CN110564688B - 一种无血清培养角膜缘基质干细胞并于体外诱导成球和诱导分化的方法 - Google Patents

一种无血清培养角膜缘基质干细胞并于体外诱导成球和诱导分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无血清培养角膜缘基质干细胞及其诱导分化和干细胞成球的方法。本发明还同时提供了用于体外诱导角膜缘基质干细胞成球或分化成角膜缘基质细胞的培养基组合。本发明所使用的无血清培养基组合，能提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，能够稳定的在体外扩增培养角膜缘基质干细胞，而且能确保扩增培养后仍保持角膜缘基质干细胞的干性以及特异性。同时成功构建了诱导分化成角膜基质细胞的体系，可用于角膜缘基质干细胞的实验研究、角膜病变的细胞治疗以及角膜损伤的移植，具有广泛的科学效益和社会经济效益。

Description

一种无血清培养角膜缘基质干细胞并于体外诱导成球和诱导 分化的方法
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域。更具体地，涉及一种无血清的角膜缘基质干细胞培养方法，以及角膜缘基质干细胞体外诱导成球和体外诱导分化的培养方法。
背景技术
角膜是存在于眼球前端的一层透明组织，在空间上具有一定的曲率半径。从生理学角度上来说，角膜分为中间透明的角膜区域和周围边缘的角膜缘区域。中央透明的角膜区域共分为五层，从外向内分别是角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层。其中，基质层占了角膜厚度的90%，主要由I型、V型胶原蛋白、粘合物和角膜基质细胞构成。角膜基质细胞在发育学上来源于神经嵴细胞，出生后这些细胞不再增殖分裂，平时是处于静止状态的。这些角膜基质细胞可以通过分泌ECM以维持角膜的完整性和透明性。当角膜受到损伤，或因细菌性真菌性角膜炎以及碱烧伤等一系列疾病导致角膜基质受到损伤后，会引发角膜白斑，当白斑出现时，会导致角膜出现不透明区域，严重影响了病人的视力，目前缺乏有效的治疗手段。角膜白斑的传统治疗方法主要是角膜移植。但角膜移植存在一系列的问题，比如供体来源不足，以及术后排斥和各种并发症等，临床治疗效果均不理想。因此，采用体外培养的角膜缘基质干细胞移植治疗角膜白斑病变，近年来成为人们关注的热点。
对于角膜缘基质干细胞的培养，目前方法主要采用酶消化法从角膜缘组织上取得原代细胞后进行体外扩增培养。如何在体外培养后仍保持基质干细胞的干性以及其特性相当重要，是细胞工程迫切需要解决的课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种无血清的角膜缘基质干细胞培养方法，确保体外扩增培养后仍保持角膜缘基质干细胞的干性以及特异性。以保证，将体外培养的角膜基质干细胞移植回体内进行治疗后，能够分化为角膜基质细胞进行损伤修复，以治疗角膜白斑等角膜病变，为进一步的临床移植创造条件。
本发明的第一个目的是提供一种角膜缘基质干细胞的培养基。
本发明的第二个目的是提供一种角膜缘基质干细胞成球的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种角膜缘基质细胞的培养基。
本发明的第四个目的是提供一种用于体外诱导角膜缘基质干细胞成球或分化成角膜缘基质细胞的培养基。
本发明的第五个目的是提供使用上述角膜缘基质干细胞的培养基，获取无血清的体外角膜缘基质干细胞的培养方法。
本发明的第六个目的是提供一种体外诱导角膜缘基质干细胞成球的培养方法，即：使用上述角膜缘基质干细胞的培养基和上述角膜缘基质干细胞成球的培养基，获取角膜缘基质干细胞成球的体外培养方法。
本发明的第七个目的是提供一种体外诱导角膜缘基质干细胞分化成角膜基质细胞的培养方法，即：使用上述角膜缘基质干细胞的培养基和上述角膜缘基质细胞的培养基，获取角膜缘基质细胞的体外培养方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明涉及了一种角膜缘基质干细胞培养基，包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分包括：50～150 IU的青霉素、90～110 µg/mL的链霉素、40～60 µg/mL的庆大霉素、ITS、5～30 ng/mL的人重组EGF、0.05～0.2 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbicacid-2-phosphate）、1×10-6～1×10-10M的地塞米松和50～200 ng/mL的霍乱毒素。
