BR112019023076A2 - expansão de células t gama delta, composições e métodos de uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

a presente invenção fornece métodos de expandir células t gama delta de uma fonte de tecido não hematopoético. são ainda fornecidas composições de células t gama delta expandidas e métodos de utilização das células t gama delta expandidas (por exemplo, uma parte de uma terapia de célula t adotiva).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para EXPANSÃO DE CÉLULAS T GAMA DELTA, COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS.
ANTECEDENTE
[0001] O crescente interesse na imunoterapia com células T para câncer tem se concentrado na capacidade evidente de subconjuntos de células T CD8+ e CD4+ αβ para reconhecer células cancerígenas e mediar potenciais funcionais de proteção do hospedeiro, particularmente quando desreprimidos pelo antagonismo clinicamente mediado de vias inibitórias exercidas por PD-1, CTLA-4 e outros receptores. No entanto, muitas questões permanecem. Por exemplo, parece haver muitos cenários clínicos importantes nos quais a eficácia de tais tratamentos parece fraca. Muitas vezes, existem eventos adversos profundos, a capacidade de prever eficácia ou eventos adversos é extremamente limitada e há muito pouca explicação das interações que permitem ao hospedeiro detectar células tumorais (imunogenicidade) que precedem a ativação de respostas de células Τ αβ CD8+ e CD4+ específicas de antígeno convencionais.
[0002] As células T gama delta (células Τ γδ) representam um subconjunto de células T que expressam em sua superfície um receptor de células Τ γδ (TCR) distinto e definidor. Este TCR é constituído por uma cadeia gama (y) e uma delta (õ). As células Τ γδ humanas podem ser amplamente classificadas em um ou dois tipos - células T γδ residentes no sangue periféricas e células γδ residentes nos tecidos não hematopoéticos. A maioria das células Τ γδ residentes no sangue expressa um TCR de Võ2, enquanto isto é menos comum entre as células Τ γδ residentes no tecido, que mais frequentemente usam as cadeias Võ1 e/ou outras Võ. Como as células Τ γδ residentes nos tecidos não hematopoéticos não são facilmente obtidas em números altos e nâo existem protocolos de isolamento ou expansão convencionais,
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2/119 elas não foram bem caracterizadas ou estudadas para aplicações terapêuticas. Portanto, existe uma necessidade não atendida no campo de métodos para isolar e expandir células Τ γδ residentes nos tecidos não hematopoéticos em quantidades suficientes para estudar e potencialmente adaptar-se como terapias, por exemplo, como terapias de células T adotivas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção fornece métodos para expandir células Τ γδ (por exemplo, células Τ γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) a partir de uma fonte de tecido não hematopoético (por exemplo, células Τ γδ derivadas de tecido não hematopoéticas, por exemplo, células T Võ1 derivadas de tecido não hematopoéticas). Os métodos de expansão incluem a cultura de células Τ γδ (por exemplo, células Τ γδ separadas de células estromais do tecido não hematopoéticas) na ausência da estimulação de TCR substancial e/ou na presença de IL-4, IL-15, IL-21 e/ou IL-2. Também são fornecidas composições de células Τ γδ expandidas (por exemplo, células Τ γδ derivadas de tecido não hematopoéticas, por exemplo, células T Võ1 derivadas de tecido não hematopoéticas) e métodos de utilização de células Τ γδ expandidas (por exemplo, uma parte de uma terapia de célula T adotiva, por exemplo, para tratamento de câncer).
[0004] Em um aspecto, a invenção apresenta um método de expansão de células Τ yõ (i) fornecendo uma população de células Τ γδ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2, IL-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, ILβ, lisado de plaquetas humano (HPL) e fator-1 derivado de células estromais (SDF-1) por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Por exemplo, as células T yõ podem ser
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3/119 cultivadas na presença de IL-2, IL-15 e IL-4; IL-2, IL-15 e IL-21; ou IL2, IL-15, IL-4 e IL-21.
[0005] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de expansão de células Τ γδ (i) fornecendo uma população de células Τ γδ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21 por pelo menos 5 dias em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ.
[0006] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, as células Τ γδ são expostas simultaneamente à IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21 por pelo menos 5 dias. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas da via de TCR exógenos. Em algumas modalidades, o método inclui ainda, após a etapa (i), separar as células Τ γδ das células não hematopoéticas para produzir uma população separada de células T yõ, e a etapa (ii) inclui: (a) cultivar as células Τ γδ na ausência do contato substancial de células estremais; (b) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células tumorais; e/ou (c) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células alimentadoras.
[0007] Em outro aspecto, um método de expansão de células T yõ inclui as etapas de: (i) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido compreendendo células não hematopoéticas e células T yõ; (ii) separar células T yõ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células Τ γδ; e (iii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-β, HPL e SDF-1 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2, IL-15, IL-4 e/ou IL-21 (por exemplo, IL-2, IL-15 e IL- 4; IL-2, IL-15 e IL-21; ou IL-2, IL-15, IL-4 e IL-21). Em
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4/119 algumas modalidades, as células T γδ são expostas simultaneamente à IL-2, IL-15, IL-4 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T γδ na ausência do contato substancial de células estromais com as células T γδ. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas da via de TCR exógenos.
[0008] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de expansão de células T γδ, o método incluindo as etapas de: (i) fornecer uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL21 por pelo menos 5 dias em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células T γδ. As células T γδ podem ser expostas simultaneamente à IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21, por exemplo, por pelo menos 5 dias, ou podem ser expostas a um ou mais dos fatores antes da exposição a outros. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2 recombinante humana, IL-4 recombinante humana, IL-15 recombinante humana e IL-21 recombinante humana por pelo menos 5 dias em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T γδ na ausência de agonistas da via de TCR exógenos (por exemplo, anti-CD3), por exemplo, na ausência de ativação substancial da via de TCR. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T γδ na presença de IL-21 em uma concentração de 1 ng/mL a 1,000 ng/mL (por exemplo, a cerca de 10 ng/mL ou cerca de 100 ng/mL). A etapa (ii) também pode incluir cultivar as células T γδ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo consistindo em IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-1 β, lisado de plaquetas humano (HPL) e fator-1 derivado de células estromais (SDF-1).
[0009] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de expan
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5/119 são de células Τ γδ pelas etapas de: (i) fornecer uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2 e IL-15 por pelo menos 5 dias em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células Τ γδ. Em algumas modalidades deste aspecto, as células Τ γδ são expostas simultaneamente à IL-2 e à IL-15. A etapa (ii) pode Incluir cultivar as células Τ yõ na ausência de agonistas exógenos da via de TCR ou na ausência de ativação substancial da via de TCR. Em algumas modalidades, etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-4, IL21, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-1 β, HPL e SDF-1. Em algumas modalidades, as células Τ γδ são cultivadas na presença de IL-4 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. A IL-21 pode estar em uma concentração de 1 ng/mL a 1 000 ng/mL (por exemplo, 10 ng/mL ou 100 ng/mL).
[0010] Ainda em outro aspecto, a invenção apresenta um método de expansão de células Τ yõ pelas etapas de: (I) fornecer uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células Τ γδ na ausência de ativação substancial da via do TCR por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células Τ γδ na presença de IL-2 e IL-15. Em alguns casos, as células T yõ são expostas simultaneamente à IL-4 e à IL-15. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-Ιβ, HPL e SDF-1. Por exemplo, as células T yõ podem ser cultivadas na presença de IL-4, IL-21 ou ambas. Em algumas modalidades, as células T yõ são cultivadas na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. A IL-21 pode estar em
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6/119 uma concentração de 1 ng/mL a 1 000 ng/mL (por exemplo, 10 ng/mL ou 100 ng/mL).
[0011] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o método inclui ainda, após a etapa (i), separar as células T yõ das células não hematopoéticas para produzir uma população separada de células T yõ, e a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais, na ausência do contato substancial de células tumorais e/ou na ausência do contato substancial de células alimentadoras (por exemplo, células alimentadoras irradiadas, células B ou células apresentadoras de antígeno).
[0012] Em outro aspecto, é apresentado aqui um método de expansão de células T yõ pelas etapas de: (I) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido incluindo células não hematopoéticas e células T yõ; (ii) separar células T yõ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células T yõ; e (iii) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais com as células T yõ por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas da via de TCR exógenos e/ou na ausência de ativação substancial da via de TCR. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2 e IL-15. Por exemplo, as células T yõ podem ser expostas simultaneamente à IL-2 e à IL-15. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL-6, IL-7, IL8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1 , IL-Ιβ, HPL e SDF-1. Por exemplo, em alguns casos, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-4, IL-21 ou ambas. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T γδ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. A IL-21 pode estar em uma concentração de 1 ng/mL a 1 000 ng/mL (por
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7/119 exemplo, 10 ng/mL ou 100 ng/mL).
[0013] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de expansão de células T yõ pelas etapas de: (i) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido incluindo células não hematopoéticas e células T yõ; (ii) separar células T yõ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células T yõ; e (iii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2 e IL-5 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais com as células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas exógenos da via do TCR ou na ausência de ativação substancial da via do TCR. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2 e IL-15. As células T yõ podem ser expostas simultaneamente à IL-2 e à IL-15. Em alguns casos, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-β, HPLeSDF-1. Por exemplo, as células T yõ podem ser cultivadas na presença de IL-4 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. A IL-21 pode estar em uma concentração de 1 ng/mL a 1 000 ng/mL (por exemplo, 10 ng/mL ou 100 ng/mL).
[0014] Em ainda outro aspecto, aqui apresentado é um método de expansão de células T yõ pelas etapas de: (i) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido incluindo células não hematopoéticas e células T yõ; (ii) separar células T yõ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células T yõ; e (iii) cultivar as células T yõ na ausência de ativação substancial da via do TCR por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ.
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Em alguns casos, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas exógenos da via do TCR e/ou na ausência do contato substancial de células estremais com as células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2 e IL-15. Por exemplo, as células T yõ podem ser expostas simultaneamente à IL-2 e à IL-15. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-4, IL-21, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, IL-Ιβ, HPLeSDF-1. Por exemplo, as células T yõ podem ser cultivadas na presença de IL-2 e/ou IL-21. Em algumas modalidades, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. A IL-21 pode estar em uma concentração de 1 ng/mL a 1,000 ng/mL (por exemplo, 10 ng/mL ou 100 ng/mL). [0015] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos anteriores, a etapa de separar as células T yõ das células não hematopoéticas inclui cultivar as células T yõ e as células não hematopoéticas em uma estrutura configurada para facilitar a saída celular do tecido não hematopoético. Em algumas modalidades, a etapa de separar as células T yõ das células nâo hematopoéticas inclui cultivar as células T yõ e as células não hematopoéticas na presença de IL-2, IL-15 ou ambas. Em algumas modalidades, uma população separada de linfócitos inclui a população separada de células T yõ, e a população separada de células T yõ inclui uma população separada de células T Võ1 e/ou duplas negativas (células DN). Em alguns casos, antes da etapa de expansão, 1 a 10% da população separada de linfócitos sâo células T yõ. Em algumas modalidades, antes da etapa de expansão, 1 a 10% da população separada de linfócitos são células T Võ1. Antes da etapa de expansão, pelo menos 80% da população separada de células T yõ podem ser células T Võ1 e/ou menos de 10% da população separada de células T yõ podem ser células T Võ2. Em algumas modalidades,
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9/119 as células T αβ e/ou células NK são removidas da população separada de células T yõ (por exemplo, antes da etapa de expansão).
[0016] Em algumas modalidades, antes da etapa de expansão, a população separada de células T γδ inclui pelo menos 10% de células CCR3+, pelo menos 0% de células CCR4+, pelo menos 10% de células CCR7+, pelo menos 10% de células CCR8+ ou pelo menos 10% de células CD103T Em algumas modalidades, antes da etapa de expansão, a população separada de células T yõ inclui uma maior frequência de células CCR3+, células CCR4+, células CCR7+ e/ou células CCR8+, em relação a uma população de referência (por exemplo, uma população de referência de células T Võ2 residentes no sangue). Em algumas modalidades, antes da etapa de expansão, a população separada de células T Võ1 inclui uma maior frequência de células NKG2D*, células CD56+, células CD69* e/ou células TIM3+ em relação a uma população de referência (por exemplo, uma população de referência de células T Võ2 residentes no sangue).
[0017] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, dentro de 14 dias de cultura durante a etapa de expansão, a população expandida de células T yõ inclui pelo menos 20 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de yõ T células antes da etapa de expansão. Adicionalmente ou alternativamente, dentro de 21 dias de cultura durante a etapa de expansão, a população expandida de células T yõ pode incluir pelo menos 50 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão. A população expandida de células T yõ inclui uma população expandida de células T Võ1. Em algumas modalidades, dentro de 14 dias de cultura durante a etapa de expansão, a população expandida de células T Võ1 inclui pelo menos 20 vezes o número de células T Võ1 em relação à população separada de células T Võ1 antes da expansão. Adicionalmente ou alternativamente, dentro
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10/119 de 21 dias de cultura durante a etapa de expansão, a população expandida de células T Võ1 inclui pelo menos 50 vezes o número de células T Võ1 em relação à população separada de células T Võ1 antes da expansão.
[0018] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, a população expandida de células T γδ expressa CD27. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter uma expressão superficial mediana maior de CD27 do que a população separada de células T γδ. Em alguns casos, a população expandida de células T γδ tem uma expressão superficial mediana de CD27 que é pelo menos duas vezes em relação à população separada de células T yõ. Adicionalmente ou alternativamente, a população expandida de células T γδ pode ter uma frequência maior de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ em relação à população separada de células T γδ. Em algumas modalidades, a população expandida de células T Võ1 expressa CD27. Em algumas modalidades, a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão superficial mediana maior de CD27 do que a população separada de células T VÕ1. Por exemplo, a população expandida de células T Võ1 pode ter uma expressão superficial mediana de CD27 que é pelo menos duas vezes em relação à da população separada de células T Võ1. Adicionalmente ou alternativamente, a população expandida de células T Võ1 pode ter uma frequência maior de células CD27+ em relação à população separada de células T Võ1. Por exemplo, a população expandida de células T Võ1 pode ter pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27* em relação à população separada de células T Võ1.
[0019] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, a população expandida de células T yõ tem uma expressão
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11/119 superficial mediana mais baixa de TIGIT do que a população separada de células T γδ. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter uma expressão superficial mediana de TIGIT que é pelo menos 50% menor que a população separada de células T γδ. Adicionalmente ou alternativamente, a população expandida de células T γδ pode ter uma frequência mais baixa de células TIGIT+ do que a população separada de células T γδ. Por exemplo, a população expandida de células T γδ pode ter pelo menos uma frequência 20% menor de células TIGIT* do que a população separada de células T yõ. Em algumas modalidades, a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão superficial mediana mais baixa de TIGIT do que a população separada de células T Võ1. Por exemplo, a população expandida de células T Võ1 pode ter uma expressão superficial mediana de TIGIT que é pelo menos 50% menor que a da população separada de células T Võ1. Adicionalmente ou alternativamente, a população expandida de células T Võ1 pode ter uma frequência mais baixa de células TIGIT* do que a população separada de células T VÕ1. Por exemplo, a população expandida de células T Võ1 pode ter pelo menos uma frequência 20% menor de células TIGIT* do que a população separada de células T VÕ1.
[0020] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, a população expandida de células T yõ tem uma maior expressão superficial de um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA , CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada células T γδ antes da etapa de expansão). Adicionalmente ou altemativamente, a população expandida de células T γδ pode ter uma frequência maior de células que expressam um ou
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12/119 mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T γδ tem uma expressão superficial inferior de um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG 3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Adicionaimente ou alternativamente, a população expandida de células T yõ pode ter uma frequência mais baixa de células que expressam um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão).
[0021] Em algumas modalidades, a população expandida de células T Võ1 tem uma maior expressão superficial de um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma maior frequência de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que
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13/119 consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma expressão superficial inferior de um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69 , PD-1 e CD64, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em outras modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma frequência inferior de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão).
[0022] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, a etapa (iii) inclui cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais, na ausência do contato substancial de células alimentadoras e/ou na ausência contato substancial de célula de tumor. Em algumas modalidades, o tecido não hematopoético não é um tecido tumoral.
[0023] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o tecido não hematopoético é a pele (por exemplo, pele humana, por exemplo, pele obtida por biópsia por punção). Em outras modalidades, o tecido não hematopoético é um tecido intestinal.
[0024] Em qualquer um dos aspectos e modalidades anteriores, o
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14/119 método de expansão de células T yõ pode ser realizado in vitro.
[0025] Em qualquer um dos aspectos e modalidades anteriores, a etapa de fornecer um tecido não hematopoético pode incluir o fornecimento de um tecido não hematopoético que foi obtido de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo animal humano ou não humano.
[0026] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma célula T yõ expandida obtida pelo método de qualquer um dos aspectos anteriores.
[0027] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica incluindo a célula T γδ expandida do aspecto anterior. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda um agente terapêutico adicional selecionado do grupo que consiste em um agente imunoterapêutico, um agente citotóxico, um agente inibidor de crescimento, um agente de radioterapia, um agente antiangiogênico ou uma combinação de dois ou mais agentes dos mesmos. Em alguns casos, o agente terapêutico adicional é um agente imunoterapêutico (por exemplo, IL-2, por exemplo, IL-2 em baixa dose, por exemplo, de 0,3 x 106a 3,0 x 106 UI de IL-2 por dia, por exemplo, 1,0 x 106 UI de IL2 por dia).
[0028] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica do aspecto anterior para uso em um método de tratamento de um indivíduo por terapia de célula T adotiva.
[0029] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma célula T yõ expandida de qualquer um dos aspectos anteriores para uso em um método de tratamento de um indivíduo por terapia de célula T adotiva. [0030] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um uso da célula T γδ expandida ou sua composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer (por exemplo, um tumor sólido), infecção (por exemplo, infecção por citomegalovírus (CMV)) ou imunopatologia em
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15/119 um indivíduo,
[0031] Em outro aspecto, a invenção fornece a célula T yõ expandida ou sua composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores para uso em um método para o tratamento de câncer (por exemplo, um tumor sólido), infecção (por exemplo, citomegalovírus (infecção por CMV) ou imunopatologla em um indivíduo.
[0032] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um Indivíduo por terapia de célula T adotiva, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas obtidas pelos métodos de qualquer uma das modalidades anteriores ao indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas é menor do que 10 x 1012 células por dose ou menor do que 10 x 1012 células ao longo do tratamento. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao indivíduo em necessidade do mesmo. O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupo que consiste em um agente imunoterapêutico, um agente citotóxico, um agente inibidor do crescimento, um agente de radioterapia, um agente antlangiogênico ou uma combinação de dois ou mais agentes dos mesmos. O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente com, antes ou após a administração das células T expandidas. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente imunoterapêutico. Em uma modalidade, o agente imunoterapêutico é IL-2 (por exemplo, IL-2 em baixa dose, por exemplo, de 0,3 x 106 a 3,0 x 106 UI de IL-2 por dia, por exemplo, 1,0 x 106 UI de IL-2 por dia). Estas modalidades se aplicam a qualquer um dos aspectos anteriores ou a seguir relacionados ao uso das células T yõ expandidas obtidas pelos métodos aqui descritos (ou uma composição farmacêutica que inclui estas células T yõ) em um método que trata um indivíduo por terapia de célula T adotiva.
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[0033] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um indivíduo por terapia de célula T adotiva, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0034] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos anteriores, o indivíduo é um humano (por exemplo, um paciente com câncer humano (por exemplo, um paciente com câncer humano sendo tratado por um tumor sólido) ou um paciente com câncer humano sendo tratado por uma infecção (por exemplo, uma infecção de um vírus, tal como o CMV)).
[0035] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de expansão de células Τ yõ incluindo (i) fornecer uma população de células Τ yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células Τ yõ na presença de: (a) IL-2 ou IL-9; (b) IL-15; e (c) IL-21 por pelo menos 5 dias em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células Τ yõ. Em algumas modalidades, as células T yõ são cultivadas na presença de IL-4, bem como na etapa (ii).
[0036] Ainda em outro aspecto, a invenção apresenta um método para expandir células T yõ (i) fornecendo uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivando as células T yõ na presença de IL-2, IL-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-21, fator derivado de células estromais (SDF, por exemplo, SDF-1), IL- 1 β, IL-12, IL-18 e IL-33 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ na ausência de agonistas da via de TCR exógenos. Em algumas modalidades, a etapa (ii) inclui cultivar as células T yõ em meio sem soro. Em algumas modalidades, após a etapa (i), as células T yõ são separadas das células não hematopoéticas para produzir uma população separada de células
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Τ γδ. Além disso, a etapa (ii) pode incluir cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais; cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células tumorais; e/ou cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células alimentadoras.
[0037] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de expansão de células Τ γδ através das etapas de: (i) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido incluindo células não hematopoéticas e células T yõ; (ii) separar células Τ γδ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células T yõ; e (iii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2, 1L-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-21, SDF, IL-1 β, IL-12, IL-18 e IL-33 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ. As células T yõ podem ser cultivadas na presença de IL-2, IL-15 e IL21. Adicionalmente ou alternativamente, as células T yõ podem ser cultivadas em meio sem soro.
[0038] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma população isolada de células T yõ tendo um fenótipo de qualquer uma das populações expandidas acima mencionadas de células Τ yõ. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T yõ da população isolada expressam CD27 e não expressam substancialmente TIGIT. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T yõ da população isolada expressam Võ1.
[0039] Em outro aspecto, a invenção inclui composições farmacêuticas das células T yõ isoladas do aspecto anterior.
[0040] Em outro aspecto, são aqui fornecidos usos das composições farmacêuticas aqui descritas.
[0041] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um indivíduo por terapia de célula T adotiva, administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas
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18/119 descritas acima, uma população isolada descrita acima ou uma composição farmacêutica descrita acima, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[0042] Qualquer modalidade descrita neste pedido pode ser combinada com qualquer outra modalidade descrita, dentro de cada um dos aspectos da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0043] FIGS. 1A-1D mostram que a pele humana inclui uma população notável de células T yõ residentes. FIG. 1A: Os linfócitos residentes na pele foram isolados utilizando uma cultura celular organotípica publicada por Clark et al (Clark et al., Journal of Investlgational Dermatology. 2006. 126(5): 1059-70; the Clark protocol). Dentro das células CD45+, anti-CD3 foi usado para corar células T e anticorpo anti-CD56 para identificar células NK, CD3 CD56+, respectivamente. Nas células CD3+, anticorpos contra o receptor de célula T yõ pan foram utilizados para identificar Τ yõ residente na pele e anti-CD8a para identificar proporções de células Τ αβ positivas para CD4 e CD8 convencionais dentro do canal CD3+, pan yõ TCR. FIG. 1B mostra um resumo destas experiências para 7-10 doadores usando o protocolo Clark. Usando este protocolo, os linfócitos da pele humana ainda estão em contato com os fibroblastos dérmicos, e foram suplementados sem citocinas ou com interieucina-2 (IL-2), interleucina-15 (IL-15) ou IL-2 e IL-15, indicando que o uso de citocinas não altera a composição de linfócitos residentes na pele, com exceção de uma população de células T yõ ligeiramente maior ao suplementar a cultura com IL-15 ou IL-2 e IL-15, validando o protocolo Clark. As composições de linfócito após uma cultura de pele organotípica de 3 semanas são mostradas usando as citocinas indicadas como um resumo para 4 doadores. FIG. 1C: As células yõ residentes na pele incluem principalmente células T yõ de expressão de Võ1 (76,24% ± 17,3), uma pequena população de céluPetição 870190111981, de 01/11/2019, pág. 207/321
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Ias T VÕ2 (3,06% ± 6,1) e uma população de células positivas para TCR pan-γδ que apresentam manchas negativas para Võ1 ou VÕ2, também aqui referidas como células T duplas negativas (DN) γδ (20,7% ± 13,97). A marcação de controle do sangue de voluntários saudáveis mostra a forte compartimentação das células T yõ humanas, pois no sangue a população dominante de células Τ γδ expressa a cadeia Võ2 TCR. FIG. 1D: As células Τ γδ residentes na pele mostram marcadores previamente associados a células T que foram ativadas cronicamente, embora estes marcadores sejam indicadores de assinatura da residência do tecido, em vez de refletir necessariamente a ativação crônica. Os histogramas mostram marcação dos marcadores indicados nas células Τ γδ (histograma preenchido) versus o controle ísotípíco apropriado para cada anticorpo (histograma vazio).
[0044] FIGS. 2A a 2D mostram que as células Τ γδ residentes na pele derivadas diretamente da pele humana através do protocolo Clark exibem uma resposta parcial de Th1 na ativação por meios convencionais para ativar células T e também exibem uma resposta parcial de Th1 na ativação apenas de ligantes NKG2D. FIG. 2A: As células Τ γδ residentes na pele mostram forte expressão do receptor ativador e associado à célula NK NKG2D (histograma preenchido, contra isótipo representado pelo histograma vazio). Na ativação usando MICA recombinante ligado à placa, um dos ligantes conhecidos para os receptores NKG2D, as células T yõ de pele respondem sem qualquer outra estimulação e independente da ligação do TCR, pois a resposta é revogada na presença de anticorpos NKG2D bloqueadores. As células foram estimuladas por 6 horas na presença de brefeldina A e 100 unidades de IL-2/mL e foram subsequentemente analisadas quanto à desgranulação por marcação para CD 107a. A produção de TNFa e INF-γ foi analisada por permeabilização após a marcação de superfície e subsequente marcação de citocinas intracelulares. O 13-acetato de
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20/119 forbol 12-miristato (P) em combinação com a ionomicina (I) foi usado como controle positivo para ativar as células T. FIG. 2B: As células T yõ residentes na pele mostram uma resposta parcial de TH1, as células T yõ foram recuperadas usando o protocolo Clark e estimuladas com PMA e ionomicina por 6h na presença de brefeldina A e coradas para citocinas intracelulares, células T yõ recém-isoladas da pele humana produz TNFa e IFN-γ na estimulação, porém, apenas pequenas ou indetectáveis quantidades de citocinas, por exemplo, IL-4, IL-17A, IL-13, IL-22, que estão associadas às células Th2 ou Th-17, enquanto as células T CD4+ αβ convencionais mostram uma variedade muito mais ampla de produção de citocinas. FIG. 2C: Dos linfócitos derivados diretamente da pele humana, níveis variados do receptor NKG2D são expressos por células T yõ, células T αβ convencionais CD8a+ e células NK. Entre estas células, as células NK respondem à exposição apenas aos ligantes NKG2D, porém, dentro das células T, é apenas a população de células T yõ que mostra uma resposta de citocina na estimulação com ligantes NKG2D na ausência de qualquer estimulação de TCR (veja, fileira superior de plotagens de pontos por cltometria de fluxo). A resposta pode ser bloqueada usando anticorpos anti-NKG2D bloqueadores solúveis, indicando que a resposta é mediada exclusivamente pelo receptor NKG2D. FIG. 2D: Entre as células T yõ residentes na pele, apenas as células T Võ1 e DN yõ mostram o potencial tipo inato a ser ativado apenas por MICA recombinante (indicado por um *). As células T de expressão Võ2 encontradas em pequenos números na pele não apresentam tal resposta.
