CN111454888A

CN111454888A - 一种干细胞处理方法及使用该方法得到的细胞和应用

Info

Publication number: CN111454888A
Application number: CN201910047997.9A
Authority: CN
Inventors: 王树森; 王乐; 梁瑞; 刘腾丽; 王贯乔; 邹家琦; 刘尧娟; 沈中阳
Original assignee: Tianjin First Central Hospital
Current assignee: Tianjin First Central Hospital
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明涉及一种干细胞处理方法及使用该方法得到的细胞和应用。一种干细胞处理方法，包括在所述干细胞的培养基中加入炎症因子的步骤。使用该方法制备的干细胞可以有效逆转胰岛β细胞去分化，为2型糖尿病的预防和治疗提供了可能的途径。

Description

一种干细胞处理方法及使用该方法得到的细胞和应用

技术领域

本发明涉及一种干细胞处理方法及使用该方法得到的细胞和应用。

背景技术

糖尿病是以持续的高血糖为特征，由胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素利用缺陷导致的慢性代谢疾病，包括I型糖尿病，2型糖尿病(Type 2diabetic mellitus,T2DM)和妊娠糖尿病，以2型糖尿病的影响人群最广。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，2型糖尿病的发病率呈现出快速攀升的趋势。中国的糖尿病患病率占全球27％，居全球首位。作为全球糖尿病的第一大国，2017年我国糖尿病患者人数达1.14亿，其中95％左右为T2DM。T2DM已经成为一个严重危害我国人群健康的公共卫生问题，对我国的经济社会发展和人民身体健康产生越来越严重的影响，持续的高血糖意味着将来发生心脑血管疾病、糖尿病、微血管病以及肿瘤和痴呆等疾病的危险性增高，如何有效防止和治疗糖尿病仍然是糖尿病研究所面临的重要课题之一。有研究表明，2型糖尿病与胰岛β细胞去分化有关。

发明内容

为了至少部分地解决糖尿病的有效预防和治疗问题，本专利申请旨在利用干细胞逆转胰岛β细胞去分化，提高去分化胰岛细胞的功能。并进一步的，利用炎症因子或其组合刺激干细胞，提高干细胞逆转胰岛β细胞去分化的能力。

作为本发明的一个方面，涉及一种干细胞处理方法，包括如下步骤：在所述干细胞的培养基中加入炎症因子。

具体来讲，就可以是在所述干细胞的培养基中加入IL-1β、TNF-α、IL-6或其任意组合。在具体实施例中，可以是在培养基中加入终浓度10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α；在培养基中加入终浓度10ng/mL IL-1β和100ng/mL IL-6；或在培养基中加入终浓度100ng/mLTNF-α和100ng/mL IL-6。

在一具体实施例中，所述干细胞可以为间充质干细胞。

作为本发明的另一个方面，涉及使用上述干细胞处理方法处理得到的干细胞。

作为本发明的又一个方面，涉及一种干细胞，所述干细胞是经过炎症因子处理的，具体来讲，比如可以是IL-1β、TNF-α、IL-6或其任意组合处理的。

在具体实施例中，所述干细胞可以是经过终浓度10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α处理的；经过终浓度10ng/mL IL-1β和100ng/mL IL-6处理的；或是经过终浓度100ng/mLTNF-α和100ng/mL IL-6处理的。

在一具体实施例中，所述干细胞可以为间充质干细胞。

作为本发明的再一个方面，涉及上述干细胞在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。

本发明提供的测序文库及其应用，至少实现了如下有益效果：

干细胞可逆转T2DM胰岛β细胞的去分化，经IL-1β、TNF-α或IL-6预刺激的MSCs逆转胰岛β细胞去分化的能力增强，而经过IL-1β和TNF-α组合处理的MSCs逆转胰岛β细胞去分化的能力最强，胰岛素阳性细胞增多，能有效改善胰岛β细胞功能，为2型糖尿病的预防和治疗提供了可能的途径。

附图说明

图1.对照组T2DM胰岛细胞、实验组MSCs共培养后的T2DM胰岛细胞中Insulin⁺FOXO1⁺细胞在胰岛细胞中的比例。

图2.对照组T2DM胰岛细胞、实验组MSCs共培养后的T2DM胰岛细胞中ALDH1a3⁺细胞在胰岛细胞中的比例。

图3.对照组T2DM胰岛细胞、实验组预处理的MSCs与T2DM胰岛细胞共培养后，T2DM胰岛细胞中Insulin⁺FOXO1⁺细胞在胰岛细胞中的比例。

图4.对照组T2DM胰岛细胞、实验组预处理的MSCs与T2DM胰岛细胞共培养后，T2DM胰岛细胞中ALDH1a3⁺细胞在胰岛细胞中的比例。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1、脐带间充质干细胞和人胰岛细胞的提取及培养