本发明中，所述的基础培养基是指不含血清的、能给角膜缘基质干细胞或角膜缘基质细胞提供必要营养物质的培养基，包括了在角膜缘基质细胞培养领域公知的各种适用于角膜缘基质干细胞或角膜缘基质细胞培养的所有培养基。
优选地，本发明所述基础培养基为低糖DMEM、MCDB-201和/或Advanced DMEM。
更优选地，角膜缘基质干细胞培养基中所述的基础培养基为低糖DMEM和/或MCDB-201。
优选地，所述添加组分中的各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、ITS、20 ng/mL的人重组EGF、0.1 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbic acid-2-phosphate）、1×10-8 M的地塞米松和100 ng/mL的霍乱毒素。
更优选地，所述角膜缘基质干细胞培养基的配方比例为：每500 mL培养基含有：5mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL庆大霉素，5 mL的ITS，1 mL的人重组EGF、1 mL的L-抗坏血酸-2-磷酸酯、1 mL的霍乱毒素和288 mL的低糖DMEM，余量为MCDB-201。
本发明还涉及了一种角膜缘基质干细胞成球培养基，包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分包括：50～150 IU的青霉素、90～110 µg/mL的链霉素、40～60 µg/mL的庆大霉素、5～30 ng/mL的人重组EGF、0.5～4 mM的L-谷氨酰胺、0.5%～5%的B27和ITS。
优选地，角膜缘基质干细胞成球培养基中所述的基础培养基为Advanced DMEM。
优选地，所述添加组分中的各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、20 ng/mL的人重组EGF、2mM的L-谷氨酰胺、2%的B27和ITS。
更优选地，所述角膜缘基质干细胞成球培养基的配方比例为：每500 mL培养基含有：5 mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL的庆大霉素，5 mL的ITS、1 mL的人重组EGF、5 mL的L-谷氨酰胺和5 mL的B27，余量为Advanced DMEM。
本发明还涉及了一种角膜缘基质细胞培养基，包含基础培养基和添加组分；其中，所述添加组分包括：50～150 IU的青霉素、90～110 µg/mL的链霉素、40～60 µg/mL的庆大霉素、ITS、0.2～2 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbic acid-2-phosphate）和10～200ng/mL的人重组FGF2。
优选地，角膜缘基质细胞培养基中所述的基础培养基为低糖DMEM。
优选地，所述添加组分中的各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、ITS、1 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbic acid-2-phosphate）和100 ng/mL的人重组FGF2。
更优选地，所述角膜缘基质细胞培养基的配方比例为：每500 mL培养基含有：5 mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL的庆大霉素，5 mL的ITS、1 mL的L-抗坏血酸-2-磷酸酯和1 mL的人重组FGF2，余量为低糖DMEM。
本发明中，所述ITS是指Insulin, Transferrin, Selenium Solution。本发明所述ITS购买自Gbico ITS试剂，其为100X溶液，按比例稀释即可使用。
本发明中，所述B27是指B27添加剂；B27添加剂为无血清添加剂；本发明B27添加剂购于Gbico，货号为12587010。
本发明还涉及了一种无血清培养角膜缘基质干细胞及其体外诱导成球和诱导分化的培养基组合，为上述的角膜缘基质干细胞培养基和角膜缘基质干细胞成球培养基的组合，或为上述的角膜缘基质干细胞培养基和角膜缘基质细胞培养基的组合。
具体地，用于体外诱导角膜缘基质干细胞成球的培养基，包括所述角膜缘基质干细胞培养基，以及所述角膜缘基质干细胞成球培养基。
具体地，用于体外诱导角膜缘基质干细胞分化成角膜缘基质细胞的培养基，包括所述角膜缘基质干细胞培养基，以及所述角膜缘基质细胞培养基。
本发明提供的培养基是一种化学成分确定、无血清的培养基，其质量稳定，批次可控性强，易于推广和市场化，是角膜缘基质干细胞和角膜缘基质细胞基础研究和临床应用研究的理想培养基。
