JP6580791B2 - 調節ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用薬学的組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を通してＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化を誘導し、調節Ｔ細胞媒介性疾患を予防または治療するための組成物および方法に関する。

全ての正常個体において最も重要な特性の一つは、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質に対しては有害に反応しないのに対し、多くの非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）抗原に対しては、これを認識し、反応して除去できる能力を有しているということである。このように、自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）という。自己寛容は、自己抗原の特異的な受容体を有しているかもしれないリンパ球を除去することで、または自己抗原に接した後、自ら反応する機能が不活性化されることで発生する。自己寛容を誘導するか、または維持し続けるにあたって問題が生じると、自己抗原に対して免疫反応が起こるようになり、これによってもたらされる疾患を自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）という。例示的な自己免疫疾患の一つとしてアレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられ、アレルギー性疾患は、免疫体系の異常で一般の人には無害な物質が特定人にのみ様々な症状の過敏反応を起こす疾患を意味する。前記アレルギー性疾患を起こす物質は、アレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）または抗原といい、花粉、抗生剤、薬物、塵埃、食べ物、冷たい空気や日光等もアレルギーを誘発する原因となり得る。前記アレルギー性疾患の症状としては、蕁麻疹、くしゃみ、掻痒症、鼻水、咳、枯草熱、はやり目、湿疹、発疹等がある。代表的なアレルギー性疾患としては、気道狭窄、肺粘液分泌増加、呼吸困難、咳等の症状を伴うアレルギー性喘息があり、それ以外にアトピー性皮膚炎、結膜炎、鼻炎、および潰瘍性大腸炎等がある。

このように、各種の自己免疫体系の異常により発生する疾病と関連して、調節Ｔ細胞の重要性に関する研究が盛んに進められている。１９７０年代初期、Ｇｅｒｓｈｏｎにより姑息なＴ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ）の効果器機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｔｉｏｎ）を制御および抑制できるＴ細胞の存在可能性が抑制Ｔ細胞という概念を導入して初めて提示された以来（Ｒ．Ｋ．Ｇｅｒｓｈｏｎ ａｎｄ Ｋ．Ｋｏｎｄｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９７０，１８：７２３−３７）、免疫学の多くの分野で調節Ｔ細胞の生物学的特性および機能を糾明するための研究がなされてきた。特に、１９９５年、ＳａｋａｇｕｃｈｉによりＣＤ２５が自然発生ＣＤ４^＋調節Ｔ細胞の重要な表現型マーカーとして作用できることが提示された以来（Ｓ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１５５：１１５１−１１６４）、自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）に対する末梢寛容（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の誘導において調節Ｔ細胞が有する役割と重要性に関する研究が重点的に遂行されていた。

近年は、Ｔ細胞媒介性疾病が多数の免疫系疾患を代表する疾病と認識されており、特に、Ｔ細胞は、自己免疫疾患を発生させ、永続させるものと見なされている。自己抗原への免疫反応は、自己反応性Ｔ細胞の持続的な活性化または定期的な活性化によりなされ、自己反応性Ｔ細胞は、直間接的に自己免疫疾患で確認される特徴的な組織傷害および組織破壊の原因として注目されている。

従って、自己免疫疾患およびその他のＴ細胞媒介性疾病に対する多くの治療剤が提示されているが、依然としてまた他の治療剤が必要な実情であり、特に、治療剤として活用されるためには、その正確な機序に関する研究が必要である。

一方、間葉系幹細胞は、多分化能の他に免疫細胞の活性と分化を調節できる免疫調節能を有していると知られており、様々な炎症性環境でＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、自然殺害細胞、樹状細胞等を調節して調節Ｔ細胞を誘導して免疫反応を抑制できると知られている。しかし、調節Ｔ細胞の誘導に関しては、具体的な調節因子や作用機序についてはほとんど知られておらず、それを自己免疫疾患等の免疫疾患治療に活用するための具体的な機序および有効成分に関する研究が未だ不足している状況である。

本発明者らは、間葉系幹細胞と調節Ｔ細胞媒介性疾患に関して研究していた中、間葉系幹細胞表面のＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）がＣＤ４＋Ｔ細胞を調節Ｔ細胞に分化するように誘導でき、それを通して多くの調節Ｔ細胞を生産し、Ｔ細胞媒介性疾患を効果的に改善できることを確認して本発明を完成した。

従って、本発明の目的は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用薬学的組成物、ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化誘導用組成物および方法を提供することである。

前記目的を達成するために、本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

また、本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および増殖誘導用組成物を提供する。

さらに、本発明は、ＩＣＯＳＬまたはＩＣＯＳＬの発現が増加した幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋Ｔ細胞に処理するステップ；を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調節Ｔ細胞に分化および増殖を誘導する方法を提供する。

本発明のＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、調節Ｔ細胞のＩＣＯＳの発現を誘導することでＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ機序を通して調節Ｔ細胞の分化を誘導できるだけでなく、ＰＢＭＣの増殖を効果的に抑制できるので、調節Ｔ細胞媒介性疾患を効果的に予防、治療または改善できる。