[0045] FIGS. 3A-3D mostram que as células T residentes na pele respondem exclusivamente à segregação do estroma dérmico com forte ativação e proliferação. FIG. 3A: Linfócitos residentes na pele foram isolados usando o protocolo Clark. Após uma cultura organotípica de 3 semanas, os linfócitos da pele foram colhidos e separados de
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21/119 quaisquer células da pele residuais, incluindo fibroblastos e colocados em cavidades de cultura de tecido em densidades de 1 milhão de linfócitos/mL e suplementados com 100 U/mL de IL-2. Após 3 semanas adicionais, as células T yõ residentes expandiram-se fortemente e foram enriquecidas na cultura de linfócitos da pele. Esse forte fenômeno proliferativo foi exclusivo das células T yõ residentes na pele, representadas pela maioria das células T Võ1 que proliferaram 127,18 vezes em média em 3 semanas, enquanto as células T αβ convencionais proliferaram apenas 5,21 vezes em média; isto é mais de 20 vezes menos satisfatório. FIG. 3B: As células T Võ1 residentes na pele respondem à perda de tecido por meio da sub-regulação do marcador Ki~ 67 (indicativo de ciclagem celular) por 14 dias (controle de isótipo representado pelo histograma vazio delimitado por uma linha tracejada; expressão de Ki-67 no dia 0 representado pelo histograma vazio; expressão de Ki-67 no dia 7 representado pelo histograma cinza claro; expressão de Ki-67 na marcação do dia 14 representada pelo histograma cinza escuro). Além disso, as células T Võ1 residentes na pele, que na maioria são negativas para o receptor alfa de IL-2 (CD25) quando em contato com estroma dérmico, sub-regulam o CD25 após a segregação do tecido (controle de isotipo: histograma tracejado, marcação do dia 0: histograma cinza claro, marcação do dia 7: histograma cinza escuro). FIG. 3C: Altas taxas de ciclagem celular, conforme indicado pela intensidade de fluorescência mediana (MFI) de Ki-67, são vistas apenas nas células T yõ residentes na pele, representadas pelas células T VÕ1, e não são vistas nas células T αβ convencionais nem nas células NK onde a MFI realmente diminui em 14 dias. FIG. 3D: Os linfócitos da pele segregados a partir de células estromais mostram uma população de células T γδ residentes fortemente enriquecida após uma cultura de 3 semanas. Essa população de células T γδ contém a maioria das células positivas para Võ1 (77,49% ± 17,04) e
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22/119 células T DN positivas para pan yõ TCR (21,46% ± 16,92). A população de célula T VÕ2 pequena inicial observada em linfócitos de pele recém-colhidos usando o protocolo Clark está diminuindo e quase perdendo (0,6% ± 1,204) após uma expansão de 3 semanas de células T yõ de tecido.
[0046] FIGS. 4A e 4B mostram que as células T residentes na pele respondem à perda de tecido e sâo controladas por um mecanismo dependente de contato pelas células do estroma dérmico, particularmente fibroblastos. FIG. 4A: Os linfócitos da pele mistos foram colhidos após cultura organotípica, como no protocolo Clark após 3 semanas. Os linfócitos mistos foram, então, semeados em cima de uma camada confluente de fibroblastos de pele autólogos e em uma transcavidade para controlar a presença de inibidores solúveis produzidos por fibroblastos. Após 14 dias, as expansões dobradas calculadas através de números absolutos de células presentes foram medidas para células T yõ e células T αβ convencionais. As células T yõ residentes na pele mostraram uma forte resposta proliferativa quando separadas do tecido e na presença de fibroblastos, porém, apenas quando não estão em contato celular direto com fibroblastos autólogos. As células T αβ convencionais não apresentaram tal resposta em nenhuma condição testada. FIG. 4B: Os linfócitos mistos obtidos da cultura organotípica foram semeados em uma monocamada de fibroblastos autólogos (histogramas cinza claro) ou semeados em cavidades vazias (histogramas cinza escuro) suplementados com IL-2 e cultivados por 7 dias. As células T Võ1 residentes na pele (painéis à esquerda) e as células T yõ TCR+, DN (painéis à direita) permaneceram inativas na presença direta de fibroblastos, porém, mostraram forte ativação quando segregadas da cultura organotípica dérmica e nenhuma presença de fibroblastos, como indicado por expressão superregulada (MFI) de CD25, o fator de transcrição associado a Th-1 T-bet
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23/119 e o marcador de ciclagem celular Ki-67 (histogramas vazios tracejados representam o controle de isótipo correspondente).
[0047] FIGS. 5A e 5B mostram que células T yõ da pele em expansão apresentam sinais de repressão e ganho de forte potencial citotóxico. FIG. 5A: As células T γδ residentes na pele foram deixadas expandir por 14 dias após a separação da cultura celular organotipica. As células T γδ foram, então, classificadas negativamente usando citometria de fluxo, excluindo todas as células T convencionais coradas com um anticorpo monoclonal pan αβ TCR. 150.000 células T γδ classificadas foram, então, semeadas em uma placa de cultura de 96 cavidades planas em duplicado e deixadas em cultura sem suplementação de citocinas nem suplementação com qualquer ligante de ativação por 24 horas. Os sobrenadantes foram colhidos e analisados quanto a citocinas produzidas usando um arranjo de citocina à base de Affymetrix LUMIEX®. FIG. 5B: Células T yõ classificadas negativamente também foram semeadas em linhagens celulares de câncer semeadas 1 dia antes a uma concentração de 10.000 células por cavidade. Como um controle, células T αβ de pele convencionais negativamente classificadas foram utilizadas. As células T foram semeadas nas relações efetoralvo indicadas na presença e ausência de anticorpo NKG2D bloqueador na presença de IL-2 a 100 U/mL As células T yõ residentes na pele mostraram morte superior, como mostrado pela liberação de citoqueratina 18 (CK18) especifica epitelial clivada pela caspase, medida através de ELISA, de linhagens celulares malignas sobre células T αβ convencionais. A citotoxicidade foi pelo menos parcialmente mediada através do receptor NKG2D, como mostrado por sua redução em culturas contendo um anticorpo que bloqueia o receptor NKG2D.
[0048] FIGS. 6A-6D mostram uma análise de células T γδ residentes nos tecidos no intestino humano. FIG. 6A: Uma adaptação do protocolo Clark permitiu o isolamento de linfócitos residentes no intestino.
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Os linfócitos intestinais mistos contêm uma grande população de células T yõ residentes em tecidos, geralmente incluindo principalmente células T Võ1, porém, também contêm células Võ2 e T yõ duplas negativas. FIG. 6B: As células T yõ isoladas da cultura organotípica do intestino mostram respostas similares às células T yõ derivadas da pele à medida que super-regulam Ki~67 ao longo do tempo, uma vez segregadas do estroma intestinal. FIG. 6C: As células T yõ derivadas do intestino respondem a estímulos do tipo inato, tal como MICA recombinante, produzindo IFN-y e por desgranulação, conforme medido pela sub-regulação de CD107a. FIG. 6D: As células T yõ isoladas da cultura organotípica do intestino mostram respostas similares às células T yõ derivadas da pele e se expandem ao longo do tempo na cultura celular, como visto pelo enriquecimento geral em culturas de linfócitos que não têm contato com o estroma intestinal.
[0049] FIGS. 7A e 7B mostram o fenótipo de tecido de células T yõ derivadas da pele expandidas. FIG. 7A: As células T γδ derivadas da pele apresentam marcação positiva para os receptores de quimiocina residente na pele CCR4 e CCR8. FIG. 7B: Os níveis de expressão são diferentes nas células T yõ expandidas derivadas da pele ou sangue, respectivamente.
[0050] FIG. 8 mostra que a repressão das células T yõ derivadas da pele, sem qualquer estimulação do TCR, resulta na produção de citocina Th1 espontânea e de maneira interessante e em contraste com as células T yõ ativadas por TCR frescas, na produção da citocina atópica IL-13). Consistentemente com células T yõ recentemente derivadas, as células T yõ reprimidas e em expansão produzem quantidades desprezíveis de citocinas associadas a Th-2, por exemplo, IL-4 e IL-5. As células T yõ derivadas da pele foram deixadas expandir por 14 dias e classificadas negativamente excluindo células T αβ convencionais. 150.000 células T yõ misturadas foram cultivadas a uma densi
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25/119 dade de 1 milhão de células/mL em uma placa plana de 96 cavidades em duplicado para 4 doadores sem qualquer estímulo ou suplementação de citocina. Os sobrenadantes foram coletados após 24 horas e analisados usando o arranjo de citocina à base de LUMINEX® por Affymetrix.
[0051] FIG. 9 mostra que as células T yõ derivadas da pele expandidas e negativamente classificadas apresentam forte citotoxicidade contra várias linhagens celulares tumorais humanas com as quais são cocultivadas conforme medido pela liberação de citoqueratina 18 clivada por caspase pelas células alvo, usando ELISA.
[0052] FIGS. 10A e 10B mostram que células T Võ1 derivadas da pele, novas, não expandidas, mostram marcadores de ativação de células T anterior. FIG. 10A: As células T Võ1 derivadas da pele expressam CD69 alto e TIM3 e CD28 baixo. Além disso, elas mostram alta expressão do marcador de ativação NKG2D. Este fenótipo é sustentado por células T Võ1 derivadas da pele durante a expansão in vitro. Por outro lado, as células T Võ1 derivadas do sangue humano não apresentam estes sinais de ativação, não expressam CD69 ou ΊΊΜ3. Em comparação às células T Võ1 derivadas da pele, a expressão de NKG2D nas células T Võ1 derivadas do sangue é muito menor, enquanto as células T Võ1 derivadas do sangue expressam a molécula coestimuladora CD28. FIG. 10B: Somente células T Võ1 derivadas da pele são reativas a ligantes NKG2D, tal como MICA recombinante na ausência de qualquer outro estimulo, tal como um ligante para o receptor de células T. As células T Võ1 ou VÕ2 derivadas de sangue não mostraram tal capacidade de resposta a estímulos do tipo inato. As células foram semeadas em placas de 96 cavidades com anticorpos MICA ou anti-CD3 recombinantes ou ambos, ou ambos, conforme indicado. As células foram cultivadas durante 6 horas em IL-2 100 U/mL e BFA durante as últimas 4 horas, seguidas de marcação de antígeno
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26/119 de superfície, permeablllzação e marcação intracelular para IFN-y.
[0053] FIG. 11 mostra que as células T Võ1 derivadas da pele expressam níveis menores de CD16, porém, mostram expressão superficial substancial do receptor de IgG de alta afinidade CD64. Portanto, além da atividade citotóxica direta, as células T Võ1 derivadas de tecido também podem ser usadas para aumentar a eficácia de terapias com anticorpos monoclonais, tais como as terapias CD20 ou Her2, pois seriam guiadas pelo anticorpo para sítios de malignidades e metástase, reconhecer células tumorais opsonizadas e matá-las através de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Os resultados mostrados são de um doador representativo (de quatro). [0054] FIG. 12 mostra a expansão das células T Võ1 em IL-2 (painel esquerdo), IL-15 (painel central) e IL-2 + IL-15 (painel direito). Os linfócitos derivados da pele recentemente isolados foram cultivados em placas de base plana de 96 cavidades em Meio RPMI contendo 10% de FCS e 1% de Pen/Estrep e foram suplementados com IL-2, IL15 ou IL-2 + IL-15, respectivamente, por 7 dias. Tanto a IL-2 quanto a IL-15, bem como a combinação de ambas as citocinas, induziram a proliferação de células T VÕ1, conforme indicado pela alteração na marcação de Ki-67 em comparação à marcação de isótipo (verdadeiro negativo) na ausência de quaisquer células estremais. Ki-67 cora especificamente células que deixaram G0 do ciclo celular e é comumente associado à proliferação.
[0055] FIG. 13 mostra resultados de citometria de fluxo que indicam a expressão de CD9, CCR3 e CD39 na superfície das células T Võ1 expandidas no dia 21. As células T Võ1 derivadas da pele expandidas mantiveram altos níveis dos marcadores da superfície celular, CCR3, CD39 e CD9 conforme indicado por (histograma escuro) versus a marcação de isótipo equivalente (verdadeiro negativo, histograma aberto).
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[0056] FIG. 14 mostra a expressão de mRNA de CCR3 e CD9 em células T Võ1 derivadas da pele (barras escuras) e células T Võ1 derivadas do sangue (barras claras). As células T Võ1 derivadas da pele foram expandidas como aqui descrito, e as células T Võ1 derivadas do sangue foram expandidas usando anticorpos ligados à placa para o receptor de células T Võ (20 pg/mL). Após a expansão, as células T Võ1 foram isoladas usando Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) e o RNA foi isolado de 3 doadores para ambos os grupos (sangue · cinza vs. pele ™ escuro). O mRNA inteiro foi sequenciado e os níveis de expressão dos mRNAs indicados normalizados e log 2 transformado. Todos os níveis de expressão são mostrados em comparação direta e em relação ao GAPDH, um gene de manutenção comum expresso em altos níveis na maioria das células humanas.
[0057] FIG. 15 mostra a expressão de mRNA da IL-13 em células T Võ1 derivadas da pele (barras escuras) e células T Võ1 derivadas do sangue (barras claras). As células T Võ1 derivadas da pele foram expandidas como aqui descrito, e as células T Võ1 derivadas do sangue foram expandidas usando anticorpos de alta dose ligados à placa para o receptor de célula T Võ (20 pg/ml). Após a expansão, as células T Võ1 foram isoladas usando FACS e o RNA foi isolado de 3 doadores para ambos os grupos (sangue cinza vs. pele preto). O mRNA inteiro foi sequenciado e os níveis de expressão de mRNAs para IL-13 foram normalizados e o log 2 transformado. Os níveis de expressão são mostrados em comparação direta e em relação a GAPDH.
[0058] FIGS. 16A e 16B mostram a produção de citocinas em células T Võ1 derivadas da pele após estimulação do TCR com PMA/lonomicina (FIG. 16A) ou anti-CD3 (FIG. 16B). Após isolamento e expansão, as células T Võ1 derivadas da pele foram purificadas usando Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS). 150.000 células T Võ1 foram semeadas em uma placa de base plana de 96
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28/119 cavidades em duplicado para três doadores e estimuladas com antiCD3 ligado à placa (5 pg/mL) ou PMA/lonomicina por 24 horas. Os sobrenadantes foram analisados para quantidades absolutas de citocinas indicadas usando a plataforma LUMINEX®.
[0059] FIGS. 17A-17I mostram resultados de condições de expansão. As FIGS. 17A e 17B mostram plotagens representativas de citometria de fluxo e esquemas de controle para linfócitos separados (após 21 dias de cultura de separação; FIG. 17A) e linfócitos que foram expandidos na presença de IL-2, IL-4, IL-15 e IL -21 por 20 dias (FIG. 17B). FIG. 17C mostra a expansão dobrada de células T Võ1 sob várias condições, normalizada para expansão de células T Võ1 como um resultado de IL-2 (100 LJ/mL) e IL-15 (10 ng/mL). FIG. 17D mostra a expansão dobrada de células T Võ1 sob condições nas quais a IL-2 foi substituída com outros fatores, normalizadas para expansão de célula T Võ1 como um resultado de IL-2 e IL-15. O(s) fator(es) utilizados no lugar de IL-2 é indicado abaixo de cada barra. FIG. 17E mostra a expressão dobrada em relação à população separada, como um resultado do tratamento com IL-2+IL-15, IL2+IL-15+IL-4, IL-2+IL-15+IL21 e IL-2+IL-15+IL-4+IL-21. FIG. 17F mostra números absolutos de células T Võ1+ no dia 21 (pré-expansão) e no dia 41 (pós-expansão). As expansões foram realizadas em 100 U/ml de IL-2, 100 U/ml de IL-2 + 10 ng/ml de IL-15 ou 100 U/ml de IL-2 + 5 ng/ml de IL-4 + 10 ng/ml de IL-15 + 100 ng/ml de IL-21, como indicado, (n ™ 8-17). FIG. 17G mostra os números médios (mais SEM) de células T Võ1+ para cada condição em ambos os pontos de tempo. ** p = 0,001. Teste t de student não pareado. (n 8-17). FIG. 17H mostra a expansão de células T Võ1+ usando diferentes concentrações de IL-21, normalizadas para expansão usando 100 U/mL de IL-2, 5 ng/ml de IL-4 e 10 ng/ml de apenas IL-15 (n = 3). FIG. 17F mostra a expansão de células T Võ1 + usando 100 U/ml de IL-2 + 5 ng/ml de IL-4 + 10 ng/ml de IL-15 + 10
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29/119 ng/ml de IL-21, normalizada para expansão apenas com IL-2.
[0060] FIGS. 18A-18E caracterizam a expressão de CD27 por células T Võ1 expandidas. FIG. 18A mostra expressão dobrada de CD27 (por MFI) sob várias condições, normalizadas para expressão de CD27 como um resultado de IL-2 (100 U/mL) e IL-15 (10 ng/mL). FIG. 18B mostra a expressão dobrada de CD27 sob condições nas quais IL-2 foi substituída com outros fatores, normalizada para expressão de CD27 como um resultado d IL-2 e IL-15. O(s) fator(es) utilizado(s) no lugar de IL-2 é indicado abaixo de cada barra. FIG. 18C mostra MFI de CD27, em relação à população separada, como um resultado do tratamento com IL-2-HL-15, IL2+IL-15 + IL-4, IL-2+IL-15+IL-21 e IL-2+IL15+IL-4+IL-21. FIG. 18C mostra a expressão de Võ1+ CD27 usando diferentes concentrações de IL-21, normalizada para expansão usando 100 U/mL de IL-2, 5 ng/ml de IL-4 e 10 ng/ml de apenas IL-15, conforme avaliado por citometria de fluxo (n 3). FIG. 18E mostra a expressão de Võ1+ CD27 usando 100 U/ml de IL-2 + 5 ng/ml de IL-4 + 10 ng/ml de IL-15 + 10 ng/ml de IL-21, normalizada para expansão apenas com IL-2, conforme avaliado por citometria de fluxo, (n ™ 4)
[0061] FIG. 19A e 19B caracterizam a expressão superficial de TIGIT por células T Võ1 expandidas. FIG. 19A mostra a expressão dobrada de TIGIT (por MFI) sob várias condições, normalizadas para a expressão de TIGIT resultante do tratamento com IL-2 e IL-15. FIG. 19B mostra a expressão dobrada de TIGIT sob condições nas quais IL-2 foi substituída com outros fatores, normalizada para a expressão de TIGIT como um resultado de IL-2 e IL-15. O(s) fator(es) utilizado(s) no lugar de IL-2 é(são) indicado(s) abaixo de cada barra.
[0062] FIG. 20 é uma plotagem que mostra a expressão de TIGIT de superfície de células Individuais como uma função da expressão de CD27.
[0063] FIG. 21 é um gráfico que mostra o uso de citocinas para
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30/119 suportar a expansão e o enriquecimento de células Τ yõ derivadas de tecido na presença ou ausência de frações séricas ou plasmáticas derivadas do sangue. Populações de linfócitos mistas isoladas de uma amostra de tecido contendo células T yõ a 2% foram expandidas nos meios contendo IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21 com ou sem soro AB humano a 10%. Os dados destacam expansão bem-sucedida e equivalente (432 vezes) e enriquecimento (de 2% a 77%) sem soro humano versus com soro (expansão de 295 vezes, enriquecimento de 2% a 75%).
[0064] FIGS. 22A-22D são gráficos que mostram exemplos de enriquecimento de células yõ derivadas de tecido de populações de linfócitos mistas isoladas. As células foram isoladas a partir de uma única amostra de tecido humano e replicações e depois expandidas em meios TexMACS mais IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21 contendo 10% de soro (colunas da esquerda) ou 5% de soro de sistema de terapia celular (CTS™) (colunas da direita). Os perfis de culturas celulares isoladas e expandidas são apresentados como indicado. FIG. 22A mostra que as culturas isoladas iniciais contêm números relativamente baixos (<10%) de células T yõ derivadas de tecido desejadas. Em contraste, as FIGS. 22B-22D mostram que após a expansão, a população de célula resultante é fortemente enriquecida para células T yõ derivadas de tecido.
[0065] FIG. 23 é um gráfico que mostra a expressão de TIGIT constitutiva nas células Võ1 residentes no intestino. Os dados foram gerados usando células Võ1 isoladas do epitélio intestinal usando um protocolo de isolamento padrão para a liberação de linfócitos intraepiteliais colônicos.
[0066] FIGS. 24A e 24B são gráficos que mostram que o receptor de Poliovírus (PVR) inibe especificamente a sinalização do TCR conforme medido pela expressão de IFNy (FIG. 24A) e TNFa (FIG. 24B). As células foram incubadas com IL-2 e IL-15 e ativadas com anticorpo anti-CD3.
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[0067] FIGS. 25A e 25B são gráficos que mostram que o efeito inibidor de PVR é perdido em células VÕ1+/VÕ3+ negativas para TlGIT, conforme medido por IFNy (FIG. 25A) ou TNFa (FIG. 25B). As células foram incubadas com IL-2, IL-15, IL-4 e IL-21 e ativadas com anticorpo anti-CD3.
[0068] FIGS. 26A e 26B são gráficos que mostram que a IL-9 pode substituir a função da IL-2 na expansão de células T yõ derivadas da pele. Os tecidos da pele de três doadores (TS052, TS056 e SK073) foram colocados em grades de 9 mm e cultivados por três semanas em meio suplementado com IL-2 e IL-15. Em seguida, os linfócitos isolados foram expandidos em meio suplementado com IL-2, IL-4- IL-15 e IL-21 (barras da esquerda) ou IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21 (barras da direita). O rendimento final de células T γδ/grade (FIG. 26A) e células Võ1/grade (FIG. 26B) foi calculado após 3 semanas de expansão. A substituição de IL-2 por IL-9 na expansão de células T yõ derivadas da pele resultou na eficiência de expansão equivalente. Os histogramas representam a média +/- SEM.
[0069] FIGS. 27A-27C são gráficos que mostram que a IL-9 pode substituir a função da IL-2 na expansão de células T yõ derivadas da pele, conforme medido por mudança de duplicação (FIG. 27A), % de células T yõTCR+ (FIG. 27B) e % de células T VÕ1+ (FIG. 27C). Os tecidos de pele eram de seis doadores (SK073, SK075, SK077, TS052, TS053 e TS056). 2CK = 2 citocinas (IL-2 + IL-15) e 4CK = 4 citocinas (IL-2 + IL-15 + IL-21 + IL-4).
DESCRIÇÃO DETALHADA
I. Introdução
[0070] São aqui fornecidos métodos de expansão de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T duplas negativas) de uma fonte de tecido não hematopoético (por exemplo, células T yõ deriva
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32/119 das de tecido não hematopoético, por exemplo, células T Võ1 derivadas de tecido não hematopoético). Os métodos de expansão incluem a cultura de células Τ γδ (por exemplo, células Τ γδ separadas de células estromais do tecido não hematopoético) na ausência de estimulação do TCR substancial e/ou na presença de interleucina-4 (IL-4), interleucina~15 (IL-15), interleucina~21 (IL-21) e/ou interleucina-2 (IL-2). Além disso, são fornecidas composições de células T yõ expandidas (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) e métodos de utilização das células T yõ expandidas (por exemplo, uma parte de uma terapia de célula T adotiva, por exemplo, para tratamento do câncer).
II, Definições
[0071] Deve ser entendido que os aspectos e modalidades da invenção aqui descritos incluem compreendendo, consistindo e consistindo essencialmente em aspectos e modalidades. Quando aqui utilizado, a forma singular um, uma e o/a inclui referências plurais, a menos que indicado de outra forma.
[0072] O termo cerca de, quando aqui utilizado, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo especialista neste campo técnico. A referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Em alguns casos, cerca de abrange variações de +20%, em alguns casos +10%, em alguns casos +5%, em alguns casos +1% ou em alguns casos +0,1% do valor especificado, como tais variações são apropriadas para executar os métodos descritos.
[0073] Quando aqui utilizado, os termos substancial e substancialmente se referem à condição qualitativa de exibir extensão ou grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Alguém versado em técnicas biológicas entenderá que os fe
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33/119 nômenos biológicos e químicos raramente, se alguma vez, chegam à conclusão e/ou prosseguem à integralidade ou alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo substancialmente é, portanto, aqui utilizado para capturar a potencial falta de integralidade inerente a muitos fenômenos biológicos e químicos. Ao descrever um cenário físico, tal como interação receptor/Hgante ou contato célula/célula, o cenário é substancial se seu resultado funcional for detectável por meios convencionais disponíveis para a pessoa que executa o método. Por exemplo, ativação do TCR substancial refere-se a um nível detectável de ativação do TCR entre uma população de células (por exemplo, um grau estatisticamente significativo de ativação do TCR). Em algumas modalidades, um TCR é substancialmente ativado na exposição de até 0,1%, até 0,5%, até 1%, até 5%, até 10%, até 20%, até 30% ou até 40% da ECso do agonista da via do TCR (por exemplo, um anticorpo, por exemplo, anti-CD3 ou uma lectina) na respectiva população de células. Da mesma forma, contato de célula substancial (por exemplo, contato de célula alimentadora substancial, contato de célula estromal substancial ou contato de célula de tumor substancial) refere-se a um grau de contato célula para célula capaz de induzir uma alteração detectável na célula em expansão (por exemplo, para reduzir a expansão). Em alguns casos, o contato celular substancial ocorre quando um tipo de célula contaminante (por exemplo, uma célula alimentadora, uma célula estromal ou uma célula tumoral) está presente no compartimento de cultura em uma concentração de até 0,1%, até 0,5%, até 1%, até 5%, até 10% ou até 20% em número em relação à população de células em expansão. Um número substancial” de células ou quantidade substancial de agente também se refere ao número ou quantidade necessária para induzir um efeito substancial, como definido acima.