本发明还涉及了一种无血清的角膜缘基质干细胞的体外培养方法，是清理、切碎角膜缘组织后，对其进行酶解，将酶解后的产物置于所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养。
优选地，所述酶解是用L型胶原蛋白酶进行酶解。
优选地，所述L型胶原蛋白酶的浓度为0.1～1 mg/mL，酶解时间为3～12 h。
优选地，将酶解后的产物置于所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养之前，先加入Matrigel。
更优选地，加入Matrigel后，于37℃孵育10 min，再加入分离后的角膜缘基质干细胞。
本发明还涉及了一种角膜缘基质干细胞成球的体外培养方法，是将角膜缘基质干细胞培养至P1～P5代，清洗、消化，将消化后的产物置于所述的角膜缘基质干细胞成球培养基中进行培养。
优选地，所述清洗是用PBS进行清洗；所述消化是用0.01%～0.25%含EDTA胰酶进行消化。
优选地，将消化后的产物置于所述的角膜缘基质干细胞成球培养基中进行培养之前，提前2天先用Poly-HEMA包被培养板。
更优选地，用Poly-HEMA包被培养板后，于37℃孵育2～14天，再加入分离后的角膜缘基质干细胞。
本发明还涉及了一种角膜缘基质细胞的体外培养方法，是将角膜缘基质干细胞培养至P1～P5代，清洗、消化后，将消化后的产物先置于所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养；培养12～36 h后，再换到所述的角膜缘基质细胞培养基中进行培养。
本发明还涉及了一种无血清培养角膜缘基质干细胞及体外诱导成球的方法，包括无血清的角膜缘基质干细胞的体外培养和角膜缘基质干细胞成球的体外培养，具体步骤为：首先采用上述方法培养角膜缘基质干细胞，培养至P1～P5代，清洗、消化，将消化后的产物置于所述的角膜缘基质干细胞成球培养基中进行培养。
本发明还涉及了一种无血清培养角膜缘基质干细胞及体外诱导分化的方法，包括无血清的角膜缘基质干细胞的体外培养和角膜缘基质细胞的体外培养，具体步骤为：首先采用上述方法培养角膜缘基质干细胞，培养至P1～P5代，清洗、消化后，将消化后的产物先置于所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养；培养12～36 h后，再换到所述的角膜缘基质细胞培养基中进行培养。
作为一种优选的技术方案，所述无血清的角膜缘基质干细胞体外培养方法，包括如下步骤：
S11. 将角膜缘组织用DMEM清理后，切碎进行酶解；使用的酶为L型胶原蛋白酶，浓度为0.1～1 mg/mL，于37℃酶解3～12 h；用40 µm细胞筛过滤，去除残留组织块；加入等体积10 mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5 min，弃上清；
S12. 用上述的角膜缘基质干细胞培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S13. 将10%的Matrigel溶液平铺于24孔板中，于37℃静置10 min后，吸干剩余的Matrigel溶液；
S14. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了10%的Matrigel的24孔板中，于37℃，5%CO2条件下培养12～24 h即可贴壁，隔天换液培养。
作为一种优选的技术方案，所述无血清培养角膜缘基质干细胞及体外诱导成球的方法，包括如下步骤：
S21. 等到上述步骤S14培养的角膜缘基质干细胞P1～P3代细胞长至80%～90%汇合度时，吸弃液体，用PBS洗一遍，用0.01%～0.25%含EDTA胰酶消化，加入等体积10 mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5 min，弃上清；
S22. 用上述的角膜缘基质干细胞成球培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S23. 用120 mg/mL Poly-HEMA溶液37℃摇床过夜溶解后，平铺于12孔板中，于37℃静置48 h后使用；
S24. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了120 mg/mL Poly-HEMA溶液的12孔板中，于37℃，5%CO2条件下培养，隔天观察细胞状态；
S25. 每天用角膜缘基质干细胞成球培养液进行换液，培养约7天。