ｈｃＭＳＣのマーカー発現をフローサイトメトリーを通して確認した結果を示した図である。点線は、同型対照Ａｂで染色されたものを示し、実線は、各マーカーの特異的発現を示す。 ｈｃＭＳＣのＩｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞抑制活性をＣＦＳＥアッセイを通して確認した結果を示した図である（Ｍ；ｈｃＭＳＣ、Ｐ：ＣＦＳＥ染色されたＰＢＭＣ）。 Ａは、Ｔｒｅｇ誘導条件でのＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ分化を２、５日目にフローサイトメトリーを通して確認した結果を示した図であり、ＢおよびＣは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ分化に及ぼすｈｃＭＳＣの影響をＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現（Ｂ）およびＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５＋細胞の増加を通して確認（Ｃ）した結果を示した図である（＊、Ｐ＝０．０１７）。 ｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔ細胞共同培養によるＣＤ４＋Ｔ細胞の形態を光学顕微鏡を通して確認した結果（Ａ）、および浮遊性ＣＤ４＋Ｔ細胞および付着性ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋の変化を比較した結果（Ｂ）を示した図である（青いボックス：浮遊性ＣＤ４＋Ｔ細胞、赤いボックス：ｈｃＭＳＣ付着性ＣＤ４＋Ｔ細胞）。 ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養、トランズウェル培養、浮遊性ＣＤ４＋Ｔ細胞、接着性ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋の変化を比較した結果を示した図である。 ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養によるｈｃＭＳＣのＩＣＯＳＬタンパク質発現の変化（Ａ）、ｍＲＮＡ発現の変化（Ｂ）を確認した結果、およびＩＣＯＳＬ発現を共焦点顕微鏡で確認した結果（Ｃ）を示した図である（倍率：Ｘ２００，Ｘ４００）。 ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養によるＩＣＯＳタンパク質発現の変化（Ａ）、およびＣＤ４^＋細胞でのＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＩＣＯＳの発現変化（Ｂ）を確認した結果を示した図である。 抗−ＩＣＯＳＬ Ａｂ（１０μｇ／ｍＬ）（αＩＣＯＳＬ）または対照群Ａｂ（Ｃｏｎ Ａｂ）処理による、ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養によるＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびＩＣＯＳの発現変化をフローサイトメトリーおよびＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ細胞およびＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４^＋ＩＣＯＳ^＋Ｔ細胞を通して確認した結果を示した図である（＊Ｐ＝０．０１７、＊＊Ｐ＝０．０４９）。 抗−ＩＣＯＳＬ Ａｂ（１０μｇ／ｍＬ）（αＩＣＯＳＬ）または対照群Ａｂ（Ｃｏｎ Ａｂ）処理による、ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養によるＣＤ４^＋Ｔ細胞のＩＬ−１０生産をフローサイトメトリー（Ｂ）およびＥＬＩＳＡ分析（Ｃ）を通して確認した結果を示した図である（＊＊＊Ｐ＝０．０３）。 ＩＣＯＳＬを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈＩＣＯＳＬ）を用いた遺伝子ターゲティングによるＩＣＯＳＬのノックダウン結果（Ａ）およびノックダウンによるＴｒｅｇ誘導効果の変化（Ｂ）をｑＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーを通して確認した結果を示した図である（＊Ｐ＝０．００８、＊＊Ｐ＝０．０１３）。 全長ヒトＩＣＯＳＬを発現するレンチウイルスが導入されたｈｃＭＳＣ（ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}）および空ベクターが導入されたＭＳＣ対照群（ｈｃＭＳＣ^Ｅｍｐ）でのＩＣＯＳＬの発現増加をｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）、ウェスタンブロット（Ｂ）、フローサイトメトリー（Ｃ）を通して確認した結果を示した図である。 ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}のＴｒｅｇ誘導増加効果（Ａ）をフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡで確認した結果（＊Ｐ＝０．０４５、＊＊Ｐ＝０．０４９）およびＴｒｅｇによるＩＬ−１０分泌増加効果をフローサイトメトリー（Ｂ）およびＥＬＩＳＡ（Ｃ）（＊＊＊Ｐ＝０．０３４）を通して確認した結果を示した図である。 ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}またはｈｃＭＳＣ^Ｅｍｐの共同培養物から分離されたＣＤ２５＋集団をＣＦＳＥ標識されて活性化されたＰＢＭＣと共に１：５または１：１０（Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ）で３日間共同培養した後、ＰＢＭＣの増殖をＣＦＳＥ希釈評価フローサイトメーターを通して分析した結果を示した図である。 ｒｈＩＣＯＳＬ処理によるＴｒｅｇ分化誘導効果をフローサイトメトリーを通して確認した結果（Ａ）およびｒｈＩＣＯＳＬ処理によるＡｋｔリン酸化効果をウェスタンブロットを通して確認した結果（Ｂ）を示した図である。 ＩＣＯＳＬ媒介されたＴｒｅｇ分化において、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路が関与するか否かを確認するために、ＰＩ３Ｋ抑制剤ＬＹ２９４００２（５μＭ）およびＡｋｔ抑制剤ＧＳＫ６９０６９３（１μＭ）処理によるＰＩ３Ｋ−Ａｋｔのリン酸化抑制（Ａ）およびＴｒｅｇ分化抑制効果（Ｂ）を確認した結果を示した図である。 非クローナルＭＳＣ（ｈｎｃＭＳＣ）およびｈｃＭＳＣ１〜４のＩＣＯＳＬ発現差をＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果（Ａ、Ｂ）およびこれらのＴｒｅｇ細胞誘導能力を混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）でＰＢＭＣとの共同培養（Ｃ）またはＴｒｅｇ誘導条件（Ｄ）で比較した結果を示した図である。 ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ処理によるＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡの発現増加（Ａ）、ＩＬ−１βによるＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡの時間による発現増加（Ｂ）、ＩＬ−１βによるＩＬ−１Ｒ発現変化（Ｃ）を確認した結果を示した図である。 ＩＬ−１β処理によるクローナル（ｈｃＭＳＣ）および非−クローナルＭＳＣ（ｈnｃＭＳＣ）のＩＣＯＳＬ誘導効果をｑＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）、ウェスタンブロット（Ｂ）、フローサイトメトリー（Ｃ）を通して確認した結果を示した図である。 抗−ＩＬ−１β中性化抗体の処理によるＩＬ−１β遮断後のＩＣＯＳＬ発現が誘導変化を確認した結果を示した図である（＊Ｐ＝０．００３）。 ＩＬ−１βプライミングによるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋またはＣＤ４^＋ＩＣＯＳ^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞集団の比率をフローサイトメトリーを通して確認した結果を示した図である（ｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}；ＩＬ−１βプライミングｈｃＭＳＣ、ｈｃＭＳＣ^Ｖｅｈ；ＩＬ−１β未処理ｈｃＭＳＣ）。 抗−ＩＣＯＳＬ中和抗体処理（αＩＣＯＳＬ）によってｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}および正常ｈｃＭＳＣにより誘導されるＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇ減少効果を確認した結果を示した図である。 ＤＳＳ大腸炎モデル製造方法を示した模式図である。 ＤＳＳ誘導された大腸炎マウスモデルでｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}処理による大腸長さ変化を確認した結果を示した図である。

本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

本発明においては、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞が調節Ｔ細胞に分化することおよび調節Ｔ細胞の増殖を促進できることを確認し、これを通して炎症性または自己免疫性反応を抑制して調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療に用いられ得ることを確認した。

本発明の「ＩＣＯＳ」は、Ｈ４またはＡＩＬＩＭとも呼ばれ、共同刺激分子であるＣＤ２８のスーパーファミリーであり、活性化されたＴ細胞でその発現が増加するものと知られている。ＩＣＯＳは、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７ＲＰ−１、Ｂ７ｈ、ＧＬ５０、およびＬＩＣＯＳとも知られているＩＣＯＳＬと結合して細胞間信号伝達を媒介できる。ＩＣＯＳＬは、Ｔ細胞活性化信号を伝達する共同刺激タンパク質であり、ヒトの場合、ＩＣＯＳＬＧ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３０８）によって暗号化される。また、ＩＣＯＳＬは、Ｂリンパ球で豊富に発現されるものと知られており、特に、炎症性条件下で間葉系幹細胞表面に発現が増加し得る。

本発明において、前記ＩＣＯＳＬは、間葉系幹細胞由来であってよく、「間葉系幹細胞由来」は、間葉系幹細胞表面に発現されたＩＣＯＳＬまたはそれを分離した形態を指す。
従って、本発明のＩＣＯＳＬは、間葉系幹細胞表面に発現された形態またはそれを組み換えて合成された分離形態を全て制限なく含むことができる。

本発明の「ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞」は、ＩＣＯＳＬの間葉系幹細胞表面発現が正常対照群と比較して増加している幹細胞を意味し、ＩＣＯＳＬの表面発現の増加は、ＩＣＯＳＬの遺伝子導入、発現増加誘導等、当分野に公知になった遺伝子またはタンパク質発現増加方法を制限なく利用して達成できる。本発明の一例示においては、全長ヒトＩＣＯＳＬ遺伝子を発現するレンチウイルスをウイルスパッキング構造体（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）と共にｈｃＭＳＣ（ｈｕｍａｎ ｃｌｏｎａｌ ＭＳＣ）に導入して、間葉系幹細胞でＩＣＯＳＬの発現の増加を誘導し、ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を製造した。ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｒｅｇ）に分化することを促進する能力および調節Ｔ細胞の増殖を促進する能力に優れており、炎症または自己免疫反応、例えば、大腸炎をさらに効果的に抑制できる。

また、本発明において、幹細胞は、クローナル間葉系幹細胞（ｃｌｏｎａｌ ＭＳＣ）であることが好ましい。本発明においては、前記クローナル間葉系幹細胞を使用する場合、ｈｎｃＭＳＣ（ｈｕｍａｎ ｎｏｎ ｃｌｏｎａｌ ＭＳＣ）より顕著に優れたＩＣＯＳＬの発現を誘導できることを実施例１１を通して確認した。単クローナル幹細胞は、当分野に公知になった収得方法を通して得ることができるが、好ましくは、Ｓｏｎｇ ＳＵ，ｅｔ ａｌ．（２００８）（Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １７（３）：４５１−４６１．）に開示された層分離培養収得方法によって分離することができ、前記文献は、本発明に参照として統合される。単クローナル幹細胞は、ＩＣＯＳＬの発現がｈｎｃＭＳＣより増加しており、調節Ｔ細胞の分化誘導効果もまたｈｎｃＭＳＣより優れ、炎症性または自己免疫性疾患の治療にさらに効果的に利用できる。

