RU2727900C2 - Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными т-клетками - Google Patents
Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными т-клетками Download PDFInfo
- Publication number
- RU2727900C2 RU2727900C2 RU2018124640A RU2018124640A RU2727900C2 RU 2727900 C2 RU2727900 C2 RU 2727900C2 RU 2018124640 A RU2018124640 A RU 2018124640A RU 2018124640 A RU2018124640 A RU 2018124640A RU 2727900 C2 RU2727900 C2 RU 2727900C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- icosl
- cell
- hcmsc
- regulatory
- Prior art date
Links
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 39
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 37
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title description 35
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 125
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 18
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 81
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 28
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 23
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims description 16
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 10
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims description 10
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006292 polyarteritis nodosa Diseases 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000033116 Asbestos intoxication Diseases 0.000 claims description 2
- 206010050245 Autoimmune thrombocytopenia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007465 Giant cell arteritis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002972 Hepatolenticular Degeneration Diseases 0.000 claims description 2
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 claims description 2
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010001 Silicosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 claims description 2
- 206010043781 Thyroiditis chronic Diseases 0.000 claims description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018839 Wilson disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010638 acquired aplastic anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003441 asbestosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 2
- 206010043207 temporal arteritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 claims description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims 3
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 claims 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 claims 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 claims 2
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 claims 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 claims 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 22
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 abstract description 12
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 abstract description 7
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 38
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 38
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 38
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 29
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 28
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 9
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 7
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 6
- KGPGFQWBCSZGEL-ZDUSSCGKSA-N GSK690693 Chemical compound C=12N(CC)C(C=3C(=NON=3)N)=NC2=C(C#CC(C)(C)O)N=CC=1OC[C@H]1CCCNC1 KGPGFQWBCSZGEL-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000046492 human ICOSLG Human genes 0.000 description 4
- 102000014909 interleukin-1 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040006732 interleukin-1 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940126638 Akt inhibitor Drugs 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 101710093458 ICOS ligand Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- PBTPTBMYJPCXRQ-MGMRMFRLSA-N (2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;hexadecanoic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O.CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O PBTPTBMYJPCXRQ-MGMRMFRLSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- SPSPIUSUWPLVKD-UHFFFAOYSA-N 2,3-dibutyl-6-methylphenol Chemical compound CCCCC1=CC=C(C)C(O)=C1CCCC SPSPIUSUWPLVKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MOMKYJPSVWEWPM-UHFFFAOYSA-N 4-(chloromethyl)-2-(4-methylphenyl)-1,3-thiazole Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=NC(CCl)=CS1 MOMKYJPSVWEWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010027654 Allergic conditions Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-DUZGATOHSA-N D-araboascorbic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-DUZGATOHSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001042104 Homo sapiens Inducible T-cell costimulator Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101150016644 ICOSLG gene Proteins 0.000 description 1
- -1 IL -6 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102100021317 Inducible T-cell costimulator Human genes 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101001042093 Mus musculus ICOS ligand Proteins 0.000 description 1
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 239000012162 RNA isolation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229960002242 chlorocresol Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 229940013361 cresol Drugs 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- HRUVKSKSDDVGMC-JDYVBSGKSA-L disodium;(2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].OS([O-])(=O)=O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] HRUVKSKSDDVGMC-JDYVBSGKSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000010350 erythorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004318 erythorbic acid Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001617 ethyl hydroxybenzoate Drugs 0.000 description 1
- 235000010228 ethyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004403 ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N ethylparaben Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000001200 fecal consistency Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- FOYKKGHVWRFIBD-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 FOYKKGHVWRFIBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940026239 isoascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 229930004090 phosphatidylinositide Natural products 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000019983 sodium metaphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000007916 tablet composition Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к индуцированию дифференцировки CD4Т-клетки в регуляторную Т-клетку и пролиферации регуляторной Т-клетки, индуцированной дифференцировкой, а также применениям мезенхимальной стволовой клетки, гиперэкспрессирующей ICOSL (лиганд индуцируемого Т-клеточного ко-стимулятора). Способ включает обработку CD4Т-клетки in vitro мезенхимальной стволовой клеткой, гиперэкспрессирующей ICOSL. Мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL, применяют для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания и индуцирования дифференцировки CD4Т-клетки в регуляторную Т-клетку и пролиферации регуляторной Т-клетки, индуцированной дифференцировкой. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 21 ил., 15 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции и способу индуцирования дифференцировки CD4+ Т-клеток в регуляторные Т-клетки посредством лигандов индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или посредством мезенхимальных стволовых клеток, гиперэкспрессирующих ICOSL, для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками. Уровень техники
Одной из самых важных характеристик всех здоровых индивидуумов является их способность не реагировать в ущерб собственному организму на антигенные вещества, присутствующие в организме, и в тоже время способность таких индивидуумов распознавать, реагировать и уничтожать многие антигены, не являющиеся собственными (аутоантигенами). Отсутствие ответа организма на аутоантигены называют иммунологической неотвечаемостью или толерантностью. Аутотолерантность возникает при удалении лимфоцитов, которые могут содержать специфичные для аутоантигенов рецепторы, или при инактивации аутореактивной функции после воздействия аутоантигенов. В случае, когда затруднительно индуцировать или поддерживать аутотолерантность, возникает иммунный ответ на аутоантиген, и возникающее в результате заболевание называют аутоиммунным заболеванием. Пример аутоиммунных заболеваний включает аллергическое заболевание, которое относится к расстройству, при котором нарушается работа иммунной системы, и вещества, безвредные для большинства людей, вызывают различные симптомы гиперчувствительности только у конкретного человека. Вещества, вызывающие аллергические заболевания, называют аллергенами или антигенами. Аллергии могут вызывать пыльца, антибиотики, лекарственные средства, пыль, пищевые продукты, холодный воздух или солнечный свет. Симптомы аллергического заболевания включают крапивницу, чихание, зуд, ринорею, кашель, поллиноз (сенную лихорадку), покраснение, экзему, сыпь и им подобные симптомы. Обычные аллергические заболевания включают аллергическую астму с такими симптомами, как респираторный стеноз, повышенная концентрация слизистой в легких, одышка и кашель. Кроме того, наблюдается атопический дерматит, конъюнктивит, ринит и язвенный колит.
Исследования важности регуляторных Т-клеток активно проводились в отношении заболеваний, вызванных нарушениями (аномалиями) различных аутоиммунных систем. В начале 1970-х годов Гершон (Gershon) впервые ввел понятие ингибирующих Т-клеток в качестве возможно присутствующих Т-клеток, которые способны контролировать и ингибировать эффекторную функцию обычных Т-клеток (R.K. Gershon and K. Kondo, Immunology, 1970, 18: 723-37). Затем были проведены исследования для выяснения биологических свойств и функции регуляторных Т-клеток во многих областях иммунологии. В частности, в 1995 году Сакагути (Sakaguchi) сообщил о том, что CD25 может действовать в качестве важного фенотипического маркера встречающихся в природе CD4+ регуляторных Т-клеток (S. Sakaguchi et al., J. Immunol., 1995, 155: 1151-1164). Затем проводимые исследования были сосредоточены на роли и важности регуляторных Т-клеток при индукции периферической толерантности к аутоантигенам.
В последние годы заболевания, опосредуемые Т-клетками, были признаны заболеваниями, представляющими собой множественные заболевания иммунной системы. В частности, считается, что Т-клетки вызывают и поддерживают аутоиммунные заболевания. Непрерывная активация или регулярная активация аутореактивных Т-клеток приводит к иммунным ответам на аутоантигены. Аутореактивные Т-клетки привлекают внимание в качестве причины характерного повреждения ткани и разрушения ткани, которые напрямую или опосредованно выявляются при аутоиммунных заболеваниях.
Соответственно, многие терапевтические агенты были предложены для аутоиммунных заболеваний и других заболеваний, опосредованных Т-клетками. Тем не менее, до сих пор требуются другие терапевтические средства. В частности, точный механизм действия Т-клеток необходим для применения их в качестве терапевтического агента.
Между тем, известно, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммунорегуляторной способностью регулировать активацию и дифференцировку иммунных клеток в дополнение к мультипотентности. Известно, что они регулируют Т-клетки, В-клетки, макрофаги, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки и т.д. в различных воспалительных средах и индуцируют регуляторные Т-клетки для ингибирования иммунных ответов. Тем не менее, мало что известно о конкретном механизме регуляции или действия при индукции регуляторных Т-клеток. В этой связи для лечения иммунных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, необходимы исследования конкретных механизмов и эффективных ингредиентов.
Описание
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения исследовали мезенхимальные стволовые клетки и заболевания, опосредованные регуляторными Т-клетками. Авторы настоящего изобретения определили, что лиганд индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) на поверхности мезенхимальных стволовых клеток может индуцировать дифференцировку CD4+ Т-клеток в регуляторные Т-клетки с образованием множества регуляторных Т-клеток, и эффективно излечивать заболевания, опосредованные Т-клетками, что и позволило получить настоящее изобретение.
Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками, которая содержит лиганды индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, а также обеспечение композиции и способа для индуцирования дифференцировки в регуляторные Т-клетки.
Техническое решение
Для достижения описанных выше целей в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, которая содержит лиганд индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL.
Кроме того, в настоящем изобретении предложена композиция для индуцирования дифференцировки и пролиферации CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку, которая содержит лиганд индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ индуцирования дифференцировки и пролиферации CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку, который включает обработку CD4+ Т-клетки in vitro лигандом индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальной стволовой клеткой, гиперэкспрессирующей ICOSL.
Положительные эффекты
В настоящем изобретении указанный лиганд индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или указанная мезенхимальная стволовая клетка, гиперэкспрессирующая ICOSL, индуцирует экспрессию ICOS в регуляторных Т-клетках, индуцируя таким образом дифференцировку регуляторных Т-клеток через механизм PI3K-Akt, а также и эффективное ингибирование пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), так что возможно эффективное предотвращение, лечение или облегчение заболеваний, опосредованных Т-клетками.
Описание чертежей
На ФИГ. 1 показаны результаты проточного цитометрического анализа на определение экспрессии маркера hcMSC методом проточной цитометрии, на которой пунктирная линия обозначает окрашивание гомологичным контрольным антителом, а сплошная линия представляет собой специфичную экспрессию каждого маркера.