作为一种优选的技术方案，所述无血清培养角膜缘基质干细胞及体外诱导分化的方法，包括如下步骤：
S31. 等到上述步骤S14培养的角膜缘基质干细胞P2～P4代细胞长至80%～90%汇合度时，吸弃液体，用PBS洗一遍，用0.01%～0.25%含EDTA胰酶消化，加入等体积10 mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5 min，弃上清；
S32. 用上述的角膜缘基质干细胞培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S33. 将10%的Matrigel溶液平铺于24孔板中，置于37℃温箱静置10 min后吸干剩余的Matrigel溶液；
S34. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了10%的Matrigel的24孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
S35. 隔天换成上述角膜缘基质细胞培养液进行诱导分化培养，并在显微镜中观察细胞的生长状态；
S36. 每2天用角膜缘基质细胞培养液进行换液，分化培养约7天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所使用的无血清培养基，能够稳定的在体外扩增培养角膜缘基质干细胞，且构建了体外将干细胞进行成球的培养体系，并表达相应的干细胞Marker，实验证实，本发明体外培养的角膜缘基质干细胞具有干性；同时也成功的构建了诱导分化成角膜缘基质细胞的体系，能够特定的高表达角膜缘基质细胞的特异性Marker，这充分说明了本发明分化体系构建成功；相较于其他含血清的培养方法而言，本发明避免了血清组分对实验研究的影响，更加清晰了培养液中各组分对角膜基质细胞培养的作用，提高了细胞培养和实验结果的可重复性，也更易于细胞产品的纯化，有利于产业化，具有广阔的应用开发前景。
附图说明
图1为无血清培养的角膜缘基质干细胞的细胞形态图。
图2为角膜缘基质干细胞成球培养的细胞形态图。
图3为角膜缘基质细胞的细胞形态图。
图4为角膜缘基质细胞的特异性标志KERA的QPCR结果图（按本发明无血清诱导培养的角膜缘基质细胞标注为keratocytes，而用含血清的培养液培养的角膜缘基质细胞标记为Fibroblasts）。
图5为角膜缘基质细胞的特异性标志ALDH3A1的QPCR结果图（按本发明无血清诱导培养的角膜缘基质细胞标注为keratocytes，而用含血清的培养液培养的角膜缘基质细胞标记为Fibroblasts）。
图6为成纤维细胞的特异性标志αSMA的QPCR结果图（按本发明无血清诱导培养的角膜缘基质细胞标注为keratocytes，而用含血清的培养液培养的角膜缘基质细胞标记为Fibroblasts）。
图7为成纤维细胞的特异性标志FN的QPCR结果图（按本发明无血清诱导培养的角膜缘基质细胞标注为keratocytes，而用含血清的培养液培养的角膜缘基质细胞标记为Fibroblasts）。
图8为用含血清的培养液培养的角膜缘基质细胞的细胞形态图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
ITS购买自Gbico ITS试剂，其为100X溶液，按比例稀释后使用。
实施例1 一种角膜缘基质干细胞的培养基及其培养方法
1、培养基配方
一种角膜缘基质干细胞培养基，由以下组分组成：
每500 mL培养基含有：5 mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL庆大霉素，5mL的ITS，1 mL的人重组EGF、1 mL的L-抗坏血酸-2-磷酸酯、1 mL的霍乱毒素和288 mL的低糖DMEM，余量为MCDB-201。
其中，各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100 µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、ITS、20 ng/mL的人重组EGF、0.1 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbicacid-2-phosphate）、1×10-8M的地塞米松和100 ng/mL的霍乱毒素。
2、一种无血清的角膜缘基质干细胞体外培养方法，包括如下步骤：
S11. 将角膜缘组织用DMEM清理后，用手术刀切碎进行酶解；使用的酶为L型胶原蛋白酶，浓度为0.1～1 mg/mL，置于37℃孵箱，酶解时间为3～12 h；用40 ~70µm细胞筛过滤，去除残留组织块；加入等体积10 mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5min，弃上清；