本発明において、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される１種以上由来の間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）であってよく、特に好ましくは、骨髄由来間葉系幹細胞であってよい。本発明の間葉系幹細胞は、幹細胞そのものだけではなく、その培養物を制限なく含む概念と理解することができる。

本発明のＩＣＯＳＬは、間葉系幹細胞の表面に発現され、Ｔ細胞のＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）発現を増加させることを特徴とすることができる。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化の間、Ｔ細胞の表面に発現され、本発明においては、ｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔ細胞の共同培養を通してＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇｓがさらに高いＩＣＯＳの発現を示すことを確認した。

また、本発明のＩＣＯＳＬは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路を活性化させることを特徴とすることができ、ＩＣＯＳＬとＴ細胞上のＩＣＯＳの結合を通して、ＴｒｅｇでＡｋｔのリン酸化を促進し、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路が活性化される。

本発明のまた他の様態においては、ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上で処理されたことを特徴とする、調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

前記ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上、好ましくはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、最も好ましくはＩＬ−１βは、間葉系幹細胞に処理することで幹細胞をプライミングする役割を果たすことができる。より具体的には、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上を間葉系幹細胞に処理すれば、間葉系幹細胞でＩＣＯＳＬの発現の増加を誘導でき、それを通してＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を製造することで調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）分化および増殖を強く促進できる。また、製造されたＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）分化および増殖促進効果を通して調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用幹細胞治療剤として利用され得る。

従って、本発明は、間葉系幹細胞およびＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上、好ましくはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、最も好ましくはＩＬ−１βを個別的区画に含むキットの形態でも提供され得、間葉系幹細胞にＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上、最も好ましくはＩＬ−１βを前処理することで、間葉系幹細胞でＩＣＯＳＬの過発現を誘導し、それを通してＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療用組成物を製造することができる。

本発明において、「調節Ｔ細胞媒介性疾患」は、調節Ｔ細胞の異常または欠乏によって誘導される疾患を意味し、具体的には、炎症性疾患または自己免疫性疾患であることを特徴とすることができる。

本発明の一様態において、前記炎症性疾患は、狼瘡、シェーグレン症候群、リウマチ関節炎、線維筋炎、強皮症、強直性脊椎炎、ベーチェット病、アフタ性口内炎、ギラン・バレー症候群、円形脱毛症、皮膚筋炎、クローン病、大腸炎、結節性多発動脈炎、再発性多発軟骨炎および自己免疫血小板減少症で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とすることができる。

また、本発明の一様態において、前記自己免疫性疾患は、リウマチ性関節炎、全身性強皮症、膵臓細胞抗体によるインスリン依存型小児期糖尿病、円形脱毛症、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、一部の後天性再生不良性貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、クローン病、珪肺、石綿肺症、ＩｇＡ腎臓疾患、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症、グレーブス甲状腺亢進症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、線維組織炎、側頭動脈炎、ウィルソン病、ファンコーニ症候群、多発性骨髄腫および全身性エリテマトーデスからなる群で１種以上であることを特徴とすることができる。

本発明の組成物は、薬剤学的に許容される担体および／または添加物等を含むことができる。例えば、滅菌水、生理食塩水、寛容の緩衝剤（リン酸、クエン酸、その他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤等を含むことができる。また、バイオポリマー等の有機物、ヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）等の無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体、そして、これらの混合組成物を利用することができるが、これに限定されるものではない。前記安定剤としては、例えば、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウム等を用いることができる。前記酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルまたはエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を用いることができる。前記懸濁剤は、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を用いることができる。前記等張化剤としては、例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビトール等を用いることができる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を用いることができる。

このように製造された本発明に係るＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞、その培養物またはＩＣＯＳＬを含む薬学的製剤は、当業界において通常用いる投与方法を利用して移植およびその他の用途に用いられる他の幹細胞と共にまたはそのような幹細胞との混合物の形態で投与され得、具体的には、治療が必要な患者の疾患部位に直接生着または移植するか、あるいは腹腔に直接移植または注入することが可能であるが、これに限定されることはない。また、前記投与は、カテーテルを用いた非外科的投与および疾患部位切開後の注入または移植等の外科的投与方法がいずれも可能であるが、カテーテルを用いた非外科的投与方法がより適切である。また、常法によって非経口的に、例えば、直接病変に投与することの他に血管内注入による移植も可能である。前記幹細胞の１回投与量は、１．０×１０^４〜１．０×１０^１０細胞／ｋｇ体重、具体的には、１．０×１０^５〜１．０×１０^９細胞／ｋｇ体重、より具体的には、１．０×１０^６〜１．０×１０^８細胞／ｋｇ体重を１回または数回に分けて投与できる。しかし、有効成分の実際の投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢および性別等の様々な関連因子に照らして決定されなければならないものと理解されるべきであり、従って、前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。

また、本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を個体に投与するステップ；を含む調節Ｔ細胞媒介性疾患の予防または治療方法を提供する。

前記個体は、ヒトを含む哺乳類であることが好ましく、調節Ｔ細胞媒介性疾患治療を要する患者であって調節Ｔ細胞媒介性疾患治療中の患者、調節Ｔ細胞媒介性疾患治療を受けたことのある患者、調節Ｔ細胞媒介性疾患治療を受ける必要がある患者を全て含み、調節Ｔ細胞媒介性疾患治療のために外科的手術を施行した患者もまた含まれ得る。

また、本発明は、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、その他の既存の調節Ｔ細胞媒介性疾患治療のための薬物または治療方法と併用して処理され得る。本発明のＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を併用処理する場合、これは、調節Ｔ細胞媒介性疾患治療のための他の薬物または治療方法と同時にまたは順次に処理され得る。

また、本発明は、一様態として、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および増殖誘導用組成物を提供する。

前記「分化および増殖誘導」とは、間葉系幹細胞表面のＩＣＯＳＬとＣＤ４＋Ｔ細胞の直接的な接触によってＣＤ４＋Ｔ細胞が調節Ｔ細胞に分化することを促進し、ＩＣＯＳＬ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ）またはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞により分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖が促進されることを意味する。

前記組成物は、間葉系幹細胞でＩＣＯＳＬの発現をさらに促進するための目的で、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上、好ましくはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、最も好ましくはＩＬ−１βをさらに含むことを特徴とする組成物であってよく、前記ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳからなる群から選択された１種以上は、間葉系幹細胞表面にＩＣＯＳＬの過発現を促進するように幹細胞をプライミングする物質である。

また、本発明のまた他の一様態として、本発明は、ＩＣＯＳＬまたはＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋Ｔ細胞に処理するステップ；を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調節Ｔ細胞に分化誘導する方法を提供する。

前記方法において、ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞は、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上、好ましくはＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、最も好ましくはＩＬ−１βで前処理されたことを特徴とすることができ、ＩＣＯＳＬまたはＩＣＯＳＬの発現が増加した幹細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞との直接的な接触を通してＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＣＯＳの発現増加を誘導し、調節Ｔ細胞への分化および分化された調節Ｔ細胞の増殖を促進することができる。

本方法において、前記処理は、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＣＯＳＬがコーティングされたウェルで培養するか、またはＣＤ４＋Ｔ細胞とＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を共同培養することをいずれも含むことができる。