На ФИГ. 2 показаны результаты анализа с применением карбоксифлуоресцеина (CFSE) по определению супрессорной активности hcMSC в отношении Т-клеток in vitro (М: hcMSC и Р: окрашенные CFSE РВМС).
На ФИГ. 3 показаны результаты проточного цитометрического анализа по определению дифференцировки CD4+ Т-клеток в регуляторные Т-клетки (Treg) в условиях индуцирования Treg на 2 и 5 день (А), результаты подтверждения воздействия hcMSC через определение экспрессии FoxP3 и CD25 (В), и результаты подтверждения воздействия hcMSC через увеличение числа клеток FoxP3+CD4+CD25+ (С) (*, Р=0,017).
На ФИГ. 4 показаны результаты подтверждения формы CD4+ Т-клеток, полученных совместным культивированием hcMSC с CD4+ Т-клетками, при помощи микроскопа (А), и результаты сравнения изменений уровней экспрессии CD25+ и FoxP3+ в плавающих CD4+ Т-клетках и адгезивных CD4+ Т-клетках (В) (Синий квадрат: плавающие CD4+ Т-клетки и красный квадрат: адгезивные (прикрепленные к hcMSC) CD4+ Т-клетки).
На ФИГ. 5 показаны результаты сравнения изменений уровней экспрессии CD25+ и FoxP3+ в плавающих CD4+ Т-клетках, адгезивных CD4+ Т-клетках, совместно культивированных с hcMSC и культивированных с применением системы трансвел.
На ФИГ. 6 показаны результаты подтверждения изменений экспрессии белка ICOSL путем совместного культивирования hcMSC с CD4+ Т-клетками (А), результаты подтверждения таким образом изменений экспрессии мРНК (В) и результаты подтверждения экспрессии ICOSL при помощи конфокального микроскопа (С) (увеличение: ×200, ×400).
На ФИГ. 7 показаны результаты подтверждения изменений экспрессии белка ICOS в результате совместного культивирования hcMSC с CD4+ Т-клетками (А) и результаты подтверждения таким образом изменений экспрессии FoxP3, CD25 и ICOS в клетках CD4+(В).
На ФИГ. 8А показаны результаты проточного цитометрического анализа по определению изменений экспрессии FoxP3, CD25 и ICOS путем совместного культивирования hcMSC с CD4+ Т-клетками, которые обрабатывают антителом против ICOSL (10 мкг/мл) или контрольным антителом, CD4+ Т-клетками, и подтверждение FoxP3+CD4+CD25+ Т-клеток и FoxP3+CD4+ICOS+ Т-клеток (*Р=0,017 и **Р=0,049).
На ФИГ. 8 В показаны результаты проточного цитометрического анализа по определению образования IL-10 CD4+ Т-клетками путем совместного культивирования hcMSC с CD4+ Т-клетками, которые обрабатывают антителом против ICOSL (10 мкг/мл) или контрольным антителом, CD4+ Т-клетками, и на ФИГ. 8С показаны результаты определения такого образования методом иммуноферментного анализа ELISA (***р=0,03).
На ФИГ. 9 показаны результаты количественной ПЦР в режиме реального времени и проточного цитометрического анализа результатов нокдауна в зависимости от направленного на ген воздействия с применением нацеливающихся на ICOSL кшРНК (shICOSL), (А), и изменения индуцирующего Treg воздействия в зависимости от нокдауна (В) (*Р=0,008 и **Р=0,013).
На ФИГ. 10 показаны результаты количественной ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) (А), вестерн-блоттинга (В) и проточного цитометрического анализа (С) по определению повышения экспрессии ICOSL в клетках hcMSC (hcMSCICOSL), в которые трансдуцировали лентивирусы, экспрессирующие полноразмерный человеческий ICOSL, и в клетках MSC, представляющих собой контроль (hcMSCEmp), в которые трансдуцировали пустые векторы.
На ФИГ. 11 показаны результаты проточной цитометрии и ELISA по определению эффекта повышения индукции Treg в клетках hcMSCICOSL (А) (*Р=0,045 и **Р=0,049) и результаты проточного цитометрического анализа (В) и ELISA (С) по определению эффекта повышения секреции IL-10 клетками Treg (***Р=0,034).
На ФИГ. 12 показаны результаты анализа пролиферации РВМС после того, как популяции CD25+ клеток, выделенные из совместно культивированных hcMSCICOSL или hcMSCEmp, совместно культивировали с CFSE-меченными и активированными РВМС при соотношении 1:5 или 1:10 (Treg:PBMC) в течение 3 дней, которую оценивали по уровню разбавления CFSE в проточном цитометрическом анализаторе.
На ФИГ. 13 показаны результаты проточного цитометрического анализа по определению индуцирующего воздействия обработки rhICOSL на дифференцировку Treg (A), и результаты вестерн-блот-анализа по определению воздействия обработки rhICOSL на фосфорилирование Akt (В).
На ФИГ. 14 показаны результаты подтверждения ингибирующего воздействия на фосфорилирование PI3K-Akt (А) и ингибирующего воздействия на дифференцировку Treg
(B) обработки ингибитором PI3K LY294002 (5 мкМ) и ингибитором Akt GSK690693 (1 мкМ) для подтверждения того, участвует ли путь передачи сигнала PI3K-Akt в опосредованной ICOSL дифференцировке Treg.
На ФИГ. 15 показаны результаты подтверждения различий в экспрессии ICOSL между неклональными MSC (hncMSC) и hcMSC 1-4 с применением ПЦР с обратной транскрипцией и количественной ПЦР в режиме реального времени (А и В) и сравнения их индуцирующей способности в отношении Treg-клетки путем совместного культивирования с РВМС (С) и в условиях индуцирования Treg (D) в реакции смешанных лимфоцитов (MLR).
На ФИГ. 16 показаны результаты подтверждения повышения экспрессии мРНК ICOSL в результате обработки IL-1β, ФНО-α и ЛПС (А), повышения экспрессии мРНК ICOSL в результате обработки IL-1β в динамике (В) и изменения экспрессии IL-1R в результате обработки IL-1β (С).
На ФИГ. 17 показаны результаты подтверждения ICOSL-индуцируемых воздействий клональнных (hcMSC) и неклональных MSC (hncMSC) в результате обработки IL-1β посредством количественной ПЦР в режиме реального времени (А), вестерн-блоттинга (В) и проточной цитометрии (С).
На ФИГ. 18 показаны результаты подтверждения изменений индукции экспрессии ICOSL после блокады IL-1β в результате обработки нейтрализующим антителом против IL-1β (*Р=0,003).
На ФИГ. 19А показан результат проточного цитометрического анализа по определению соотношения популяции CD4+CD25+FoxP3+ или CD4+ICOS+Foxp3+ Т-клеток с применением праймирования IL-1β (hcMSCIL-1β, праймирование IL-1β клеток hcMSC, hcMSCVeh, необработанные IL-1β клетки hcMSC).
На ФИГ. 19В показаны результаты подтверждения восстанавливающего воздействия CD25+FoxP3+ Treg, индуцированных hcMSCIL-1β и нормальными (здоровыми) hcMSC, в результате обработки нейтрализующим антителом против ICOSL (αICOSL).
ФИГ. 20 представляет собой схематическую диаграмму, на которой представлен способ получения при помощи DSS модели колита.
На ФИГ. 21 показаны результаты подтверждения изменения длины толстой кишки в зависимости от обработки клетками hcMSCICOSL в DSS-индуцированной модели мышиного колита.
Предпочтительный вариант реализации изобретения
В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками, которая содержит лиганд индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL.
Настоящее изобретение свидетельствует о том, что лиганды индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, могут способствовать дифференцировке CD4+Т-клеток в регуляторные Т-клетки и пролиферации регуляторных Т-клеток, ингибируя таким образом воспалительный или аутоиммунный ответ, так что их можно применять для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками.
В контексте настоящего описания термином «ICOS» назван Н4 или AILIM, который представляет собой суперсемейство CD28 костимуляторных молекул, и его экспрессия, как известно, увеличивается в активированных Т-клетках. ICOS может связываться с ICOSL, известным как В7-Н2, B7RP-1, B7h, GL50 и LICOS, для опосредования межклеточной передачи сигнала. ICOSL представляет собой костимуляторный белок, который несет сигнал активации для Т-клеток, и который кодируется геном ICOSLG (Gene ID: 23308) у людей. Также известно, что ICOSL обильно экспрессируется в В-лимфоцитах. В частности, экспрессия ICOSL может повышаться на поверхности мезенхимальных стволовых клеток в условиях воспаления.
В настоящем изобретении ICOSL можно получить из мезенхимальной стволовой клетки. Термин «полученный из мезенхимальных стволовых клеток» относится к ICOSL, экспрессированному на поверхности мезенхимальных стволовых клеток, или к выделенному из них типу. Таким образом, ICOSL согласно настоящему изобретению может включать все типы, экспрессированные на поверхности мезенхимальных стволовых клеток, или выделенные типы, синтезированные путем их рекомбинирования (перекомпоновки) без ограничения.
В контексте настоящего описания термин «мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL» относится к стволовым клеткам, у которых экспрессия ICOSL на поверхности мезенхимальных стволовых клеток повышается по сравнению с нормальной (здоровой) контрольной группой. Повышение экспрессии ICOSL на поверхности клеток можно достигнуть без ограничений за счет способа повышения экспрессии гена или белка, известного в данной области, например, в результате введения гена ICOSL и индукции повышения экспрессии. В одном варианте реализации настоящего изобретения лентивирус, экспрессирующий полноразмерный человеческий ген ICOSL, трансдуцируют в человеческие клональные мезенхимальные стволовые клетки (hcMSC) совместно с конструкциями для упаковки вируса для индуцирования повышения экспрессии ICOSL в мезенхимальных стволовых клетках, получая таким образом мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL. Мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, обладают хорошей способностью стимулировать дифференцировку CD4+ Т-клеток в регуляторные Т-клетки (Treg) и пролиферацию регуляторных Т-клеток, и они могут эффективно ингибировать воспалительные или аутоиммунные ответы, такие как колит.