S12. 用上述角膜缘基质干细胞培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S13. 将10%的Matrigel溶液平铺于24孔板中，置于37℃温箱静置10 min后吸干剩余的Matrigel溶液；
S14. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了10%的Matrigel的24孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天换液，并在显微镜中观察细胞的生长状态。
3、实验结果分析：
如图1所示，原代无血清体外培养的角膜基质干细胞，呈现出类似于神经细胞的多触角树枝状的细胞形态，更接近于其发育来源神经嵴细胞的形态。说明该种培养基更有利于维持体外角膜基质干细胞的干性。
实施例2 一种角膜缘基质干细胞成球的培养基及其培养方法
1、培养基配方
一种角膜缘基质干细胞成球培养基，由以下组分组成：
每500 mL培养基含有：5 mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL的庆大霉素，5mL的ITS、1 mL的人重组EGF、5 mL的L-谷氨酰胺和5 mL的B27，余量为Advanced DMEM。
其中，各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100 µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、20 ng/mL的人重组EGF、2 mM的L-谷氨酰胺、2%的B27和ITS。
2、一种体外诱导角膜缘基质干细胞成球的培养方法，包括如下步骤：
S21. 将上述实施例1中步骤S14培养的角膜缘基质干细胞P1～P3代细胞长至80%～90%汇合度时，吸弃液体，用PBS洗一遍，用0.01%～0.25%含EDTA胰酶消化，加入等体积10mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5 min，弃上清；
S22. 用上述角膜缘基质干细胞成球培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S23. 用120 mg/mL Poly-HEMA溶液37℃摇床过夜溶解后，平铺于12孔板中，置于37℃温箱静置48 h后使用；
S24. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了120 mg/mL Poly-HEMA溶液的12孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天观察细胞状态；
S25. 每天用角膜缘基质干细胞成球培养液进行换液，成球培养7天后，收取细胞RNA。
3、实验结果分析：
如图2所示，将体外培养的角膜基质干细胞进行成球培养后，可以看到细胞能够成球生长，且具有良好的干细胞特性。
实施例3 一种角膜缘基质细胞的培养基及其培养方法
1、培养基配方
一种角膜缘基质细胞培养基，由以下组分组成：
每500 mL培养基含有：5 mL的10×青霉素-链霉素双抗溶液、500 µL的庆大霉素，5mL的ITS、1 mL的L-抗坏血酸-2-磷酸酯和1 mL的人重组FGF2，余量为低糖DMEM。
其中，各组分在该培养基中的浓度为：100 IU的青霉素、100 µg/mL的链霉素、50 µg/mL的庆大霉素、ITS、1 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯（ascorbic acid-2-phosphate）和100ng/mL的人重组FGF2。
2、一种体外诱导角膜缘基质干细胞分化成角膜基质细胞的培养方法，包括如下步骤：
S31. 等到上述步骤S14培养的角膜缘基质干细胞P2～P4代细胞长至80%～90%汇合度时，吸弃液体，用PBS洗一遍，用0.01%～0.25%含EDTA胰酶消化，加入等体积10 mg/mL的Trypsin inhibitor终止酶解，1500 rpm离心5 min，弃上清；
S32. 用上述角膜缘基质干细胞培养基，将酶解离心得到的角膜缘基质干细胞重悬；
S33. 将10%的Matrigel溶液平铺于24孔板中，置于37℃温箱静置10 min后吸干剩余的Matrigel溶液；
S34. 将重悬的角膜缘基质干细胞种植于铺了10%的Matrigel的24孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