以上、本明細書に記載の数値は、別に明示されていない限り、均等範囲まで含むものと解釈されるべきである。

以下、本発明の理解を助けるために、好ましい製造例、実施例および製剤例を提示する。しかし、下記の製造例、実施例および製剤例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであるだけで、製造例、実施例および製剤例によって本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１．ヒトクローナルＭＳＣ（ｈｃＭＳＣ）の特性分析
ヒト骨髄を健常な男性志願者から得て、仁荷大学校病院の倫理委員会の承認（ＩＲＢ ＃１０−５１）によって実験を遂行した。ｈｃＭＳＣを以前の文献（Ｓｏｎｇ ＳＵ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｌｏｎａｌ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １７（３）：４５１−４６１．）による層分離培養法で分離した。全てのｈｃＭＳＣを１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充された低グルコースＤＭＥＭ培地で培養し、分離されたｈｃＭＳＣに対するフローサイトメトリーを通して様々な細胞表面マーカーを確認した。前記分析に用いられた抗体は、次のとおりである：抗−ＣＤ２９（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）、抗−ＣＤ４４（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗−ＣＤ１０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗−ＣＤ３４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗−ＣＤ４５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ９０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ７３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＨＬＡ ＤＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗−ＣＤ８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗−ＣＤ８６（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）、および抗−Ｏｃｔ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）。細胞は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して分析し、同型でマッチされた対照群抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を対照群として利用した。フローサイトメトリーを利用してｈｃＭＳＣの表面マーカー発現を確認した結果を図１に示した。

図１に示したように、ＣＤ２９、ＣＤ４４、Ｃ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４およびＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉに対する陽性、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ−ＤＲに対する陰性発現を確認し、共同刺激因子ＣＤ８０、ＣＤ８６に対しても陰性発現を確認した。

ｈｃＭＳＣのＩｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣ活性をＣＦＳＥアッセイを通して確認した。
ｈｃＭＳＣとＰＨＡで処理されたＰＢＭＣを共同培養し、より具体的には、１Ｘ１０^６ＰＢＭＣを１ｕＭ ＣＦＳＥで染色し、染色されたＰＢＭＣを１Ｘ１０^５または１Ｘ１０^６のｈｃＭＳＣの存在または非存在下で１ｕｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激した。ＰＨＡ刺激７２時間後、ＰＢＭＣを収穫してフローサイトメーターで分析し、その結果を図２に示した。

図２に示したように、ｈＭＳＣをＰＨＡ処理で活性化されたＰＢＭＣと共同培養した場合、それはＰＢＭＣの増殖を抑制した。

実施例２．ｈｃＭＳＣのＴｒｅｇ分化誘導確認
ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）を健常な供与者から得て、ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を通して分離した。ＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｓｌｅｙ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を利用して収得した。

先ず、Ｔｒｅｇ分化を確認するために、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンが補充されたＲＰＭＩ １６４０含有完全培地で培養した。２４ウェルプレートを１ｕｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３単クローン抗体で４℃で一晩間コーティングした。また、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｒｅｇ分化のための条件であるａｎｔｉ−ＣＤ３、ａｎｔｉ−ＣＤ２８、ＩＬ−２、ＴＧＦ−ｂ１、およびａｔＲＡで刺激した。Ｔｒｅｇ分化を確認するために、ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５の発現を２日および５日目に確認した。

Ｔｒｅｇ誘導とｈｃＭＳＣとの関連性を確認するために、ｈｃＭＳＣと共同培養またはｈｃＭＳＣなしにＣＤ４＋Ｔ細胞だけを単独培養し、その結果を培養１〜３日目のＦｏｘＰ３およびＣＤ２５発現分析およびＦｏｘＰ３^＋ＣＤ４＋ＣＤ２５^＋細胞の増加を通して確認し、その結果を図３に示した。

図３に示したように、Ｔｒｅｇ誘導条件で漸次にＦｏｘＰ３^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇが確認（Ａ）された。また、ｈｃＭＳＣとの共同培養が明確にさらに多くのＦｏｘＰ３^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇを誘導（Ｂ）でき、ＣＤ４＋Ｔ細胞由来のＦｏｘＰ３^＋ＣＤ２５^＋集団もまた増加させることができることを確認（Ｃ）した。このような結果を通して、ｈｃＭＳＣがＴｒｅｇを強く誘導できるということを確認した。

実施例３．ｈｃＭＳＣの接触依存的誘導効果確認
ｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔ細胞を共同培養し、これらの細胞の様子を光学顕微鏡（Ｘ４００）で確認し、存在形態によって付着または浮遊形態に分けてこれらのＣＤ２５およびＦｏｘＰ３発現量をフローサイトメトリー法を通して比較した。

図４に示したように、ＣＤ４＋Ｔ細胞が付着または浮遊形態で存在することを光学顕微鏡上で確認し（Ａ）、一部のＣＤ４＋Ｔ細胞がｈｃＭＳＣに付着しており、このような付着ＣＤ４＋Ｔ細胞はさらに多くのＣＤ２５とＦｏｘＰ３を発現した。これに対し、一部のＣＤ４＋Ｔ細胞は培養培地で浮遊した状態で存在し、このような浮遊細胞は、付着細胞よりさらに少ない量のＣＤ２５およびＦｏｘＰ３を発現した（Ｂ）。

ＭＳＣ媒介されたＴｒｅｇ誘導に細胞が付着しているか否かが影響を及ぼすか否かをさらに検証するために、トランズウェルアッセイを２日間遂行した。トランズウェルアッセイのために、ＣＤ４＋Ｔ細胞は下部チャンバに培養し、ｈｃＭＳＣ上部チャンバに培養して、このような培養方法によってもｈｃＭＳＣによるＴｒｅｇ誘導効果が現れ得るか否かを確認し、その結果を図５に示した。

図５に示したように、トランズウェルアッセイを通してＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣを分離培養した場合、ｈｃＭＳＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の発現に影響を与えなかった。

このような結果は、ｈｃＭＳＣ媒介されたＴｒｅｇ誘導は細胞間接触を要し、ｈｃＭＳＣとＴ細胞間の直接的な相互作用がＣＤ４＋Ｔ細胞でＴｒｅｇの分化のための誘導信号伝達に重要な役割を果たせることを示す。

実施例４．ｈｃＭＳＣ上のＩＣＯＳＬ発現とＴｒｅｇ誘導関連性確認
ｈｃＭＳＣとＴ細胞の直接的な相互作用がＴｒｅｇ分化を誘導するということを確認したので、ｈｃＭＳＣ上のＩＣＯＳＬの発現が信号伝達に重要な役割を果たすと予想し、それを確認するための実験を遂行した。Ｔｒｅｇ誘導条件下でｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔｒｅｇを２日間共同培養し、ｈｃＭＳＣでのＩＣＯＳＬタンパク質の発現をフローサイトメトリーで、ｍＲＮＡの発現を共同培養２４時間後ｑＲＴ−ＰＣＲを通して確認し、ｈｃＭＳＣ上のＩＣＯＳＬの発現を非付着ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去した後、免疫蛍光染色を通して共焦点顕微鏡を通して確認した。ｈｃＭＳＣの総ＲＮＡは、ＥａｓｙＢｌｕｅ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｔｒｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）利用して測定し、ｃＤＮＡを２ｕｇの総ＲＮＡから合成した。
ＲＴ−ＰＣＲをＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を通して遂行した。増幅されたＰＣＲ産物をＳｙｂｒＳａｆｅを含む１％アガロースゲル上に電気泳動し、蛍光イメージ分析器を通して分析した。ＰＣＲは、下記プライマーを利用して遂行した：ＩＬ−１０（正方向５´−ＡＴＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＣＴＡＣＴＡＡ−３´および逆方向５´−ＴＡＡＡＴＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣ−３´）、ＩＬ−１（正方向５´−ＧＣＴＧＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣ−３´および逆方向５´−ＴＧＡＧＧＡＧＧＧＡ−ＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧ−３´）、ＩＬ−１Ｒ（正方向５´−ＡＴＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＣＣＴＧＴ ＣＣ−３´および逆方向５´−ＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡ−３´）とＧＡＰＤＨ（正方向５´−ＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３´および逆方向５´−ＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧ−３´）。

ＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡを確認するために、ｑＲＴ−ＰＣＲをＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅｓ（Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００３２３６２１＿ｍ１；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して遂行した。ｍＲＮＡ水準は、１８ｓ ｒＲＮＡ（Ｈｓ０３９２８９８５＿ｇ１）に対して標準化し、その結果を図６に示した。

