CN101052299A - 来自角膜缘的未分化干细胞组织系统 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种具有自我再生能力的角膜缘干细胞的组织系统，其中角膜缘干细胞主要是未分化干细胞(USCs)。该组织系统来自分离的角膜缘组织，适合修复眼表损伤，尤其适合角膜缘干细胞缺乏的损伤。组织系统形成是通过选择性扩增针对USCs的组织系统，例如通过选择和分选表达干细胞特异表面标记的细胞，如阶段性特异胚胎抗原标记物4(SSEA－4)。经过分离，将USCs在加富培养基中的组织基底上培养，形成适合于移植、植入或被移植的组织系统。

Description

来自角膜缘的未分化干细胞组织系统
有关联邦资助研究或发展的声明
[0002]不可应用。
                            背景技术
1.发明的领域
[0003]本发明涉及包括哺乳动物未分化干细胞的组织系统系统，优选人未分化干细胞，其来自角膜缘组织角膜缘组织并且适合修复眼表的损伤或病患。
2.相应领域的描述
[0004]在有机体的一生中，干细胞负责细胞的更替和组织的再生。干细胞是有强大增殖潜能的细胞，并且依赖干细胞分化成几种细胞系，和/或经过移植使组织重新生成。胚胎干(ES)细胞是典型的干细胞，有无限的自我更新和多能性的潜力。ES细胞是来自胚泡期胚胎的内层细胞团。在有机体中，成体干细胞也是特异的未分化干细胞，其在出生后和整个成体期保留了细胞更换和组织再生的能力。一般认为成体干细胞与ES细胞相比，具有较弱的自我更新能力，并且虽然它们可以分化成为多个系，但一般不认为是多能的。在成熟机体的不同的组织中发现成体干细胞(又叫″组织特异干细胞″)数目很少，包括骨髓(Weissman，(2000)Science 287：1442-1446)、神经组织(Gage，(2000)Science 287：1433-1438)、胃肠组织(Potten，(1998)Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.353：821-830)、表皮组织(Watt，(1997)Phil.Trans.R.Soc.Lond.B.353：831)、肝组织(Alison和Sarraf，(1998)J.Hepatol.29：678-683)和间叶细胞组织(Pittenger et al.，(1999)Science 284：143-147)。尤其是在哺乳动物眼角膜巩膜缘发现的成体干细胞对维持健康眼表面是十分重要的，并且参与健康眼和角膜表面的动态平衡。
[0005]眼表面由角膜上皮细胞、结膜上皮细胞和前角膜泪膜组成。在健康眼中，角膜上皮细胞不断脱落进入泪池并由角膜巩膜缘干细胞补充。由角膜边缘产生的新细胞从边缘向心移动和从上皮的基底层向前移动补充角膜上皮细胞完成更新(Cotsarelis et al.，(1989)细胞57：201-209)。如果缺乏适当的补充，会导致一个不健康或不正常的眼表面产生诸如视物不清或眼部不适的症状。角膜缘干细胞的缺乏和损耗会形成不正常的角膜表面，例如结膜成分内生到角膜表面导致角膜失明、疼痛、畏光等(Anderson et al.，(2001)Br.J.Opthalmol.85：567-575)。即使眼睛的其它部位健康，但由于不正常角膜表面导致视力障碍。
[0006]一级角膜缘干细胞缺乏可以由遗传条件引起，诸如先天性无虹膜症、多发性内分泌缺乏相关的角膜炎、limbitis和原发症。先天性无虹膜症是一种遗传决定的由于角膜巩膜边缘的未完全分化引起的眼异常，特征是眼表面异常以及虹膜缺失。次级角膜缘干细胞缺失也可以在获得性条件下发生，诸如Steven-Johnson综合症、感染(如严重的细菌性角膜炎)、眼表肿瘤、由化学或热损伤或暴露于紫外线照射引起的角膜缘干细胞的创伤性破坏、多次外科手术或冷冻疗法、角膜内上皮肿瘤、外围溃疡和炎症性角膜炎、缺血性角膜炎、角膜病、隐型眼镜或镜片清洗液引起的毒性作用、免疫条件、眼睛斑痕类天疱疮、翼状胬肉、假翼状胬肉，等等。