[0074] Quando aqui utilizado, células não hematopoéticas inclu
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34/119 em células estromais e células epiteliais. As células estromais são células do tecido conjuntivo não hematopoético de qualquer órgão e suportam a função das células parenquimatosas deste órgão. Exemplos de células estromais incluem fibroblastos, pericitos, células mesenquimais, queratinócitos, células endoteliais e células tumorais nâo hematológicas. As células epiteliais são células não hematopoéticas que revestem as cavidades e superfícies dos vasos sanguíneos e órgãos por todo o corpo. Elas sâo normalmente escamosas, colunares ou cuboidais na forma e podem ser dispostas como uma única camada de células ou como camadas de duas ou mais células.
[0075] Quando aqui utilizado, células T yõ residentes em tecido não hematopoético”, derivadas de tecidos não hematopoéticos e células T yõ nativas em tecido não hematopoético referem-se a células T yõ que estavam presentes em um tecido não hematopoético no momento em que o tecido é explantado. As células T yõ residentes em tecido não hematopoético podem ser obtidas a partir de qualquer tecido não hematopoético animal humano ou não humano adequado. O tecido não hematopoético é um tecido que não é sangue ou medula óssea. Em algumas modalidades, as células T yõ não são obtidas a partir de tipos particulares de amostras de fluidos biológicos, tal como sangue ou fluido sinovial. Exemplos de tais tecidos não hematopoéticos animais humanos ou não humanos adequados incluem a pele ou uma porção dos mesmos (por exemplo, derme ou epiderme), o trato gastrointestinal (por exemplo, epitélio gastrointestinal, cólon, intestino delgado, estômago, apêndice, ceco ou reto), tecido da glândula mamária, pulmão (preferivelmente, em que o tecido não é obtido por lavado broncoalveolar), próstata, fígado e pâncreas. Em algumas modalidades, células T yõ residentes em tecido não hematopoético podem ser derivadas de um tecido linfoide, como timo, baço ou amígdala. As células T yõ também podem ser residentes nos tecidos de câncer huma
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35/119 no, por exemplo, mama e próstata. Em algumas modalidades, as células T yõ não são obtidas a partir de tecido de câncer humano. As amostras de tecido não hematopoético podem ser obtidas por técnicas padrão, por exemplo, por explante (por exemplo, blópsia). As células T yõ residentes no tecido não hematopoética incluem células T yõ não VÕ2, por exemplo, células T VÕ1, células T duplas negativas (DN), células T VÕ3 e células T VÕ5.
[0076] Quando aqui utilizado, !iIL-2!i refere-se a IL-2 nativa ou recombinante ou uma variante do mesmo que atua como um agonista de uma ou mais subunidades do receptor de IL-2 (IL-2R) (por exemplo, mutantes, muteínas, análogos, subunidades, complexos receptores, fragmentos, isoformas e peptidomiméticos dos mesmos). Tais agentes podem suportar a proliferação de uma linhagem celular dependente de IL-2, CTLL-2 (33; American Type Culture Collection (ATCC®) TIB 214). A IL-2 humana madura ocorre como uma sequência de 133 aminoácidos (menos o peptídeo sinal, consistindo em 20 aminoácidos Nterminais adicionais), como descrito em Fujita, et al. Ce// 1986. 46,3: 401-407. Uma muteína de IL-2 é um polipeptídeo em que foram feitas substituições específicas à proteína interleucina-2, mantendo a capacidade de se ligar a IL~2Rp, tais como as descritas em US 2014/ 0046026. As muteínas de IL-2 podem ser caracterizadas por inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácidos em um ou mais sítios em ou nos outros resíduos da cadeia polipeptídica de IL2 nativa. De acordo com esta descrição, tais inserções, deleções, substituições e modificações resultam em uma muteína de IL-2 que mantém a atividade de ligação a IL-2Rp. Muteínas exemplares podem incluir substituições de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos. [0077] O ácido nucleico que codifica a IL-2 humana pode ser obtido por procedimentos convencionais, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR). A sequência de aminoácido da IL-2 humana (Gene
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ID 3558) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NPJ300577.2 Gl: 28178861. A sequência de aminoácido de IL-2 de murino (Mus musculus) (Gene ID 16183) é encontrada no Genbank sob localizador de acesso NP_032392.1 Gl: 71 0653.
[0078] IL-2 também pode se referir a IL-2 derivada de uma variedade de espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, humano, símio, bovino, suíno, equino e murino. As variantes podem compreender sequências conservativamente substituídas, o que significa que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo tendo propriedades físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservadoras incluem substituição de um resíduo allfátlco por outro, tal como Ile, Vai, Leu ou Ala um para o outro, ou substituições de um resíduo polar para outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras tais substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras tendo características de hidrofobicidade similares, são bem conhecidas. As variantes de IL-2 de ocorrência natural também são abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de junção de mRNA alternativos ou da divagem proteolítica da proteína IL-2, em que a propriedade de ligação a IL-2 é mantida. A junção alternativa do mRNA pode produzir uma proteína IL-2 truncada, porém, biologicamente ativa. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C na expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína IL-2 (geralmente de 1 a 10 aminoácidos). Em algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado para alterar suas propriedades físicas, por exemplo, com um grupo químico tal como o polietileno glicol (Yang, et al. Câncer 1995. 76:687-694). Em algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado com aminoácidos adicionais (Clark-Lewis, et al. PNAS
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1993. 90:3574-3577).
[0079] Quando aqui utilizado, iL-15 refere-se a IL-15 nativa ou recombinante ou uma variante da mesma que atua como um agonista para uma ou mais subunidades do receptor de IL-15 (IL-15R) (por exemplo, mutantes, muteínas, análogos, subunidades, complexos receptores, fragmentos, isoformas e peptidomiméticos dos mesmos). A IL-15, como a IL-2, é um fator de crescimento de células T conhecido que pode suportar a proliferação de uma linha celular dependente de IL-2, CTLL-2. A IL-15 foi relatada pela primeira vez por Grabstein, et al. (Grabstein, et al. Science 1994. 264.5161: 965-969) como uma proteína madura de 114 aminoácidos. O termo IL-15, quando aqui utilizado, significa IL-15 nativa ou recombinante e muteínas, análogos, subunidades dos mesmos ou complexos dos mesmos (por exemplo, complexos receptores, por exemplo, peptídeos de sushi, conforme descrito em WO 2007/046006), e cada um dos quais pode estimular a proliferação de células CTLL-2. Nos ensaios de proliferação de CTLL2, os sobrenadantes de células transfectadas com precursor recombinantemente expresso e fusões em-estrutura de formas maduras de IL15 podem induzir a proliferação de células CTLL-2.
[0080] A IL-15 humana pode ser obtida de acordo com os procedimentos descritos por Grabstein, et al. (Grabstein, et al. Science 1994. 264.5161: 965-969) ou por procedimentos convencionais tais como reação em cadeia da polimerase (PCR). Um depósito de cDNA de IL-15 humano foi feito com ATCC® em 19 de Fevereiro de 1993 e o número de acesso atribuído 69245.
[0081] A sequência de aminoácido de IL-15 humana (Gene ID 3600) é encontrada no Genbank sob localizador de acesso NP000576.1 GI: 10835153 (isoforma 1) e NP... 751915.1 GI: 26787986 (isoforma 2). A sequência de aminoácido de IL-15 de murino (Mus muscuius) (Gene ID 16168) é encontrada no Genbank sob o localiza
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38/119 dor de acesso NPJ)01241676.1 Gl: 363000984.
[0082] A IL-15 também pode se referir a 11-15 derivada de uma variedade de espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, humanos, símios, bovinos, suínos, equinos e murinos. Uma materna ou variante de IL-15, como aqui referido, é um polipeptídeo substancialmente homólogo a uma sequência de uma IL-15 de mamífero nativa, porém, que possui uma sequência de amínoâcido diferente de um polipeptídeo de IL-15 de mamífero nativo devido a uma deleção, inserção ou substituição de amínoâcido. As variantes podem compreender sequências conservativamente substituídas, o que significa que um determinado resíduo de amínoâcido é substituído por um resíduo tendo características físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como lie, Vai, Leu ou Ala por outro, ou substituições de um resíduo polar por outro, como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras tais substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras tendo características de hidrofobicidade similares, são bem conhecidas. As variantes de IL-15 de ocorrência natural também são abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de junção de mRNA alternativos ou da divagem proteolítica da proteína IL-15, em que a propriedade de ligação a IL-15 é mantida. A junção alternativa do mRNA pode produzir uma proteína IL-15 truncada, porém, biologicamente ativa. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C na expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteoiítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína IL-15 (geralmente de 1 a 10 aminoácidos). Em algumas modalidades, o terminal da proteína pode ser modificado para alterar suas propriedades físicas, por exemplo, com um grupo químico tal como polietileno glicol (Yang, et al. Câncer 1995. 76:687-694). Em
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39/119 algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado com aminoácidos adicionais (Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90:3574-3577).
[0083] Quando aqui utilizado, 11-4 refere-se à IL-4 nativa ou recombinante ou uma variante da mesma que atua como um agonista de uma ou mais subunidades do receptor de IL-4 (IL-4R) (por exemplo, mutantes, muteínas, análogos, subunidades, complexos receptores, fragmentos, isoformas e peptidomiméticos dos mesmos). Tais agentes podem suportar a diferenciação de células T auxiliares virgens (células ThO) para células Th2. A IL-4 humana madura ocorre como uma sequência de 129 aminoácidos (menos o peptídeo sinal, consistindo em 24 aminoácidos N-terminais adicionais). Uma muteína de IL-4 é um polipeptídeo em que substituições específicas à proteína interleucina-4 foram feitas mantendo a capacidade de se ligar a IL-4Ra, tais como as descritas na Patente US No. 6.313.272. As muteínas de IL-4 podem ser caracterizadas por inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácido em um ou mais sítios em ou nos outros resíduos da cadeia polipeptídica de IL-4 nativa. De acordo com esta descrição, tais inserções, deleções, substituições e modificações resultam em uma muteína de IL-4 que mantém a atividade de ligação a IL~2Ra. Muteínas exemplares podem incluir substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos.
[0084] O ácido nucleico que codifica a IL-4 humana pode ser obtido por procedimentos convencionais, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR). A sequência de aminoácido de IL-4 humana (Gene ID 3565) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NGJ323252. A sequência de aminoácido de IL-4 de murino (Mus musculus) (Gene ID 6189) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NC_000Q77.6.
[0085] A IL-4 também pode se referir à IL-4 derivada de uma vari
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40/119 edade de espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, humanos, símios, bovinos, porcinos, equinos e murinos. As variantes podem compreender sequências conservativamente substituídas, o que significa que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo tendo características físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Vai, Leu ou Ala por outro, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras com características de hidrofobicidade similares, são bem conhecidas. As variantes de IL-4 de ocorrência natural também são abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de junção de mRNA alternativos ou da clivagem proteolítica da proteína IL-4, em que a propriedade de ligação à IL-4 é mantida. A junção alternativa do mRNA pode produzir uma proteína IL-4 truncada, porém, biologicamente ativa. Variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C na expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína IL-4 (geralmente de 1 a 10 aminoácidos). Em algumas modalidades, o terminal da proteína pode ser modificado para alterar suas propriedades físicas, por exemplo, com um grupo químico tal como o polietileno glicol (Yang, et al. Câncer 1995. 76:687-694). Em algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado com aminoácidos adicionais (Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90:3574-3577).
[0086] Quando aqui utilizado, IL-21 refere-se à IL-21 nativa ou recombinante ou uma variante da mesma que atua como um agonista para uma ou mais subunidades do receptor de IL-21 (IL-21 R) (por exemplo, mutantes, muteínas, análogos, subunidades, complexos re
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41/119 ceptores, fragmentos, isoformas e peptidomiméticos dos mesmos). Tais agentes podem suportar a proliferação de células T exterminadoras naturais (NK) e citotóxicas (CD8+). A IL-21 humana madura ocorre como uma sequência de 133 aminoácidos (menos o peptídeo sinal, consistindo em 22 aminoácidos N-terminais adicionais). Uma muteína de IL-21 é um polipeptídeo em que substituições específicas à proteína interleucina-21 foram feitas, enquanto mantendo a capacidade de se ligar à IL-21 Ra, tais como as descritas na Patente US No. 9.388.241. As muteínas de IL-21 podem ser caracterizadas por inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácido em um ou mais sítios em ou nos outros resíduos da cadeia polipeptídica de IL-21 nativa. De acordo com esta descrição, quaisquer inserções, deleções, substituições e modificações resultam em uma muteína de IL-21 que mantém a atividade de ligação à IL-21 R. Muteínas exemplares podem incluir substituições de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos. [0087] O ácido nucleico que codifica a IL-21 humana pode ser obtido por procedimentos convencionais, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR). A sequência de aminoácido da IL-21 humana (Gene ID 59067) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NC_000004.12. A sequência de aminoácido de IL-21 de murino (Mus muscuíus) (Gene ID 60505) é encontrada no Genbank sob o localizador de acesso NC,„000069.6.
[0088] A IL-21 também pode se referir à IL-21 derivada de uma variedade de espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, humanos, símios, bovinos, porcinos, equinos e murinos. As variantes podem compreender sequências conservativamente substituídas, o que significa que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo com características físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como lie, Vai, Leu ou Ala por outro, ou substitui
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42/119 ções de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras tais substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras tendo características de hidrofobicidade similares, sâo bem conhecidas. As variantes de IL-21 de ocorrência natural também sâo abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de junção de mRNA alternativos ou da clivagem proteolítica da proteína IL-21, em que a propriedade de ligação à IL-21 é mantida. A junção alternativa de mRNA pode produzir uma proteína IL-21 truncada, porém, biologicamente ativa. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C na expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína IL-21 (geralmente de 1 a 10 aminoácidos). Em algumas modalidades, o terminal da proteína pode ser modificado para alterar suas propriedades físicas, por exemplo, com um grupo químico tal como o polietileno glicol (Yang, et al. Câncer 1995. 76:687-694). Em algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado com aminoácidos adicionais (ClarkLewis, et al. PNAS 1993. 90:3574-3577).
[0089] Quando aqui utilizado, s1L~9Si refere-se à IL-9 nativa ou recombinante ou uma variante da mesma que atua como um agonista de uma ou mais subunidades do receptor de IL-9 (IL-9R) (por exemplo, mutantes, muteínas, análogos, subunidades, complexos receptores, fragmentos, isoformas e peptidomiméticos dos mesmos). A IL-9 humana madura ocorre como uma sequência de 144 aminoácidos. Uma muteína de IL-9 é um polipeptídeo em que substituições específicas à proteína interleucina-9 foram feitas enquanto mantendo a capacidade de se ligar à IL-9R. As muteínas de IL-9 podem ser caracterizadas por inserções, deleções, substituições e modificações de aminoácido em um ou mais sítios em ou nos outros resíduos da cadeia polipeptídica
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43/119 de IL-9 nativa. De acordo com esta descrição, quaisquer tais inserções, deleções, substituições e modificações resultam em uma muteína de IL-9 que mantém a atividade de ligação à IL-9R. Muteínas exemplares podem incluir substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos.
[0090] O ácido nucleico que codifica a IL-9 humana pode ser obtido por procedimentos convencionais, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR). A sequência de aminoácido da IL-9 humana é dada por UniProtKB P15248.
[0091] A IL-9 também pode se referir à IL-9 derivada de uma variedade de espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, humanos, símios, bovinos, porcinos, equinos e murinos. As variantes podem compreender sequências conservativamente substituídas, o que significa que um determinado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo com características físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como lie, Vai, Leu ou Ala por outro, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras tais substituições conservadoras, por exemplo, substituições de regiões inteiras tendo características de hi~ drofobicidade similares, são bem conhecidas. As variantes de IL-9 de ocorrência natural também são abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de junção de mRNA alternativos ou da divagem proteolítica da proteína IL-9, em que a propriedade de ligação à IL-9 é mantida. A junção alternativa de mRNA pode produzir uma proteína IL-9 truncada, porém, biologicamente ativa. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C na expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína IL-9 (geralmente de 1 a 0 aminoá
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44/119 cidos). Em algumas modalidades, o terminal da proteína pode ser modificado para alterar suas propriedades físicas, por exemplo, com um grupo químico tal como o polietileno glicol (Yang, et al. Câncer 1995. 76:687-694). Em algumas modalidades, o terminal ou o interior da proteína pode ser modificado com aminoácidos adicionais (Clark-Lewis, et al. PNAS 1993. 90:3574-3577).
[0092] Qualquer um ou mais dos fatores acima podem ser incluídos em um protocolo de expansão em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células Τ γδ. Quando aqui utilizado, a frase em uma quantidade eficaz para refere-se a uma quantidade que induz um resultado detectável (por exemplo, um número de células tendo um número aumentado estatisticamente significativo em relação à sua população inicial, por exemplo, em p <0,05). Nos casos em que vários fatores estão presentes de uma vez, uma quantidade eficaz refere-se ao efeito de composto de todos os fatores (por exemplo, o efeito de composto de IL-2 e IL-15, ou o efeito de composto de IL-2 ou IL-9, IL-9, IL-4, IL-15, e IL-21).
[0093] Agonistas da via do receptor de célula T (TCR) ou agentes que ativam a via do TCR referem-se a compostos que induzem a proliferação ou outras consequências da ativação de células T, tais como células Τ αβ e/ou células Τ γδ residentes no sangue, através da sinalização do TCR. Os moduladores de sinalização de células T funcionam por ativação sequencial das proteína tirosina quinases (PTKs) relacionadas a Src, Lck e Fyn e proteína quinase associada à cadeia zeta (TCR) de 70 kDA (ZAP70). Estas PTKs levam à fosforilação de polipeptídeos, incluindo ativador de ligante para células T (LAT), o que leva à estimulação a jusante através da quinase regulada por sinal extracelular (ERK), quinase N-terminal de c-Jun (JNK) e fator nuclear de células T ativadas (NFAT). A coestimulação, por exemplo, através de CD28 e CD45, pode realçar a fosforilação e realçar as vias de sinali
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45/119 zação do TCR. Assim, qualquer agente que direcione uma parte do TCR ou via coestimulatória pode ativar a sinalização de células T. Os agonistas da via do TCR incluem anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-TCR VÕ1, anti-TCR 5TCS--1, anti-TCR PAN yõ e anti-CD3), lectinas (por exemplo, lectinas de planta, por exemplo, Concanavalin A, lectinas de Phaseolus vulgaris (PHA-P), Phytolacca Americana, Tríticum vulgaris, Lens cuiinarís, Glycine max, Maackia amurensis, Pisum sativum e Sambucus nigra), fosfoantígenos sintéticos (por exemplo, BrHPP (pirofosfato de bromoidrina), 2M3B1PP P-metil-S-butenH-l-pirofosfato), HMBPP ((EH-Hidróxi-S-metil-butA?enil pirofosfato) ou IPP (pirofosfato de isopentenila)) e N-bifosfonatos (por exemplo, zoledronato). Os agonistas da via do TCR incluem agonistas de co-receptores, incluindo anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, por exemplo, anti CD2, anti-CD6, anti-CDG, anti-CD28, anti-CD43, anti-CD94, anti-CD160, anti-SLAM, anti-NKGD2, anti-2B4, anti-HLA-A, anti-HLA-b, anti-HLA-C e anti-ICAM-3) e proteínas (por exemplo, proteínas recombinantes, por exemplo, proteínas humanas recombinantes, por exemplo, CD7L , CD26, CD27L, CD30L, CD40L, OX40L, 4-1 BBL, ICAM-1, fibronectina, hidrocortisona e suas variantes, por exemplo, proteínas de fusão Fc, por exemplo, CD27L-Fc). Os agonistas da via do TCR podem ser solúveis ou ligados à membrana e podem, por exemplo, ser apresentados em células, tais como células apresentadoras de antigeno artificiais (aAPCs), como é o caso dos complexos MHC ou HLA. aAPCs adequados para ativar a sinalização de células T são conhecidos na técnica. Os métodos adequados para ativar células T adicionando exogenamente agonistas da via do TCR são bem conhecidos na técnica e resumidos na Figura 1 de Deniger, et al. (Deniger, et al. Frontiers in Immunology. 2014. 5(636):1-10).
[0094] Agonistas da via do TCR exógeno referem-se a agonistas da via do TCR que não se originam do tecido não hematopoético ou
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46/119 doador do mesmo (isto é, eles são adicionados exogenamente). Assim, será entendido que, em algumas modalidades da invenção, um agonista da via do TCR pode estar presente na cultura como material residual do tecido não hematopoético (por exemplo, fibronectina solúvel ou ICAM-1 ligado à célula). Em algumas modalidades, um agonista da via residual do TCR é de uma concentração desprezível e não ativa substancialmente as células T.
[0095] Quando aqui utilizado, uma estrutura sintética, estrutura e grade são usados altemadamente e referem-se a uma estrutura tridimensional não nativa adequada para apoiar o crescimento celular. Um explante pode ser aderido a uma estrutura sintética para facilitar a saída de linfócitos do explante para a estrutura. As estruturas sintéticas podem ser construídas a partir de materiais naturais e/ou sintéticos, tais como polímeros (por exemplo, polímeros naturais ou sintéticos, por exemplo, polivinilpirolidonas, polimetilmetacrilato, metilcelulose, poliestireno, polipropileno, poliuretano), cerâmica (por exemplo, fosfato tricálcico, aluminato de cálcio), hidroxiapatita de cálcio) ou metais (tântalo, titânio, platina e metais no mesmo grupo de elementos que platina, nióbio, háfnio, tungstênio e combinações de ligas dos mesmos). Fatores biológicos (por exemplo, colágenos (por exemplo, colágeno I ou colágeno II), fibronectinas, lamininas, integrinas, fatores angiogênicos, fatores anti-inflamatórios, glicosaminoglicanos, vitrógenos, anticorpos e seus fragmentos, citocinas (por exemplo, IL-2 ou IL15 e combinações das mesmas) podem ser revestidos na superfície da estrutura ou encapsulados dentro do material de estrutura para realçar a adesão, migração, sobrevivência ou proliferação celular, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Este e outros métodos podem ser usados para isolar os linfócitos de um número de outros tipos de tecidos não hematopoéticos, por exemplo, intestino, próstata e mama. Um suporte sintético exemplar contemplado para uso como
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47/119 parte da presente invenção inclui aquele usado no protocolo Clark.
[0096] Quando aqui utilizado, os termos separação, separado ou para separar se referem ao ato de quebrar ou proibir o contato físico entre populações celulares distintas (por exemplo, separação de células hematopoéticas (por exemplo, linfócitos) de células não hematopoéticas). A separação pode ser realizada, por exemplo, pipetando com força uma população mista de células para interromper as associações entre membranas ou induzindo o rastreamento de uma população de células de, por exemplo, uma matriz de tecido, cultivando com, por exemplo, quimiocinas ou citocinas, como descrito por Carrasco, et al. (Carrasco A. et al. Journal of Immunological Methods 2013. 389(1-2):29-37). A separação pode ser mantida durante a cultura usando um sistema de cultura de transcavidade ou por métodos de cultura similares que impedem o contato físico entre populações celulares distintas.
[0097] Quando aqui utilizado, uma população separada de células γδ refere-se a uma população de células hematopoéticas, incluindo células γδ que foram separadas de seu tecido de origem não hematopoético, de modo que fique fora do contato substancial com células não hematopoéticas (por exemplo, de acordo com qualquer um dos protocolos de separação aqui descritos). Da mesma forma, uma população separada de células T VÕ1 refere-se a uma população de células hematopoéticas, incluindo células T Võ1 que foram separadas de seu tecido de origem não hematopoético, de modo que fique fora do contato substancial com células não hematopoéticas (por exemplo, de acordo com qualquer um dos protocolos de separação aqui descritos). Assim, nestes casos, a separação refere-se à separação de células hematopoéticas (por exemplo, linfócitos) de células não hematopoéticas (por exemplo, células estromais e/ou células epiteliais).
[0098] O termo anticorpo é usado no sentido mais amplo e
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48/119 abrange especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho natural), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.
[0099] Quando aqui utilizado, uma etapa de expansão refere-se a uma fase da cultura que ocorre após a separação, na qual o número de uma célula T γδ particular aumenta por divisão celular. Será entendido que a divisão celular pode ocorrer durante a fase de separação, enquanto as células T yõ estão em contato com células estromais, porém, a etapa de expansão não inicia até que a separação esteja completa. Assim, quando uma população celular separada é caracterizada em um ponto anterior à etapa de expansão, significa o momento após a cultura de separação e antes da cultura de expansão.
[00100] Quando aqui utilizado, uma população expandida de células yõ refere-se a uma população de células hematopoéticas, incluindo células T yõ que foram cultivadas em uma condição e por um período que induziu a expansão de células yõ, isto é, número de célula yõ aumentado. Da mesma forma, uma população expandida de células T VÕ1, quando aqui usada, refere-se a uma população de células hematopoéticas, incluindo células T Võ1 que foram cultivadas em uma condição e por um período que induziu a expansão de células T Võ1, isto é, aumento do número de células Võ1.
[00101] Quando aqui utilizado, uma célula alimentadora refere-se a qualquer célula exógena adicionada a uma cultura para fornecer contato de superfície de célula para célula com as células derivadas de tecidos não hematopoéticos. As células alimentadoras podem ser células primárias (por exemplo, derivadas de um tecido) ou derivadas de uma linhagem celular. As células alimentadoras podem ser vivas ou irradiadas, e incluem células tumorais, fibroblastos, células B e outras células apresentadoras de antígeno.
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[00102] O termo marcador aqui refere-se a um marcador molecular de DNA, RNA, proteína, carboidrato, glicolipídeo ou com base em célula, cuja expressão ou presença na amostra de um paciente pode ser detectada por métodos padrão (ou métodos descritos aqui).