図６に示したように、ＩＣＯＳＬは、Ｔｒｅｇ分化条件でｈｃＭＳＣとの共同培養の場合、明確に上向き調節されることをフローサイトメトリーを通して確認した（Ａ）。また、フローサイトメトリーの結果と同様に、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果でも、共同培養の間、ｈｃＭＳＣのＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡ発現が増加したことを確認した（Ｂ）。ｈｃＭＳＣ共同培養でのＩＣＯＳＬの発現の増加が免疫蛍光染色においても同様に現れた（Ｃ）。

このような結果は、Ｔｒｅｇ誘導条件下でｈｃＭＳＣ上のＩＣＯＳＬの発現が増加するということを示す。

実施例５．ｈｃＭＳＣとの共同培養を通したＴ細胞のＩＣＯＳの発現増加確認
Ｔ細胞活性化の間、Ｔ細胞のＩＣＯＳは上向き調節されているものと知られており、ＡＰＣのＩＣＯＳＬの発現は、Ｔｒｅｇ誘導促進を通してＴ細胞の反応を抑制できるものと知られている。ｈｃＭＳＣがＴ細胞のＩＣＯＳ発現に影響を与えるか否かを確認するために、ｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｒｅｇ分化条件下で４８時間の間共同培養し、ｈｃＭＳＣの存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＣＯＳの誘導を５回の独立的実験を通して確認した結果を図７に示した。

図７に示したように、ＩＣＯＳは、ＣＤ４＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣの共同培養条件でさらに増加するものと示され（Ａ）、興味深いことにｈｃＭＳＣの存在下でＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇはさらに高いＩＣＯＳを発現した（Ｂ）。このような結果は、ｈｃＭＳＣが、ＣＤ４＋Ｔ細胞がさらに高いＩＣＯＳ発現およびＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ表現型を示すように誘導するということを示す。

実施例６．ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬの信号伝達経路の確認
Ｔｒｅｇ誘導とｈｃＭＳＣ上のＩＣＯＳＬとの相互作用を直接的に検証するために、ＩＣＯＳＬの機能を遮断し、それによる変化を確認した。ＩＣＯＳＬの機能遮断のために、ＩＣＯＳＬに対する中和抗体処理実験および遺伝子ターゲティング実験を遂行した。

より具体的には、ＩＣＯＳＬの機能を遮断するために、共同培養されたｈｃＭＳＣとＣＤ４＋Ｔ細胞に抗−ＩＣＯＳＬ中性化抗体を１０μｇ／ｍＬの量で添加した。細胞表面をＦＩＴＣまたはＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）−接合されたＣＤ２５、ＡＰＣおよびＰＥ−接合されたＩＣＯＳ、ＦＩＴＣ−接合されたＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で暗環境、４℃で２０分間染色した。２日間共同培養を遂行し、ＦｏｘＰ３^＋ＣＤ２５^＋およびＦｏｘｐ３^＋ＩＣＯＳ^＋集団の比率をフローサイトメトリーを通して確認した。

一方、ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬの相互作用がＩＬ−１０生産に重要し、Ｔｒｅｇ発現ＩＣＯＳがＩＬ−１０生産を促進するので、ｈｓＭＳＣにより誘導されるＴｒｅｇによるＩＬ−１０の生産をフローサイトメーターおよびＥＬＩＳＡで分析した。ＩＬ−１０生産は、ＰＭＡ（４０ｎｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）およびＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（１μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）で５時間の間細胞を再刺激した後に確認し、刺激の終了のためにＭｏｎｅｎｓｉｎ（４μＭ；Ｓｉｇｍａ）を加えた。

前記のようなｈｃＭＳＣ媒介Ｔｒｅｇ誘導において、中和抗体処理を通したＩＣＯＳＬの機能遮断による結果を図８に示した。

図８に示したように、ＩＣＯＳＬに対する中和抗体処理（αＩＣＯＳＬ）は、ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇ集団を明確に減少させ、これによってＴｒｅｇ集団でＩＣＯＳ発現もまた減少することを確認した（Ａ）。一方、ｈｃＭＳＣは、ＴｒｅｇのＩＬ−１０生産を有意的に増加させたのに対し、ＩＣＯＳＬ中和抗体処理によってＩＬ−１０の生産は減少した（Ｂ、Ｃ）。

また、ｈｃＭＳＣのＩＣＯＳＬを、ＩＣＯＳＬを標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈＩＣＯＳＬ）発現レンチウイルス感染を通してノックダウンさせた後、これによるＴｒｅｇ集団をＦｏｘｐ３、ＩＣＯＳ、ＣＤ２５の発現変化を確認した。レンチウイルスｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）−媒介された遺伝子ノックダウンのために、ＩＣＯＳＬウイルス粒子をＳａｎｔａ ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ．）から購入して用いた。ｓｈＲＮＡ形質感染のために、１×１０^５ｈｃＭＳＣを２４−ウェルプレート上に分注し、翌日、付着ｈｃＭＳＣを対照群（ｓｈＣｏｎ）またはＩＣＯＳＬ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（ｓｈＩＣＯＳＬ）でポリブレン（５μｇ／ｍＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を添加するか、または添加せずに２４時間の間感染させた。ＩＣＯＳＬのノックダウンは、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を通して確認し、感染されたｈｃＭＳＣは、以後、Ｔｒｅｇ誘導条件でＣＤ４＋Ｔ細胞との共同培養に使用し、ノックダウンの結果およびノックダウンによるＴｒｅｇ誘導効果の変化を図９に示した。

図９に示したように、ＩＣＯＳＬは、ｓｈＲＮＡ処理により効果的にノックダウンされ（Ａ）、このようなノックダウンによってｈｃＭＳＣのＴｒｅｇ誘導はＩＣＯＳＬノックダウン群で減少することを確認した（Ｂ）。

このような結果は、ＩＣＯＳＬがｈｃＭＳＣ媒介Ｔｒｅｇ誘導に必須な役割をするということを示す。

実施例７．ｈｃＭＳＣのＩＣＯＳＬ過発現によるＴｒｅｇ集団誘導
７．１．ＩＣＯＳＬ過発現誘導確認
ＭＳＣ媒介Ｔｒｅｇ誘導において、ｈｃＭＳＣでＩＣＯＳＬの過発現を誘導し、それによる効果を確認した。ＩＣＯＳの過発現のために、全長ヒトＩＣＯＳＬ遺伝子を発現するレンチウイルスをｈｃＭＳＣにウイルスパッキング構造体（ｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）と共に導入した。より具体的には、全長ヒトＩＣＯＳＬ遺伝子発現ベクターをＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｍＧＦＰタギングされたｐＬｅｎｔｉベクターにサブクローンした。ｃＤＮＡ定量化のために、これをｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換させ、結果物であるクローンをＩＣＯＳＬ挿入確認のために配列分析した。２９３ＦＴ細胞にＩＣＯＳＬ発現ベクターをＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｋｉｔ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を利用して形質感染させた。２．５×１０^６の２９３ＦＴ細胞をレンチウイルス生産のために１００−ｍｍ培養ディッシュに分注した。２日後、ウイルス−包含培養上澄みを収穫し、ｈｃＭＳＣ感染に使用した。ｈｃＭＳＣｓ感染後、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーをＩＣＯＳＬ過発現水準確認のために遂行し、その結果を図１０に示した。

図１０に示したように、全長ヒトＩＣＯＳＬを発現するレンチウイルスが導入されたｈｃＭＳＣ（ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}）は、空ベクターが導入されたＭＳＣ対照群（ｈｃＭＳＣ^Ｅｍｐ）と比較して、ＩＣＯＳＬのｍＲＮＡおよびタンパク質発現がいずれも増加していることを確認した（Ａ、Ｂ）。また、ＩＣＯＳＬと融合されたレンチウイルスベクター発現ＧＦＰ発現を通してＩＣＯＳＬ誘導をさらに確認した結果、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}でＧＦＰが増加し、ＩＣＯＳＬの過発現が効果的に誘導されたことを確認した。