В настоящем изобретении стволовые клетки предпочтительно представляют собой клональные мезенхимальные стволовые клетки (клональные MSC). В настоящем изобретении пример 11 подтверждает, что клональные мезенхимальные стволовые клетки можно применять для индуцирования экспрессии ICOSL, которая значительно превосходит экспрессию в случае человеческих неклональных MSC (hncMSC). Моноклональные стволовые клетки можно получить при помощи способов, известных в данной области техники. Тем не менее, их предпочтительно выделяют при помощи способа культивирования с субфракционированием, описанным у Song S.U. et al. (2008) (Variations of clonal marrow stem cell lines established from the human bone marrow in surface epitopes, differentiation potential, gene expression, and cytokine secretion. Stem cells and development 17(3):451-461.) Данный документ включен в настоящее изобретение посредством ссылки. Моноклональные стволовые клетки обладают более высокой экспрессией ICOSL по сравнению с hncMSC. Они также обладают превосходным индуцирующим воздействием на дифференцировку регуляторных Т-клеток по сравнению с hncMSC. Таким образом, их можно более эффективно применять для лечения воспалительных или аутоиммунных заболеваний.
В настоящем изобретении мезенхимальные стволовые клетки могут представлять собой мезенхимальные стволовые клетки, полученные из одного или более источника, выбранного из группы, состоящей из пуповины, пуповинной крови, костного мозга, жира, мышц, нервов, кожи, амниона и плаценты. В частности, они могут предпочтительно представлять собой мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга. Следует понимать, что мезенхимальные стволовые клетки согласно настоящему изобретению включают не только сами стволовые клетки, но и их культуры без ограничения.
ICOSL согласно настоящему изобретению экспрессируется на поверхности мезенхимальных стволовых клеток, и его можно охарактеризовать по повышению экспрессии индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOS) Т-клеток. ICOS экспрессируется на поверхности Т-клеток во время активации Т-клеток. Настоящее изобретение свидетельствует о том, что клетки CD25+FoxP3+ Treg показали более высокую экспрессию ICOS при совместном культивировании hcMSC и CD4+ Т-клеток.
Кроме того, ICOSL согласно настоящему изобретению можно охарактеризовать по активации пути передачи сигнала PI3K-Akt. ICOSL связывается с ICOS Т-клеток, способствуя таким образом фосфорилированию Akt в Treg и активации пути передачи сигнала PI3K-Akt.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками, в которой мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, обработаны одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида).
Мезенхимальные стволовые клетки можно обработать одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида), предпочтительно IL-1β, ФНО-1α и ЛПС, наиболее предпочтительно IL-1β, участвуя таким образом в праймировании стволовых клетках. Более конкретно, мезенхимальные стволовые клетки обрабатывают одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-α и ЛПС (липополисахарида) для индуцирования повышения экспрессии ICOSL в мезенхимальных стволовых клетках. Таким образом, можно усилить дифференцировку и пролиферацию регуляторных Т-клеток (Treg), получая мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL. Кроме того, полученные мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, можно применять в качестве терапевтического агента на основе стволовых клеток для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками, в результате стимулирования эффектов дифференцировки и пролиферации регуляторных Т-клеток.
Таким образом, настоящее изобретение может быть предложено в виде набора, содержащего мезенхимальные стволовые клетки и одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида), предпочтительно одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α и ЛПС, наиболее предпочтительно IL-1β, расположенные в отдельных секциях. Мезенхимальные стволовые клетки предварительно обрабатывают одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-α и ЛПС (липополисахарида), наиболее предпочтительно IL-1β, для индуцирования гиперэкспрессии ICOSL в мезенхимальных стволовых клетках, получая таким образом композицию для предотвращения или лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, которая содержит мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL.
В контексте настоящего описания термин «заболевание, опосредованное регуляторными Т-клетками» относится к заболеванию, которое вызвано аномалиями или недостаточностью (дефицитом) регуляторных Т-клеток, и, в частности, такое заболевание может представлять собой воспалительное заболевание или аутоиммунное заболевание.
В одном аспекте настоящего изобретения указанное воспалительное заболевание может включать одно или более заболевание, выбранное из группы, состоящей из волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, фибромиозита, склеродермии, анкилозирующего спондилита, болезни Бехчета, афтозного стоматита, синдрома Гийена Барре, очаговой алопеции, дерматомиозита, болезни Крона, колита, узелкового полиартериита, рецидивирующего полихондрита и аутоиммунной тромбоцитопении.
Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание может включать одно или более заболевание, выбранное из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системной склеродермии, инсулинзависимого сахарного диабета у детей вследствие разрушения клеток поджелудочной железы, очаговой алопеции, псориаза, пемфигуса, астмы, афтозного стоматита, хронического тиреоидита, частично приобретенной апластической анемии, первичного гепатоцирроза, язвенного колита, болезни Бехчета, болезни Крона, силикоза, асбестоза, болезни почек IgA-типа, пострептококкового гломерулонефрита, синдрома Шегрена, синдрома Гийена Барре, дерматомиозита, полимиозита, рассеянного склероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного энцефаломиелита, миастении гравис, гиперплазии щитовидной железы Грейвса, узелкового полиартериита, анкилозирующего спондилоартрита, фиброзита, височного артериита, болезни Вильсона, синдрома Пакони, множественной миеломы и системной красной волчанки.
Композиция согласно настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или добавку и т.п. Например, она может содержать стерильную воду, физиологический раствор, обычный буфер (например, фосфорную кислоту, лимонную кислоту и другую органическую кислоту), стабилизатор, соль, антиоксидант, поверхностно-активное вещество, суспендирующий агент, изотонический агент или консервант. Кроме того, она может, но не ограничиваться ими, содержать органическое вещество, такое как биополимер, и неорганическое вещество, такое как гидроксиапатит, в частности, коллагеновую матрицу, полимер полимолочной кислоты или ее сополимер, полимер полиэтиленгликоля или его сополимер, его химическое производное и его смесь. Примеры указанного стабилизатора могут включать декстран 40, метилцеллюлозу, желатин, сульфит натрия, метасульфат натрия и им подобные. Примеры указанного антиоксиданта могут включать хелатирующий агент, такой как эриторбиновая кислота, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферилацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соль, пальмитат L-аскорбиновой кислоты, стеарат L-аскорбиновой кислоты, гидросульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, пропилгаллат или этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), пирофосфат натрия и метафосфат натрия. Примеры указанного суспендирующего агента могут включать метилцеллюлозу, полисорбат 80, гидроксиэтилцеллюлозу, гуммиарабик, трагакантовую камедь, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и полиоксиэтиленсорбитана монолаурат. Примеры указанного изотонического агента могут включать D-маннит и сорбит. Примеры указанного консерванта могут включать метилпарабен, этилпарабен, сорбиновую кислоту, фенол, крезол и хлорокрезол.
Фармацевтический препарат, содержащий полученные таким образом мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, их культуры или ICOSL согласно настоящему изобретению, можно вводить с другими стволовыми клетками, применяемыми для трансплантации и других применений или в форме смеси с такими стволовыми клетками с применением способа введения, обычно применяемого в данной области техники. В частности, такой препарат можно, но не ограничиваться этим, вводить путем непосредственного внедрения (engraft) или трансплантации в очаг поражения у пациента, нуждающегося в таком лечении, или путем непосредственной трансплантации или инъекции в брюшную полость. Кроме того, введение можно осуществить путем нехирургического введения с применением катетера и путем хирургического введения, как, например, инъекции или трансплантации, после разрезания очага поражения. Тем не менее, способ нехирургического введения с применением катетера является более подходящим. Кроме того, введение можно осуществить при помощи парентеральной инъекции согласно обычному способу, например, при помощи прямой инъекцией в очаг поражения, а также путем имплантации при помощи внутрисосудистой инъекции. Единичная доза стволовых клеток составляет от 1,0×104 до 1,0×1010 клеток/кг массы тела, в частности от 1,0×105 до 1,0×109 клеток/кг массы тела, более конкретно от 1,0×106 до 1,0×108 клеток/кг масса тела, и их можно вводить один или несколько раз в разделенных дозах. Тем не менее, следует понимать, что фактическую дозу активного ингредиента определяют в зависимости от различных соответствующих факторов, таких как заболевание, подлежащее лечению, тяжесть заболевания, путь введения и масса тела, возраст и пол пациента. Доза не предназначена для ограничения каким-либо образом объема настоящего изобретения.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ предотвращения или лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, который включает введение индивидууму лиганда индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальной стволовой клетки, гиперэкспрессирующей ICOSL.
Предпочтительно указанный индивидуум является млекопитающим, включая человека, который является пациентом, нуждающимся в терапии заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, включая пациента, получающего лечение от заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, пациента, который получал лечение от заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками, и пациента с заболеванием, опосредованным регуляторными Т-клетками, который нуждается в таком лечении. Он может также включать пациента, который подвергался хирургической операции для лечения заболевания, опосредованного регуляторными Т-клетками.
Кроме того, в настоящем изобретении можно применять лиганды индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, а также с их помощью осуществлять лечение, в комбинации с лекарственными средствами или методами лечения для терапии других обычных заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками. В случае, когда лиганды индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или мезенхимальные стволовые клетки, гиперэкспрессирующие ICOSL, согласно настоящему изобретению применяют в комбинации, лечение с их помощью можно проводить одновременно или последовательно с лечением другими лекарственными средствами или методами лечения для терапии заболеваний, опосредованных регуляторными Т-клетками.
Кроме того, в одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для индуцирования дифференцировки и пролиферации CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку, которая содержит лиганд индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL.
Термин «индукция дифференцировки и пролиферации» относится к стимулированию дифференцировки CD4+ Т-клеток в регуляторные Т-клетки в результате прямого контакта между CD4+ Т-клетками и ICOSL на поверхности мезенхимальной стволовой клетки и пролиферации регуляторных Т-клеток, которые были дифференцированы и индуцированы при помощи лигандов индуцированных Т-клеточных костимуляторов (ICOSL) или мезенхимальных стволовых клеток, гиперэкспрессирующих ICOSL.
Для того, чтобы дополнительно способствовать экспрессии ICOSL на поверхности мезенхимальных стволовых клеток, указанная композиция может дополнительно содержать одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида), предпочтительно одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α и ЛПС, и наиболее предпочтительно IL-ip.Одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-α и ЛПС, представляет собой вещество, которое праймирует мезенхимальные стволовые клетки, способствуя таким образом гиперэкспрессии ICOSL на поверхности мезенхимальных стволовых клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ индуцирования дифференцировки и пролиферации CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку, который включает обработку CD4+ Т-клеток in vitro лигандом индуцированного Т-клеточного костимулятора (ICOSL) или мезенхимальной стволовой клеткой, гиперэкспрессирующей ICOSL.