[00103] Uma célula ou população de células que expressa um marcador de interesse é aquela em que o mRNA que codifica a proteína, ou a própria proteína, incluindo seus fragmentos, é determinado como estando presente na célula ou na população. A expressão de um marcador pode ser detectada por vários meios. Por exemplo, em algumas modalidades, a expressão de um marcador refere-se a uma densidade superficial do marcador em uma célula. A intensidade de fluorescência média (MFI), por exemplo, usada como leitura da citometria de fluxo, é representativa da densidade de um marcador em uma população de células. Uma pessoa versada na técnica entenderá que os valores de MFI dependem de parâmetros de marcação (por exemplo, concentração, duração e temperatura) e composição de fluorocromo. No entanto, a MFI pode ser quantitativa quando considerada no contexto de controles apropriados. Por exemplo, pode-se dizer que uma população de células expressa um marcador se a MFI de um anticorpo para este marcador for significativamente maior que a MFI de um anticorpo de controle de isótipo apropriado na mesma população de células, corada sob condições equivalentes. Adicionalmente ou altemativamente, pode-se dizer que uma população de células expressa um marcador em uma base de célula por célula usando um canal positivo e negativo de acordo com os métodos analíticos de citometria de fluxo convencionais (por exemplo, definindo o canal de acordo com controles de isótipo ou de fluorescência menos um (FMO)). Por esta métrica, pode-se dizer que uma população expressa um marcador se o número de células detectadas positivas para o marcador for significativamente maior que o antecedente (por exemplo, ativando um con
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50/119 trote de isótipo).
[00104] Quando aqui utilizado, quando a expressão de uma população é declarada como uma porcentagem de células positivas e esta porcentagem é comparada a uma porcentagem correspondente de células positivas de uma população de referência, a diferença percentual é uma porcentagem da população origem de cada população respectiva. Por exemplo, se um marcador é expresso em 10% das células da população A, e o mesmo marcador é expresso em 1% das células da população B, diz-se que a população A tem uma frequência 9% maior de células positivas marcadoras que a população B (ou seja, 10% - 1%, não 10%*1%). Quando uma frequência é multiplicada pelo número de células na população origem, a diferença no número absoluto de células é calculada. No exemplo dado acima, se houver 100 células na população A e 10 células na população B, em seguida a população A terá 100 vezes o número de células em relação à população B, isto é, (10% x 100) - (1% x 10).
[00105] Um nível de expressão de um marcador pode ser um nível de expressão de ácido nucleico (por exemplo, um nível de expressão de DNA ou um nível de expressão de RNA, por exemplo, um nível de expressão de mRNA). Qualquer método adequado para determinar um nível de expressão de ácido nucleico pode ser usado. Em algumas modalidades, o nível de expressão de ácido nucleico é determinado usando qPCR, rtPCR, RNA-seq, qPCR ou RT-qPCR multiplexado, análise por microarranjo, análise serial de expressão gênica (SAGE), técnica MassARRAY, hibridização ín situ (por exemplo, FISH) ou combinações dos mesmos.
[00106] Quando aqui utilizado, uma população de referência de células refere-se a uma população de células correspondentes às células de interesse, contra a qual um fenótipo das células de interesse é medido. Por exemplo, um nível de expressão de um marcador em uma
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51/119 população separada de células γδ derivadas de tecido não hematopoético pode ser comparado ao nível de expressão do mesmo marcador em uma célula T γδ derivada de tecido hematopoético (por exemplo, uma célula γδ residente no sangue, por exemplo, uma célula yõ residente no sangue derivada do mesmo doador ou de um doador diferente) ou uma célula T γδ derivada de tecido não hematopoético expandida sob diferentes condições (por exemplo, na presença de ativação substancial do TCR, na presença de um agente de ativação de TCR exógeno (por exemplo, anti-CD3) ou em contato substanciai de células estromais (por exemplo, fibroblastos)). Uma população também pode ser comparada a si mesma em um estado anterior. Por exempio, uma população de referência pode ser uma população de células separadas antes de sua expansão. Neste caso, a população expandida é comparada com sua própria composição antes da etapa de expansão, isto é, sua composição passada, neste caso, é a população de referência.
[00107] Câncer refere-se à proliferação anormal de células cancerígenas malignas e inclui leucemias, tais como leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL) e leucemia Hnfocitica aguda (CLL), linfomas, tais como linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin e mieloma múltiplo e cânceres sólidos, tais como sarcomas, câncer de pele, melanoma, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de mama, câncer de útero, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer renal, câncer adrenal, câncer de estômago, câncer de testículo, câncer de vesícula biliar e vias biliares, câncer de tireoide, câncer de timo, câncer de osso e câncer cerebral.
[00108] As células cancerígenas no paciente com câncer podem ser imunologicamente distintas das células somáticas normais no indi
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52/119 víduo (por exemplo, o tumor cancerígeno pode ser imunogênico). Por exemplo, as células cancerígenas podem ser capazes de provocam uma resposta imune sistêmica no paciente com câncer contra um ou mais antígenos expressos pelas células cancerígenas. Os antígenos que provocam a resposta imune podem ser antígenos tumorais ou podem ser compartilhados por células normais. Um paciente com câncer pode exibir pelo menos um sinal, sintoma ou descoberta laboratorial identificável que seja suficiente para fazer um diagnóstico de câncer de acordo com os padrões clínicos conhecidos na técnica. Exemplos de tais padrões clínicos podem ser encontrados em livros de medicina, tal como Harrison’s Principie of Internai Medicine (Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson J, Loscalzo J. eds. 18e. New York, NY: McGraw-Hilí; 2012). Em alguns casos, um diagnóstico de um câncer em um indivíduo pode incluir a identificação de um tipo de célula específico (por exemplo, uma célula de câncer) em uma amostra de um fluido ou tecido corporal obtido do indivíduo.
[00109] Quando aqui utilizado, um tumor sólido é qualquer câncer de tecido corporal que não seja sangue, medula óssea ou sistema linfático. Os tumores sólidos podem ainda ser divididos naqueles de origem celular epitelial e naqueles de origem celular não epitelial. Exemplos de tumores sólidos de células epiteliais incluem tumores do trato gastrointestinal, cólon, mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, ânus, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos urinários, bexiga e pele. Os tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores cerebrais e tumores ósseos.
[00110] Um paciente, indivíduo ou pessoa adequado para tratamento como descrito acima pode ser um mamífero, tal como um roedor (por exemplo, um porquinho da índia, um hamster, um rato, um ca
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53/119 mundongo), murino (por exemplo, um camundongo), canino ( por exemplo, um cachorro), felino (por exemplo, um gato), equino (por exemplo, um cavalo), um primata, símio (por exemplo, um macaco(monkey) ou macaco(ape)), um macaco (por exemplo, um sagui ou babuíno), um macaco (por exemplo, um gorila, chimpanzé, orangotango ou gibão) ou um humano.
[00111] Em algumas modalidades, o paciente, indivíduo ou pessoa é um humano. Em outras modalidades preferidas, mamíferos não humanos, especialmente mamíferos que são convencionalmente utilizados como modelos para demonstrar a eficácia terapêutica em humanos (por exemplo, murino, primata, porcino, canino ou coelho) podem ser utilizados.
[00112] Quando aqui utilizado, tratamento (e variações gramaticais dos mesmos, tal como tratar ou tratando) refere-se à intervenção clínica, seja de um humano ou de um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), em que algum efeito terapêutico desejado é alcançado, por exemplo, a inibição ou atraso do progresso da condição e inclui uma redução na taxa de progresso, uma Interrupção na taxa de progresso, melhoria da condição, cura ou remissão (parcial ou total) da condição, prevenindo, atrasando, diminuindo ou interrompendo um ou mais sintomas e/ou sinais da condição ou prolongando a sobrevivência de um indivíduo ou paciente além do esperado na ausência de tratamento.
[00113] O tratamento como uma medida profilática (isto é, profilaxia) também está incluído. Por exemplo, um paciente, indivíduo ou pessoa suscetível ou em risco da ocorrência ou reincidência do câncer pode ser tratado como aqui descrito. Esse tratamento pode impedir ou atrasar a ocorrência ou reincidência de câncer no paciente, indivíduo ou pessoa.
[00114] Em particular, o tratamento pode incluir a inibição do cres
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54/119 cimento do câncer, incluindo a remissão completa do câncer e/ou a inibição da metástase do câncer. O crescimento do câncer geralmente se refere a qualquer um dos vários índices que indicam mudança no câncer para uma forma mais desenvolvida. Assim, os índices para medir uma inibição do crescimento do câncer incluem uma diminuição na sobrevivência das células cancerígenas, uma diminuição no volume ou morfologia do tumor (por exemplo, conforme determinado pelo uso de tomografia computadorizada (CT), ultrassonografia ou outro método de imagem), um atraso no crescimento do tumor, uma destruição da vasculatura do tumor, melhor desempenho no teste cutâneo de hipersensibilidade tardia, um aumento na atividade dos linfócitos T citolíticos e uma diminuição nos níveis de antígenos específicos de tumor. A redução da supressão imune em tumores cancerígenos em um indivíduo pode melhorar a capacidade do indivíduo de resistir ao crescimento do câncer, em particular o crescimento de um câncer já presente no indivíduo e/ou diminuir a propensão ao crescimento do câncer no indivíduo.
[00115] Em algumas modalidades, as células T yõ expandidas (por exemplo, células T yõ derivadas de tecidos não hematopoéticos, por exemplo, células T Võ1 derivadas de tecidos não hematopoéticos) são administradas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença ou distúrbio.
[00116] Quando aqui utilizado, administração significa um método para administrar uma dosagem de uma terapia (por exemplo, uma terapia de célula T adotiva compreendendo, por exemplo, células T yõ derivadas de tecido não hematopoético) ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo células T yõ derivadas de tecido não hematopoético) a um paciente. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser administradas, por exemplo, por via intramuscu
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55/119 lar, intravenosa, intradérmica, percutânea, intra-arterial, intraperítoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intratecal, intranasal, intravaginal, intra-retal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosal, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, intraorbital, intravítrea (por exemplo, por injeção intravítrea), por colírio, por via oral, tópica, transdérmica, por inalação, por injeção, por implantação, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada banhando as células alvo diretamente, por cateter, por lavado, em cremes ou em composições lipídicas. As composições utilizadas nos métodos aqui descritos também podem ser administradas sistemicamente ou localmente. O método de administração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o agente ou composição terapêutica sendo administrada e a gravidade da condição, doença ou distúrbio a ser tratado).
[00117] Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso de cânceres, a quantidade terapeuticamente eficaz do agente terapêutico (por exemplo, um T yõ derivada de tecido não hematopoético) pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor primário; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente interromper) a infiltração de células cancerígenas nos órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente interromper) a metástase de tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Na medida em que o fármaco pode impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia do câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida pela avaliação da duração da sobrevida, do tempo até a progressão da doença (TTP), taxas de resposta (por exemplo, resposta completa
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56/119 (CR) e resposta parcial (PR)), duração da resposta e/ou qualidade de vida.
[00118] O termo simultaneamente é aqui utilizado para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, em que pelo menos parte da administração se sobrepõe no tempo. Por conseguinte, a administração simultânea inclui um regime de dosagem quando a administração de um ou mais agentes continua após a interrupção da administração de um ou mais agentes. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula Τ yõ derivada de tecido não hematopoético e IL2 podem ser administradas simultaneamente.
[00119] O termo composição farmacêutica refere-se a uma preparação que tem a forma de permitir que a atividade biológica de um ou mais ingredientes ativos nela contidos seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um paciente ao qual a formulação seria administrada.
III. Métodos de Separação e Expansão de Células T yõ
[00120] A invenção fornece métodos para isolar e expandir células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T VÕ1 e/ou células T DN) de qualquer tecido não hematopoético animal humano ou não humano que pode ser ou foi removido de um paciente. Em algumas modalidades, o tecido não hematopoético do qual as células T yõ são derivadas e expandidas é a pele (por exemplo, pele humana), que pode ser obtida por métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a pele é obtida por biópsia por punção. Alternativamente, os métodos de isolamento e expansão das células T yõ aqui fornecidos podem ser aplicados ao trato gastrointestinal (por exemplo, cólon), glândula mamária, pulmão, próstata, fígado, baço e pâncreas. As células T yõ também podem ser residentes nos tecidos de câncer humano, por exemplo, tumores da mama ou da próstata. Em algumas modalidades, as células T yõ po
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57/119 dem ser de tecidos de câncer humano (por exemplo, tecidos de tumor sólido). Em outras modalidades, as células T yõ podem ser de tecido não hematopoético que não seja tecido de câncer humano (por exemplo, um tecido sem um número substancial de células de tumor). Por exemplo, as células T yõ podem ser de uma região da pele (por exemplo, pele saudável) separada de um tecido cancerígeno próximo ou adjacente.
[00121] As células T yõ que são dominantes no sangue são principalmente células T Võ2, enquanto as células T yõ que são dominantes nos tecidos não hematopoéticos são principalmente células T Võ1, de modo que as células T Võ1 compreendem cerca de 70-80% da população de células T yõ residentes em tecido não hematopoéticas. No entanto, algumas células T Võ2 também são encontradas em tecidos não hematopoéticos, por exemplo, no intestino, onde podem compreender cerca de 10-20% das células T yõ (FIG. 6). Algumas células T yõ que são residentes nos tecidos não hematopoéticos não expressam Võ1 nem Võ2 TCR e as denominamos células T yõ duplas negativas (DN). É provável que estas células T yõ DN estejam principalmente expressando VÕ3 com uma minoria de células T de expressão de VÕ5. Portanto, as células T yõ que são normalmente residentes nos tecidos não hematopoéticos e que são expandidas pelo método da invenção são preferivelmente células T não VÕ2, por exemplo, células T VÕ1, com a inclusão de uma quantidade menor de células T yõ DN.
[00122] Será apreciado por um técnico versado que certos tecidos não hematopoéticos podem ser altamente vascularizados e, na prática, uma amostra de tecido não hematopoético é vulnerável à contaminação por células periféricas residentes no sangue. Para evitar ou minimizar essa contaminação, pode-se tomar cuidado para garantir que o sangue periférico seja omitido das culturas de isolamento e expansão, de acordo com métodos conhecidos na técnica, tal como por meio
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58/119 da lavagem completa do tecido em um tampão adequado para remover as células residentes no sangue. Por exemplo, em algumas modalidades, uma população de células T yõ isoladas do tecido pulmonar nâo é obtida por lavado broncoalveolar.
Separação das células T νδ residentes em tecido não hematopoético do tecido não hematopoético
[00123] Em algumas modalidades, uma etapa crítica é a separação deliberada, por exemplo, por exemplo, após alguns dias ou semanas de cultura, de células T residentes nos tecidos não hematopoéticos (por exemplo, dentro de uma população mista de Hnfócitos, que pode, por exemplo, compreender células αβ, células exterminadoras naturais (NK), células B e células T yõ2 e não yõ2) afastadas das células não hematopoéticas (por exemplo, células estromais, particularmente fibroblastos) do tecido a partir do qual as células T foram obtidas. Isto permite a expansão preferencial e rápida ao longo dos dias e semanas seguintes de células T não hematopoéticas derivadas de tecido Võ1 e células T yõ DN.
[00124] A invenção fornece métodos que envolvem a separação de células T yõ (por exemplo, células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) de um tecido não hematopoético (por exemplo, pele, por exemplo, pele obtida por biópsia por punção). Em uma modalidade, a separação das células T yõ das células não hematopoéticas compreende cultivar as células T yõ e as células não hematopoéticas em um andaime sintético configurado para facilitar a saída celular do tecido não hematopoético. Qualquer estrutura apropriada para a separação de linfócltos de um tecido sólido pode ser usada. Os andaimes sintéticos podem ser construídos a partir de materiais naturais e/ou sintéticos, como polímeros (por exemplo, polímeros naturais ou sintéticos, por exemplo, polivlnilpirrolidonas, polimetilmetacrllato, metilcelulose, poliestireno, polipropileno, poliuretano), cerâmica (por exemplo,
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59/119 fosfato tricálcico, aluminato de cálcio, hidroxiapatita de cálcio) ou metais (tântalo, titânio, platina e metais no mesmo grupo de elementos que platina, nióbio, háfnio, tungstênio e combinações de ligas dos mesmos). Fatores biológicos (por exemplo, colágenos (por exemplo, colágeno I ou colágeno II), fibronectinas, lamininas, integrinas, fatores angiogênicos, fatores anti-inflamatórios, glicosaminoglicanos, vitrógenos, anticorpos e seus fragmentos, citocinas (por exemplo, IL-2 ou IL15 e combinações dos mesmos), quimiocinas e/ou quimioatraentes podem ser revestidos na superfície da estrutura ou encapsulados dentro do material da estrutura para melhorar a adesão, migração, sobrevivência ou proliferação celular, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o material sintético de estrutura é uma estrutura Cellfoam como descrito no protocolo Clark. Em alternativa, outros métodos podem ser usados para isolar linfócitos de vários outros tipos de tecidos não hematopoéticos, por exemplo, por degradação enzimática de componentes da matriz extracelular (por exemplo, colagenase).
[00125] Uma cultura de separação pode ser realizada por qualquer duração de 1 hora (por exemplo, no caso de uma digestão simples) a até 42 dias (no caso de uma cultura de estrutura). Nos casos em que a etapa de separação é realizada em uma estrutura, a cultura pode ser realizada por pelo menos 5 dias (por exemplo, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 16 dias, pelo menos 18 dias, pelo menos 20 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 24 dias, pelo menos 28 dias, pelo menos 30 dias, pelo menos 35 dias, ou pelo menos 40 dias, por exemplo, entre 7 e 14 dias, entre 14 e 21 dias ou entre 21 e 35 dias, por exemplo, cerca de 14 dias ou cerca de 21 dias).
[00126] Durante a separação das células T γδ (por exemplo, células
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Τ γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN), o tecido não hematopoético e as células derivadas delas pode ser cultivado na presença de fatores biológicos para melhorar a saída do tecido ou promover a viabilidade de uma ou mais subpopulações de células. Em algumas modalidades, a cultura de separação inclui IL-2, por exemplo, IL-2 em uma concentração de pelo menos 10 ILJ/mL (por exemplo, de 10 lU/mL a 1.000 ILJ/mL, de 20 lU/mL a 800 lU/mL, de 25 lU/mL a 750 lU/mL, de 30 lU/mL a 700 lU/mL, de 40 lU/mL a 600 lU/mL, de 50 lU/mL a 500 lU/mL, de 75 lU/mL a 250 lU/mL, ou de 100 lU/mL a 200 lU/mL, por exemplo, de 10 lU/mL a 20 lU/mL, de 20 lU/mL a 30 lU/mL, de 30 lU/mL de 40 lU/mL, de 40 ILJ/mL a 50 lU/mL, de 50 lU/mL a 75 lU/mL, de 75 lU/mL a 100 lU/mL, de 100 lU/mL a 150 lU/mL, de 150 lU/mL a 200 lU/mL, de 200 lU/mL a 500 lU/mL ou de 500 lU/mL a 1.000 000 lU/mL). Em algumas modalidades, a cultura de separação inclui IL-2 a uma concentração de cerca de 100 ILJ/mL. Adicionalmente ou altemativamente, a cultura de separação pode incluir IL-15, por exemplo, IL-15 a uma concentração de pelo menos 0,1 ng/mL (por exemplo, de 0,1 ng/mL a 10.000 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 1.000 ng/mL, de 5 ng/mL a 800 ng/mL, de 10 ng/mL a 750 ng/mL, de 20 ng/mL a 500 ng/mL, de 50 ng/mL a 400 ng/mL, ou de 100 ng/mL a 250 ng/mL, por exemplo, de 0,1 ng/mL a 1,0 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 5,0 ng/mL, de 5,0 ng/mL a 10 ng/mL, de 10 ng/mL a 20 ng/mL, de 20 ng/mL a 50 ng/mL, de 50 ng/mL a 100 ng/mL, de 100 ng/mL a 200 ng/mL, de 200 ng/mL a 500 ng/mL ou de 500 ng/mL a 1.000 ng/mL). Em algumas modalidades, a cultura de separação inclui IL-15 a uma concentração de cerca de 20 ng/mL. [00127] Em algumas modalidades, a separação das células T yõ do tecido não hematopoético inclui cultura na presença de IL-2 e IL-15, cada uma em qualquer uma das concentrações listadas acima. Em alguns casos, a concentração de IL-2 é de cerca de 100 lU/mL e a
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61/119 concentração de IL-5 é de 20 ng/mL
[00128] As células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) podem ser cultivadas na ausência de IL-6, IL- 23 e IL-β, ou na presença de baixas concentrações dessas citocinas (por exemplo, menos de 20 ng/mL), pois a adição dessa combinação de citocinas pode atuar para reduzir a proliferação de células T yõ residentes em tecido não hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN).
[00129] Após a separação do tecido não hematopoético (por exemplo, pele), as células T yõ geralmente fazem parte de uma população maior de linfócitos contendo, por exemplo, células T αβ, células B e células exterminadoras naturais (NK). Em algumas modalidades, 1 % a 10 % da população separada de linfócitos são células T yõ antes da expansão (por exemplo, 1 a 10 % da população separada de linfócitos derivados da pele são células T yõ antes da expansão). Na maioria dos casos, a população de células T yõ (por exemplo, população de células T yõ derivada da pele) incluirá uma grande população de células T Võ1. Em algumas modalidades, 1 a 10 % da população separada de linfócitos (por exemplo, linfócitos derivados da pele) são células T Võ1 antes da expansão (por exemplo, células T Võ1 podem representar acima de 50 %, acima de 60 %, acima de 70 %, acima de 80 % ou mais de 90 % da população de uma população separada de células T yõ antes da expansão). Em alguns casos, menos de 10 % da população separada de células T yõ são células T Õ2 antes da expansão (por exemplo, menos de 10 % da população separada de células T yõ derivadas da pele são células T/Õ2 antes da expansão).
[00130] Células T não VÕ1 ou células T não DN, como células T Võ2, células T αβ, células B ou células NK, podem ser removidas da
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62/119 população separada das células T yõ (por exemplo, para, durante ou após a expansão).
[00131] Antes da expansão, as células T yõ separadas (por exemplo, células T yõ separadas da pele, por exemplo, células T Võ1 separadas da pele) têm um fenótipo distinto das células derivadas do tecido hematopoético correspondentes (por exemplo, células T yõ derivadas do sangue por exemplo, células T Võ2 derivadas de sangue). Por exemplo, a população separada de células T yõ pode expressar um nível mais alto de CCR3, CCR4, CCR7, CCR8 ou CD103 do que uma população de referência, por exemplo, uma população ativada pelo TCR de células T yõ não hematopoéticas residentes no tecido ou uma correspondente população de células derivadas de tecido hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas de sangue, por exemplo, células T Võ2 derivadas de sangue). Em algumas modalidades, a população separada de células T yõ inclui pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células
CCR3 +; pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CCR4+; pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CCR7+; pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CCR8+; e/ou pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CD103+. A população separada de células T yõ pode expressar um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou todos os seis de CCR3, CCR4, CCR7, CCR8 ou CD103.
[00132] Em algumas modalidades, a população separada de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele, por exemplo, células T Võ1 derivadas da pele) expressa um nível mais alto de NKGD2, CD56, CD69 e/ou TIM3 do que um população de referência,
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63/119 por exemplo, uma população ativada por TCR de células T yõ residentes em tecido não hematopoético ou uma população correspondente de células derivadas de tecido hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas de sangue, por exemplo, células T Võ2 derivadas de sangue). Em algumas modalidades, a população separada de células T yõ inclui pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células NKGD2+; pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CD56+: pelo menos 5 %, 10 %, 5 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células CD69+; e/ou pelo menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais células TIM3*. A população separada de células T yõ pode expressar um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou todos os cinco de NKGD2, CD56, CD69 e/ou TIM3.
[00133] A população separada de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas da pele, por exemplo, células T Võ1 derivadas da pele) também pode ser caracterizada por função. Os ensaios funcionais conhecidos na técnica e ilustrados no Exemplo 3 podem ser realizados para determinar as diferenças funcionais entre qualquer célula derivada de tecido não hematopoético da invenção (por exemplo, uma população separada de células T yõ, por exemplo, células T Võ1 derivadas da pele, ou uma população expandida de células T yõ, por exemplo, células T Võ1 derivadas da pele) e uma célula de referência (por exemplo, uma população ativada por TCR de células T yõ residentes em tecido não hematopoético ou uma população correspondente de células derivadas de tecido hematopoético, por exemplo, células T yõ derivadas do sangue, por exemplo, células T VÕ2 derivadas do sangue). Em algumas modalidades, uma população separada de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, uma população separada de células T yõ
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64/119 sem contato com ativação substancial da via do TCR) secreta um nível mais alto de IL-13 do que uma população de referência (por exemplo, uma população ativada por TCR de células Τ yõ não residentes em tecido não hematopoético, por exemplo, uma população ativada por anti-CD3 de células T yõ não residentes em tecido nâo hematopoético). Por exemplo, uma população separada de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células Τ γδ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) pode secretar 1.1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes, ou maior a concentração de IL-13 em relação a uma população de células de referência (por exemplo, uma população ativada por TCR de células Τ γδ residentes em tecido não hematopoético, por exemplo, uma população ativada por anti-CD3 de células T yõ residentes em tecido não hematopoético). Da mesma forma, o número ou frequência de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético na população separada que secretam IL-13 pode ser maior em relação a uma população de células de referência (por exemplo, uma população ativada por TCR de células Τ γδ não residentes em tecido não hematopoético, por exemplo, uma população ativada anti-CD3 de células Τ γδ residentes em tecido não hematopoético). Por exemplo, a frequência de células secretoras de IL-13 dentro da população separada de células T yõ (por exemplo, a frequência de células secretoras de IL13 dentro da população separada de células T Võ1) pode ser maior que uma população de células de referência (uma população ativada por TCR de células T yõ nâo residentes em tecido não hematopoético, por exemplo, uma população ativada anti-CD3 de células T yõ não residentes em tecido não hematopoético). Em algumas modalidades, a
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65/119 frequência de células secretoras de IL-13 dentro da população separada de células T yõ (por exemplo, a frequência de células secretoras de IL-13 dentro da população separada de células T DN ou células T Võ1 da invenção) é pelo menos 1 % maior, pelo menos 2 % maior, pelo menos 3 % maior, pelo menos 4 % maior, pelo menos 5 % maior, pelo menos 6 % maior, pelo menos 7 % maior, pelo menos 8 % maior, pelo menos 9 % maior, pelo menos 10 % maior, pelo menos 20 % maior, pelo menos 30 % maior, pelo menos 40 % maior, pelo menos 50 % maior, pelo menos 60 % maior, pelo menos 70 % maior, pelo menos 80 % maior, pelo menos 90 % maior ou até 100 % maior que a população de células de referência (uma população ativada por TCR de células T yõ residentes em tecido não hematopoético, por exemplo, uma população ativada por anti-CD3 de células T γδ residentes em tecido não hematopoético).