７．２．ｈｃＭＳＣ ^{ＩＣＯＳＬ} でのＴｒｅｇ誘導増加確認
前記７．１．でｈｃＭＳＣでＩＣＯＳＬが過発現されたことを確認したので、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}でのＴｒｅｇ誘導が増加したか否かをフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを通して確認し、その結果を図１１に示した。
図１１に示したように、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}は、空ベクターが導入された対照群と比較してさらに多くのＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを誘導し、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}により誘導されたＴｒｅｇはさらに多くのＩＣＯＳを発現した（Ａ）。また、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}は、Ｔｒｅｇによるエフェクター抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の生産および分泌をさらに促進することをフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ分析を通して確認した。このような結果は、ＩＣＯＳＬがＭＳＣ−媒介Ｔｒｅｇ誘導に非常に重要な役割を果たすことを示すものであり、これは、ＭＳＣのＩＣＯＳＬが効果的なＴｒｅｇ誘導剤としての役割を果たすということを示す結果である。

実施例８．ｈｃＭＳＣ誘導されたＴｒｅｇのＰＢＭＣ増殖抑制効果確認
ｈｃＭＳＣがＴｒｅｇ誘導条件下でＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２５、ＦｏｘＰ３、ＩＣＯＳおよびＩＬ−１０を発現するＴｒｅｇ表現型を示すように誘導できることを確認した。一方、Ｔｒｅｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのいずれでもリンパ球抑制活性を有しているということが知られているので、活性化されたリンパ球の増殖をＴｒｅｇが抑制できるか否かを確認した。

ＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｒｅｇ誘導条件下でｈｃＭＳＣ^ＥｍｐまたはｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}と２日間共同培養した。その後、Ｔｒｅｇ集団を含むＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ２５＋細胞を単離した。ＰＢＭＣを１０ｕＭ ＣＦＳＥで予め加熱されたＰＢＳで最終濃度１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで標識した。１μｇ／ｍＬ抗−ＣＤ３ ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および３μｇ／ｍＬ抗−ＣＤ２８ ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＣＦＳＥで標識されたＰＢＭＣを３日間刺激し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}またはｈｃＭＳＣ^Ｅｍｐの共同培養物から分離されたＣＤ２５＋集団をＣＦＳＥ標識されて活性化されたＰＢＭＣと共に１：５または１：１０（Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ）で３日間共同培養した。ＰＢＭＣの増殖をＣＦＳＥ希釈評価フローサイトメーターを通して分析し、その結果を図１２に示した。

図１２に示したように、Ｔｒｅｇがない条件で活性化されたＰＢＭＣは、約８０％であるとＣＦＳＥ分析結果示され、Ｔｒｅｇと共同培養された場合、ｄｉｖｉｄｉｎｇ ＰＢＭＣは、細胞数依存的に減少してＴｒｅｇにより免疫抑制効果が現れることを確認した。
一方、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}−誘導されたＴｒｅｇおよびｈｃＭＳＣ^Ｅｍｐ−誘導されたＴｒｅｇの間にＰＢＭＣ抑制に対する明確な機能的差は現れなかった。

実施例９．ＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ相互作用によるＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路活性化確認
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号伝達経路は、Ｔ細胞の増殖、移動、分化およびサイトカイン生産のようなＴ細胞の機能に重要な役割を果たすものと知られている。ＩＣＯＳＬの生理学的な機能をさらに確認するために、Ｔｒｅｇ分化の間のＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ相互作用による分子信号調節を信号伝達の観点から確認した。

このために、ＣＤ４＋Ｔ細胞に組換えヒトＩＣＯＳＬであるｒｈＩＣＯＳＬ（５μｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）をＴｒｅｇ誘導条件で２日間処理し、フローサイトメトリーを通してこれらのＣＤ２５、ＩＣＯＳ、ＦｏｘＰ３の発現を分析した。全ての実験は、５回独立的に遂行した。具体的には、ｒｈＩＣＯＳＬ（Ｒ＆Ｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）の投与のために、ウェルを５μｇ／ｍＬ ｒｈＩＣＯＳＬで３７℃で４時間の間コーティングした。分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を各ウェルに１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで追加し、１ｎｇ／ｍＬ ＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）および０．１μＭ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ａｔＲＡ；ＰＨＡＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と共に３μｇ／ｍＬ抗−ＣＤ２８ ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２〜５日間刺激した。ｈｃＭＳＣ２とＣＤ４＋Ｔ細胞は、２日間、１：１０（ｈｃＭＳＣｓ：Ｔ ｃｅｌｌｓ）の比率で共同培養した。２日後、ｈｃＭＳＣを０．０５ｍＭ ＥＤＴＡを含有した冷たいＰＢＳで３回洗浄し、ｈｃＭＳＣからリンパ球を分離した。その後、ｈｃＭＳＣをトリプシン化させ、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄し、ＰＥ−接合されたＩＣＯＳＬ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）をＩＣＯＳＬ発現分析のために添加して染色した。ｒｈＩＣＯＳＬ処理によってＡｋｔがリン酸化されたか否かをウェスタンブロットを通して確認し、これらの結果を図１３に示した。

図１３に示したように、ｈｃＭＳＣと処理結果と類似するようにＣＤ４＋Ｔ細胞に対するｒｈＩＣＯＳＬの処理もまた非処理対照群と比較してＦｏｘＰ３^＋ＩＣＯＳ^＋Ｔｒｅｇ誘導を促進させた（Ａ）。また、ｒｈＩＣＯＳＬの処理は、Ａｋｔリン酸化を顕著に増加させた（Ｂ）。このような結果は、ＩＣＯＳＬがＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路をＴｒｅｇ誘導の間に活性化させるということを示す。

実施例１０．ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路を通したＴｒｅｇ分化調節確認
ＩＣＯＳＬ媒介されたＴｒｅｇ分化において、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号経路が関与するか否かを追加確認するために、ＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅｓ）抑制剤ＬＹ２９４００２またはＡｋｔ抑制剤ＧＳＫ６９０６９３を処理し、それによる結果を確認した。Ａｋｔ抑制剤ＧＳＫ６９０６９３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、１ｕＭ濃度で、ＬＹ２９４００２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）は、５−１０ｕＭ濃度で使用した。

より具体的には、ＣＤ４^＋Ｔ細胞をＬＹ２９４００２（５μＭ）およびＧＳＫ６９０６９３（１μＭ）で３０分間前処理し、外因性ｒｈＩＣＯＳＬの処理がＡｋｔリン酸化を誘導するか否かおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ抑制剤がｒｈＩＣＯＳＬ誘導されたＡｋｔリン酸化をＴｒｅｇ誘導条件下で１時間以内に阻害させるか否かを確認し、総Ａｋｔを確認した。
また、ｒｈＩＣＯＳＬ−誘導されたＴｒｅｇ誘導においてＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ抑制の影響をＬＹ２９４００２（５μＭ）またはＧＳＫ６９０６９３（１μＭ）を２日間処理した後、ｒｈＩＣＯＳＬ−処理されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の培養を通したＣＤ２５、ＩＣＯＳ、ＦｏｘＰ３の発現を通して分析し、その結果を図１４に示した。