在本专利公开信息的指导下，本部分内容，本领域技术人员可以基于现有技术来实现，比如可以是通过如下方式来实现。

脐带干细胞提取及培养

(1)50ml PBS冲洗脐带表层血液，将脐带内血液挤压出冲洗干净。去掉动静脉血管，剥离出华通胶。

(2)将华通胶用无菌刀剪成5mm³，平铺于10cm培养皿中，超净台内风干20-30分钟，至组织块贴皿。

(3)加入5-7ml间充质干细胞完全培养基。缓慢放入培养箱中。

(4)第3天进行换液，保证培养基在7-8ml左右。每隔3天进行换液，2周后细胞生长为梭形的MSCs细胞，并逐渐向周围扩散增殖。

(5)待细胞生长至汇合度为90％后，去掉组织块，0.25％胰酶消化，用干细胞完全培养基(北京碧奥天生物公司，FasGrow人间充质干细胞培养基)重悬至T25培养瓶中，记为第1代细胞，每3天换一次液。第5代细胞作为后续实验用。

T2DM人胰岛细胞提取及培养

人T2DM胰腺由天津第一中心医院获得，捐献器官家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。本院移植中心具有成熟的胰岛细胞分离和移植技术。简单介绍如下。无菌条件下，按2ml/Kg，将4℃、1％(w/v)的V型胶原酶经胰管灌注入切取的胰腺，采用Ricordi自动分离系统消化胰腺得到粗提取的胰岛细胞，然后利用COBE2991细胞分离机进行胰岛细胞纯化，纯化后胰岛细胞经双硫腙染色鉴定纯度后，用CMRL-1066培养基(美国Gibco)进行培养。

2、MSCs-T2DM胰岛细胞共培养体系

(1)未处理的间充质干细胞与T2DM胰岛细胞共培养

准备12孔板，取第5代MSCs消化成细胞悬液，以5*10⁴个/孔接种于12孔板底层，待MSCs生长至汇合度80％后，将干细胞培养基更换为1mL CMRL-1066完全培养基(含10％人白蛋白和1％双抗)将0.4μm孔径的transwell小室置于12孔板中，500个T2DM胰岛细胞置于上层小室，体系为300μL CMRL-1066完全培养基，以此构成MSCs和胰岛细胞的非接触共培养体系。将T2DM胰岛细胞与MSCs在37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。共培养24小时后收集上层胰岛细胞。

收集的胰岛细胞进行免疫荧光染色分析，将胰岛于4％多聚甲醛固定，用石蜡包埋，切片(3μm)。脱蜡后，用EDTA抗原回收液在微波炉中处理切片，洗涤，渗透，封堵。免疫组织化学染色使用胰岛β细胞功能标志蛋白：胰岛素(Insulin)，胰岛β细胞去分化关键标志蛋白：乙醛脱氢酶(ALDH1a3)、叉头蛋白(FOXO1)抗体，用DAPI进行复染。使用pannoram MIDI和pannoram viewer扫描并拍照。使用GraphPad Prism v7.0进行图形绘制和数据处理。定量数据采用means±SEM。

免疫荧光结果显示，T2DM胰岛细胞与MSCs共培养后，Insulin⁺FOXO1⁺双阳性细胞平均增多19.48％，同时祖细胞标志蛋白ALDH1a3表达平均降低6.7％，表明胰岛β细胞去分化得到了逆转，胰岛素分泌功能提高。结果见图1和图2。

(2)因子预处理的间充质干细胞与T2DM胰岛细胞共培养

取第5代MSCs消化成细胞悬液，以5*10⁴个/孔接种于12孔板底层，体系为1mL干细胞完全培养基，待细胞生长至汇合度为80％时，在培养基中单独加入IL-1β、TNF-α或IL-6或同时加入不同组合的IL-1β、TNF-α或IL-6，预刺激MSCs 10-12小时，去除培养基上清并用PBS清洗两遍，更换新鲜1mL CMRL-1066完全培养基，将0.4μm孔径的transwell小室置于12孔板中，构成MSCs和胰岛细胞的非接触共培养体系。500个T2DM胰岛细胞置于上层小室，体系为300μL CMRL-1066完全培养基。将T2DM胰岛细胞与MSCs在37℃，5％CO₂培养箱培养24小时。共培养24小时后收集上层胰岛细胞。