Expansão de células T γδ residentes em tecido não hematopoético [00134] A invenção apresenta métodos de expansão de células T yõ residentes em tecidos não hematopoéticos (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN). Estes métodos podem ser realizados in vitro. Em algumas modalidades, as células T γδ residentes em tecido não hematopoético são expandidas a partir de uma população de células T yõ que foi separada do tecido não hematopoético de acordo com os métodos descritos acima. Em geral, as células T residentes em tecidos não hematopoéticos são capazes de expandir espontaneamente após a remoção do contato físico com células estromais (por exemplo, fíbroblastos da pele). Assim, os métodos de cultura baseados em estruturas descritos acima podem ser utilizados para induzir essa separação, resultando na repressão das células T yõ para desencadear a expansão. Por conseguinte, em algumas modalidades, nenhuma ativação substancial da via do TCR está presente durante a etapa de ex
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66/119 pansão (por exemplo, nenhum ativador da via exógena da via do TCR está incluído na cultura). Além disso, a invenção fornece métodos para expandir células T γδ residentes em tecidos não hematopoéticos, em que os métodos não envolvem contato com células alimentadoras, células tumorais e/ou células apresentadoras de antígeno.
[00135] Os inventores da presente invenção desenvolveram protocolos de expansão que envolvem a cultura de células T yõ residentes em tecidos não hematopoéticos na presença de coquetéis efetivos de fatores biológicos para apoiar a expansão eficiente das células T yõ. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de expansão de células T yõ, fornecendo uma população de células T γδ obtidas a partir de um tecido não hematopoético (por exemplo, uma população separada de células T γδ derivadas de tecido não hematopoético, por exemplo, uma população separada de acordo com os métodos aqui descritos) e cultivar as células T γδ na presença de IL-2, IL4, IL-15 e/ou IL-21. Essas citocinas ou análogos das mesmas podem ser cultivadas com as células por um período de tempo (por exemplo, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, pelo menos 14 dias, pelo menos 21 dias, pelo menos 28 dias ou mais, por exemplo, de 5 dias a 40 dias, de 7 dias a 35 dias, de 14 dias 28 dias, ou cerca de 21 dias) em uma quantidade eficaz para produzir uma população expandida de células T γδ.
[00136] Em algumas modalidades, a quantidade de IL-2 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de 1 ILJ/mL a 2.000 lU/mL (por exemplo, de 5 ILJ/mL a 1.000 lü/mL, de 10 ILJ/mL a 500 ÍU/mL, de 20 lU/mL a 400 lU/mL, de 50 lU/mL a 250 lU/mL, ou cerca de 100 lU/mL, por exemplo, de 5 lU/mL a 10 lU/mL, de 10 ILJ/mL a 20 lU/mL, de 20 ÍU/mL a 30 lU/mL, de 30 ÍU/mL a 40 lU/mL, de 40
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67/119 lU/mL a 50 lU/mL, de 50 lU/mL a 60 UI/mL, de 60 UI/mL a 70 UI/mL, de 70 UI/mL a 80 UI/mL, de 80 UI/mL a 90 UI/mL, de 90 UI/mL a 100 UI/mL, de 100 UI/mL a 120 UI/mL, de 120 UI/mL a 140 UI/mL, de 140 UI/mL a 150 UI/mL, de 150 UI/mL a 175 UI/mL, de 175 UI/mL a 200 UI/mL, de 200 UI/mL a 300 UI/mL, de 300 UI/mL a 400 UI/mL, de 400 UI/mL a 500 UI/mL, de 500 UI/mL a 1.000 UI/mL, de 1.000 UI/mL a 1.500 UI/mL, de 1.500 UI/mL a 2.000 UI/mL, ou mais). Em algumas modalidades, a quantidade de IL-2 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de cerca de 100 UI/mL.
[00137] Em algumas modalidades, a quantidade de IL-4 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é de pelo menos 0,1 ng/mL (por exemplo, de 0,1 ng/mL a 10.000 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 1.000 ng/mL, de 5 ng/mL a 800 ng/mL, de 10 ng/mL a 750 ng/mL, de 20 ng/mL a 500 ng/mL, de 50 ng/mL a 400 ng/mL ou de 100 ng/mL a 250 ng/mL, por exemplo, de 0,1 ng/mL a 1,0 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 5,0 ng/mL, de 5,0 ng/mL a 10 ng/mL, de 10 ng/mL a 20 ng/mL, de 20 ng/mL a 50 ng/mL. de 50 ng/mL a 100 ng/mL, de 100 ng/mL a 200 ng/mL, de 200 ng/mL a 500 ng/mL ou de 500 ng/mL a 1.000 ng/mL). Em algumas modalidades, a quantidade de IL-4 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de cerca de 5 ng/mL.
[00138] Em algumas modalidades, a quantidade de IL-15 eficaz para produzir uma população expandida de células Τ γδ (por exemplo, células Τ γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é de pelo menos 0,1 ng/mL (por exemplo, de 0,1 ng/mL a 10.000 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 1.000 ng/mL, de 5 ng/mL a 800 ng/mL, de 10 ng/mL a 750 ng/mL, de 20 ng/mL a 500 ng/mL, de 50 ng/mL a 400 ng/mL ou de 100 ng/mL a 250 ng/mL, por exemplo, de 0,1 ng/mL a 1,0 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 5,0 ng/mL, de
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5,0 ng/mL a 10 ng/mL, de 10 ng/mL a 20 ng/mL, de 20 ng mL a 50 ng/mL, de 50 ng/mL a 100 ng/mL, de 100 ng/mL a 200 ng/mL, de 200 ng/mL a 500 ng/mL ou de 500 ng/mL a 1.000 ng/mL). Em algumas modalidades, a quantidade de IL-15 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de cerca de 10 ng/mL.
[00139] Em algumas modalidades, a quantidade de IL-21 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é de pelo menos 0,1 ng/mL (por exemplo, de 0,1 ng/mL a 10.000 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 1.000 ng/mL, de 5 ng/mL a 800 ng/mL, de 10 ng/mL a 750 ng/mL, de 20 ng/mL a 500 ng/mL, de 50 ng/mL a 400 ng/mL ou de 100 ng/mL a 250 ng/mL, por exemplo, de 0,1 ng/mL a 1,0 ng/mL, de 1,0 ng/mL a 5,0 ng/mL, de 5,0 ng/mL a 10 ng/mL, de 10 ng/mL a 20 ng/mL, de 20 ng/mL a 50 ng/mL, de 50 ng/mL a 100 ng/mL, de 100 ng/mL a 200 ng/mL, de 200 ng/mL a 500 ng/mL, ou de 500 ng/mL a 1.000 ng/mL). Em algumas modalidades, a quantidade de IL-21 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de cerca de 10 ng/mL. Em outras modalidades, a quantidade de IL-21 eficaz para produzir uma população expandida de células T yõ é de cerca de 10 ng/mL.
[00140] A substituição ou adição de outros fatores na cultura de expansão de células T yõ residentes em tecido não hematopoético também é fornecida aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, qualquer um ou mais fatores selecionados do grupo que consiste em IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-18, IL-33, IGF-1, A IL-Ιβ, lisado de plaquetas humanas (HPL) e fator-1 derivado de células estromais (SDF-1) estão incluídos em adição ou em substituição a qualquer uma das IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21. As concentrações adequadas para cada um desses fatores são fornecidas no Exemplo 3, na Tabela 2.
[00141] Será entendido que a quantidade de cada uma das citoci
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69/119 nas acima necessárias para produzir uma população expandida de células T yõ dependerá das concentrações de uma ou mais das outras citocinas. Por exemplo, se a concentração de !L~2 for aumentada ou diminuída, a concentração de IL-15 pode ser consequentemente diminuída ou aumentada, respectivamente. Como observado acima, a quantidade eficaz para produzir uma população expandida refere-se aqui ao efeito composto de todos os fatores na expansão celular.
[00142] Em algumas modalidades, as células T yõ são expostas simultaneamente a cada um dos fatores (por exemplo, as células T yõ são expostas simultaneamente à IL-2, IL-4, IL-15 e IL-21, por exemplo, por pelo menos 5 dias). Em outros casos, as células T yõ são expostas a certos fatores antes da cultura com outros fatores. Por exemplo, a cultura de expansão pode ser gradualmente fornecida com fatores adicionais ao longo da expansão, ou, alternativamente, as células T yõ podem ser transferidas de uma cultura de um fator ou grupo de fatores para outro.
[00143] Em algumas modalidades, as células T yõ são expandidas em cultura por um período de várias horas (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18 ou 21 horas) a cerca de 35 dias (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 dias). Em uma modalidade, as células T yõ são expandidas por um período de 14 a 21 dias. Assim, incluindo um período de cultura de separação (por exemplo, de 1 a 40 dias, por exemplo, 14 a 21 dias), as etapas de separação e expansão, em algumas modalidades, podem durar entre 28 e 56 dias ou cerca de 41 dias.
[00144] Os métodos de expansão fornecem uma população expandida de células T yõ que é maior em número do que uma população de referência. Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ é maior em número do que a população separada de cé
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70/119 lulas T γδ antes da etapa de expansão (por exemplo, pelo menos 2 vezes em número, pelo menos 3 vezes em número, pelo menos 4 vezes em número, pelo menos 5 vezes em número, pelo menos 6 vezes em número, pelo menos 7 vezes em número, pelo menos 8 vezes em número, pelo menos 9 vezes em número, pelo menos 10 vezes em número, pelo menos 15 vezes em número, pelo menos 20 vezesem número, pelo menos 25 vezes em número, pelo menos 30 vezesem número, pelo menos 35 vezes em número, pelo menos 40 vezesem número, pelo menos 50 vezes em número, pelo menos 60 vezesem número, pelo menos 70 vezes em número, pelo menos 80 vezesem número, pelo menos 90 vezes em número, pelo menos 100 vezes em número, em número mínimo de 200 vezes, número mínimo de 300 ve zes, número mínimo de 400 vezes, pelo menos 500 vezes em número, pelo menos 600 vezes em número, pelo menos 700 vezes em número, pelo menos 800 vezes em número, pelo menos 900 vezes em número, pelo menos 1.000 vezes em número pelo menos 5.000 vezes em número, pelo menos 10.000 vezes em número ou mais em relação à população separada de células T yõ antes da etapa de expansão).
[00145] Assim, a invenção fornece um meio para produzir grandes populações de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células T γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) a taxas elevadas (por exemplo, removendo o contato com células estromais e/ou estimulação com TCR ou cultivo na presença de uma quantidade eficaz de fatores). Em algumas modalidades, a etapa de expansão aqui descrita expande as células T yõ em um baixo tempo de duplicação da população, o que é dado pela seguinte equação:
duração * iog(2) Tempo de Duplicação = -— .............................................——« log (Concentração Fsnal) - log (Concentração iniaai)
[00146] Dadas as informações aqui fornecidas, por exemplo, no
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Exemplo 3, abaixo, um técnico versado reconhecerá que a invenção fornece métodos para expandir células T γδ derivadas de tecidos não hematopoéticos (por exemplo, células T yõ derivadas de pele e/ou células T nâo VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) em um tempo de duplicação da população menor que 5 dias (por exemplo, menor que 4,5 dias, menor que 4,0 dias, menor que 3,9 dias, menor que 3,8 dias, menor que 15 que 3,7 dias, menor que 3,6 dias, menor que 3,5 dias, menor que 3,4 dias, menor que 3,3 dias, menor que 3,2 dias, menor que 3,1 dias, menor que 3,0 dias, menor que 2,9 dias, menor que 2,8 dias, menor que 2,7 dias, menor que 2,6 dias, menor que 2,5 dias, menor que 2,4 dias, menor que 2,3 dias, menor que 2,2 dias, menor que 2,1 dias, menor que 2,0 dias, menor que 46 horas, menor que 42 horas, menor que 38 horas, menor que 35 horas, menor que 32 horas).
[00147] Em algumas modalidades, dentro de 7 dias da cultura, a população expandida de células T γδ (por exemplo, a população expandida de células T Võ1 e/ou células T DN) compreende pelo menos 10 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos 400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, pelo menos 700 vezes, pelo menos 800 vezes, pelo menos 900 vezes, pelo menos 1.000 vezes, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes, pelo menos 4.000 vezes, pelo menos 5.000 vezes, pelo menos 6.000 vezes, pelo menos 7.000 vezes ou pelo menos 8.000 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão). Em algumas modalidades, dentro de 14 dias da cultura,
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72/119 a população expandida de células T yõ (por exemplo, a população expandida de células T Võ1 e/ou células T DN) compreende pelo menos 20 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, em pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos 400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, pelo menos 700 vezes, pelo menos 800 vezes, pelo menos 900 vezes, pelo menos 1 000-vezes, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes, pelo menos 4.000 vezes, pelo menos 5.000 vezes, pelo menos 6.000 vezes, pelo menos 7.000 vezes, pelo menos 8.000 vezes, pelo menos 9.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão). Em algumas modalidades, dentro de 21 dias da cultura, a população expandida de células T yõ (por exemplo, a população expandida de células T Võ1 e/ou células T DN) compreendem pelo menos 50 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, em pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos
150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos
400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, pelo menos
700 vezes, pelo menos 800 vezes, pelo menos 900 vezes, pelo menos
1.000 vezes, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes, pelo menos 4.000 vezes, pelo menos 5.000 vezes, pelo menos 6.000 vezes, pelo menos 7.000 vezes, pelo menos 8.000 vezes, pelo menos 9.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão). Em algumas modalidades, dentro de 28 dias da cultura, a população
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73/119 expandida de células T γδ (por exemplo, a população expandida de células T Võ1 e/ou células T DN) compreende pelo menos 100 vezes o número de células T γδ em relação às células separadas população de células T yõ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 110 vezes, pelo menos 120 vezes, pelo menos 130 vezes, pelo menos 140 vezes, pelo menos 150 vezes, pelo menos 200 vezes, pelo menos 300 vezes, pelo menos 400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, pelo menos 700 vezes, pelo menos 800 vezes, pelo menos 900 vezes, pelo menos 1.000 vezes, pelo menos 2.000 vezes, pelo menos 3.000 vezes, pelo menos 4.000 vezes, pelo menos 5.000 vezes, pelo menos 6.000 vezes, pelo menos 7.000 vezes, pelo menos 8.000 vezes, pelo menos 9.000 vezes, pelo menos 9.000 vezes, pelo menos 10.000 vezes, pelo menos 12.000 vezes ou pelo menos 15.000 vezes o número de células T γδ em relação à população separada de células T γδ antes da expansão).
[00148] Células T γδ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células T γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) expandidas pelos métodos aqui fornecidos podem ter um fenótipo adequado para eficácia antitumoral. Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ (por exemplo, células T Võ1 derivadas da pele) tem uma expressão média maior de CD27 do que uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T γδ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma expressão média de CD27 que é pelo menos 2 vezes em relação à população separada de células T yõ (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 15 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 25- dobra, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 ve
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74/119 zes, peto menos 50 vezes, peto menos 60 vezes, peto menos 70 vezes, peto menos 80 vezes, peto menos 90 vezes, peto menos 100 vezes, pelo menos 150 vezes, peto menos 200 vezes, peto menos 300 vezes, pelo menos 400 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 600 vezes, peto menos 700 vezes, peto menos 800 vezes, peto menos 900 vezes, peto menos 1.000 vezes, peto menos 5.000 vezes, pelo menos 10.000 vezes, peto menos 20.000 vezes ou mais, em relação à população separada de células Τ γδ).
[00149] Uma porção distinta da população expandida de células T γδ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) pode regular positivamente o CD27, enquanto outra porção é CD27baix0 ou CD27~. Nesse caso, a frequência de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células Τ γδ pode ser maior. Por exemplo, a população expandida de células Τ γδ pode ter peto menos 5 % maior frequência de células CD27+ em relação à população separada de células Τ γδ antes da expansão (por exemplo, peto menos 10 %, peto menos 15 %, pelo menos 20 %, peto menos 20 %, peto menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, peto menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou até 100 % maior de frequência de células CD27+ em relação à população separada de células Τ γδ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células T yõ pode ser aumentada. Por exemplo, a população expandida de células Τ γδ pode ter peto menos 2 vezes o número de células CD27+ em relação à população separada de células Τ γδ antes da expansão (por exemplo, uma frequência peto menos 10 %, peto menos 15 %, em peto menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, peto menos 35 %, pelo menos 40 %, peto menos 45 %, peto menos 50 %,
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75/119 peto menos 60 %, pelo menos 70 %, peto menos 80 %, pelo menos 90 % ou até 100 % maior de células CD27' em relação à população separada de células T yõ antes da expansão).
[00150] Os métodos de expansão, conforme aqui fornecidos, em algumas modalidades, produzem uma população T de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) com uma baixa expressão de TIGIT, em relação a uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma expressão média mais baixa de TIGIT do que uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ tem uma expressão média de TIGIT que é pelo menos 10 % menor que a população separada de células T yõ (por exemplo, peto menos 20 % menor, peto menos 30 % menor, peto menos 40 % menor, pelo menos 50 % menor, peto menos 60 % menor, peto menos 70 % menor, peto menos 80 % menor, peto menos 90 % menor ou até 100 % menor do que a população separada de células T yõ).
[00151] Uma porção distinta da população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) pode expressar TIGIT, por exemplo, altos níveis de TIGIT, enquanto outra porção é TIGITbaix0 ou TIGIT'. Nesse caso, a frequência de células TIGIT' na população expandida em relação à população separada de células T yõ pode ser menor. Por exemplo, a população expandida de células T yõ pode ter peto menos uma frequência 5 % menor de células TIGIT* em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10 %, peto menos 15 %, pelo menos 20 %,
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76/119 a peto menos 25 %, peto menos 30 %, peto menos 35 %, peto menos 40 %, peto menos 45 %, peto menos 50 %, peto menos 60 %, peto menos 70 %, peto menos uma frequência de 80 %, pelo menos 90 % ou até 100 % mais baixa de células TIGIT+ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células TIGIT* na população expandida em relação à população separada de células T yõ antes da expansão pode ser menor. Por exemplo, a população expandida de células T yõ pode ter pelo menos células TIGIT* 10 % menores em relação ao número de células TIGIT+ na população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, peto menos 10 %, peto menos 15) %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, peto menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, peto menos 50 %, peto menos 60 %, peto menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou até 100 % menor células TIGIT* em relação ao número de células TIGIT* na população separada de células T yõ antes da expansão).
[00152] Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) tem um número ou frequência alta de células CD27* e uma baixa frequência de células TIGIT*. Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ possui uma alta frequência de células CD27* TIGIT em relação a uma população de referência (por exemplo, em relação a uma população separada de células T yõ antes da expansão). Por exemplo, a população expandida de células T yõ podem ter pelo menos uma frequência 5 % maior de células CD27* TIGIT em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, peto menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20) %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, peto menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, peto menos
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77/119 %, pelo menos 90 % ou até 100 % maior frequência de células CD27+ TIGIT em relação à população separada de células T yõ antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de CD27* TIGIT na população expandida em relação à população separada de células T yõ pode ser aumentada. Por exemplo, a população expandida de células T yõ pode ter pelo menos 2 vezes o número de células CD27+ TIGIT em relação à população separada de células T yõ antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou frequência até 100 % maior de células CD27* TIGIT em relação à população separada de células T yõ antes da expansão).
[00153] Em alguns casos, a expressão média de TIGIT em uma população de células T CD27+ yõ em uma população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é baixa em relação a uma população de referência. Em algumas modalidades, a população expandida de células T CD27+ yõ tem uma expressão média mais baixa de TIGIT do que uma população de referência (por exemplo, a população separada de células T CD27+ yõ antes da etapa de expansão). Em algumas modalidades, a população expandida de células T CD27+ yõ tem uma expressão média de TIGIT que é pelo menos 10 % menor que a população separada de células T CD27+ yõ (por exemplo, pelo menos 20 % menor, pelo menos 30 % menor, em pelo menos 40 % menor, pelo menos 50 % menor, pelo menos 60 % menor, pelo menos 70 % menor, pelo menos 80 % menor, pelo menos 90 % menor ou até 100 % menor do que a população separada de células T CD27+ yõ)
[00154] Adicionalmente ou alternativamente, a expressão mediana
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78/119 de CD27 em uma população de células T yõ TIGIT em uma população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é alta em relação a uma população de referência. Por exemplo, a população expandida de células T yõ TIGIT pode ter pelo menos uma frequência 5 % maior de células CD27+ em relação à população separada de células T yõ TIGIT antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou frequência até 100 % maior de células CD27* em relação a da população separada de células T yõ TIGIT antes da expansão). Em algumas modalidades, o número de células CD27+ na população expandida em relação à população separada de células T yõ TIGIT pode ser aumentado. Por exemplo, a população expandida de células T γδ TIGIT pode ter pelo menos 2 vezes o número de células CD27+ em relação à população separada de células T yõ TIGIT antes da expansão (por exemplo, pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou até Frequência 100 % maior de células CD27+ em relação à população separada de células T yõ TIGIT antes da expansão).
[00155] Um aumento ou diminuição na expressão de outros marcadores pode ser adicional ou altemativamente usado para caracterizar uma ou mais populações expandidas de células T yõ derivadas de tecido não hematopoético (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou não células T VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN), incluindo CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39,
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CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30, CD2, NKp44, N p46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64. Em alguns casos, a população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da peie e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T VÕ1 e/ou células T DN) possuí uma expressão média maior de uma ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1 b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T yõ, por exemplo, antes da expansão. Adicional ou alternativamente, a população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) pode ter uma maior frequência de células que expressam uma ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1 b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T yõ. Em algumas modalidades, a população expandida de células T yõ (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T VÕ1 e/ou células T DN) possui uma expressão média mais baixa de uma ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T yõ. A população expandida pode similarmente ter uma frequência mais baixa de células que expressam um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1, e CD64, em relação à população separada de células T yõ.
[00156] Uma célula T yõ residente em tecido não hematopoético produzida pelo método da invenção pode, portanto, ter uma ou mais
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80/119 das seguintes propriedades: (i) exibe o fenótipo CD69hi9h, TIM3high e CD28baix0/ausente; (ii) regulação positiva de um ou mais dentre CCR3, CD39, CD1b e CD9; (iii) produz IFN-y em resposta a um ligante NKG2D na ausência de agonistas de TCR; (iv) produz IL-13 na ausência de agonistas de TCR; (v) produz um ou mais dentre IFN-y, TNF-α e GM-CSF em resposta à ativação do TCR; (vi) produz nenhuma ou praticamente nenhuma IL-17 em resposta à ativação do TCR; (vii) cresce em meio de cultura contendo IL-2 sem fatores de crescimento adicionais; (viii) exibe uma resposta de células T citotóxicas na ausência de agonistas de TCR; e/ou (ix) exibe citotoxicidade seletiva para células tumorais sobre células normais.
[00157] Em alguns casos, uma célula T yõ residente em tecido não hematopoético produzida pelo método da invenção produz IL-13 na ausência de agonistas do TCR e/ou produz IFN-y em resposta a um ligante NKG2D na ausência de agonistas do TCR.
[00158] Estão disponíveis numerosos meios de cultura basal adequados para uso na proliferação de células Τ yõ, em particular meios completos, como AIM-V, meio Iscoves e RPMI-1640 (Life Technologies). O meio pode ser suplementado com outros fatores de meios, como soro, proteínas séricas e agentes seletivos, como antibióticos. Por exemplo, em algumas modalidades, meio RPMI-1640 contendo glutamina 2 mM, FBS a 10 %, HEPES 10 mM, pH 7,2, penicilinaestreptomicina a 1 %, piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos não essenciais (por exemplo, 100 μΜ de Gly, Ala, Asn, Asp, Glu, Pro e Ser; aminoácidos não essenciais de MEM 1X Life Technologies) e 10 μΙ/L de β-mercaptoetanoL Convenientemente, as células são cultivadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5 % de CO2 em um meio de cultura adequado.
[00159] As células Τ yõ podem ser cultivadas como descrito aqui em qualquer sistema adequado, incluindo fermentadores de tanque
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81/119 agitado, fermentadores de transporte aéreo, garrafas de rolos, sacos ou pratos de cultura e outros biorreatores, em particular biorreatores de fibra oca. A utilização de tais sistemas é bem conhecida na técnica. Os métodos e técnicas gerais para a cultura de linfócitos são bem conhecidos na técnica.
[00160] Os métodos aqui descritos podem incluir mais de uma etapa de seleção, por exemplo, mais de uma etapa de depleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser realizado, por exemplo, com uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos das células negativamente selecionadas. Um método é a triagem e/ou seleção de células via imunoaderência magnética negativa ou citometria de fiuxo que utiliza um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados aos marcadores da superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente.
IV. Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento
[00161] As células T yõ obtidas pelo método da invenção podem ser usadas como um medicamento, por exemplo, para terapia de células T adotiva. Isto envolve a transferência de células T yõ obtidas pelo método da invenção para um paciente. A terapia pode ser autóloga, isto é, as células T yõ podem ser transferidas de volta para o mesmo paciente do qual foram obtidas, ou a terapia pode ser alogênica, isto é, as células T yõ de uma pessoa podem ser transferidas para um paciente diferente. Nos casos que envolvem transferência alogênica, as células T yõ podem estar substancialmente livres de células T αβ. Por exemplo, as células T αβ podem ser esgotadas da população de células T yõ, por exemplo, após expansão, utilizando qualquer meio adequado conhecido na técnica (por exemplo, por seleção negativa, por exemplo, utilizando contas magnéticas). Um método de tratamento pode incluir; fornecer uma amostra de tecido não hematopoético obtido
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82/119 de um indivíduo doador; cultivar as células T yõ da amostra como descrito acima para produzir uma população expandida; e administrar a população expandida de células T yõ a um indivíduo receptor.