図１４に示したように、ＬＹ２９４００２およびＧＳＫ６９０６９３の処理はいずれもＡｋｔリン酸化を明確に減少させた（Ａ）。同時にｒｈＩＣＯＳＬまたはｈｃＭＳＣ−誘導されたＴｒｅｇは、これらの抑制剤の処理によって減少することを確認した（Ｂ）。このような結果は、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号伝達経路がＩＣＯＳＬ−調節されたＴｒｅｇ誘導に関与するということを示す。これに対し、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の抑制による正常状態でのＴｒｅｇ集団の減少は、正常Ｔｒｅｇ誘導の間に信号伝達経路の機能的重要性を示す（Ｂ）。このような結果は、ＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号伝達軸がｈｃＭＳＣ−媒介されたＴｒｅｇ誘導調節に関与できるということを示す。

実施例１１．ＭＳＣクローン間ＩＣＯＳＬ発現とＴｒｅｇ誘導との関連性確認
異なるＭＳＣクローンは、互いに異なる機能的特性を示すものと知られているので、ｈｃＭＳＣによってヒトＴｒｅｇを誘導するためのＩＣＯＳＬ発現程度が異なるか否かを確認した。計６個のｈＭＳＣ株を利用し、一つの授与者由来の５個のクローナルｈｃＭＳＣ（ｈｃＭＳＣ１−５）および一つの非−クローナルｈｃＭＳＣ（ｈｎｃＭＳＣ）でＩＣＯＳＬの基本発現をウェスタンブロットおよびｑＲＴ−ＰＣＲを通して確認した。また、ｈｃＭＳＣのＴｒｅｇ誘導活性を確認するために、ｈｃＭＳＣ１およびｈｃＭＳＣ４細胞株のＴｒｅｇ誘導能力を混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）でＰＢＭＣとの共同培養またはＴｒｅｇ誘導条件でｈｎｃＭＳＣ、ｈｃＭＳＣ１およびｈｃＭＳＣ４でＣＤ２５、ＦｏｘＰ３の発現比較を通して確認した。その結果を図１５に示した。

図１５に示したように、ｈｃＭＳＣ４で最も高いＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡ発現が示され、ｈｎｃＭＳＣと比較してほとんどのｈｃＭＳＣがさらに高いＩＣＯＳＬ発現を示すことを確認した（Ａ、Ｂ）。特に、ｈｃＭＳＣ４は、ＭＬＲ条件（Ｃ）およびＴｒｅｇ誘導条件（Ｄ）のいずれでもＣＤ２５およびＦｏｘＰ３発現が最も高いものと示され、これを通してｈｃＭＳＣ４がＴｒｅｇ誘導に最も効果的な細胞株であることを確認した。また、ＩＣＯＳＬ ｍＲＮＡ発現増加が高い細胞株であるほど、高いＴｒｅｇ誘導効果を奏するものと示された。このような結果は、ＩＣＯＳＬの発現能力がＴｒｅｇ誘導のためのｈｃＭＳＣ能力と相関関係があることを示し、ＩＣＯＳＬ誘導性が高い細胞株であるほど、Ｔｒｅｇ誘導能が高いということを示す。

実施例１２．ＩＬ−１βによるｈｃＭＳＣでのＩＣＯＳＬ誘導確認
ＭＳＣの免疫抑制活性は、様々なプライミングおよび適切な刺激により左右できることが知られている。ｈｃＭＳＣでのＩＣＯＳＬの発現がＴｒｅｇ誘導と関連があるものと確認したので、ＩＣＯＳＬの発現を増加させる場合、さらに多くのＴｒｅｇが増加し、ｈｃＭＳＣの免疫抑制機能が強化できるものと予想した。これを確認するために、ＩＣＯＳＬの発現を誘導できる前炎症性サイトカインを確認するための実験を先に遂行した。先ず、適切なプライミング因子を見つけるために、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（２μｇ／ｍＬ）をそれぞれ２４時間の間ｈｃＭＳＣに処理した後、ｑＲＴ−ＰＣＲを通して、ＩＣＯＳＬの発現を１時間、３時間後に確認した。また、ＩＬ−１β処理によってｈｃＭＳＣでのＩＬ−１Ｒの発現が変化するか否かを確認するために、ＩＬ−１βを２４時間の間処理した後、ｈｃＭＳＣでのＩＬ−１Ｒの発現を共に確認し、その結果を図１６に示した。

図１６に示したように、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ処理群のいずれでもＩＣＯＳＬのｍＲＮＡ水準が増加することを確認（Ａ、Ｂ）し、このうちＩＬ−１βが最も強力な効果を奏した。ＩＬ−１βは、その受容体であるＩＬ１受容体１（ＩＬ−１Ｒ１）との結合を通して細胞性反応を調節し、ｈｃＭＳＣにＩＬ−１Ｒ１の発現されるという事実が知られている。ＲＴ−ＰＣＲの結果のように、正常ｈｃＭＳＣは、ＩＬ−１Ｒ１のｍＲＮＡを発現するということを確認した。また、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）の処理は、ＩＣＯＬＳのｍＲＮＡを直ちに、顕著に増加させたが、ＩＬ−１ＲのｍＲＮＡの発現は変化させなかった。

実施例１３．クローナルＭＳＣのＩＬ−１β誘導効果確認
ｈｎｃＭＳＣと比較してｈｃＭＳＣ４がＩＣＯＳＬの発現誘導効果にさらに優れているという事実を確認したので、ＩＬ−１β処理によるクローナル（ｃｌｏｎａｌ）および非−クローナルＭＳＣのＩＣＯＳＬ誘導効果差を確認するための実験を遂行した。具体的には、２４時間の間ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）でｈｎｃＭＳＣおよびｈｃＭＳＣ４を処理し、ｑＲＴ−ＰＣＲを通してＩＣＯＳＬのｍＲＮＡ発現を時間によって分析し、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーを通してＩＣＯＳＬのタンパク質発現変化を確認した。フローサイトメトリーは、５回の独立実験の代表値で示し、その結果は、図１７に示した。

図１７に示したように、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＩＬ−１β−刺激されたＩＣＯＳＬの誘導がｈｃＭＳＣおよびｈｎｃＭＳＣで６および２４時間で異に現れるということを示す（Ａ）。両ＭＳＣ間のＩＬ−１βによるＩＣＯＳＬの差は、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーの結果でも同様に現れた（Ｂ、Ｃ）。

前記のようなクローナル、非クローナルＭＳＣの種類によるＩＣＯＳＬ誘導効果の差がＩＬ−１βによって現れるものであるか否かを確認するために、ＩＬ−１β中和抗体である抗−ＩＬ−１β抗体（１０μｇ／ｍＬ）を処理してＩＬ−１β機能を遮断し、これによるＩＣＯＳＬ誘導効果の変化を確認し、その結果を図１８に示した。

図１８に示したように、抗−ＩＬ−１β中和抗体の処理は、ＩＬ−１βの機能を遮断し、その結果、ＩＬ−１βにより誘導されるＩＣＯＳＬ発現が減少するものと示された。

このような結果は、ＩＬ−１βがｈｃＭＳＣでＩＣＯＳＬを誘導するのに強力なプライミング因子であることを示すものである。

実施例１４．ＩＬ−１β処理によるＴｒｅｇ誘導増加効果確認
ＩＬ−１βでプライミングされたｈｃＭＳＣがＴｒｅｇ誘導活性をさらに増加させることができるか否かを検証するために、ｈｃＭＳＣをＩＬ−１βで２４時間の間処理して得られたｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}をＴｒｅｇ分化条件下でＣＤ４＋Ｔ細胞と２日間共同培養し、これによるＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋またはＣＤ４^＋ＩＣＯＳ^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔ細胞集団の比率をフローサイトメトリーを通して確認した。また、抗−ＩＣＯＳＬ中和抗体（５ｕｇ／ｍｌ）を処理した後、ｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}とＣＤ４＋Ｔ細胞を共同培養し、ＩＣＯＳの中和抑制がＩＬ−１βプライムされたｈｃＭＳＣによるＴｒｅｇ誘導を抑制できるか否かを確認し、その結果を図１９に示した。

