获得的肿瘤衍生的细胞系与其组织和细胞系表型的部分列表显示于表4。

还进行实验来确定抗体对癌细胞转移瘤生长的作用。如图5和6所示，已知结合至某些癌表面的抗体KID24(PTA-5174)减少来自在肾下被膜模型中建立的癌症干细胞系癌的肿瘤转移瘤的生长。

应理解本文中描述的实施例和实施方案都是仅出于说明的目的，并且多种根据其的修改或变化将给本领域的技术人员启示，并且将包含在本申请的精神和法律范围以内。对于所有情形而言，本文引证的所有出版物、专利和专利申请都是通过引用以其全部内容并入本文，达到如同每一个单独的出版物、专利或专利申请都表明是具体并单独的如此引用并入本文的程度。

Claims

1.一种分离自人类肿瘤组织的人类癌症干细胞群，其中所述细胞生长在为其生长而优化的营养培养基中。

2.根据权利要求1所述的人类癌症干细胞，其中所述细胞保持广泛传代培养而不衰老的能力。

3.根据权利要求1所述的人类癌症干细胞，其中所述细胞表达至少一种细胞表面标记。

4.根据权利要求3所述的人类癌症干细胞，其中所述细胞表面标记是CD34。

5.一种分离人类癌症干细胞群的方法，其包括：

(a)解离人类癌症干细胞来源；

(b)将所解离的人类癌症干细胞来源置于已为人类癌症干细胞生长而优化的营养培养基中；

(c)保持足以支持人类癌症干细胞从所述人类癌症干细胞来源生长到所述营养培养基中的合适的培养条件；

(d)传代培养所述人类癌症干细胞群以获得大致纯的人类癌症干细胞群。

6.一种向异源接受者提供免疫原的来源的方法，其包括以在所述接受者中引起免疫应答的有效量施用权利要求1所述的人类癌症干细胞。

7.一种癌症细胞疫苗，其包括权利要求1所述的人类癌症干细胞，其中所述疫苗当施用于有患上所选癌症风险或患有所选癌症的哺乳动物时产生针对所选癌症的保护性或治疗性免疫应答。

8.一种提供人类癌症干细胞来源特异性生物成分以在医药上开发至少一种药物的方法，其包括分离权利要求1所述的人类癌症干细胞群，并使用所述人类癌症干细胞作为开发中药物的靶。

9.一种在开发生物测定中提供人类癌症干细胞来源的方法，其包括分离权利要求1所述的人类癌症干细胞群，并使用所述人类癌症干细胞作为所述生物测定中的一种或多种主要成分。

10.一种在异种移植模型中提供人类癌症干细胞来源的方法，其包括分离权利要求1所述的人类癌症干细胞群，并使用所述人类癌症干细胞作为所述异种移植模型中的一种或多种主要成分。

11.一种药物组合物，其包括在药物上可接受的制剂中的权利要求1所述的癌症干细胞。

12.一种治疗受治疗者癌症的方法，该方法包括：(a)产生根据权利要求1所述的癌症干细胞，和(b)向所述受治疗者施用所述癌症干细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中施用所述癌症干细胞包括静脉内注射、肌内注射、瘤内注射、皮下注射或白细胞去除术。