[00162] O paciente ou indivíduo a ser tratado é preferencialmente um paciente com câncer humano (por exemplo, um paciente com câncer humano sendo tratado por um tumor sólido) ou um paciente infectado por vírus (por exemplo, um paciente infectado por CMV ou infectado por HIV). Em alguns casos, o paciente tem e/ou está sendo tratado por um tumor sólido.
[00163] Como normalmente são residentes em tecidos não hematopoéticos, as células T Võ1 e T yõ DN residentes em tecidos também são mais propensas a abrigar e a serem retidas nas massas tumorais do que suas contrapartes sistêmicas residentes em sangue e a transferência adotiva de é provável que essas células sejam mais eficazes no direcionamento de tumores sólidos e potencialmente outras imunopatologias associadas a tecidos não hematopoéticos.
[00164] Como as células T yõ não são restritas ao MHC, elas não reconhecem um hospedeiro para o qual são transferidos como estranhos, o que significa que é menos provável que causem doença do enxerto contra o hospedeiro. Isto significa que eles podem ser utilizados na prateleira e transferidos para qualquer receptor, por exemplo, para terapia de células T adotiva alogênica.
[00165] Células T yõ residentes em tecido não hematopoético obtidas por métodos da invenção expressam NKG2D e respondem a um ligante NKG2D (por exemplo, MICA), que está fortemente associado à malignidade. Eles também expressam um perfil citotóxico na ausência de qualquer ativação e, portanto, provavelmente são eficazes na morte de células tumorais. Por exemplo, as células T yõ residentes em tecido não hematopoético obtidas como descrito aqui podem expressar uma ou mais, preferencialmente todas as IFN-y, TNF-α, GM-CSF, CCL4, IL
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13, Granulisina, Granzima A e B e Perforina na ausência de qualquer ativação. A IL-17A pode não ser expressa.
[00166] As descobertas aqui relatadas fornecem, portanto, evidências convincentes da praticidade e adequação para a aplicação clínica das células T γδ residentes em tecidos não hematopoéticos, obtidas pelo método da invenção como um reagente imunoterapêutico pronto para uso. Essas células possuem abate do tipo inato, não têm restrição de HC e exibem melhor retomo e/ou retenção dentro dos tumores do que outras células T.
[00167] Em algumas modalidades, um método de tratamento de um indivíduo com um tumor em um tecido não hematopoético pode incluir; fornecer uma amostra do referido tecido não hematopoético obtido de um indivíduo doador, cultivando as células T yõ da amostra como descrito acima para produzir uma população expandida, e; administrar a população expandida de células T yõ ao indivíduo com o tumor.
[00168] As composições farmacêuticas podem incluir células T yõ residentes em tecidos não hematopoéticos expandidos, como descrito aqui em combinação com um ou mais transportador, dlluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem incluir tampões, tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e similares; carboldratos como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As soluções de criopreservação que podem ser utilizadas nas composições farmacêuticas da invenção incluem, por exemplo, DSO. As composições podem ser formuladas, por exemplo, para administração intravenosa.
[00169] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é substancialmente livre de, por exemplo, não há níveis detectáveis de um
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84/119 contaminante, por exemplo, de endotoxina ou micoplasma.
[00170] Em alguns casos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas obtidas por qualquer um dos métodos descritos acima pode ser administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um indivíduo (por exemplo, para tratamento de câncer, por exemplo, para tratamento de um sólido tumor). Em alguns casos, a quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é inferior a 10 x 1012 células por dose (por exemplo, menos de 9 x 1012 células por dose, menos de 8 x 1012 células por dose, menos de 7 x 1012 células por dose, menos de 6 x 1012 células por dose, menos de 5 x 1012 células por dose, menos de 4 x 1012 células por dose, menos de 3 x 1012 células por dose, menos de 2 x 1012 células por dose, menos de 1 x 1012 células por dose, menos de 9 x 1011 células por dose, menos de 8 x 1011 células por dose, menos de 7 x 1011 células por dose, menos de 6 x 1011 células por dose, menos de 5 x 1011 células por dose, menos de 4 x 1011 células por dose, menos de 3 x 1011 células por dose, menos de 2 x 1011 células por dose, menos de 1 x 1011 células por dose, menos de 9 x 1O10 células por dose, menos de 7,5 x 1O10 células por dose, menos de 5 x 1O10 células por dose, menos de 2,5 x 101° células por dose, menor que 1 x 101° células por dose, menos de 7,5 x 109 células por dose, menos de 5 x 109 células por dose, menos de 2,5 x 109 células por dose, menos de 1 x 109 células por dose, menos de 7,5 x 108 células por dose, menos de 5 x 108 células por dose, menos de 2,5 x 108 células por dose, menos de 1 x 108 células por dose, menos de 7,5 x 107 células por dose, menos de 5 x 107 células por dose, menos de 2,5 x 107 células por dose, menos de 1 x 107 células por dose, menos de 7,5 x 106 células por dose, menos de 5 x 106 células por dose, menos de 2,5 x 106 células por dose, menos de 1 x 106 células por dose, me
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85/119 nos de 7,5 x 105 células por dose, menos de 5 x 105 células por dose, menos de 2,5 x 105 células por dose ou menos de 1 x 105 células por dose).
[00171] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) é inferior a 10 x 1012 células ao longo do tratamento (por exemplo, menos de 9 x 1012 células, menos de 8 x 1012 células, menos de 7 x 1012 células, menos de 6 x 1012 células, menos de 5 x 1012 células, menos de 5 x 1012 células, menos de 4 x 1012 células, menos de 3 x 1012 células, menos de 2 x 1012 células, menos de 1 x 1012 células, menos de 9 x 1011 células, menos de 8 x 1011 células, menos de 7 x 1011 células, menos de 7 x 1011 células, menos de 6 x 1011 células, menos de 5 x 1011 células, menos de 4 x 1011 células, menos de 3 x 1011 células, menos de 2 x 1011 células, menos de 1 x 1011 células, menos de 9 x 1011 células, menos de 9 x 10w células, menos de 7,5 x 101° células, menos de 5 x 1O10 células, menos de 2,5 x 1O10 células, menos de 1 x 1O10 células, menos de 7,5 x 109 células, menos de 5 x 109 células, menos de 2,5 x 109 células, menos de 1 x 109 células, menos de 7,5 x 108 células, menos de 5 x 108 células, menos de 2,5 x 108 células, menos de 1 x 108 células, menos de 7,5 x 107 células, menos de 5 x 107 células, menos de 2,5 x 107 células, menos de 1 x 107 células, menos de 7,5 x 106 células, menos de 5 x 10® células, menos de 2,5 x 106 células, menos de 1 x 106 células, menos de 7,5 x 105 células, menos de 5 x 105 células, menos de 2,5 x 105 células ou menos de 1 x 105 células ao longo do tratamento).
[00172] Em algumas modalidades, a dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido, conforme descrito neste documento, compreende cerca de 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 106, 5x 10®, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 ou 5x 108
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86/119 células/kg. Em algumas modalidades, uma dose de células T γδ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) compreende pelo menos cerca de 1 x 106, 1,1 x 106, 2 x 106, 3,6 x 10®, 5 x 10®, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 ou 5 x 108 células/kg. Em algumas modalidades, uma dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T γδ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) compreende até cerca de 1 x 10®, 1,1 x 10®, 2 x 106, 3,6 x 106, 5 x 10®, 1 x 107, 1,8 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108 ou 5 x 108 células /kg. Em algumas modalidades, uma dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) compreende cerca de 1,1 x 106-1,8 x 107 células/kg. Em algumas modalidades, uma dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T VÕ1 e/ou células T DN) compreende cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células. Em algumas modalidades, uma dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não VÕ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) compreende pelo menos cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células. Em algumas modalidades, uma dose de células T yõ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T yõ derivadas da pele e/ou células T não Võ2, por exemplo, células T Õ1 e/ou células T DN) compreende até cerca de 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 10®, 1 x 109, 2 x 109 ou 5 x 109 células.
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[00173] Em uma modalidade, o indivíduo é administrado 104 a 106 células T γδ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, células T γδ derivadas da peie e/ou céluias T não Võ2, por exemplo, células T Võ1 e/ou células T DN) por kg de peso corporal do indivíduo. Em uma modalidade, o indivíduo recebe uma administração inicial de uma população de células T γδ residentes em tecido não hematopoético (por exemplo, uma administração inicial de 104 a 106 células T γδ por kg de peso corporal do indivíduo, por exemplo, 104 a 105 células T yõ por kg de peso corporal do indivíduo) e uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) administrações subsequentes de células T γδ residentes em tecido não hematopoético expandido (por exemplo, uma ou mais administração subsequente de 104 a 106 células T γδ residentes em tecido não hematopoético expandido por kg de peso corporal do indivíduo, por exemplo, 104 a 105 células T γδ residentes em tecido não hematopoético expandido por kg de peso corporal do indivíduo). Em uma modalidade, as uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior, por exemplo, menos de 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior. Em uma modalidade, o indivíduo recebe um total de cerca de 106 células T por kg de peso corporal do indivíduo ao longo de pelo menos três administrações de uma população de células T, por exemplo, o indivíduo recebe uma dose inicial de 1 x 105 células T γδ, uma segunda administração de 3 x 105 células T γδ e uma terceira administração de 6 x 105 células T yõ e, por exemplo, cada administração é administrada menos de 4, 3 ou 2 dias após a administração anterior.
[00174] As células T γδ não residentes em tecido não hematopoético obtidas pelo método da invenção também podem ser utilizadas para terapia com CAR-T. Isto envolve a geração de receptores de células T manipulados (TCRs) para reprogramar a célula T com uma nova es
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88/119 pecificidade, por exemplo, a especificidade de um anticorpo monoclonal. O TCR manipulado pode tornar as células T específicas para células malignas e, portanto, úteis para imunoterapia contra o câncer. Por exemplo, as células T podem reconhecer células cancerígenas que expressam um antígeno tumoral, como um antígeno associado a um tumor que não é expresso por células somáticas normais do tecido em questão. Assim, as células T modificadas com CAR podem ser usadas para terapia de células T adotiva de, por exemplo, pacientes com câncer.
[00175] O uso de células T yõ residentes em sangue para CAR foi descrito. Contudo, é provável que as células T yõ residentes em tecido não hematopoético obtidas pelo método da invenção sejam veículos particularmente bons para abordagens de CAR-T, pois podem ser transduzidas com TCRs específicos para antígeno quiméricos, mantendo suas capacidades semelhantes de reconhecer células transformadas e é provável que tenham melhores capacidades de penetração e retenção de tumores do que as células T yõ residentes no sangue ou as células T αβ sistêmicas convencionais. Além disso, sua falta de apresentação de antígeno dependente de MHC reduz o potencial de doença do enxerto contra o hospedeiro e permite que eles alvejem tumores que expressam baixos níveis de MHC. Do mesmo modo, a sua não dependência da coestimulação convencional, por exemplo, através do envolvimento de CD28, melhora o direcionamento de tumores que expressam baixos níveis de ligantes para receptores coestimuladores.
[00176] Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados ao indivíduo. O agente terapêutico adicional pode ser selecionado do grupo que consiste em um agente imunoterapêutico, um agente citotóxico, um agente inibidor do crescimento, um agente de radioterapia, um agente antiangiogênico ou
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89/119 uma combinação de dois ou mais agentes do mesmo. O agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente com, antes ou após a administração das células T expandidas. O agente terapêutico adicional pode ser um agente imunoterapêutico, que pode atuar em um alvo dentro do corpo do indivíduo (por exemplo, o próprio sistema imunológico do indivíduo) e/ou nas células T transferidas.
[00177] A administração das composições pode ser realizada de qualquer maneira conveniente. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente transarterialmente, subcutaneamente, intradermicamente, intratumoralmente, intranodalmente, intramedularmente, intramuscularmente, por injeção intravenosa ou intraperitoneal, por exemplo, por injeção intradérmica ou subcutânea. As composições de células T yõ não residentes em tecido não hematopoético podem ser injetadas diretamente em um tumor, linfonodo ou sítio de infecção. EXEMPLOS
[00178] Na maioria dos adultos, as células Võ2 compreendem no estado estacionário apenas um componente pequeno e altamente variável das células T do sangue (0,01 a 5 %), mas as células se expandem rapidamente, alcançando transitoriamente até -25 % das células CD3+, seguindo desafio por um amplo espectro de agentes, incluindo inúmeras bactérias e parasitas. Uma base importante para essa resposta é o reconhecimento mediado por TCR de VÕ2 de fosfoporções de baixo peso molecular, incluindo hidroxil-metil-butil-Z-enil-pirofosfato (HMBPP), um intermediário em uma via microbiana crítica da síntese de colesterol e outros lipídios usados para modificar proteínas, por exemplo por geranilação ou farnesilação. Em primatas, essa síntese ocorre pela via do mevalonato, um intermediário do qual o isopentenil pirofosfato (IPP) é expresso em níveis muito altos nas células infectadas e transformadas por vírus e também é um alvo do reconhecimento mediado por TCR de Võ2.
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[00179] Além disso, a maioria das células T Võ2 expressa altos níveis do receptor NKG2D que pode ativar ou coestimular (junto com o receptor da célula T) os potenciais citolíticos das células ao envolver os ligantes NKG2D, por exemplo. MICA, MICB e ULBP. Esses ligantes sâo proteínas hospedeiras que são reguladas quando as células são expostas a agentes como estresse oxidativo ou osmótico ou luz ultravioleta. Esses agentes promovem sinalização hiperativa da via do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), que também é comumente desregulado em tumores sólidos humanos.
[00180] A capacidade das células T Võ2 de detectar células transformadas usando seus TCRs e/ou NKG2D, juntamente com suas poderosas capacidades citolíticas e um potencial manifesto de apresentar antígenos às células T CD8+, provocaram coletivamente a visão de que as células T Võ2 podem ser clinicamente exploradas para liberar imunoterapia de câncer. Isso pode ser alcançado pela transferência adotiva das células, na qual a falha das células T yõ em ser restringida pelo MHC limita de maneira significativa e benéfica o potencial de doença do enxerto contra hospedeiro (GvHD). Para conseguir isso, as células T Vy9Võ2 yõ residentes no sangue podem ser expandidas ex vivo por adição de citocinas como a interleucina~2 (IL-2), juntamente com agentes ativadores exógenos de TCR, como fosfoporções, BrHPP), ou em conjunto com bisfosfonatos clinicamente aprovados (por exemplo, ácido zoledrônico), que inibem a farnesil pirofosfato sintase na via do mevalonato, induzindo assim acumulação da fração de ativação de TCR, IPP. No entanto, a ativação crônica de células Vy9Võ2 através de agentes como BrHPP pode levar progressivamente à exaustão celular e potencial diminuído de citotoxicidade.
[00181] Alternativamente, as células T yõ dos pacientes podem ser ativadas in situ usando formas farmacologicamente modificadas de HMBPP ou aminobifosfonatos clinicamente aprovados. Por essas
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91/119 abordagens, mais de 250 pacientes com câncer foram tratados, aparentemente com segurança, mas com apenas raras incidências de remissão completa. Uma grande preocupação em relação à limitada eficácia clínica das células é sua tendência a se tomar irreparavelmente exausta pela exposição crônica ao antígeno. Uma segunda grande preocupação é a aparente ineficiência no retomo a tumores sólidos e os tecidos que os abrigam.
[00182] A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T) está se mostrando promissora na clínica para malignidades de células B. No entanto, no que diz respeito ao tratamento de tumores sólidos, o desempenho das células CAR-T tem sido, até o momento, abaixo das expectativas, mostrando menos eficácia na indução de respostas tumorais completas e altas taxas de incidência de citotoxicidade fora do tumor. Quanto às células Τ γδ do sangue periférico, um grande obstáculo ao sucesso das abordagens de CAR-T para tumores sólidos é a provável ineficiência das células sistêmicas de CAR-T em migrar para os sítios de malignidade e residir em um estado funcionalmente eficaz. Adicionalmente, sendo baseadas em células Τ αβ convencionais, as células CAR-T têm de superar sinais imunossupressores no microambiente tumoral, por exemplo, aqueles transmitidos através do receptor PD1.
[00183] Pode haver vantagens associadas ao uso de células T yõ para abordagens de CAR-T, porque elas podem ser transduzidas com TCRs específicos para antígenos quiméricos reativos a tumores, mantendo suas capacidades inatas de reconhecer células transformadas usando receptores como NKG2D. Assim, eles podem provocar simultaneamente efeitos mediados por tumores adaptativos (TCR) e inatos (NKG2D). No entanto, permanece a questão da aparente ineficiência das células T yõ do sangue humano no retomo aos tumores dentro dos tecidos sólidos e aí sendo mantidos de forma ativa. Esta considePetição 870190111981, de 01/11/2019, pág. 280/321
92/119 ração provocou uma consideração mais detalhada das células T yõ que são normalmente residentes em tecidos não hematopoéticos.
[00184] Essas células T migram para tecidos não hematopoéticos como parte de seu desenvolvimento e, como tal, sâo distintas daquelas células T, por exemplo, células T de memória TCRap residentes no tecido (células TRM) que se infiltram no tecido após a iniciação sistêmica. As células T yõ residentes em tecidos sâo mais bem estudadas em camundongos, onde se demonstrou prevalecer na pele, no intestino e nos tecidos reprodutivos, entre outros sítios. Foi demonstrado que muitas dessas células abrigam potenciais funcionais do tipo inato, pelo que podem responder a desafios através da ativação do receptor NKG2D. Os inventores obtiveram recentemente dados demonstrando que a pele e o intestino humano também abrigam grandes compartimentos de células T yõ não residentes em tecidos não hematopoéticos com atividades semelhantes. O estudo de doenças malignas, inflamação, atopia, alergia e outras patologias que se formam dentro de tecidos não hematopoéticos não considerou o impacto potencial dessas células T humanas inatas que residem nos tecidos em que ocorrem lesões patológicas.
[00185] As células T yõ humanas residentes em tecidos não hematopoéticos são muito menos estudadas porque sua localização dificulta a amostragem das células e porque não há meios estabelecidos para cultivá-las. Este subtipo compreende uma diversidade de células com potencial citolítico não restrito ao MHC, que, por não expressarem TCRs contendo VÕ2, são totalmente reativas a fosfoporções de baixo peso molecular. Embora poucas especificidades precisas do TCR sejam conhecidas para essas células, os dados disponíveis sugerem que as células são reativas a auto-antígenos, como o Receptor Endotelial de Proteína C (EPCR), que é superexpresso por células infectadas por citomegalovírus (CMV) e por muitos tumores sólidos. Células T yõ as
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93/119 sociadas a tecidos não hematopoéticos também geralmente expressam NKG2D. Dadas essas propriedades e a residência fisiológica das células em tecidos não hematopoéticos, como a pele e o intestino, a transferência adotiva dessas células para pacientes com câncer pode ser consideravelmente mais eficaz no direcionamento de tumores sólidos e potencialmente outras imunopatologias.
[00186] Para explorar células não Võ2 para imunoterapia, é necessário um meio de expandir as células in situ ou coletá-las e expandi-las ex vivo antes da reinfusão. A última abordagem foi adotada porque não existem agentes ativadores de TCR conhecidos com capacidade comprovada para expandir um grande número de células T não Võ2 in situ. Para superar o desafio da disponibilidade limitada de tecidos não hematopoéticos, alguns pesquisadores tentaram expandir o número muito pequeno de células T não Võ2 do sangue, onde as células que expressam Võ2 são o subconjunto dominante, assumindo que essas células são equivalentes a células T não Võ2 residentes em tecidos. O pequeno número de células T não Võ2 encontradas no sangue se expande substancialmente durante a infecção ativa por CMV, mostra reatividade superior em relação a CMV em comparação com células T Võ2 e parece capaz de proteger o feto humano em casos de infecção por CMV no útero. Além disso, as células T não Võ2 yõ reativas ao CMV aparentemente protegem os pacientes transplantados da reativação do CMV durante a imunossupressão e, via reatividade cruzada às células transformadas, diminuem o risco de malignidades secundárias. Da mesma forma, existem dados sugerindo que as células T yõ desempenham papéis benéficos no controle da infecção pelo HIV, caso em que as células T não Võ2 yõ são expandidas no sangue em relação às células T VÕ2.
[00187] As células não Võ2 residentes no sangue foram expandidas ex vivo pela adição de agentes exógenos que ativam diretamente a
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94/119 sinalização do TCR, por exemplo, usando um agente como um anticorpo antí-CD3, anticorpo específico para pan yõ-TCR ou fitohemaglutinina (PHA), ou cocultivando células T não Võ2 estimuladas com células apresentadoras de antígeno artificial (aAPC), em que o contato direto entre as células T yõ e as aAPC é necessário para a expansão de células T não Võ2 ex vivo. Alternativamente, as células foram expandidas promovendo a sinalização do receptor NKG2D pelo uso de MICA recombinante imobilizado (um ligante NKG2D), por exemplo, como foi usado para sustentar a proliferação de culturas de células T yõ ex vivo a partir de linfócitos epiteliais infiltrantes de câncer (TILs). Em suma, os métodos atuais de expansão ex vivo de células T yõ sanguíneas que expressam Võ2 ou de células T yõ não Võ2 no sangue requerem adição de agentes, promovendo invariavelmente a ativação dos receptores TCR e/ou NKG2D juntamente com citocinas suplementares, como IL-2. Essa combinação de sinais ativadores de receptores e citocinas reflete a abordagem padrão de cultura e expansão de células T, amplamente adotada pela comunidade. Até à data, não foi descrito nenhum método para expandir substancialmente células T yõ residentes em tecido não hematopoético. Esse método é descrito aqui.
[00188] Como parte de uma caracterização fenotípica e funcional de células T yõ humanas residentes em tecidos não hematopoéticos (por exemplo, células T yõ da pele), os presentes inventores isolaram uma grande e distinta população de células T yõ normalmente residentes em tecidos não hematopoéticos e com propriedades únicas em relação a células T αβ e células T yõ residentes no sangue. Os inventores descobriram que as células mostram respostas fortes, independentes de TCR, do tipo inato a ligantes NKG2D e a citocinas. Enquanto os esforços de expansão das células T αβ primárias normalmente empregam a cocultura com outras células de suporte como fonte de fatores
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95/119 de crescimento benéficos, os presentes inventores mostraram inesperadamente que as células T yõ residentes na pele e em outros tecidos não hematopoéticos são profundamente e suprimida especificamente cocultivando essas células em contato com fibroblastos dérmicos autólogos e potencialmente outros componentes estromais, como queratinócitos e células endoteliais. O alívio de tais interações permite que as células sejam rapidamente expandidas em grandes quantidades para possíveis aplicações clínicas.
[00189] Além disso, em contraste com os esforços realizados até o momento para expandir células T yõ derivadas de sangue e tumor, os presentes inventores mostraram que essas células T yõ residentes em tecidos não hematopoéticos podem ser expandidas sem a adição deliberada de agentes exógenos que ativar suas vias de sinalização TCR ou NKG2D.
[00190] É descrito aqui um novo meio para isolar e expandir de maneira eficaz e reprodutível as células T yõ do tecido não hematopoético de humanos ou animais não humanos, como pele e intestino. A expansão é promovida pela interrupção do contato de células T não Võ2 derivadas de tecido não hematopoético com fibroblastos autólogos e potencialmente outros componentes do estroma e é sustentada por cultura com IL-2, IL-15, IL-4 e/ou IL-21.
[00191] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos de experiência ordinária na técnica uma descrição e descrição completas de como os métodos e compostos reivindicados neste documento são executados, fabricados e avaliados e pretendem ser puramente exemplares de invenção e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores consideram sua invenção.
Exemplo 1. Métodos Analíticos
[00192] Salvo indicação em contrário, os seguintes métodos foram utilizados para gerar os resultados dos exemplos subsequentes.
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Citometría de fluxo
[00193] A citometría de fluxo foi realizada usando os seguintes conjugados anticorpo-fluorocromo: KI-67-BV421, CD3-BV510, VÕ1PeVio770, TIM-3-PE, CD9-PE, CCR3-BV421 e CD39-BV421. As amostras também foram coradas quanto à viabilidade usando o eFluor770NIR. Os anticorpos comerciais foram adquiridos à Biolegend ou Miltenyi. O corante de viabilidade (próximo ao IR) era da eBioscience. A marcação com Kí-67 foi realizada em células fixadas e permeabilizadas usando o conjunto de tampão de marcação com Foxp3 (eBioscience). Uma vez que cada experimento foi concluído, a população de células foi lavada em PBS e dividida ao meio. As células foram coradas com eFluor770 NIR para viabilidade e lavadas, seguidas de marcação com TrueStain (Biolegend) para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos corantes. Metade da amostra foi corada para os marcadores de superfície indicados e a outra metade foi corada apenas para marcadores de linhagem (CD3, Võ1) e com o controle de isótipo equivalente para os marcadores de superfície utilizados. O anticorpo isotipo de camundongo combinado conjugado com o mesmo fluorocromo foi usado na mesma concentração. Os controles de isotipo se ligam a nenhum antígeno humano conhecido e, portanto, indicam ligação inespecífica ou falsos positivos. Os hlstogramas são mostrados em comparação com seu controle de isótipo correspondente ou, onde indicado, FMO (FIGS. 1D, 2A, 3B, 4B, 6B, 7A e 11-13). Os resumos dos dados indicam a porcentagem de células que foram positivas para o marcador indicado em comparação e, portanto, em um nível superior ao isotipo. A análise dos dados da citometría de fluxo foi realizada no FlowJo (Versão 10.1).
Sequenciamento de RNA
[00194] As células T Võ1 da pele humana e as células T Võ1 de sangue humano (após expansão iniciada pelo receptor de células T)
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97/119 foram classificadas (FACS), centrifugadas e o sedimento celular ressuspenso em tampão RLT. O RNA foi preparado usando o kit RNAMicro-plus (QIAGEN). As bibliotecas de RNA foram geradas usando o Kit ΚΑΡΑ Stranded RNA-seq com RiboErase (HMR) (ΚΑΡΑ BIOSYSTEMS). Sequenciação de extremidade emparelhada no HiSeq 2500 (ilumina) usando química de execução rápida (comprimento de leitura: 100 pb). 101 leituras de extremidade pareada de pares de bases foram alinhadas e quantificadas usando o RSEM (v1.2.1 1) com Bowtie2. As leituras foram alinhadas ao transcriptoma humano, os valores de contagem foram transformados em Iog2 e o quantil normalizado.