В указанном способе мезенхимальную стволовую клетку, гиперэкспрессирующую ICOSL, можно предварительно обработать одним или более веществом, выбранным группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида), предпочтительно одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-1β, ФНО-1α и ЛПС, и наиболее предпочтительно IL-1β. ICOSL или стволовые клетки с повышенной экспрессией ICOSL могут индуцировать повышенную экспрессию ICOS в CD4+ Т-клетках в результате непосредственного контакта с CD4+ Т-клетками, и могут способствовать дифференцировке в регуляторные Т-клетки и пролиферации дифференцированных регуляторных Т-клеток.
В данном способе обработка может включать как культивирование CD4+ Т-клеток в лунке, покрытой ICOSL, так и совместное культивирование CD4+ Т-клеток с мезенхимальными стволовыми клетками, гиперэкспрессирующими ICOSL.
Следует понимать, что описанные в настоящем документе численные значения включают эквивалентные диапазоны, если не указано иное.
Далее для облегчения понимания настоящего изобретения будут описаны предпочтительные примеры получения примеров, примеры и примеры приготовления. Тем не менее, следующие примеры получения, примеры и примеры приготовления приведены только для более легкого понимания настоящего изобретения, и они не ограничивают содержание настоящего изобретения.
[Принцип настоящего изобретения]
Пример 1: Анализ характеристики человеческих клональных MSC (hcMSC)
Человеческий костный мозг собирали у здорового мужчины-донора. Эксперимент проводили согласно разрешению, полученному экспертным советом организации университетской больницы Инха (IRB №10-51). Клетки hcMSC выделяли при помощи способа культивирования с субфракционированием согласно предшествующему документу (Song S.U. et al. (2008). Вариации линий клональных стволовых клеток мозга определяли по полученным из человеческого костного мозга эпитопам клеточной поверхности, потенциалу дифференцировки, экспрессии генов и секреции цитокинов (Stem cells and development, 17 (3): 451-461.). Все hcMSC инкубировали в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% смесью пенициллин/стрептомицин. Выделенные hcMSC анализировали с применением проточной цитометрии для идентификации различных маркеров клеточной поверхности. Антитела, применяемые для анализа, были следующими: антитело против CD29 (Serotec, Кидлингтон, Великобритания), антитело против CD44 (Serotec), антитело против CD 105 (Serotec), антитело против CD34 (BD Biosciences, Сан-Диего, штат Калифорния, США) антитело против CD45 (BD Biosciences), антитело против CD90 (BD Biosciences), антитело против CD73 (BD Biosciences), антитело против HLA класса I (BD Biosciences), антитело против HLA DR (BD Biosciences), антитело против CD80 (eBiosciences, Сан-Диего, штат Калифорния, США), антитело против CD86 (SouthernBiotech, Бирмингем, штат Алабама, США) и антитело против Oct4 (Cell Signaling Technology, Данверс, штат Массачусетс, США). Клетки анализировали с применением проточного цитометра (FACS Calibur; BD Biosciences). В качестве контролей применяли контрольные антитела с парными изотипами. Результаты идентификации экспрессии поверхностных маркеров hcMSC с применением проточной цитометрии показаны на ФИГ. 1.
Как показано на ФИГ. 1, было обнаружено, что экспрессия была позитивной для CD29, CD44, С73, CD90, CD105, Oct-4 и HLA класса I, но было обнаружено, что она является негативной для CD34, CD45 и HLA-DR. Было также обнаружено, что экспрессия является негативной для костимуляторных факторов CD80 и CD86.
Аактивность hcMSC в отношении РВМС in vitro определяли при помощи анализа с применением карбоксифлуоресцеина (CFSE). hcMSC совместно культивировали с РВМС, обработанными РНА. Более конкретно, РВМС в количестве 1×106 окрашивали 1 мкМ CFSE, окрашенные РВМС стимулировали 1 мкг/мл РНА в присутствии или в отсутствии 1×105 или 1×106 hcMSC. После стимуляции РНА в течение 72 часов РВМС собирали и анализировали методом проточной цитометрии. Результаты показаны на ФИГ. 2.
Как показано на ФИГ. 2, в случае, когда hcMSC совместно культивировали с активированными РВМС, обработанными РНА, они ингибировали пролиферацию РВМС.
Пример 2: Определение индуцирования дифференцировки Treg клетками hcMSC
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) собирали от здоровых доноров и разделяли при помощи центрифугирования в градиенте плотности фикол-гипака. CD4+ Т-клетки, полученные из РВМС, получали с применением набора для выделения CD4+ Т-клеток MicroBeads (Miltenyi Biotech, Bisley, Суррей, Великобритания).
Для того, чтобы идентифицировать дифференцировку Treg, выделенные CD4+ Т-клетки инкубировали в полной среде, содержащей RPMI 1640, дополненной 10% ФБС, 2 мМ L-глутамином и 100 ед/мл пенициллина. В 24-луночном планшете лунки покрывали 1 мкг/мл моноклонального антитела против CD3 при 4°С в течение ночи. Кроме того, очищенные CD4+ Т-клетки стимулировали антителом против CD3, антителом против CD28, IL-2, TGF-b1 и atRA, что являлось условием для дифференцировки Treg. Для того, чтобы идентифицировать дифференцировку Treg, подтверждали экспрессию FoxP3 и CD25 на 2 и 5 день.
Для того, чтобы подтвердить взаимосвязь между индукцией Treg и hcMSC, CD4+ Т-клетки совместно культивировали с hcMSC, или инкубировали только CD4+ Т-клетки без hcMSC. Результаты подтверждали при помощи анализа на определение экспрессии FoxP3 и CD25 и через увеличение числа клеток FoxP3+CD4+CD25+ на 1-3 день. Результаты показаны на ФИГ. 3.
Как показано на ФИГ. 3, клетки FoxP3+CD25+ Treg постепенно обнаруживались в условиях индуцирования Treg (А). Кроме того, совместное культивирование с hcMSC значительным образом индуцировало большее число клеток FoxP3+CD25+ Treg (В), а также увеличивало популяцию клеток FoxP3+CD25+, полученную из CD4+ Т-клеток (С).
Результаты свидетельствуют о том, что hcMSC могут на высоком уровне индуцировать Treg.
Пример 3: Определение контакт-зависимого индуцирующего воздействия hcMSC
hcMSC совместно культивировали с CD4+ Т-клетками, и появление таких клеток подтверждали при помощи светового микроскопа (×400). Клетки классифицировали как адгезивные или плавающие в зависимости от формы присутствия. Уровни экспрессии CD25 и FoxP3 сравнивали методом проточной цитометрии.
Как показано на ФИГ. 4, при помощи светового микроскопа было подтверждено, что CD4+ Т-клетки присутствовали в адгезивной или плавающей форме (А). Некоторые CD4+ Т-клетки находились в контакте с hcMSC, а адгезивные CD4+ Т-клетки на высоком уровне экспрессировали CD25+ и FoxP3+. Тем не менее, некоторые CD4+ Т-клетки плавали в среде для культивирования. Эти плавающие клетки экспрессировали более низкий уровень CD25+ и FoxP3+, чем адгезивные клетки (В).
Для того, чтобы дополнительно подтвердить необходимость контакта клеток в опосредованной MSC индукции Treg, в течение 2 дней проводили трансвел-анализ. Для трансвел-анализа CD4+ Т-клетки инкубировали в нижней камере, a hcMSC находились в верхней камере. Подтверждали, можно ли при помощи этого способа культивирования получить эффект индукции Treg клетками hcMSC, и результаты показаны на ФИГ. 5.
Как показано на ФИГ. 5, в случае, когда CD4+ Т-клетки и hcMSC инкубировали отдельно с применением трансвел-анализа, hcMSC не влияли на экспрессию CD25+ и FoxP3+ в CD4+ Т-клетках.
Эти результаты свидетельствуют о том, что для опосредованной hcMSC индукции Treg необходимо наличие контакта клеток, что свидетельствует о том, что непосредственное взаимодействие между hcMSC и Т-клетками может играть ключевую роль в передаче индуцирующих сигналов для дифференцировки Treg в CD4+ Т-клетках.
Пример 4: Определение взаимосвязи между экспрессией ICOSL на поверхности hcMSC и индукцией Treg
Было подтверждено, что непосредственное взаимодействие между hcMSC и Т-клетками индуцирует дифференцировку Treg. Следовательно, ожидалось, что экспрессия ICOSL на поверхности hcMSC будет играть существенную роль в передаче сигнала. Таким образом, для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты. Клетки hcMSC и CD4+ Treg совместно культивировали в течение 2 дней в условиях индуцирования Treg. Экспрессию белка ICOSL на поверхности hcMSC подтверждали методом проточной цитометрии. Экспрессию мРНК подтверждали количественной ПЦР в режиме реального времени после 24 часов совместного культивирования. Неадгезивные CD4+ Т-клетки удаляли с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием. Затем экспрессию ICOSL на поверхности hcMSC наблюдали при помощи конфокального микроскопа. Суммарную РНК hcMSC измеряли с применением реагента для выделения РНК EasyBlue (Intron, Biotechnology, Соннам, Корея), а кДНК синтезировали из 2 мкг суммарной РНК с применением набора для синтеза кДНК AccuPower (Bioneer, Тэджон, Корея). Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с применением премикса AccuPower PCR (Bioneer). Амплифицированные продукты ПЦР подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, содержащем SybrSafe, и анализировали при помощи анализатора флуоресцентных изображений. ПЦР проводили с применением следующих праймеров: IL-10 (прямая 5'-ATCCAAGACAACACTACTAA-3' и обратная 5'-TAAATATCCTCAAAGTTCC-3'), IL-1 (прямая 5'-GCTGAGTGCTGCAAAGTACC-3' и обратная 5'-TGAGGAGGGA-CTTGTGACTG-3'), IL-1R (прямая 5'-ATTGATGTTCGTCCCTGTCC-3' и обратная 5'-CCTCCACCTTAGCAGGAACA-3') и GAPDH (прямая 5'-CCACTGGCGTCTTCACCAC-3' и обратная 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3').