S35. 隔天换成上述角膜缘基质细胞培养液进行诱导分化培养，并在显微镜中观察细胞的生长状态；
S36. 每2天用角膜缘基质细胞培养液进行换液，分化培养7天后，收取细胞RNA。
3、实验结果分析：
（1）细胞形态学观察：
如图3所示，将体外培养的角膜基质干细胞进行分化诱导培养后，可以呈现出静止期的角膜基质细胞的形态，并且表达角膜基质细胞特异性Marker。说明该分化培养具有良好的干性和特异性。
对比例1 阳性对照（含胎牛血清培养基）
实验方法同实施例1，唯一不同的是，本实施例所用的角膜缘基质干细胞培养基中含有胎牛血清，其具体组成为：216 mL Ham’s F12、216 mL DMEM、5 mL 100×青霉素-链霉素双抗溶液和63 mL的胎牛血清。
研究发现，与含有血清的培养方法相比，利用本发明的无血清培养基及其培养方法培养出来的角膜基质干细胞不仅在形态上更接近于其生物发育来源的神经嵴细胞形态（图1），且能够特异性表达干细胞的Marker；另外，如图4和图5所示，经诱导分化成角膜缘基质细胞后，还能够特异性表达角膜缘基质细胞的Marker（KERA和ALDH3A1）。而如图6、图7和图8所示，含血清的培养基培养出来的细胞更接近于体外培养的纤维细胞，不仅形态上呈现梭型的纤维细胞形态，而且高表达成纤维细胞的Marker（如FN和αSMA）。结果表明，本发明的体外无血清培养角膜基质干细胞的培养基及其培养方法培养的细胞具有更高的干性和特异性，具有更优的细胞分化性能。
对比例2
1、对角膜缘基质干细胞生长的影响
（1）不同组分浓度对角膜缘基质干细胞生长的影响
培养基各成分浓度改变对培养角膜缘基质干细胞生长影响的检测：分别以表1所示的培养基参照实施例1的方法培养角膜缘基质干细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表1所示。
表1 不同组分浓度对角膜缘基质干细胞生长的影响
Figure 730282DEST_PATH_IMAGE002
研究显示，当青霉素为50～150 IU、链霉素为90～110 µg/mL、庆大霉素为40～60µg/mL、人重组EGF为5～30 ng/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸酯为0.05～0.2 mM、地塞米松为1×10-6～1×10-10M、霍乱毒素为50～200 ng/mL时，角膜缘基质干细胞生长效果较好；其中当青霉素为100 IU、链霉素为100 µg/mL、庆大霉素为50 µg/mL、人重组EGF为20 ng/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸酯为0.1 mM、地塞米松为1×10-8M、霍乱毒素为100 ng/mL时，角膜缘基质干细胞生长效果最好。
（2）不同组分对角膜缘基质干细胞生长的影响
培养基各成分改变对培养角膜缘基质干细胞生长影响的检测：其他条件与实施例1相同，分别以表2所示的培养基培养角膜缘基质干细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表2所示。
表2 不同组分对角膜缘基质干细胞生长的影响
Figure 913002DEST_PATH_IMAGE004
由表2可知，无血清的角膜缘基质干细胞培养基中的青霉素、链霉素、庆大霉素、人重组EGF、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、地塞米松、霍乱毒素和ITS均在角膜缘基质干细胞的生长中起到重要的作用，各组分相互作用，缺一不可。
2、对角膜缘基质干细胞成球培养的影响
（1）不同组分浓度对角膜缘基质干细胞成球培养的影响
培养基各成分浓度改变对角膜缘基质干细胞成球培养影响的检测：分别以表3所示的培养基参照实施例2的方法培养角膜缘基质干细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表3所示。
表3 不同组分浓度对角膜缘基质干细胞成球培养的影响
Figure 692739DEST_PATH_IMAGE006
研究显示，当青霉素为50～150 IU、链霉素为90～110 µg/mL、庆大霉素为40～60µg/mL、人重组EGF为5～30 ng/mL、L-谷氨酰胺为0.5～4 mM、B27和ITS为0.5%～5%时，角膜缘基质干细胞成球培养效果较好；其中当青霉素为100 IU、链霉素为100 µg/mL、庆大霉素为50 µg/mL、人重组EGF为20 ng/mL、L-谷氨酰胺为2 mM、B27和ITS为2%时，角膜缘基质干细胞成球培养效果最好。
（2）不同组分对角膜缘基质干细胞成球培养的影响