Quantificação de citocinas
[00195] As células T Võ1 da pele humana foram estimuladas com PMA e ionomicina ou mAb anti-CD3 ligado à placa (ΟΚΤ3, 5 pg/ml) por 24 horas. Os sobrenadantes foram tomados posteriormente e analisados usando ProcartaPlex Human Cytokine & Chemokine Panei 1A (34 plex) da eBioscience. Os ensaios foram analisados usando um Luml·nex FlexMap3D (Luminex Corp). Os dados foram analisados no Microsoft Excel, sendo mostrada a média de 3 doadores (executados em duplicatas). Barras de erro indicam desvio padrão.
Cocuitura com fíbroblastos
[00196] Para cada cultura de separação, duas placas de Petri (100 x 25 mm, Corning) foram arranhadas em vários locais usando um bisturi. Pedaços de pele picada foram colocados em arranhões. Após 5 a 10 minutos de secagem ao ar, os pedaços de pele normalmente grudavam na placa e foram adicionados 10 mL de meio Skin-T. Os meios foram trocados uma vez por semana e os fibroblastos primários foram colhidos após o tratamento com ACCUTASE® (Life Technologies) após 3 semanas de crescimento. Os fibroblastos foram semeados em placas de 48 cavidades a 1x104 ou na câmara inferior de placas de 24 cavidades a 2 x 104 no caso de experiências com transcavidade. Após
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98/119 a 3 dias, os fibroblastos atingiram a confluência e as experiências de cocultura foram iniciadas usando RPM! e as citocinas indicaram a adição de 2 x 105 linfócitos mistos da pele no caso de placas de 48 cavidades ou 3 x 105 linfócitos no caso de placas de 24 cavidades, cavidades inferiores, bem como transcavidades.
Expansão de células T νδ derivadas de sangue
[00197] As células T yõ derivadas de sangue nas PBMCs só podem ser expandidas se estimuladas com ligantes de TCR (no caso de VÕ2, por exemplo, IPP, HMBPP, bifosfonatos) ou suplementação de anticorpos para reticular o receptor de TCR (mAbs) ou a CD3 de quinase associada ao TCR. O mesmo efeito da reticulação de TCR também pode ser alcançado usando lectinas como PHA. Na ausência de adição de tais agentes estimuladores de TCR, as células T yõ em PBMCs sobrevivem por vários dias, mas não conseguem se expandir e permanecer em sua composição inicial de subconjuntos de células T com pequenas variações.
[00198] Utilizou-se sangue de voluntários saudáveis para isolar PBMCs por camadas de sangue total em Ficoll, seguido de centrifugação a 400 g por 20 minutos para separar os glóbulos vermelhos, plasma sanguíneo e linfócitos/monócitos brancos. Os glóbulos brancos foram cuidadosamente colhidos através de uma tira e lavados quatro vezes em PBS fria. As células foram ressuspensas em meio RPMI1640 (Life Technologies) com 10 % de soro fetal bovino inativado pelo calor (Life Technologies), L-glutamina (292 mg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 pg/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2etanossulfônico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), meios essenciais mínimos (MEM) aminoácidos não essenciais (1X; Life Technologies) a uma densidade de 1 x 106 por mL e suplementada com IL-2 (100 lU/ml). As células foram
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99/119 transferidas para uma placa de 24 cavidades que foi revestida com anticorpo monoclonal de pan yõ TCR (20 pg/ml, clone B1, Biolegend) 90 minutos antes da transferência celular. As células foram cultivadas por 14 dias, os meios mudaram a cada 2-3 dias e adicionadas citocinas frescas. Ao atingir a confluência, as células foram divididas 1:1. Nessas condições, após 14 dias, a população menor original de células T yõ é normalmente altamente ativada por meio de seu TCR (como indicado pela regulação positiva se CD69 e CD25) e amplamente enriquecida, consistindo principalmente em células T Võ2, mas também células T VÕ1 (até 30 % de todas as células T yõ). As células T Võ1 podem subsequentemente ser isoladas usando FACS para análise funcional ou fenotípica (por exemplo, genética).
Exemplo 2. Isolamento de células T yõ residentes em tecidos não hematopoéticos da pele e intestino
[00199] Foi estabelecido um protocolo tridimensional de explante cutâneo usando o protocolo Clark. As matrizes Cellfoam (Cytomatrix Pty Ltd, Victoria, Australia) ou equivalente com dimensões de 9 mm x 9 mm x 1,5 mm, foram autoclavadas e incubadas em uma solução de 100 mg/ml de colágeno I da cauda de rato (BD Biosciences) em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido de uma lavagem em PBS. Amostras de pele humana adulta foram obtidas dentro de 3-6 horas após a cirurgia cutânea. A gordura subcutânea foi removida e o restante tecido da pele foi picado em fragmentos medindo aproximadamente 1 mm x 1 mm. Aproximadamente cinco fragmentos/explantes de pele foram colocados e pressionados contra a superfície de cada matriz. Cada matriz foi colocada em uma cavidade separada de uma placa de 24 cavidades (Corning) contendo 2 ml de meio Skin-T (meio de Dulbecco modificado da Iscove (IMDM; Life Technologies) com 10 % de soro bovino fetal inativado pelo calor (Life Technologies), Lglutamina (292 mg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml;
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Life Technologies), estreptomicina (100 Mg/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanossulfônico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos não essenciais de meios essenciais mínimos (MEM) (1x; Life Technologies) e 3,5 μΙ/L de 2-mercaptoetanol (Life Technologies). Durante os primeiros 7 dias de cultura, Anfotericina (2,5 mg/ml; Life Technologies) foi adicionada aos meios. Os meios foram atualizados três vezes por semana aspirando o 1 mL superior de meios de cada cavidade e adicionando 1 ml de meio fresco. IL-2 recombinante humana (100 lll/mL; PROLEUKIN®; Novartis Pharmaceutical UK Ltd) e IL15 recombinante humana (20 ng/ml; Biolegend) foram adicionadas no início da cultura e em cada meio de atualização até o isolamento dos linfócitos após 21-35 dias, conforme indicado na Tabela 1. Foram criadas até 96 cavidades (quatro placas de 24 cavidades) em cultura para cada doador.
[00200] Para isolar os linfócitos, as matrizes e os meios foram transferidos para um tubo de centrífuga de 50 ml (Corning) contendo 10 ml de solução salina equilibrada de Hanks (HBSS; Life Technologies) com HEPES 0,01 mM (até 12 matrizes/tubo). As matrizes foram lavadas com a suspensão de células usando uma pipeta de 10 ml, e a suspensão de células foi passada através de um filtro de 70 pm (BD Biosciences) para um tubo de centrifugação fresco de 50 ml. O enxágue das matrizes foi repetido mais duas vezes. O meio da cavidade de cultura também foi aspirado e passado através de um filtro de 70 horas para um tubo de centrífuga fresco de 50 ml. As cavidades foram lavadas mais duas vezes com 1 ml de HEPES/HBSS 0,01 mM e passadas através de um filtro de 70 pm. As células foram subsequentemente isoladas por centrifugação (1600 rpm por 15 minutos). O sedimento foi ressuspenso em meio Skin-T. O sedimento celular final foi ressuspenso no meio Skin-T para posterior análise por citometria de
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101/119 fluxo ou estudos funcionais. Quando as contagens de células eram necessárias, os linfócitos foram contados nesse estágio por um ou outro; (1) corante de azul de tripano (0,4 %) (Life Technologies) e hemocitômetro, ou (2) contador e analisador de células CASY® Modelo TT (Roche). Os resultados de um estudo exemplar sâo mostrados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1. Rendimentos isolados de linfócitos por doador.
Duração da cultura Linfócitos Totais Número de Estruturas Linfócitos/Estrutura
35 dias 23,5 x 10® 72 3,26 x 105
32 dias 38,87 x 10® 96 4,04 x 105
21 dias 29,9 x 10® 96 3,11 χ 105
21 dias 18,0 x 10® 72 2,50 x 105
23 dias 16,0 χ 106 72 2,22x105
28 dias 10,7 x 10® 23 4,65 x 105
25 dias 88,0 χ 106 120 7,33 x 105
22 dias 20,0 x 10® 39 5,12 x105
21 dias 4,1 x 10® 42 0,97 x 105
23 dias 31,4 x 10® 96 3,27 x 105
23 dias 15,21 χ 106 72 2,11 χ 105
26 dias 43,0 χ 106 144 2,99 x 105
32 dias 44,5 x 10® 96 4,64 x 105
24 dias 72,4 x 106 96 7,54 x 105
22 dias 46,0 x 10® 96 4,79 x 105
Médias:
25 dias 33,4 x 106 82 3,91 x 10s
[00201] Como as amostras primárias do intestino eram mais propensas à contaminação, as biópsias adquiridas foram lavadas primeiro em IMDM contendo 10% de FCS, penicilina (500 U/mL), estreptomicina (500 pg/mL), gentamicina (100 pg/mL), anfotericina B (12,5 pg/mL) e Metronidazol (5 pg/mL) duas vezes antes de ser picado e colocado em estruturas. Culturas de estruturas intestinais foram cultivadas em meio Gut-T (IMDM, FCS a 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina
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100 pg/mL, gentamicina 20 pg/mL, Metronidazol 1 pg/mL). Para a primeira semana de crescimento, também usamos Anfotericina B 2,5 pg/mL, semelhante à pele. O meio continha IL-2 (100 Ul/ml) e IL-15 (20 ng/ml) e foi trocado três vezes por semana. Como a estrutura intestinal era mais solta que a pele, os linfócitos foram colhidos após uma semana.
Exemplo 3. Caracterização de células T yõ residentes em tecido não hematopoético
As células T γδ humanas sâo abundantes na pele, predominantemente Võ2~, e participam da resposta da vigilância do estresse linfóide humano [00202] As Figs. 1A-1D mostram que a pele humana compreende uma população notável de células T yõ residentes. Utilizando o protocolo Clark, usamos amostras de pele residual humana suplementadas com IL-2 e IL-15 para permitir o crescimento de linfócitos residentes no tecido ao longo de três semanas. O rendimento médio foi de 240.000 linfócitos por cada estrutura. Consistente com os relatórios anteriores, subconjuntos distintos de linfócitos residentes na pele foram identificados e a maioria das células expressou um αβ TCR convencional, principalmente do tipo TRM residente no tecido. No geral, 59,9% (± 8,6%) das células CD45+ eram CD4+ e 18,3% (± 2,8%) células T CD8 + αβ com uma fração de células NK de 8,7% (± 3,6%). Adicionalmente, encontramos uma população substancial de células T yõ (média 8,513% das células CD45+, ± 6,564 %) em nossos doadores (FIGS. 1A e 3D). Esse perfil de linfócitos era altamente reprodutível em aproximadamente 100 doadores após a cultura organotípica e era comparável com amostras de pele digeridas recentemente, diferindo apenas em uma população yõ ligeiramente aumentada, mas de utilidade prática, oferecendo populações de linfócitos muito maiores e mais puras em comparação com os protocolos de digestão de tecidos padrão. De acordo com a literatura em relação à compartimentalização tecidual de
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103/119 células T γδ humanas com base em sua cadeia delta de TCR, a maioria das células T yõ de pele humana expressou uma cadeia TCR Võ1 emparelhada com várias cadeias y identificadas por citometria de fluxo. Isso contrasta com a maioria das células T yõ do sangue periférico, que mostram um único heterodímero específico de TCR de uma cadeia Võ2 ligada a Vy9 e estavam praticamente ausentes em amostras de pele humana. No entanto, é importante notar que um subconjunto não expressou nem Võ1 TCR nem VÕ2 TCR, que são aqui referidos como células T yõ negativas duplas (células T yõ DN: FIG. 1C).
[00203] As células T yõ residentes na pele cultivadas desta maneira mostraram um fenótipo de memória não terminalmente diferenciado, sem expressão de CD45RA e expressando níveis variáveis do CCR7 de molécula coestimuladora. Em relação às células T sistêmicas convencionais, as células T yõ residentes na pele exibiram alta expressão do marcador de superfície CD69, juntamente com a expressão do receptor de morte programado 1 (PD-1), níveis baixos a ausentes de receptor de IL-2 α (CD25), e uma falta da molécula coestimuladora CD28, sugerindo ativação prévia ou crônica (FIG. 1D). Consistente com a localização dos tecidos, as células Võ1 e DN mostram expressão de marcadores de retorno à pele e tecidos, como CCR4, CCR8 e integrina aE (CD103; FIG. 7). Esse conjunto de marcadores residentes no tecido pode ser benéfico em um ambiente de imunoterapia. Além disso, as células T yõ residentes na pele mostram altos níveis de expressão para o receptor ativador NKG2D (FIG. 2A), implicando um possível papel dessas células na resposta da vigilância do estresse linfóide. Os ligantes de NKG2D, como MICA, MICB e ULBPs, respectivamente, são regulados pelas células em resposta a danos no DNA, ativação do receptor de EGF e estresse oxidativo e, portanto, podem permitir que as células T que expressam NKG2D identifiquem e erradiquem células estressadas ou transformadas, mantendo assim a ho
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104/119 meostasia do tecido. De acordo com este princípio, descobrimos que as células T yõ residentes na pele expandidas pelo método da invenção são ativadas após a exposição a ligantes recombinantes para o receptor NKG2D (MICA, ULBP2), demonstrando a desgranulação medida pela regulação positiva da proteína de membrana lisossômica CD107a (FIG. 2A). Esta característica do tipo inato era exclusiva das células T yõ Võ1+ e DN, uma vez que outras células T residentes em tecidos (FIG. 2C) e células T yõ sistêmicas não possuíam essa resposta (FIG. 10B).
[00204] No geral, as células T yõ Võ e DN residentes na pele ativadas executaram um programa de citocinas influenciada por Th1 próinflamatório (marcação positiva para IFN-y, TNF-α e GM-CSF) quando ativado por PMA/ionomicina ou por ligantes de NKG2D, por exemplo, proteína MICA recombinante (FIGS. 2A e 2B), afirmando assim as respostas do tipo inato das células. De fato, as respostas à MICA foram quase completamente revogadas pelo bloqueio do receptor NKG2D por meio de um anticorpo (FIGS. 2B e 2C).
[00205] Sabe-se que as células T yõ secretam IL-17 sob certas condições de doença, como psoríase e em alguns tipos de tumores, as células T yõ expandidas pelo método da invenção produzem níveis baixos ou inexistentes de IL-17, mesmo após extensa ativação (FIGS. 2B e 8). Inversamente, as células Τ αβ que expressam CD4 residentes em tecidos produziram IL-17 após a ativação do TCR (FIG. 2B). Em geral, as células Τ αβ mostraram um repertório de citocinas muito mais diversificado em resposta à PMA/ionomicina em comparação com as células T Võ1+ e yõ DN, limitadas a um programa influenciado por Th1 associado à proteção do hospedeiro.
Separação do tecido causa ativação e proliferação maciça de células T γδ do tecido humano
[00206] Para estudar ainda mais as células T yõ do tecido humano,
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105/119 os linfócitos mistos da pele foram transferidos para as cavidades de cultura celular e suplementados com IL-2, a fim de manter a viabilidade ao longo do tempo. Curiosamente, por separação das células estremais e epiteliais presentes na cultura organotípica, as células T Võ1 mostraram exclusivamente sinais de ativação e proliferação sem nenhum estímulo adicional. Dentro de 7 dias, as células T Võ1+ e γδ DN regularam de maneira única e maciça o fator nuclear Ki-67 e aumentaram a expressão superficial do receptor de IL-2 a (CD25; FIGS. 3B e 4B). Surpreendentemente, ao longo de três semanas, e apenas na presença de IL-2, as células T Võ1+ e yõ DN derivadas de tecido superaram todos os outros subconjuntos de células T, de modo a representar até 65 % de todos os linfócitos da pele, aumentando em número médio de 127,18 vezes, enquanto as células Τ αβ se multiplicaram apenas 5,21 vezes (p - 0,0124), conforme medido pelos números absolutos de células (FIG. 3A). A MFI do fator nuclear associado ao ciclismo celular KI-67 aumentou de 2.664,5 (± 1, 876,1) para 8.457,7 (± 4.574,2) em 14 dias nas células T Võ1+ e yõ DN, enquanto nas células Τ αβ a MFI diminuiu de 592,8 (± 390,5) a 284,7 (± 140,1) no mesmo período (FIG. 3C). Esse fenômeno de crescimento seletivo de células Τ yõ residentes na pele podería ser ainda mais suportado usando IL15 recombinante adicional, o que aumentou a viabilidade e o número total de linfócitos.
Células Τ νδ da pele são ativamente suprimidas por fibroblastos de maneira dependente do contato
[00207] A impressionante expansão das células T Võ1+ e γδ DN descritas acima nunca ocorreu em sistemas de cultura organotípica nos quais houve extenso crescimento de fibroblastos. Os fibroblastos autólogos foram cultivados a fim de testar diretamente se sua cocultura com células T Võ1+ e γδ DN inibiría a expansão da célula T. Após uma cultura de três semanas, os linfócitos da pele misturados foram
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106/119 semeados em cavidades vazios ou que continham uma monocamada confluente previamente estabelecida de fibroblastos e, em cada caso, suplementaram o meio com IL-2 exógena para sustentar o crescimento de células T. Além disso, transcavidades foram usados para impedir que as células T entrem em contato direto com os fibroblastos dentro das mesmas cavidades, permitindo que eles sejam influenciados por fatores solúveis secretados pelos fibroblastos. Em 14 dias de cocultura, as células T VõT e yõ DN começaram a proliferar em cavidades nos quais não havia fibroblastos e naqueles em que as células T foram impedidas de contatar diretamente os fibroblastos. Como antes, a proliferação de células T αβ era baixa em todas as condições. Quando as células T foram permitidas contato direto com fibroblastos, a taxa de crescimento ao longo de duas semanas de células T Võ1+ e yõ DN foi consideravelmente reduzida, de 22,6 (± 8,07) vezes em cavidades sem contato com fibroblastos para 3,3 (± 0,17) vezes (FIG. 4A). Essa inibição mediada por contato foi ainda confirmada pela ausência de regulação positiva de CD25, Ki-67 e pelo fator de transcrição T~bet nas células T Võ1 ao longo de 7 dias, em comparação com os linfócitos cultivados sozinhos (FIG. 4B). Alguma forma de controle mediado por tecido do sistema imunológico parece ser fundamental para manter a homeostasia tecidual, pois sem isso havería o potencial de inflamação persistente. A regulação supressora de células T Võ1+ e yõ DN por fibroblastos estromais parece ser um exemplo desse controle.
[00208] Em suma, o fenótipo das células T Võ1+ e yõ DN residentes na pele e seu potencial funcional impressionante refletem as células T pré-ativadas que são normalmente controladas pelos fibroblastos dérmicos vizinhos por meio de um mecanismo dependente de contato. A inativação desse mecanismo liberando as células T do contato com os fibroblastos permite seletivamente a expansão das células T Võ1+ e yõ DN, enquanto outras células T na pele nâo são afetadas.
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Liberação da inibição mediada por contato solicita uma resposta citotóxica de citocina influenciada por TH1 citotóxica pelas células T da pele Vd1
[00209] Os linfócitos mistos derivados da pele foram expandidos por 14 dias, e a classificação celular associada à fluorescência foi usada para remover células Τ αβ das células T yõ, permitindo purezas de até 90 %. Essas células altamente enriquecidas foram depositadas em cavidades de cultura de células em concentrações de 150.000 células/cavidade em meio RPMI contendo 10 % de FCS. Os sobrenadantes foram coletados 24 horas depois e avaliados quanto a uma ampla gama de citocinas efetoras, utilizando uma matriz baseada em LUMINEX®. De maneira totalmente inesperada, as células T yõ em expansão (provocadas apenas pela separação dos fibroblastos) produziram espontaneamente grandes quantidades de citocinas associadas ao TH1, como IFN-y (12.383,46 ± 16.618,90 pg/ml), GM-CSF (4,3 6,73 ± 4.534,96 pg/ml), e as quimiocinas pró-inflamatórias CCL4 (14.877,34 ± 10.935,64 pg/ml) e CCL3 (1.303,07 ± 757,23 pg/ml; FIG. 5A).
[00210] Além disso, as células produziram grandes quantidades de IL-13 espontânea, associadas a respostas atópicas, durante a expansão e em contraste com as células T yõ ativadas por TCR, derivadas da pele, isoladas recentemente na pele. Outras citocinas, como a ILHA, foram produzidas em níveis muito mais baixos ou absolutamente nada (FIG. 8). Os altos potenciais efetores das células podem ser aumentados ainda mais após a estimulação com MICA recombinante (ligante NKG2D), anti-CD3 ou PMA/ionomicina. Para avaliar o potencial citotóxico de células T yõ expandidas contra células alvo malignas, usamos linhagens celulares transformadas estabelecidas em experimentos de cocultura de 24 horas. As células T Võ1+ e yõ DN mostraram uma atividade citotóxica muito alta em relação às células Hela (colo do útero) e Caco2 (cólon), de uma maneira dependente da dose su
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108/119 perior às células T αβ de tecido convencionais (FIG. 5B).
[00211] Além disso, a citotoxicldade mediada por células T yõ pode ser fortemente inibida através do bloqueio do receptor NKG2D usando anticorpos monoclonais solúveis, indicando que este receptor está pelo menos parcialmente envolvido na vigilância de tumores por células T yõ derivadas da pele humana reprimidas. O potencial citotóxico dessas células foi ainda confirmado usando outros alvos: HCT1954 (carcinoma da mama), MDAMB231 (carcinoma da mama) e HCT1 16 (cólon) (FIG. 9).
[00212] As células T yõ residentes em tecido não hematopoético produzidas pelo método da invenção podem ainda ser distinguidas de outras células T yõ derivadas de sangue, na medida em que respondem ao ligante NKG2D (MICA), que está fortemente associado à malignidade, na ausência de qualquer ligante estimulador do receptor de células T, por exemplo, pelo aumento da produção de TNFa, IFNy e CD107a (FIG. 2 e FIG. 10). Eles também executam uma resposta de células T citotóxicas sem sofrer qualquer ativação farmacológica ou mediada por ligantes exógenos do receptor de células T e, portanto, são citotóxicos na ausência de estimulação (FIG. 3 e FIG. 5). Isto significa que, comparadas com outras células T yõ, com células T αβ ou com células NK, as células T yõ não hematopoéticas residentes no tecido produzidas pelo método da invenção são únicas em sua capacidade de responder e proliferar na ausência de adição de quaisquer agentes exógenos que ativam a sinalização do receptor de células T (FIG. 3). As células T yõ não residentes em tecido não hematopoético produzidas pelo método da invenção também coraram positivas para CD69 e PD-1, careciam de expressão de CD28 e expressavam apenas baixos níveis de CD25 (ver FIG. 1 D). Esta combinação de marcadores não é expressa por células T yõ derivadas do sangue. Além disso, eles mostraram maior expressão de receptores de retomo ao tecido, como CCR4 e CCR8, em comparação com células T yõ Vd2 expandidas de
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109/119 rivadas de sangue (FIG. 7B).
Células T νδ residentes em tecidos no intestino humano
[00213] Também foi identificada uma população derivada do cólon humano de uma população residente em tecido não hematopoético de células T γδ que expressam um receptor de célula T VÕ1 (FIG. 6). Em três doadores, essas células foram expandidas usando os mesmos métodos utilizados para células da pele, ao longo de um período de 4 a 5 semanas. Durante a expansão, as células T Võ1+ e yõ DN derivadas do cólon mostraram um padrão semelhante de regulação positiva de Ki-67 após seu isolamento da cultura de células organotípicas ricas em fibroblastos. Da mesma forma, as células T Võ1+ e γδ DN residentes no cólon foram fortemente estimuladas pelo fornecimento de ligantes para o receptor NKG2D. As células T yõ derivadas do sangue estão bem equipadas para executar citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos via expressão de CD 16, provando citotoxicidade aumentada direcionada contra um linfoma da linhagem B CD20-positivo quando combinado com rituximabe. Da mesma forma, a leucemia linfocítica crônica (LLC) e as células de câncer de mama positivas para HER2 podem ser mortas com mais eficácia quando direcionadas com anticorpos monoclonais. A fim de avaliar o potencial das células T Õ1 derivadas da pele para atingir células alvo opsonizadas por anticorpos, foram quantificados os níveis de expressão dos três receptores Fc associados a lgG1, CD16, CD32 e CD64. As células T Võ1 derivadas da pele expressam níveis menores do receptor Fc CD16, mas mostram bons níveis de expressão para o receptor CD64 de IgG de alta afinidade (FIG. 11). Portanto, as células T Võ1 derivadas de tecido podem estar bem equipadas para serem usadas como adjuvantes de terapias de anticorpos monoclonais, como terapias CD20 ou Her2, por orientação do anticorpo para sítios de malignidades e metástases, reconhecendo células tumorais opsonizadas e matando alvos via ADCC.
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Exemplo 4. Otimização de condições de expansão de células T yõ residentes em tecido não hematopoético
Expansão de células T νδ derivadas da pele
[00214] Os linfócitos mistos foram colhidos após três a quatro semanas de cultura da estrutura, lavados em PBS, centrifugados e ressuspensos em meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640; Life Technologies) com soro bovino fetal filtrado a 10 %, inativado pelo calor (Life Technologies), L-glutamina (292 pg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 g/ml; Life Technologies), ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2etanossulfônico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos não essenciais de meios essenciais mínimos (MEM) (1X; Life Technologies) e 50 μΜ de 2-mercaptoetanol (Life Technologies) a uma concentração de 1 x 106 células/ml. A população inicial de células Võ1+ era de 1,12 % de linfócitos. As células foram semeadas em 2 x 105 células/cavidade em placas de fundo plano de 96 cavidades (Corning) ou em 2 x 106 células/cavidade em placas de 24 cavidades (Corning) para expansão e suplementadas com fatores conforme indicado nas concentrações fornecidas na Tabela 2.