收集的胰岛细胞进行免疫荧光染色分析，将胰岛于4％多聚甲醛固定，用石蜡包埋，切片(3μm)。脱蜡后，用EDTA抗原回收液在微波炉中处理切片，洗涤，渗透，封堵。免疫组织化学染色使用Insulin、ALDH1a3、FOXO1抗体(美国Abcam)，用DAPI进行复染。使用pannoram MIDI和pannoram viewer扫描并拍照。使用GraphPad Prism v7.0进行图形绘制和数据处理。定量数据采用means±SEM。

共设6组实验：

实验组1、用终浓度10ng/mL的IL-1β处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC1)；

实验组2、用终浓度100ng/mL的TNF-α处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC2)；

实验组3、用终浓度100ng/mL的IL-6处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC3)；

实验组4、用终浓度10ng/mL IL-1β和终浓度100ng/mL TNF-α混合处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC4)；

实验组5、用终浓度10ng/mL IL-1β和终浓度100ng/mL IL-6混合处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC5)；

实验组6、用终浓度100ng/mL TNF-α和终浓度100ng/mL IL-6混合处理的MSCs与胰岛细胞共培养(MSC6)。

实验结果见图3和图4，实验结果表明：

单独使用IL-1β、TNF-α、IL-6刺激MSCs后，MSCs逆转胰岛β细胞去分化的作用提高，且三者的作用效果相当，Insulin⁺FOXO1⁺双阳性细胞平均增多23.18％-26.19％，同时祖细胞标志蛋白ALDH1a3表达平均降低15.63％-19.21％。

而用组合刺激因子处理的MSCs与胰岛细胞共培养后，MSCs逆转胰岛β细胞去分化的效果更佳，Insulin⁺FOXO1⁺双阳性细胞比例得到显著提高，ALDH1a3蛋白的表达也降低明显，其中10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α混合处理的MSCs逆转胰岛β细胞去分化的效果最好。

并且相比于未刺激的MSCs，终浓度10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α混合处理的MSCs可以使Insulin⁺FOXO1⁺双阳性细胞平均增多20.7％，ALDH1a3⁺细胞平均降低18.76％，作用效果显著提高。

综上可见，MSCs可逆转T2DM胰岛β细胞的去分化，而经过IL-1β和TNF-α组合处理的MSCs逆转胰岛β细胞去分化的能力最强，胰岛素阳性细胞增多，有效改善胰岛β细胞功能，结果见表1。

表1

表1：对照组T2DM胰岛细胞、实验组未处理MSCs/预处理的MSCs与T2DM胰岛细胞共培养后，Insulin⁺FOXO1⁺细胞和ALDH1a3⁺细胞在T2DM胰岛细胞中的比例统计，数据采用means±SEM。

在2型糖尿病中，胰岛β细胞去分化已成为胰岛细胞功能障碍一个关键过程，因此有必要探索安全有效的逆转β细胞去分化的方法。我们的专利提出，人脐带间充质干细胞可以逆转T2DM人胰岛β细胞去分化，且利用因子预刺激MSCs的方法可提高其逆转胰岛β细胞去分化能力。这种方法对于MSCs在治疗T2DM中的应用可能具有重要意义。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种干细胞处理方法，其特征在于，包括在所述干细胞的培养基中加入炎症因子的步骤。

2.权利要求1所述干细胞处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

所述炎症因子是指IL-1β、TNF-α、IL-6或其任意组合。

3.权利要求2所述干细胞处理方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中加入终浓度10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α。

4.使用权利要求1-3任一项所述干细胞处理方法处理得到的干细胞。

5.一种干细胞，其特征在于，所述干细胞是经过炎症因子处理的。

6.权利要求5所述干细胞，其特征在于，所述炎症因子是指IL-1β、TNF-α、IL-6或其任意组合。

7.权利要求5所述干细胞，其特征在于，所述干细胞是经过终浓度10ng/mL IL-1β与100ng/mL TNF-α处理的。

8.权利要求5所述干细胞，其特征在于，所述干细胞是经过终浓度10ng/mL IL-1β和100ng/mL IL-6处理的。

9.权利要求5所述干细胞，其特征在于，所述干细胞是经过终浓度100ng/mL TNF-α和100ng/mL IL-6处理的。

10.权利要求5-9任一项所述干细胞在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。