培养基各成分改变对角膜缘基质干细胞成球培养影响的检测：其他条件与实施例2相同，分别以表4所示的培养基培养角膜缘基质干细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表4所示。
表4 不同组分对角膜缘基质干细胞成球培养的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE008
由表4可知，无血清的角膜缘基质干细胞成球培养基中的青霉素、链霉素、庆大霉素、人重组EGF、L-谷氨酰胺、B27和ITS均在角膜缘基质干细胞成球培养中起到重要的作用，各组分相互作用，缺一不可。
3、对角膜缘基质细胞生长的影响
（1）不同组分浓度对角膜缘基质细胞生长的影响
培养基各成分浓度改变对培养角膜缘基质细胞生长影响的检测：分别以表5所示的培养基参照实施例3的方法培养角膜缘基质干细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表5所示。
表5 不同组分浓度对角膜缘基质细胞生长的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE010
研究显示，当青霉素为50～150 IU、链霉素为90～110 µg/mL、庆大霉素为40～60µg/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸酯为0.2～2 mM和人重组FGF2为10～200 ng/mL时，角膜缘基质细胞生长效果较好；其中当青霉素为100 IU、链霉素为100 µg/mL、庆大霉素为50 µg/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸酯为1 mM和人重组FGF2为100 ng/mL时，角膜缘基质细胞生长效果最好。
（2）不同组分对角膜缘基质细胞生长的影响
培养基各成分改变对培养角膜缘基质细胞生长影响的检测：其他条件与实施例3相同，分别以表6所示的培养基培养角膜缘基质细胞，每组做三个平行对照，24小时后进行计数，结果如表6所示。
表6 不同组分对角膜缘基质细胞生长的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE012
由表6可知，无血清的角膜缘基质干细胞成球培养基中的青霉素、链霉素、庆大霉素、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、人重组FGF2和ITS均在角膜缘基质细胞生长中起到重要的作用，各组分相互作用，缺一不可。

Claims (3)

1.角膜缘基质干细胞培养基和角膜缘基质细胞培养基在角膜缘基质细胞的体外培养中的应用，其特征在于，将角膜缘基质干细胞培养至P1～P5代，清洗、消化后，将消化后的产物先置于所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养；培养12～36 h后，再换到所述的角膜缘基质细胞培养基中进行培养；所述角膜缘基质干细胞培养基由基础培养基和添加组分组成；其中，所述添加组分的组成为：100～150 IU的青霉素、100～110 µg/mL的链霉素、50～60 µg/mL的庆大霉素、体积百分比为1%的100× ITS、20～30 ng/mL的人重组EGF、0.1～0.2 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯、1×10-6～1×10-8 M的地塞米松和100～200 ng/mL的霍乱毒素；所述角膜缘基质细胞培养基由基础培养基和添加组分组成；其中，所述添加组分的组成为：50～100IU的青霉素、90～100 µg/mL的链霉素、40～50 µg/mL的庆大霉素、体积百分比为1%的100× ITS、0.2～1 mM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯和10～100 ng/mL的人重组FGF2；所述基础培养基是指不含血清的、能给角膜缘基质细胞提供必要营养物质的培养基。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述角膜缘基质干细胞培养的培养方法为：清理、切碎角膜缘组织后，对其进行酶解，将酶解后的产物置于权利要求1中所述的角膜缘基质干细胞培养基中进行培养。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述基础培养基为低糖DMEM、MCDB-201和/或Advanced DMEM。
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