Для подтверждения наличия мРНК ICOSL количественную ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) проводили с примением зондов TaqMan (ID анализа: Hs00323621_m1; Applied Biosystems, Фостер Сити, штат Калифорния, США) и TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Уровень мРНК нормировали no 18S рРНК (Hs03928985_g1). Результаты показаны на ФИГ. 6.
Как показано на ФИГ. 6, при помощи проточной цитометрии было подтверждено, что ICOSL значимым образом повышающе регулируется на поверхности совместно культивированных hcMSC в условиях для дифференцировки Treg (А). Кроме того, методом qRT-PCR установили, что экспрессия мРНК ICOSL на поверхности hcMSC увеличилась во время совместного культивирования (В), что не противоречит результатам проточной цитометрии. Экспрессию ICOSL в совместно культивированных hcMSC дополнительно подтверждали с применением иммунофлюоресцентного окрашивания (С).
Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия ICOSL на поверхности hcMSC повышается в условиях индуцирования Treg.
Пример 5: Определение повышенной экспрессии ICOS Т-клеткой, совместно культивированной с hcMSC
Было известно, что ICOS повышающим образом регулируется в Т-клетках после активации, и что ICOSL, экспрессированный на поверхности АРС, может ингибировать Т-клеточные ответы, стимулируя индукцию Treg. Для определения того, воздействуют ли hcMSC на экспрессию ICOS Т-клетками, hcMSC и CD4+ Т-клетки совместно культивировали в течение 48 часов в условиях для дифференцировки Treg. Индукцию экспрессии ICOS CD4+ Т-клетками в присутствии hcMSC подтверждали 5 независимыми экспериментами. Результаты показаны на ФИГ. 7.
Как показано на ФИГ. 7, уровень ICOS еще больше увеличивался в условиях совместного культивирования CD4+ Т-клеток и hcMSC (А). Интересно отметить, что клекти CD25+FoxP3+ Treg экспрессировали ICOS на более высоком уровне в присутствии hcMSC (В). Эти результаты свидетельствуют о том, что hcMSC стимулируют CD4+ Т-клетки для представления фенотипов FoxP3+ Treg с более высокой экспрессией ICOS.
Пример 6: Определение пути передачи сигнала ICOS-ICOSL
Для того, чтобы получить непосредственные доказательства взаимодействия между индукцией Treg и ICOSL на поверхности hcMSC, блокировали функцию ICOSL и наблюдали за ее изменением. Для того, чтобы блокировать функцию ICOSL, проводили обработку нейтрализующими антителами против ICOSL и эксперименты по нацеливанию на ген.
В частности для того, чтобы блокировать функцию ICOSL, к совместной культуре hcMSC и CD4+ Т-клеток добавляли 10 мкг/мл нейтрализующего антитела против ICOSL. Поверхность клеток окрашивали CD25, конъюгированным с флуоресцеиноизотиоцианатом (FITC) или аллоцикоцианином (АРС), АРС- и РЕ-коннъюгированным ICOS, FITC-конъюгированным CD4 (eBiosciences) в течение 20 минут при температуре 4°С в темноте. Совместное культивирование проводили в течение 2 дней, а соотношение популяции клеток FoxP3+CD25+ и Foxp3+ICOS+ определяли методом проточной цитометрии.
Между тем, ICOS-ICOSL-взаимодействие играет важную роль в образовании IL-10, а Treg, экспрессирующий ICOS, способствует образованию IL-10. Следовательно, образование IL-10 клетками Treg, индуцированными hcMSC, анализировали с применением проточного цитометрического анализатора и при помощи метода ELISA. Образование IL-10 подтверждали после повторного стимулирования клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА, 40 нг/мл, Sigma) и иономцином (1 мкг/мл, Sigma) в течение 5 часов. Для прекращения стимуляции добавляли монензин (4 мкМ, Sigma).
При опосредованной hcMSC индукции Treg, результаты блокирования функции ICOSL в результате обработки нейтрализующим антителом показаны на ФИГ. 8.
Как показано на ФИГ. 8, обработка нейтрализующими антителами (alCOSL) против ICOSL позволила значительно уменьшить популяцию клеток CD25+FoxP3+ Treg, понизив таким образом экспрессию ICOS в указанной популяции Treg (А). Между тем, hcMSC значительно увеличивали образование IL-10 клетками Treg, тогда как образование IL-10 уменьшалось при обработке нейтрализующим антителом против ICOSL (В и С).
Кроме того, был осуществлен нокдаун ICOSL в клетках hcMSC путем инфицирования их лентивирусами, экспрессирующими нацеливающиеся на ICOSL кшРНК (shICOSL). Затем для популяции клеток Treg наблюдали изменения в экспрессии Foxp3, ICOS и CD25. Для нокдауна лентивирусного гена, опосредованного короткошпилечной РНК (кшРНК), содержащие ICOSL вирусные частицы были приобретены у компании Santa cruz (Santa cruz biotechnology, Санта-Крус, штат Калифорния, США). Для трансфекции кшРНК клетки hcMSC в количестве 1×105 высевали в 24-луночный планшет.На следующий день адгезивные hcMSC инфицировали контрольными лентивирусными частицами (shCon) или лентивирусными частицами, экспрессирующими нацеливающуюся на ICOSL кшРНК (shICOSL), в присутствии или в отсутствие полибрена (5 мкг/мл, Санта-Крус) в течение 24 часов. Нокдаун ICOSL подтверждали при помощи qRT-PCR-анализа. Инфицированные hcMSC дополнительно культивировали с CD4+ Т-клетками в условиях индуцирования Treg. Результаты нокдауна и индуцирующих Treg воздействий в зависимости от нокдауна показаны на ФИГ. 9.
Как показано на ФИГ. 9, был осуществлен эффективный нокдаун ICOSL путем обработки кшРНК (А). Индуцирование Treg клеток hcMSC таким нокдауном понижался в такой группе с нокдауном ICOSL (В).
Эти результаты показывают, что ICOSL играет важную роль в опосредованной hcMSC индукции Treg.
Пример 7: Индукция популяции клеток Treg в результате гиперэкспрессии ICOSL в клетках hcMSC
7.1 Определение индукции гиперэкспрессии ICOSL
При опосредованной MSC индукции Treg, в клетках hcMSC индуцировали гиперэкспрессию ICOSL и исследовали воздействие такой гиперэкспрессии. Для гиперэкспрессии ICOSL в hcMSC, лентивирус, экспрессирующий полноразмерный человеческий ген ICOSL, трансдуцировали в клетки hcMSC вместе с конструкциями для вирусной упаковки. Более конкретно, векторы экспрессии полноразмерного человеческого гена ICOSL субклонировали в pLent векторы с mGFP-меткой (мономерный зеленый флуоресцентный белок) на С-конце. Для количественной оценки кДНК их трансформировали в компетентные клетки E.coli, и полученные клоны секвенировали для подтверждения встраивания ICOSL. Клетки 293FT трансфицировали вектором экспрессии ICOSL с применением набора для упаковки Lenti-vpak (Origene). Клетки 293FT для образования лентивируса в количестве 2,5×106 высевали в 100 мм чашку для культивирования. Через два дня супернатант культуры клеток, содержащий вирус, собирали и применяли для инфицирования hcMSC. После инфицирования hcMSC для проверки уровня гиперэкспрессии ICOSL применяли qRT-PCR, вестерн-блоттинг и проточную цитометрию. Результаты показаны на ФИГ. 10.
Как показано на ФИГ. 10, было подтверждено, что клетки hcMSC (hcMSCICOSL), трансдуцированные лентивирусом, экспрессирующим полноразмерный человеческий ICOSL, повышают экспрессию мРНК и белка ICOSL по сравнению с контрольными MSC, трансдуцированными пустым вектором (hcMSCEmp) (А и В). Кроме того, индуцирование ICOSL дополнительно подтверждали экспрессией ICOSL, слитого с GFP, в лентивирусном векторе экспрессии. Результаты свидетельствовали о том, что количество GFP увеличивалось в клетках hcMSCIC0SL с эффективной индукцией гиперэкспрессии ICOSL.
7.2 Определение повышенной индукции Treg в клетках hcMSCICOSL
Было подтверждено, что в эксперименте по п. 7.1 наблюдалась гиперэкспрессия ICOSL в клетках hcMSC. Таким образом, проточную цитометрию и ELISA применяли для подтверждения того, было ли повышена индукция Treg в клетках hcMSCICOSL. Результаты показаны на ФИГ. 11.
Как показано на ФИГ. 11, hcMSCICOSL индуцировали большее количество клеток CD25+FoxP3+ Treg по сравнению с контрольными клетками, в которые вводили пустой вектор, а клетки Treg, индуцированные hcMSCICOSL, экспрессировали ICOS на более высоком уровне (А). Кроме того, проточный цитометрический анализ и анализ ELISA применяли для подтверждения того, способствовали ли дополнительно клетки Treg, индуцированные hcMSCICOSL, образованию и секреции IL-10, эффекторного противовоспалительного цитокина. Эти результаты свидетельствуют о том, что ICOSL выполняет ключевую роль в опосредованной MSC индукции Treg, которая является результатом того, что ICOSL MSC выполняет роль эффективного индуктора Treg.
Пример 8: Определение ингибирующего воздействия hcMSC-индуцированных клеток Treg на пролиферацию РВМС
Было подтверждено, что клетки hcMSC индуцировали так, чтобы CD4+ Т-клетки проявляли фенотипы Treg, экспрессирующих CD25, FoxP3, ICOS и IL-10 в условиях индуцирования Treg. Между тем, известно, что клетка Treg обладает ингибирующей активностью в отношении лимфоцитов как in vitro, так и in vivo. Таким образом, подтверждали, подавляли (ингибировали) ли клетки Treg пролиферацию активированных лимфоцитов.