図１９に示したように、ＩＬ−１βでプライミングされたｈｃＭＳＣ（ｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}）は、ＩＬ−１β未処理ｈｃＭＳＣであるｈｃＭＳＣ^Ｖｅｈと比較してＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇをさらに多く生産するものと示された（Ａ）。また、抗−ＩＣＯＳＬ中和抗体処理によってｈｃＭＳＣ^{ＩＬ−１β}および正常ｈｃＭＳＣにより誘導されるＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇをいずれも減少させるものと示された（Ｂ）。このような結果は、ＩＬ−１βでプライミングされたｈｃＭＳＣはＩＣＯＳＬを発現させ、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号伝達経路の活性化を通してＴｒｅｇ分化を促進するということを示す結果である。

実施例１５．ｈｃＭＳＣによるＤＤＳ誘導大腸炎の緩和
１５．１．ＤＤＳ大腸炎誘導動物モデルの製造および実験方法
前記実施例を通してｈｃＭＳＣの免疫抑制能力において、ヒトＩＣＯＳＬの機能的役割を確認したので、実際、このような処理がＴ細胞媒介疾患の治療に効果を奏することができるか否かを確認するために、Ｔ細胞媒介疾患の一つである大腸炎モデルでＭＳＣ投与による免疫抑制効果に及ぼす影響を確認した。

急性大腸炎を誘導するために、０〜７日間、飲水に４％ＤＳＳを希釈してＢａｌｂ／ｃ雌マウスに投与し、８日目に正常な飲水に取り替えた。Ｂａｌｂ／ｃマウスを４群に分けて実験を遂行し、このような大腸炎動物モデル誘導プロトコルを図２０に示した。ｈｃＭＳＣは、ＤＳＳ投与２４時間前、ＩＣＯＳＬ発現レンチウイルスを通して形質導入された。形質導入されたｈｃＭＳＣはＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ／２００μｌの密度で再懸濁した。１日目および３日目にｈｃＭＳＣｓ（５×１０^５ｃｅｌｌｓ、２００μｌＰＢＳ）を尾静脈を通して静脈注入し、マウスを１０日目に犠牲にさせた。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、下記のような実験群に分けて実験した：対照群（Ｃｏｎ、４マウス）、ＰＢＳ処理された大腸炎群（ＰＢＳ＋ＤＳＳ、６マウス）、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}−注入された大腸炎群（ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}＋ＤＳＳ、６マウス）。

１５．２．ＤＤＳ誘導された大腸炎に対するｈｃＭＳＣの影響
ＤＤＳ誘導された大腸炎マウスモデルで大腸炎深刻度を毎日確認し、糞便の濃度、血液有無、体重が減少したか否かでこれを評価した。マウスから全体大腸を除去し、大腸の長さを間接的炎症マーカーで確認した。大腸内マウスＴｒｅｇの分析のために、ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃリンパ節から分離された細胞をＡＰＣ−接合された抗−ＣＤ２５、ＦＩＴＣ−接合された抗−ＣＤ４、およびＰＥ−接合された抗−ＦｏｘＰ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共に培養した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、ＣＤ４＋Ｔ細胞を脾臓およびリンパ節から分離し、分離された細胞の純度をフローサイトメトリーを通して確認した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１ｕｇ／ｍｌのプレート付きの抗−ＣＤ３ ｍＡｂおよび３μｇ／ｍＬのｓｏｌｕｂｌｅ抗−ＣＤ２８ ｍＡｂで活性化させ、１日および２日目に分析を遂行し、その結果を図２１に示した。

図２１に示したように、ＰＢＳ処理された大腸炎群と比較して、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}注入マウス大腸の収縮が減少することを確認した。また、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}注入マウスでは、体重の損失もまた減少した。このような結果は、ｈｃＭＳＣ^{ＩＣＯＳＬ}がいずれも大腸炎マウスで効果的な大腸炎緩和および治療効果を奏することができることを示す。

前記のような結果をまとめると、ＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬの相互作用がＭＳＣによるヒトＴｒｅｇ誘導に重要な役割を果たすということが分かる。炎症性条件下で、ｈｃＭＳＣは、ＩＣＯＳＬをそれらの表面に発現誘導でき、それは、Ｔｒｅｇ上のＩＣＯＳ発現を通したＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ信号伝達経路の活性化を通してＴｒｅｇの誘導を促進できる。ＩＬ−１βは、ｈｃＭＳＣで上向き調節されたＩＣＯＳＬによるヒトＴｒｅｇを促進できる強力なプライミング因子である。このような結果を通して、ｈｃＭＳＣの免疫抑制機序を明確に理解することができ、難治性免疫疾患の標的治療のためのさらに効果的な幹細胞治療剤を開発するのに有用に用いることができる。

製剤例１．医薬品の製造
１．１ 散剤の製造
ＩＣＯＳＬ １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
前記の成分を混合し、気密包に充填して散剤を製造する。

１．２ 錠剤の製造
ＩＣＯＳＬ １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法に従って打錠し、錠剤を製造する。

１．３ カプセル剤の製造
ＩＣＯＳＬ １００ｍｇ
トウモロコシデンプン １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法に従って前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填して錠剤を製造する。

１．４ 注射剤の製造
ＩＣＯＳＬ １００ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 適量
ｐＨ調節剤 適量
通常の注射剤の製造方法に従って１アンプル当たり（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。

１．５ 液剤の製造
ＩＣＯＳＬ １００ｍｇ
砂糖 ２０ｇ
異性化糖 ２０ｇ
レモン香 適量
精製水を加えて全体１，００ｍｌに合わせた。通常の液剤の製造方法に従って前記の成分を混合した後、茶色瓶に充填し、滅菌させて液剤を製造する。

Claims (15)

1. ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
2. 前記ＩＣＯＳＬが、間葉系幹細胞の表面に発現されることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
3. 前記幹細胞が、クローナル幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
4. 前記幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
5. 前記ＩＣＯＳＬが、Ｔ細胞のＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
6. 前記ＩＣＯＳＬが、ＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｏｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ）−Ａｋｔ信号経路を活性化させることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
7. 前記間葉系幹細胞が、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上で処理されたことを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
8. 前記Ｔ細胞のＩＣＯＳの発現の増加が、ＩＣＯＳＬ過発現した間葉系幹細胞とＴ細胞の接触によって誘導されることを特徴とする、請求項５に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
9. 前記炎症性疾患が、狼瘡、シェーグレン症候群、リウマチ関節炎、線維筋炎、強皮症、強直性脊椎炎、ベーチェット病、アフタ性口内炎、ギラン・バレー症候群、円形脱毛症、皮膚筋炎、クローン病、大腸炎、結節性多発動脈炎、再発性多発軟骨炎および自己免疫血小板減少症で構成された群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
10. 前記自己免疫性疾患が、リウマチ性関節炎、全身性強皮症、膵臓細胞抗体によるインスリン依存型小児期糖尿病、円形脱毛症、乾癬、天疱瘡、喘息、アフタ性口内炎、慢性甲状腺炎、一部の後天性再生不良性貧血、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病、クローン病、珪肺、石綿肺症、ＩｇＡ腎臓疾患、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症候群、皮膚筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性脳脊髄炎、重症筋無力症、グレーブス甲状腺亢進症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、線維組織炎、側頭動脈炎、ウィルソン病、ファンコーニ症候群、多発性骨髄腫および全身性エリテマトーデスからなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患または自己免疫性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
11. ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞を含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖誘導用組成物。
12. ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖誘導用組成物。
13. ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞を処理するステップを含む、ＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖を誘導する方法。
14. 前記ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞が、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−１およびＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）からなる群から選択された１種以上で前処理されたことを特徴とする、請求項１３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖を誘導する方法。
15. 前記処理が、ＩＣＯＳＬ過発現間葉系幹細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞に接触させることである、請求項１３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の調節Ｔ細胞への分化および分化誘導された調節Ｔ細胞の増殖を誘導する方法。