Tabela 2. Concentrações de cada fator incluído nas culturas de expansão
Fator Concentração
IL-Ιβ 10 ng/ml
IL-2 100 U/mL
IL-4 5 ng/ml
IL-6 10 ng/ml
IL-7 25 ng/ml
IL-8 5 ng/ml
IL-9 10 ng/ml
IL-12 2,5 ng/ml
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Fator Concentração
IL-15 10 ng/ml
IL-18 50 ng/ml
IL-21 10 ng/ml
IL-23 10 ng/ml
IL-33 500 ng/ml
SDF1a 10 ng/ml
IGF-1 100 ng/ml
[00215] As células foram monitoradas diariamente por microscopia e fornecidas com meios frescos e citocinas três vezes por semana. Após confluência total e agregação celular, as células foram divididas 1: 1 em cavidades e placas adicionais, conforme necessário. Após 21 dias, as células foram colhidas usando ACCUTASE® (eBioscience), contadas e analisadas por citometria de fluxo. FIG. 17A e FIG. 17B mostram gráficos representativos de citometria de fluxo antes e após a expansão. A Tabela 3 mostra os valores de expansão de dobras correspondentes à FIG. 17C em adição à expressão relativa de CD27 e TIGIT nas células expandidas de cada grupo de tratamento. As expansões finais de dobras Võ1 foram calculadas usando números totais Võ1 pré e pós-expansão (% de células CD3+ pan yõ+ Võ1+ + 100) x (número total de células).
Tabela 3. Expansão de células T Võ1 residentes na pele na presença de vários fatores.
Fator de Expansão (IL-2 + IL-15) + Expansão de V61 normalizado para IL-2 + IL-15 CD27 MH sobre V61 normalizado para IL-2 +IL-15 TIGIT MFI sobre V61 normalizado para IL-2 + IL-15
IL-4 1,5 ±0,5 1,4 + 0,5 NT
IL-6 1,9 ±0,3 0,9 ±0,4 1,0 ±0,1
IL-7 1,6 ±0,3 0,5 ±0,7 1,1 ±0,2
IL-8 1,6 ±0,2 1,0 ±0,3 NT
IL-21 2,9 + 1,6 2,8 ±0,8 NT
IL-23 1,3 ±0,5 0,7 + 0,5 NT
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112/119
Fator de Expansão (iL-2 + IL-15) + Expansão de V51 normalizado para IL-2 + IL-15 CD27 MFI sobre V51 normalizado para IL-2 +IL-15 TIGIT MFI sobre V51 normalizado para IL-2 + IL-15
SDF-1 3,9 ± 1,9 0,9 ±0,4 NT
IL-4 + IL-21 7,4 ±5,0 7,3 ±2,5 0,4 ±0,1
IL1 b 3,0 ± 1,4 1,0 + 0,4 1,1 +0,3
IL-12 6,8 ±4,3 0,7 + 0,8 NT
IL-18 3,3 ±1,0 0,8 ±0,5 0,9 ±0,2
IL-33 2,5 ± 1,3 1,1 ±0,4 0,9 ±0,2
IL-33 + IL-4 + IL-21 2,0 + 1,3 0,7 ±3,5 0,4 ±0,2
IGF-1 1,1 ±0,1 0,9 + 0,1 1,2 + 0,1
IL-9 0,9 ±0,4 1,2 ±0,0 1,3 ±0,2
IL-9 + IL-4 + IL-21 1,8 ± 1,3 7,4 ±3,9 0,3 ±0,1
IL-4 + IL-21 + 1% HPL 5,3 ±0,5 5,4± 1,0 0,3 + 0,1
IL-4 + IL-21 + 5% HPL 4,7 ±0,9 4,8 + 2,9 0,4 + 0,1
[00216] Em comparação com a expansão apenas na IL-2 e IL-15, a adição de outros fatores aumentou a expansão das células T VÕ1, como mostrado na FIG. 7C. Dado o alto rendimento de células T Võ1 em resposta a IL-2, IL-15, IL-4 e IL-21, as combinações desses fatores foram mais investigadas, como mostrado na FIG. 17D-17H.
[00217] Os fenótipos inicial e final de cada população de células T Võ1+, incluindo a expressão de CD27 e TIGIT, foram determinados usando a intensidade média de fluorescência (MFI), e as amostras dentro de cada grupo foram calculadas pela média da IMF mediana. A expressão de CD27 e TIGIT por células T Võ1+ em cada condição de expansão é mostrada na Tabela 4.
Tabela 4. Fenótipo de células T Võ1 residentes na pele expandidas na presença de vários fatores.
Fator de Expansão CD27 MFI TIGIT MFI
IL-2 113 ± 5 7919± 179
IL-2, IL-15 226 ± 33 4788 ± 679
IL-2, IL-15, IL-6 140 ±91 6663 ± 767
IL-2, IL-15, IL-7 128 ±115 6083 ±1813
IL-1, IL-15, IL-4, IL-21 1284±1048 1721 ±308
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Fator de Expansão CD27 MFI TIGIT MFI
IL-2, IL-15, Ιί1β -136 ±3.5 9453 ± 390
IL-2, IL-15, IL-18 121 ±75 4396 ± 2782
IL-2, IL-15, IL-9 260 ± 21 5247 ± 2333
IL-2, IL-15, IGF-1 193 ±94 6584 ±1127
IL-2, IL-15, IL-4, IL-21, IL-9 790 ± 61 1389 ±803
IL-2, IL-15, IL-4, IL-21, 1% HPL 990 ± 258 1203 ±222
IL-2, IL-15, IL-4, IL-21,5% HPL 421 ± 76 1045 ±798
[00218] Em relação a IL-2 e IL-15 isoladamente, a adição de outros fatores aumentou a expressão de CD27, medida pela intensidade média de fluorescência, como mostrado na FIG. 18A. De importância, a adição de IL-4 e IL-21 elevou a CD27 de MFI para cerca de 8 vezes em relação à IL-2 e IL-15 isoladamente. Novamente, a combinação de quatro vias de IL-2, IL-15, IL-4 e IL-21 produziu a expressão mais alta de CD27, em relação a outras combinações dos mesmos (FIG. 18B e 18D). De notar, a baixa expressão de CD27 nas células T está frequentemente associada a um fenótipo esgotado, terminalmente diferenciado, com pouco potencial para proliferação a longo prazo.
[00219] Uma tendência diferente foi observada em relação à expressão de TIGIT pelas células T Võ1+ expandidas (FIG. 19). Em particular, a expressão de TIGIT diminuiu em resposta a IL-4 e IL-21, em conjunto com IL-2 e IL-5. Para explorar ainda mais essa tendência, a expressão de TIGIT foi plotada em função da expressão de CD27 (FIG. 20). Foi observada correlação negativa entre TIGIT e CD27. A alta expressão de TIGIT pode tomar as células T suscetíveis à inibição por um microambiente tumoral, onde a expressão de seu receptor de poliovírus ligante (PVR; CD155) pode ser alta.
Exemplo 5. Cultura de quatro citocinas é suficiente para substituir o soro da cultura de células
[00220] Atualmente, a adição de soro e plasma derivados de san
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114/119 gue complexos ao meio durante a fabricação de células T derivadas de tecidos ou residentes em tumores é comum. No entanto, o uso desses soros ou componentes do plasma pode ser indesejável devido à variação inerente de batelada à batelada desses componentes, ao alto custo desses componentes e à oferta limitada, dada a alta demanda na indústria de medicamentos de terapia avançada (ATMP), e o aumento do risco de contaminação cruzada de agentes adventícios desses componentes. Consequentemente, após a identificação bemsucedida de citocinas que suportam a expansão e o enriquecimento das células T yõ desejadas, conforme descrito aqui, foi testado se o uso de tais citocinas podería negar qualquer exigência de componentes séricos/plasmátícos complexos normalmente empregados para expandir células T yõ derivadas de tecido. Para testar ainda mais, as células imunes foram retiradas de uma amostra de pele e testadas para determinar se ainda eram necessários plasmas/soros para apoiar a expansão e o enriquecimento de células T yõ +/- soro. Consequentemente, as células egressadas foram, então, colhidas e semeadas em dois meios no dia 0. O primeiro meio compreendeu um meio isento de componentes derivados de animais (ADCF) (TexMACS, Miltenyi) com 10 % de soro e citocinas derivados de humanos. O segundo meio compreendia a mesma mistura de meio ADCF/citocina, um suplemento definido padrão (CTS™, contendo albumina sérica humana purificada, insulina recombinante e transferrina), mas sem adição de soro. Os resultados deste estudo são mostrados na FIG. 21. Surpreendentemente, foram observados enriquecimentos equivalentes e expansões dobradas equivalentes com ou sem soro humano. Isto mostra que é possível expandir e enriquecer células T yõ derivadas de tecido sem quaisquer componentes derivados de animais ou soro humano.
[00221 ] Em seguida, esta abordagem foi avaliada quanto à expansão preferencial de células T yõ a partir de populações de linfócitos
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115/119 misturadas colhidas em culturas organotípicas padrão. Se possível, tal expansão preferencial seria altamente desejável, particularmente se os protocolos resultassem em uma população final de linfócitos expandidos compreendendo > 50 % de células T yõ. De fato, até o momento, os protocolos de enriquecimento convencionais exigem o uso de tecnologias de depleção ou enriquecimento, como tecnologias de imunodepleção magnética (por exemplo, de Miltenyi ou Dynal) ou tecnologias de classificação por citometria de fluxo (por exemplo, da BD Biosciences) para separar fisicamente uma minoria de células T yõ ou fisicamente esgotar a maioria das células αβ. Em vez disso, o presente estudo avaliou se os métodos atuais poderíam enriquecer as células T yõ presentes em qualquer população inicial de linfócitos mistos sem a necessidade de tais protocolos de separação ou depleção física. Surpreendentemente, e devido à seletividade dos protocolos para a expansão da célula yõ acima e acima de outros tipos de células também presentes na população inicial, esse enriquecimento foi alcançado usando esses métodos de expansão. Isso resultou em uma população de células T yõ mais pura e mais enriquecida, representando mais de 50 % de todas as células presentes na cultura. Este enriquecimento foi alcançado na presença e/ou ausência de soro e é ainda mostrado na FIG. 21 e FIGS. 22A-22D em que as células T yõ foram expandidas > 100 vezes, aumentando a pureza das células T yõ de < 50 % a > 50 % em todas as ocasiões para esta amostra de tecido.
Métodos de Isolamento e Expansão
[00222] Os linfócitos mistos foram colhidos do tecido após três semanas de cultura da estrutura usando a abordagem equivalente, como descrito anteriormente pelo protocolo Clark, bem como no Exemplo 2. O perfil resultante das células colhidas foi semelhante ao descrito no Exemplo 3. Estes colhidos as células foram lavadas em HBSS* HEPES, centrifugadas e ressuspensas em meio TexMACS (Miltenyi)
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116/119 contendo (i) soro AB humano a 10 % (Life Science Production), além de IL-2 (100 Ul/L), IL4 (Biolegend, 5 ng/ml), IL-15 (Biolegend, 20 ng/ml) e IL-21 (Biolegend, 5 ng/ml) ou (ii) 5 % de CTS ™ (Thermo Fisher Scientific) além de IL-2 (100 Ul/L), IL-4 (Biolegend, 5 ng/ml), IL-15 (Biolegend, 20 ng/ml) e IL-21 (Biolegend, 5 ng/ml). Os meios contendo soro e sem soro também continham antibióticos pen/estreptococos (100 unidades/ml, 100 pg/ml, respectivamente, Life Technologies). As células foram então semeadas a 2 milhões de células/cavidade em placas de 24 cavidades (Corning). Uma vez que as células se tomaram confluentes, elas foram expandidas/passadas dividindo-se entre 1-em-2 a 1-em-4 em novas cavidades contendo o mesmo meio. No dia 21, as células foram colhidas com a ajuda da solução de descolamento de células ACCUTASE® (Thermo-Fisher) e analisadas por citometria de fluxo para determinar os perfis finais de células, como apresentado na FIG. 21 e FIGS. 22A-22D.
Exemplo 6. Relevância funcional da expressão TIGIT
[00223] TIGIT foi expresso constitutivamente em células Võ1 residentes no intestino, como mostrado na FIG. 23. Os dados foram gerados usando células Võ1 isoladas do intestino por digestão convencional de tecido. A expressão constitutiva de TIGIT da célula T γδ residente no tecido não está relacionada apenas às células Võ1 derivadas da pele e a expressão TIGIT não era um artefato do protocolo Clark (procedimento de isolamento baseado em grade).
[00224] Além disso, em células incubadas apenas com IL-2 e IL-15, o receptor de poliovírus (PVR) inibiu especificamente a sinalização de TCR, conforme medido pela expressão de IFNy (FIG. 24A) e TNFa (FIG. 24B). Em células incubadas com IL-2, IL-15, IL-4 e IL-21, o efeito inibidor de PVR foi perdido em células VÕ1+/VÕ3+ negativas a TIGIT, medidas como IFNy (FIG. 25A) ou TNFa (FIG. 25B), indicando que a negatividade de TIGIT resultante da mistura de quatro citocinas impe
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117/119 de preferencialmente a inibição da ativação mediada por TIGIT de células T VÕ1+/V63+.
Exemplo 7. Substituição de IL-9 por IL-2 em culturas de expansão [00225] Os tecidos da pele de três doadores (TS052, TS056 e SK073) foram colocados em grades de 9 mm e cultivados por três semanas em meio suplementado com IL-2 e IL-15. Os linfócitos isolados foram incubados em meio suplementado com IL-2, IL-4- IL-5 e IL-21 (barras esquerdas FIGS. 26A e 26B) ou IL-4, IL-9, IL-15 e IL-21 (Figuras 26A e 26B barras direitas). O rendimento final de células T γδ/grade (Figura 26A) e células Võ1/grade (Figura 26B) foi calculado após três semanas de expansão.
[00226] Como mostrado nas FIGS. 27A-27C, IL-9 foi suficiente para substituir a função da IL-2 na expansão das células Τ γδ da pele, conforme medido por dobra (FIG. 27A), % de células T yõTCR+ (FIG. 27B) e % de células T VÕ1+ (FIG. 27C). Os tecidos da pele eram de seis doadores (SK073, SK075, SK077, TS052, TS053 e TS056). O coquetel de duas citocinas incluía IL-2 e IL-15, e o coquetel de quatro citocinas incluía IL-2, IL-15, IL-21 e IL-4.
[00227] Como mostrado nas FIGS. 28A e 28B, a IL-9 foi suficiente para substituir a função da IL-2 na expansão das células Τ γδ da pele, medida pela intensidade média de fluorescência (MFI) da expressão de CD27 nas células T VÕ1* (FIG. 28A) e na MFI normalizada de expressão de CD27 em células T Võ1+ (FIG. 28B). Não foi observada diferença na expressão de CD27 em comparação com as condições de cultura padrão. Os tecidos da pele eram de quatro doadores (SK073, TS052, TS053 e TS056). O coquetel de duas citocinas consistiu em IL-2 e IL-15 e o coquetel de quatro citocinas consistiu em IL-2, IL-15, IL-21 e IL-4.
Expansão de células Τ γδ derivadas da pele
[00228] Os linfócitos mistos foram colhidos após três semanas de
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118/119 cultura da estrutura, lavados em solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugados e ressuspensos em RPMI-1640 com 10 % de FBS inativado pelo calor (Life Technologies), L~glutamina (292 pg/ml; Life Technologies), penicilina (100 unidades/ml; Life Technologies), estreptomicina (100 pg/ml; Life Technologies), ácido Ν-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanossulfônico (HEPES; 0,01 M; Life Technologies), piruvato de sódio (1 mM; Life Technologies), aminoácidos não essenciais de meios essenciais mínimos (MEM) (1X; Life Technologies) e 2-mercaptoetanol 50 mM (Life Technologies) a uma concentração de 1 x 106 células/ml. As células foram semeadas a 2 x 106 células/cavidade em placas de 24 cavidades (Corning) para expansão com meio suplementado com citocinas, conforme indicado nas seguintes concentrações finais: IL-2: 100 U/mL, IL-4: 5 ng/mL, IL-9: 10 ng/mL, IL-15: 20 ng/mL e IL-21: 10 ng/mL.
[00229] As células foram monitoradas diariamente por microscopia e fornecidas com meios frescos e citocinas três vezes por semana, substituindo 1 mL de meio de cultura por 1 mL de meio de cultura fresco contendo citocinas com força dupla, ou seja, IL-2: 200 U/mL, IL -4: 10 ng/mL, IL-9: 20 ng/mL, IL-15: 40 ng/mL e IL-21: 20 ng/mL.
[00230] Após confluência total e agregação de células, as células foram divididas 1:1 em cavidades e placas adicionais, conforme necessário. Após 21 dias, as células foram colhidas usando ACCUTASE® (eBioscience), contadas e analisadas por citometria de fluxo. Os números finais de células Τ yõ e células Võ1 foram calculados usando números pré e pós-expansão e os dados mostram o rendimento final de células por grade após a expansão.
Outras Modalidades
[00231] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesta especificação são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação independente ou pedido de
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119/119 patente fosse específico e individualmente indicado para ser incorporado por referência.
[00232] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, entender-se-á que é capaz de modificações adicionais e esta aplicação destina-se a abranger quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e a inclusão de tais desvios da presente descrição que se enquadram na prática conhecida ou costumeira na técnica à qual a invenção se refere e pode ser aplicada aos recursos essenciais aqui mencionados anteriormente e segue no escopo das reivindicações.
[00233] Outras modalidades estão dentro das reivindicações.

Claims (77)

1. Método de expandir as células T yõ, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(i) fornecer uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células T yõ na presença de:
(a) IL-2 ou IL-9;
(b) IL-15; e
c)IL-21 por pelo menos 5 dias em quantidades efetivas para produzir uma população expandida de células T yõ.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende ainda cultivar as células T yõ na presença de IL-4.
3. Método de expandir as células T yõ, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
(I) fornecer uma população de células T yõ obtidas de um tecido não hematopoético; e (ii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-21, fator derivado de células estromais (SDF), IL-β, IL-12, IL-18 e IL-33 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende cultivar as células T yõ na ausência de agonistas exógenos da via do TCR.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende cultivar as células T yõ em meio sem soro.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda,
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2/12 após a etapa (i), separar as células T yõ das células não hematopoéticas para produzir uma população separada de células Tyõ e a etapa (ii) compreende:
(a) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais;
(b) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células tumorais; e/ou (c) cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células alimentadoras.
7. Método de expandir as células T yõ, o método caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas de:
(i) fornecer um tecido não hematopoético, o tecido compreendendo células não hematopoéticas e células T yõ;
(ii) separar células T yõ de células não hematopoéticas para obter uma população separada de células T yõ; e (iii) cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-15 e um fator selecionado do grupo que consiste em IL-21, SDF, IL-1 β, IL-12, IL-18 e IL -33 por pelo menos 5 dias para produzir uma população expandida de células T yõ.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o tecido não hematopoético foi obtido de um indivíduo humano ou de um animal não humano.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende cultivar as células T yõ na presença de IL-2, IL-15 e IL-21.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende cultivar as células T yõ em meio sem soro.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende
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3/12 cultivar as células T γδ na ausência do contato substancial de células estromais com as células T yõ.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende cultivar as células T yõ na ausência de agonistas exógenos da via do TCR.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de separar as células T yõ das células não hematopoéticas compreende cultivar as células T yõ e as células não hematopoéticas em uma estrutura sintética configurada para facilitar a saída celular do tecido não hematopoético.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, caracterizado pelo fato de que a etapa de separação das células T yõ das células não hematopoéticas compreende cultivar as células T yõ e as células não hematopoéticas na presença de IL-2 e/ou IL-15.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 14, caracterizado pelo fato de que uma população separada de linfócitos compreende a população separada de células T yõ e a população separada de células T yõ compreende uma população separada de células T Võ1.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que 1-10% da população separada de linfócitos são células T yõ antes da expansão.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que 1 a 10% da população separada de linfócitos são células T Võ1 antes da expansão.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80% da população separada de células T yõ são células T Võ1 antes da expansão.
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4/12
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 18, caracterizado pelo fato de que menos de 10% da população separada de células Τ γδ são células T Võ2 antes da expansão.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 19, caracterizado pelo fato de que as células Τ αβ e/ou células NK são removidas da população separada de células Τ γδ.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 20, caracterizado pelo fato de que, antes da expansão, a população separada de células Τ yõ compreende pelo menos 10% de células CCR3+, pelo menos 10% de células CCR4+, pelo menos 10% de células CCR7+, pelo menos 10% de células CCR8+ ou pelo menos 10% de células CD103*.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 21, caracterizado pelo fato de que, antes da expansão, a população separada de células T yõ compreende uma maior frequência de células CCR3+, células CCR4+, células CCR7+ e/ou células CCR8+, em relação a uma população de referência de células T Võ2 residentes no sangue.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato de que a população separada de células T Võ1 compreende uma maior frequência de células NKG2D+, células CD56*, células CD69+ e/ou células TIM31· em relação a uma população de referência de células Võ1 residentes no sangue.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que, dentro de 14 dias de cultura, a população expandida de células T yõ compreende pelo menos 20 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que, dentro de 21 dias da cultu-
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5/12 ra, a população expandida de células T yõ compreende pelo menos 50 vezes o número de células T yõ em relação à população separada de células T yõ antes da expansão.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ compreende uma população expandida de células T Võ1.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que, dentro de 14 dias da cultura, a população expandida de células T Võ1 compreende pelo menos 20 vezes o número de células T Võ1 em relação à população separada de células T Võ1 antes da expansão.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que, dentro de 21 dias da cultura, a população expandida de células T Võ1 compreende pelo menos 50 vezes o número de células T Võ1 em relação à população separada de células T Võ1 antes da expansão.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ expressa CD27.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana maior de CD27 do que a população separada de células T yõ.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana de CD27 que é pelo menos duas vezes em relação à população separada de células T yõ.
32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma maior frequência de células CD27+ em relação à população separada
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6/12 de células Τ γδ.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células Τ yõ tem pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ em relação à população separada de células T yõ.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 expressa CD27.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão mediana maior de CD27 do que a população separada de células T VÕ1.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão mediana de CD27 que é pelo menos duas vezes em relação à da população separada de células T Võ1.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 36, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma frequência maior de células CD27+ em relação à população separada de células T Võ1.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem pelo menos uma frequência 5% maior de células CD27+ em relação à da população separada de células T Võ1.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana mais baixa de TIGIT do que a população separada de células T yõ.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma
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7/12 expressão mediana de TIGIT que é pelo menos 50% menor que a da população separada de células T γδ.
41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T γδ tem uma frequência inferior de células TIGIT+ do que a população separada de células T γδ.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T γδ tem pelo menos uma frequência 20% menor de células TIGIT* do que a população separada de células T γδ.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28 ou 34 a 38, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão mediana mais baixa de TIGIT do que a população separada de células T Võ1.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão mediana de TIGIT que é pelo menos 50% menor que a da população separada de células T Võ1.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28 ou 34 a 38, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma frequência inferior de células TlGIT* do que a população separada de células T Võ1.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem pelo menos uma frequência 20% mais baixa de células TIGIT* do que a população separada de células T Võ1.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana maior de um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215,
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CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células Τ yõ,
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma maior frequência de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T yõ.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana mais baixa de um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T yõ.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma frequência inferior de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T yõ.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, 34 a 38, 43 ou 45, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T Võ1 tem uma expressão mediana maior de um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T Võ1.
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52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, 33 a 38, 43, 45 ou 51, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma maior frequência de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo que consiste em CD124, CD215, CD360, CTLA4, CD1b, BTLA, CD39, CD45RA, Ligante de Fas, CD25, ICAM-1, CD31, KLRG1, CD30 e CD2, em relação à população separada de células T yõ.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, 34 a 38, 43, 45, 51 ou 52, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma expressão mediana mais baixa de um ou mais marcadores selecionados do grupo consistindo em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T yõ.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, 34 a 38, 43, 45 ou 51 a 53, caracterizado pelo fato de que a população expandida de células T yõ tem uma frequência inferior de células que expressam um ou mais dos marcadores selecionados do grupo consistindo em NKp44, NKp46, ICAM-2, CD70, CD28, CD103, NKp30, LAG3, CCR4, CD69, PD-1 e CD64, em relação à população separada de células T yõ.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 54, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células estromais.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 55, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células alimentadoras.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica
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10/12 ções 8 a 56, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende cultivar as células T yõ na ausência do contato substancial de células tumorais.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que o tecido não hematopoético não é tecido tumoral.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que o tecido não hematopoétl· co é a pele.
60. Célula T yõ expandida, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 59.
61. População isolada de células T γδ, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das células T yõ da população isolada expressam CD27 e não expressam substancialmente TIGIT.
62. População isolada de células T yõ, de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50% das células T yõ da população isolada expressam Võ1.
63. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula T yõ expandida como definida na reivindicação 60 ou a população isolada de células T yõ como definida na reivindicação 61 ou 62.
64. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de câncer ou infecção em um indivíduo.
65. Uso da composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou infecção em um indivíduo.
66. Método de tratamento de um indivíduo por terapia de
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11/12 célula T adotiva, o método caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas obtidas pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, a célula T yõ expandida como definida na reivindicação 60, uma população isolada como definida na reivindicação 61 ou 62, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 63, a um indivíduo em necessidade do mesmo.
67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de células T yõ expandidas é menor do que 10 x 1012 células por dose.
68. Método, de acordo com a reivindicação 66 ou 67, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais ao indivíduo em necessidade do mesmo.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é selecionado do grupo que consiste em um agente imunoterapêutico, um agente citotóxico, um agente inibidor do crescimento, um agente de radioterapia, um agente antiangiogênico e combinações dos mesmos.
70. Método, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é administrado simultaneamente com as células T yõ expandidas.
71. Método, de acordo com a reivindicação 68 ou 69, caracterizado pelo fato de que o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é administrado após a administração das células T yõ expandidas.
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 71, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente imunoterapêutico.
73. Método de tratamento de um indivíduo por terapia de
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12/12 célula T adotiva, o método caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica da reivindicação 63 a um indivíduo em necessidade do mesmo do mesmo.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 73, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o humano é um paciente com câncer humano.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o paciente com câncer humano está sendo tratado por um tumor sólido.
77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o humano é um paciente humano sendo tratado por uma infecção viral.
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