CD4+Т-клетки, очищенные от клеток РВМС, совместно культивировали с клетками hcMSCICOSL или hcMSCEmp в условиях индуцирования Treg в течение 2 дней. Затем CD25+ клетки выделяли из CD4+ Т-клеток, содержащих популяцию Treg. РВМС помечали при помощи 10 мкМ CFSE в предварительно нагретом ФСБ при конечной концентрации 107 клеток/мл. РВМС, меченные CFSE, стимулировали в присутствии 1 мкг/мл моноклонального антитела против CD3 (eBiosciences) и 3 мкг/мл моноклонального антитела против CD28 (eBiosciences) в течение 3 дней. Популяцию CD25+ клеток, выделенных из совместной культуры CD4+ Т-клеток и hcMSCICOSL или hcMSCEmp, совместно культивировали с CFSE-мечеными и активированными РВМС при соотношении 1:5 или 1:10 (Treg:PBMC) в течение 3 дней. Пролиферацию РВМС анализировали с применением проточного цитометра, который позволяет оценить разбавление CFSE. Результаты показаны на ФИГ. 12.
Как показано на ФИГ. 12, анализ на определение CFSE показал, что содержание активированных РВМС составляло приблизительно 80% при отсутствии Treg. Когда их совместно культивировали с Treg, деление РВМС уменьшалось в зависимости от числа клеток, так что клетки Treg проявляли иммунный ингибирующий эффект.Между тем, очевидные функциональные отличия между клетками Treg, индуцированными hcMSCICOSL и индуцированными hcMSCEmp, в отношении ингибирования РВМС отсутствовали.
Пример 9: Определение активации пути передачи сигнала PI3K-Akt в результате ICOSL-ICOS-взаимодействия
Известно, что путь передачи сигнала PI3K-Akt играет важную роль в функциях Т-клеток, таких как пролиферация, миграция, дифференцировка и образование цитокинов Т-клетками. Для того, чтобы дополнительно определить физиологическую функцию ICOSL, регуляцию молекулярной передачи сигнала в результате ICOSL-ICOS-взаимодействия при дифференцировке Treg исследовали с точки зрения передачи сигнала.
Для данного Примера CD4+ Т-клетки обрабатывали rhICOSL, рекомбинантным человеческим ICOSL (5 мкг/мл) (R&D research, Миннеаполис, штат Миннесота, США), в течение 2 дней в условиях индуцирования Treg, и экспрессию ими CD25, ICOS и FoxP3 анализировали методом проточной цитометрии. Было проведено пять независимых экспериментов. В частности, для введения rhICOSL (R&D research, Миннеаполис, штат Миннесота, США) лунки покрывали 5 мкг/мл rhICOSL при 37°С в течение 4 часов. Очищенные CD4+ клетки добавляли в каждую из таких лунок при концентрации 1×106 клеток/мл, которые стимулировали при помощи 1 нг/мл IL-2 (eBiosciences), 5 нг/мл TGF-α (R&D research, Миннеаполис, штат Миннесота, США) и 0,1 мкМ полностью транс-ретиноевой кислоты (atRA, PHASigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США), а также 3 мкг/мл моноклонального антитела против CD28 (eBiosciences) в течение 2-5 дней. Клетки hcMSC совместно культивировали с CD4+ Т-клетками при соотношении 1:10 (hcMSC:T-клетки) в течение 2 дней. Через 2 дня hcMSC промывали три раза холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 0,05 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), для отсоединения лимфоцитов от hcMSC. Затем hcMSC трипсинизировали и дважды промывали холодным раствором ФСБ-ЭДТА и окрашивали при помощи конъюгированного с фикоэритрином (РЕ) антитела против ICOSL (BioLegend) для анализа экспрессии ICOSL. Фосфорилирование Akt в результате обработки rhICOSL подтверждали методом вестерн-блоттинга. Результаты показаны на ФИГ. 13.
Как показано на ФИГ. 13, аналогично результатам обработки hcMSC, обработка rhICOSL CD4+ Т-клеток также на достаточном уровне способствовала индукции клеток FoxP3+ICOS+ Treg по сравнению с необработанным контролем (А). Кроме того, обработка rhICOSL значительным образом увеличивала фосфорилирование Akt (В). Эти результаты показывают, что ICOSL активирует путь передачи сигнала PI3K-Akt во время индукции Treg.
Пример 10: Определение регуляции дифференцировки Treg через путь передачи сигнала PI3K-Akt
Для того, чтобы дополнительно продемонстрировать участие пути передачи сигнала PI3K-Akt в опосредуемой ICOSL дифференцировке Treg, их обрабатывали ингибитором фосфатидилинозитид-3-киназ (PI3K) LY294002 или ингибитором Akt GSK690693, и таким образом подтверждали данные результаты. Ингибитор Akt GSK649 (Calbiochem, Сан Диего, штат Калифорния, США) применяли в концентрации 1 мкМ, a LY294002 (Cell Signaling Technology, Данверс, штат Массачусетс, США) применяли в концентрации от 5 до 10 мкМ.
Более конкретно, CD4+ Т-клетки предварительно обрабатывали LY294002 (5 мкМ) и GSK690693 (1 мкМ) в течение 30 мин. Подтверждали то, индуцирует ли экзогенная обработка rhICOSL фосфорилирование Akt, и ингибируют ли ингибиторы PI3K-Akt фосфорилирование Akt, индуцированное rhICOSL, в течение часа в условиях индуцирования Treg. Была определена суммарная Akt. Кроме того, после обработки LY294002 (5 мкМ) или GSK690693 (1 мкМ) в течение 2 дней обработанные rhICOSL CD4+ Т-клетки инкубировали для анализа экспрессии CD25, ICOS и FoxP3, оценивая таким образом воздействие ингибирования PI3K-Akt при rhICOSL-индуцированной индукции Treg. Результаты показаны на ФИГ. 14.
Как показано на ФИГ. 14, обработка как LY294002, так и GSK690693 приводила к значительному уменьшению фосфорилирования Akt (А). В то же время, эти ингибиторы снижали количество индуцированных rhICOSL или hcMSC клеток Treg (В). Эти результаты свидетельствуют о том, что путь передачи сигнала PI3K-Akt участвует в регулируемой ICOSL индукции Treg. С другой стороны, снижение популяции клеток Treg при нормальных состояниях в результате ингибирования пути PI3K-Akt свидетельствует о функциональной важности этого пути передачи сигнала при нормальной индукции Treg (В). Эти результаты свидетельствуют о том, что ось передачи сигнала ICOSL-ICOS-PI3K-Akt может участвовать в регуляции опосредованной hcMSC индукции Treg.
Пример 11. Определение корреляции между экспрессией ICOSL и индукцией Treg среди клонов MSC
Известно, что различные клоны MSC обладают различными функциональными свойствами. Таким образом, подтверждали, отличались ли уровни экспрессии ICOSL для индуцирования человеческих Treg в зависимости от hcMSC. В общей сложности шесть линий hcMSC, включая пять линий клональных hcMSCs (hcMSC1-5) и одну линию неклональных hcMSC (hncMSC), полученных от одного донора, исследовали на определение их основной экспрессии ICOSL методами вестерн-блоттинга и qRT-PCR. Кроме того, для оценки индуцирующей Treg активности hcMSC исследовали потенциал индукции Treg линий hcMSC1 и hcMSC4, при которой экспрессию CD25 и FoxP3 сравнивали между линиями клеток hncMSC, hcMSC1 и hcMSC4 путем совместного культивирования каждой линии клеток с клетками РВМС в реакции смешанных лимфоцитов (MLR) или в условиях индуцирования Treg. Результаты показаны на ФИГ. 15.
Как показано на ФИГ. 15, было подтверждено, что линия клеток hcMSC4 показала наивысший уровень экспрессии мРНК ICOSL, и большинство клеток hcMSC показали более высокий уровень экспрессии ICOSL по сравнению с hncMSC (А и В). В частности, линия клеток hcMSC4 показала наивысшую экспрессию CD25 и FoxP3 как в условиях MLR (С), так и в условиях индуцирования Treg (D). Результаты подтверждают, что линия клеток hcMSC4 является наиболее эффективной линией клеток для индукции Treg. Кроме того, поскольку линии клеток демонстрируют более высокую экспрессию мРНК ICOSL, наблюдаются и более сильные индуцирующие Treg воздействия. Эти результаты показывают, что эффективность экспрессии ICOSL коррелируется с эффективностью hcMSC для индуцирования Treg, и чем сильнее индуцируемая линия клеток ICOSL, тем сильнее Treg-индуцирующая способность.
Пример 12: Идентификация индукции ICOSL в клетках hcMSC IL-1β
Известно, что на иммуноподавляющую активность MSC можно воздействовать при помощи разнообразных праймирующих или соответствующих стимуляций. Было подтверждено, что экспрессия ICOSL в hcMSC коррелируется с индукцией Treg. Таким образом, ожидалось, что экспрессия ICOSL будет улучшена для увеличения числа Treg и для усиления иммуноподавляющей функции hcMSC. Чтобы подтвердить это прндположение, сначала был проведен эксперимент для подтверждения присутствия провоспалительного цитокина, который может индуцировать экспрессию ICOSL. Во-первых, для обнаружения подходящих праймирующих факторов, hcMSC обрабатывали IL-1β (10 нг/мл), ФНО-α (10 нг/мл) и ЛПС (2 мкг/мл) в течение 24 часов. Затем экспрессию ICOSL определяли через 1 час и через 3 часа методом qRT-PCR. Кроме того, для подтверждения того, изменяла ли обработка IL-1β экспрессию IL-1R в hcMSC, экспрессию IL-IR в hcMSC подтверждали после обработки IL-1β в течение 24 часов. Результаты показаны на ФИГ. 16.
Как показано на ФИГ. 16, было подтверждено, что уровни мРНК ICOSL были увеличены во всех группах обработки IL-1β, ФНО-α и ЛПС (А и В), и среди их числа IL-1β them проявлял наибольшее вляние. Известно, что IL-1β связывается со своим рецептором, IL-1R1, для регулирования клеточного ответа, и IL-1R1 экспрессируется в hcMSC. По результата проведенной RT-PCR было обнаружено, что здоровые hcMSC экспрессируют мРНК IL-1R1. Кроме того, обработка IL-1β (10 нг/мл) незамедлительно и значительным образом повышала экспрессию мРНК ICOLS, но не изменяла экспрессию мРНК IL-1R.
Пример 13: Определение IL-ip-индуцируемого воздействия клональных MSC
Было подтверждено, что индуцируемый эффект экспрессии ICOSL был сильнее в линии клеток hcMSC4, чем в hncMSC. Таким образом, эксперименты проводили для того, чтобы подтвердить различие в ICOSL-индуцируемых воздействиях клональных и некланальных MSC в результате обработки IL-1β. Если подробно, то hcMSC4 и hncMSC обрабатывали IL-1β (10 нг/мл) в течение 24 часов и экспрессию мРНК ICOSL анализировали методом qRT-PCR в динамике. Вестерн-блот-анализ и проточный цитометрический анализ обнаружили изменения в экспрессии белка ICOSL. Способ проточной цитометрии показал репрезентативное значение пяти независимых экспериментов. Результаты показаны на ФИГ. 17.
Как показано на ФИГ. 17, результаты qRT-PCR показали, что стимулированная IL-1β индукция ICOSL различалась между hcMSC4 и hncMSC как через 6, так и 24 часа (А). Различие в индукции ICOSL, стимулированной IL-1β, между двумя линиями клеток MSC было одинаково как при ее определении методом вестерн-блоттинга, так и методом проточной цитометрии (В и С).
Антитело против IL-1β (10 мкг/мл), которое представляет собой нейтрализующее антитело против IL-1β, применяли для определения того, было ли связано различие в воздействии на индукцию ICOSL с IL-1β.
Для подтверждения того, связаны ли различия в ICOSL-индуцируемых воздействиях, зависящих от типа клональных и неклональных MSC, с IL-1β, клетки обрабатывают антителом против IL-1β (10 мкг/мл), которое представляет собой нейтрализующее антитело против IL-1β, для блокировки функции IL-1β. Таким образом, определяли изменение ICOSL-индуцируемых воздействий. Результаты показаны на ФИГ. 18.
Как показано на ФИГ. 18, обработка нейтрализующим антителом против IL-1β, блокировала функцию IL-ip, что приводило к понижению экспрессии ICOSL, индуцированной IL-1β.
Эти результаты показывают, что IL-1β является мощным праймирующим фактором для индуцирования ICOSL в hcMSC.
Пример 14: Определение воздействия увеличения индукции Treg в результате обработки IL-1β
Для исследования того, проявляли ли клетки hcMSC, праймированные IL-1β, более сильную Treg-индуцирующую активности, hcMSC обрабатывали IL-1β в течение 24 часов, получая таким образом клетки hcMSCIL-1β. HcMSCIL-1β совместно культивировали с CD4+ Т-клетками в условиях для дифференцировки Treg. Для подтверждения соотношения популяции CD4+CD25+FoxP3+ или CD4+ICOS+Foxp3+ Т-клеток проводили проточную цитометрию. Кроме того, после обработки нейтрализующим антителом против ICOSL (5 мкг/мл) hcMSCIL-1β совместно культивировали с CD4+ Т-клетками для подтверждения того, подавляло ли ингибирование нейтрализации ICOS индукцию Treg, вызванную праймированными IL-1β клетками hcMSC. Результаты показаны на ФИГ. 19.
Как показано на ФИГ. 19, праймированные IL-1β клетки hcMSC (hcMSCIL-1β) образовывали большее количество CD25+FoxP3+ Treg по сравнению с клетками hcMSCVeh, которые представляют собой клетки hcMSC, непраймированные IL-1β (А). Кроме того, обработка нейтрализующим антителом против ICOSL понижало количество CD25+FoxP3+ Treg, индуцированных как hcMSCIL-1β, так и здоровыми hcMSC (В). Эти результаты показывают, что hcMSC, праймированные IL-1β, экспрессируют ICOSL, который дополнительно стимулирует дифференцировку Treg за счет активации пути передачи сигнала PI3K-Akt.
Пример 15: Ослабление колита, индуцированного DSS, при помощи hcMSC
15.1 Получение животной модели DSS-индуцированного колита и способ проведения эксперимента
Вышеприведенные примеры подтвердили функциональную роль человеческого ICOSL для иммуносупрессорной способности hcMSC. Следовательно, для подтверждения того, действительно ли такое лечение может быть подходящим для лечения заболеваний, опосредованных Т-клетками, подтверждали, влияет ли введение MSC на иммуносупрессорное воздействие в модели колита, которое представляет собой одно из заболеваний, опосредованных Т-клетками.
Острый колит индуцировали у самок мышей Balb/c путем введения питьевой воды с разбавленным в ней 4% DSS с 0 по 7 день и с заменой на обычную воду, начиная с 8 дня. Мышей Balb/c делили на четыре группы. Протокол такой индукции колита в животной модели показан на ФИГ. 20. Клетки hcMSC трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим ICOSL, за 24 часа до введения DSS. Трансдуцированные hcMSC промывали ФСБ и повторно суспендировали при плотности 5×105 клеток/мышь/200 мкл ФСБ. На 1 и 3 день, клетки hcMSC (5×105 клеток, 200 мкл ФСБ) внутривенно вводили через хвостовую вену. Мышей умерщвляли на 10 день. Мышей Balb/c поделили на следующие четыре группы: контрольная группа (Con, 4 мыши), группа с колитом, обработанная ФСБ, (ФСБ+DSS, 6 мышей) и группа с колитом с трансдуцированными клетками hcMSCICOSL (hcMSCICOSL+DSS, 6 мышей).
15.2 Воздействие hcMSC на DSS-индуцированный колит
Оценку степени тяжести в DSS-индуцированной мышиной модели колита определяли ежедневно, оценивая консистенцию кала, кровь и потерю массы тела. У мыши полностью удаляли толстую кишку, и ее длину измеряли по косвенным маркерам воспаления. Для анализа определения Treg у мышей в толстой кишке клетки, выделенные из мезентериальных лимфатических узлов, инкубировали с АРС-конъюгированными антителом против CD25, FITC-коньюгированными антителом против CD4 и РЕ-коньюгированным антителом против FoxP3 (eBioscience). Для эксперимента in vitro CD4+ Т-клетки удаляли из селезенки и лимфатических узлов. Чистоту выделенных клеток определяли методом проточного цитометрического анализа. CD4+ Т-клетки активировали при помощи прикрепленного к планшету 1 мкг/мл моноклонального антитела против CD3 и 3 мкг/мл растворимого моноклонального антитела против CD28 и анализировали на 1 и 2 день. Результаты показаны на ФИГ. 21.
Как показано на ФИГ. 21, было подтверждено, что у трансдуцированных hcMSCICOSL мышей наблюдали меньшее ущемление толстой кишки по сравнению с мышами, которые получали лечение ФСБ. Кроме того, у трансдуцированных hcMSCICOSL мышей наблюдали меньшую потерю массы тела. Эти результаты показывают, что все hcMSCICOSL демонстрируют облегчение колита и терапевтическое воздействие на мышей с колитом.
Приведенные выше результаты в сумме свидетельствуют о том, что ICOS-ICOSL-взаимодействие может играть важную роль в индукции человеческих Treg посредством MSC. В условиях воспаления hcMSC могут индуцировать экспрессию ICOSL на своей поверхности, что может способствовать индукции Treg посредством активации пути передачи сигнала PI3K-Akt в результате взаимодействия с ICOS, экспрессированным на поверхности Treg. IL-1β является мощным праймирующим фактором для улучшения человеческих Treg путем повышающей регуляции экспрессии ICOSL в hcMSC. По этим результатам можно легко понять иммуносупрессорный механизм hcMSC и применять его для разработки более эффективного терапевтического средства на основе стволовых клеток для направленного лечения трудноизлечимых иммунных заболеваний.
Пример получения 1: Получение лекарственных средств
1.1 Получение порошка
ICOSL: 100 мг
Лактоза: 100 мг
Тальк: 10 мг
Компоненты смешивают и упаковывают в герметичный мешок для получения порошков.
1.2 Получение таблетки
ICOSL: 100 мг
Кукурузный крахмал: 100 мг
Лактоза: 100 мг
Стеарат магния: 2 мг
Компоненты смешивают и придают им форму таблетки согласно обычному способу получения препарата в таблетках для получения таблеток.
1.3 Получение капсул
ICOSL: 100 мг
Кукурузный крахмал: 100 мг
Лактоза: 100 мг
Стеарат магния: 2 мг
Компоненты смешивают и наполняют ими желатиновые капсулы согласно обычному способу получения препарата в капсулах для получения капсул.
1.4 Получение агента для инъекции
ICOSL: 100 мг
Стерильная дистиллированная вода для инъекций: подходящее количество
Регулятор рН: подходящее количество
Агент для инъекции получают с содержанием вышеуказанных компонентов на 1 ампулу (2 мл) согласно обычному способу получения препарата для инъекций.
1.5 Получение жидкого агента
ICOSL: 100 мг
Сахар: 20 г
Изомеризованный сахар: 20 г
Ароматизатор «Лимон»: подходящее количество
Добавляли очищенную воду для регулирования общего объема до 100 мл. Вышеуказанные компоненты смешивают согласно обычному способу получения препарата в виде жидкого агента, затем ею заполняют емкость из коричневого стекла и стерилизуют для получения жидких агентов.
Claims (14)
1. Применение мезенхимальной стволовой клетки, гиперэкспрессирующей ICOSL (лиганд индуцируемого Т-клеточного ко-стимулятора) для лечения воспалительного заболевания или аутоиммунного заболевания.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный ICOSL экспрессируется на поверхности мезенхимальной стволовой клетки.
3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанная стволовая клетка представляет собой клональную стволовую клетку.
4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанная стволовая клетка представляет собой мезенхимальную стволовую клетку, полученную из костного мозга.
5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный ICOSL повышает экспрессию индуцируемого Т-клеточного ко-стимулятора (ICOS) Т-клетки.
6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный ICOSL активирует путь передачи сигнала PI3K (фосфоинозитид-3-киназы)-Akt.
7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанная мезенхимальная стволовая клетка обработана одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей из IL-β, ФНО-α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида).
8. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное воспалительное заболевание включает одно или более заболевание, выбранное из группы, состоящей из волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, фибромиозита, склеродермии, анкилозирующего спондилита, болезни Бехчета, афтозного стоматита, синдрома Гийена Барре, очаговой алопеции, дерматомиозита, болезни Крона, колита, узелкового полиартериита, рецидивирующего полихондрита и аутоиммунной тромбоцитопении.
9. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное аутоиммунное заболевание включает одно или более заболевание, выбранное из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системной склеродермии, инсулинзависимого сахарного диабета у детей вследствие разрушения клеток поджелудочной железы, очаговой алопеции, псориаза, пемфигуса, астмы, афтозного стоматита, хронического тиреоидита, частично приобретенной апластической анемии, первичного гепатоцирроза, язвенного колита, болезни Бехчета, болезни Крона, силикоза, асбестоза, болезни почек IgA-типа, пострептококкового гломерулонефрита, синдрома Шегрена, синдрома Гийена Барре, дерматомиозита, полимиозита, рассеянного склероза, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного энцефаломиелита, миастении гравис, гиперплазии щитовидной железы Грейвса, узелкового полиартериита, анкилозирующего спондилоартрита, фиброзита, височного артериита, болезни Вильсона, синдрома Пакони, множественной миеломы и системной красной волчанки.
10. Применение мезенхимальной стволовой клетки, гиперэкспрессирующей ICOSL (лиганд индуцируемого Т-клеточного ко-стимулятора) для индуцирования дифференцировки CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку и пролиферации регуляторной Т-клетки, индуцированной дифференцировкой.
11. Применение по п. 10, включающее одно или более вещество, выбранное из группы, состоящей из IL-β, ФНО-α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида).
12. Способ индуцирования дифференцировки CD4+ Т-клетки в регуляторную Т-клетку и пролиферации регуляторной Т-клетки, индуцированной дифференцировкой, причем указанный способ включает:
обработку CD4+ Т-клетки in vitro мезенхимальной стволовой клеткой, гиперэкспрессирующей ICOSL.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанные стволовые клетки с повышенной экспрессией ICOSL предварительно обработаны одним или более веществом, выбранным из группы, состоящей IL-β, ФНО-α, IL-6, IL-2, IL-1 и ЛПС (липополисахарида).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20160023551 | 2016-02-26 | ||
KR10-2016-0023551 | 2016-02-26 | ||
PCT/KR2017/002096 WO2017146538A1 (ko) | 2016-02-26 | 2017-02-24 | 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018124640A3 RU2018124640A3 (ru) | 2020-01-09 |
RU2018124640A RU2018124640A (ru) | 2020-01-09 |
RU2727900C2 true RU2727900C2 (ru) | 2020-07-24 |
Family
ID=59685776
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018124640A RU2727900C2 (ru) | 2016-02-26 | 2017-02-24 | Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными т-клетками |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11096967B2 (ru) |
EP (1) | EP3388514B1 (ru) |
JP (1) | JP6580791B2 (ru) |
KR (1) | KR102025417B1 (ru) |
CN (1) | CN108699524B (ru) |
AU (1) | AU2017224499B2 (ru) |
RU (1) | RU2727900C2 (ru) |
SG (2) | SG11201805468RA (ru) |
WO (1) | WO2017146538A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11058729B2 (en) * | 2018-01-25 | 2021-07-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Exosomes and miRNA to treat glaucoma |
CN111454888A (zh) * | 2019-01-18 | 2020-07-28 | 天津市第一中心医院 | 一种干细胞处理方法及使用该方法得到的细胞和应用 |
KR102268242B1 (ko) * | 2020-01-06 | 2021-06-23 | 에스씨엠생명과학 주식회사 | 줄기세포의 기능강화용 조성물 |
CN111481573A (zh) * | 2020-03-26 | 2020-08-04 | 卡替(上海)生物技术股份有限公司 | 牙髓间充质干细胞在制备克罗恩病治疗药物中的用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493869C2 (ru) * | 2007-10-17 | 2013-09-27 | ТИксСЕЛЛ | Tr1-КЛЕТКИ, МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
RU2540018C2 (ru) * | 2008-03-13 | 2015-01-27 | Биотест Аг | Средство для лечения заболевания |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2290052T3 (es) * | 1999-09-21 | 2008-02-16 | Genetics Institute, Llc | Moleculas gl50 y usos para las mismas. |
JP2008501638A (ja) * | 2004-04-23 | 2008-01-24 | ドイツ連邦共和国 | ICOS陽性細胞のinvivo枯渇によるT細胞介在病態の治療方法 |
WO2006003999A1 (ja) * | 2004-07-05 | 2006-01-12 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | ヒト抗ヒトb7rp-1抗体およびその抗体フラグメント |
CN101426533A (zh) * | 2005-12-08 | 2009-05-06 | 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 | 免疫刺激组合物和方法 |
CN102740887B (zh) * | 2009-09-30 | 2015-04-15 | 斯隆凯特林防癌纪念中心 | 用于治疗癌症的组合免疫疗法 |
EP2531216B1 (en) * | 2010-02-04 | 2019-03-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells |
JP5900865B2 (ja) | 2012-04-26 | 2016-04-06 | 国立大学法人京都大学 | T細胞の分化誘導方法、t細胞の製造方法、t細胞、医薬組成物、及び、スクリーニング方法 |
ES2434853B1 (es) * | 2012-06-12 | 2014-09-30 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii | Marcador molecular de potencia terapéutica de células madre mesenquimales humanas y sus usos |
WO2015088414A1 (en) * | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Isletone Ab | Immunomodulatory compositions |
ES2717308T3 (es) * | 2014-12-06 | 2019-06-20 | Gemoab Monoclonals Gmbh | Células madre pluri- o multi-potentes genéticamente modificadas y sus usos |
-
2017
- 2017-02-24 WO PCT/KR2017/002096 patent/WO2017146538A1/ko active Application Filing
- 2017-02-24 EP EP17756875.5A patent/EP3388514B1/en active Active
- 2017-02-24 KR KR1020170024766A patent/KR102025417B1/ko active IP Right Grant
- 2017-02-24 SG SG11201805468RA patent/SG11201805468RA/en unknown
- 2017-02-24 AU AU2017224499A patent/AU2017224499B2/en active Active
- 2017-02-24 CN CN201780009667.XA patent/CN108699524B/zh active Active
- 2017-02-24 RU RU2018124640A patent/RU2727900C2/ru active
- 2017-02-24 JP JP2018535058A patent/JP6580791B2/ja active Active
- 2017-02-24 US US16/069,486 patent/US11096967B2/en active Active
- 2017-02-24 SG SG10201912046VA patent/SG10201912046VA/en unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493869C2 (ru) * | 2007-10-17 | 2013-09-27 | ТИксСЕЛЛ | Tr1-КЛЕТКИ, МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
RU2540018C2 (ru) * | 2008-03-13 | 2015-01-27 | Биотест Аг | Средство для лечения заболевания |
Non-Patent Citations (4)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108699524B (zh) | 2019-12-10 |
CN108699524A (zh) | 2018-10-23 |
EP3388514A1 (en) | 2018-10-17 |
JP6580791B2 (ja) | 2019-09-25 |
US20190022144A1 (en) | 2019-01-24 |
SG10201912046VA (en) | 2020-02-27 |
RU2018124640A3 (ru) | 2020-01-09 |
SG11201805468RA (en) | 2018-07-30 |
WO2017146538A1 (ko) | 2017-08-31 |
KR20170101147A (ko) | 2017-09-05 |
RU2018124640A (ru) | 2020-01-09 |
AU2017224499B2 (en) | 2020-10-08 |
KR102025417B1 (ko) | 2019-09-25 |
EP3388514A4 (en) | 2018-10-24 |
JP2019501183A (ja) | 2019-01-17 |
EP3388514B1 (en) | 2023-10-25 |
AU2017224499A1 (en) | 2018-07-26 |
US11096967B2 (en) | 2021-08-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Poggi et al. | How to hit mesenchymal stromal cells and make the tumor microenvironment immunostimulant rather than immunosuppressive | |
Wu et al. | The long noncoding RNA MALAT1 induces tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells via miR155/dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin/IL10 axis | |
Ge et al. | Infusion of mesenchymal stem cells and rapamycin synergize to attenuate alloimmune responses and promote cardiac allograft tolerance | |
JP2021100955A (ja) | 癌治療のための免疫療法とサイトカイン制御療法との組み合わせ | |
Kim et al. | Interleukin (IL)-10 induced by CD11b+ cells and IL-10-activated regulatory T cells play a role in immune modulation of mesenchymal stem cells in rat islet allografts | |
US7553661B2 (en) | Stromal antigen-presenting cells and use thereof | |
RU2727900C2 (ru) | Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболеваний, опосредованных регуляторными т-клетками | |
ES2769778T3 (es) | Composiciones inmunomoduladoras | |
KR101507174B1 (ko) | 면역 특권 및 조절 전구 세포 | |
KR101846464B1 (ko) | 외래 미토콘드리아를 포함하는 자연살해세포 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
WO2010102278A1 (en) | Methods and compositions for the generation and maintenance of regulatory t cells | |
KR101415039B1 (ko) | 자기유래 활성화 림프구의 대량 증식을 위한 배지 조성물 및 배양방법 | |
KR20110125495A (ko) | Pias3을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
US20210147801A1 (en) | Methods for increasing expansion and immunosuppressive capacity of a population of cd8+cd45rclow/- tregs | |
Koga et al. | IL10-and IL35-secreting MutuDC lines act in cooperation to inhibit memory T cell activation through LAG-3 expression | |
JP2021513860A (ja) | ユニバーサル抗原提示細胞およびその使用 | |
Wang et al. | A novel role of the scaffolding protein JLP in tuning CD40-induced activation of dendritic cells | |
JP2022513055A (ja) | 形質転換されたt細胞を用いた臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の培養方法 | |
TW202305360A (zh) | 用於t細胞共培養效力測定及配合細胞療法產品使用的方法及組合物 | |
van der Zouwen et al. | Collateral damage of nonhematopoietic tissue by hematopoiesis-specific T cells results in graft-versus-host disease during an ongoing profound graft-versus-leukemia reaction | |
WO2016154176A1 (en) | Methods and compositions for modifying endothelial cells | |
Liu et al. | DCs sensitized with mPD-L1-Ig fusion protein improve the effect of heart transplantation in mice by promoting the generation of T-reg cells | |
Jiang et al. | Characterization of leptin receptor+ stromal cells in lymph node | |
CN114657123B (zh) | 白血病特异性树突状细胞来源的过表达rae-1的外泌体无细胞疫苗及其制备方法 | |
이병철 | Enhancement of therapeutic efficacy by immunomodulation in human mesenchymal stem cells |