[0007]因此具有高增殖能力的角膜缘干细胞对维持具有活力和健康的眼表面非常重要，因为它们连续不断地提供为维持角膜表面平衡所需角膜上皮细胞(Tseng，(1996)Mol.Biol.Rep.23：47-58)。角膜缘干细胞在有损伤或病患眼中的角膜缘干细胞缺乏，如果没有角膜缘干细胞源的再引入，就不能被正常化(Holland et al.，(1996)Trans.Am.Ophthalmol.Soc.94：677-743；Tan et al.，(1996)Ophthalmol.103：29-36)。因此没有对眼角膜缘干细胞源的再引入，就不能修复角膜缘干细胞缺失带来的损害(Tseng et al.，(1996)；Tsai et al.，(2000)N.Engl.J.Med.343：86-93；Henderson et al.，(2001)Br.J.Ophthalmol.85：604-609)。
[0008]已经使用了几种方法来试图恢复角膜表面损伤后的正常视力，但是这些方法不足以修复涉及或由于角膜缘干细胞缺失造成的损伤。一个常规的修复由于角膜缘干细胞缺失造成角膜表面损伤的方法是将羊膜直接移植到治疗对象治疗对象的眼表面(Anderson et al.，(2001)Br J.Opthalmol.85：567-575)。已经发现羊膜移植促进上皮形成、保持正常上皮形态、降低炎症、减少疤痕、降低组织的粘连和降低眼睛脉管的形成。但是羊膜移植并不都能成功，最后的结果经常是与病人的初始情况没有太大的差别(Prabhasawat etal.，(1997)Arch.Ophthalmol 115：1360-67)。这项技术在恢复角膜角膜缘干细胞正常数量上所取得的成功也是有限的(Shimazaki et al.，(1997)Ophthalmology 104：2068-2076；Tseng et al.，(1997)Am.J.Ophthalmol.124：765-774)。另外，羊膜移植仅应用在部分角膜缘干细胞缺乏的病人例子中，因为病人眼中相当数量的角膜缘干细胞的存在角膜缘干细胞，可以提高成功的可能性。诸如Hu等(WO00/73421)所公开的分离人羊膜上皮细胞并将其分化为角膜表面上皮细胞的方法，具有费力和角膜缘干细胞产率低的缺点。
[0009]另一种治疗角膜缘干细胞缺乏的方法涉及角膜移植，其治疗慢性眼表疾患也存在问题，因为最后治疗的成功依赖于供者角膜上皮细胞被受者角膜上皮细胞的逐渐更替，由于受者眼中缺乏角膜缘干细胞，会出现不良预后(Lindstrom，(1986)N.Engl.J.Med.3 15：57-59。另一治疗角膜缘干细胞缺乏的方法是将供者眼边缘移植物移植到受者眼。该技术包括移植两个大的来自健康眼的分离的结膜边缘移植物，优选来自同一病人，每一个边缘跨度弧长大约为6-7mm，。该方法已经显示在兔模型中，比结膜移植修复角膜表面的效果好得多(Tsai et al.，(1990)Ophthalmology 97：446-455)，并已经用于解除很多病人经历的眼睛不适，以及修复角膜表面和视力。但是与该方法相关的一个主要问题是，它需要从病人健康眼中移出大量角膜缘干细胞，其有将健康眼睛置于角膜缘干细胞缺乏的危险以及由严重的角膜缘干细胞缺损导致健康眼的其它并发症。
[0010]在了解了从活体供者中移出大量角膜缘活检组织的缺点后，角膜缘干细胞一些只采用健康眼少量边缘上皮细胞活检组织来治疗角膜缘干细胞缺乏的方法已被开发了出来(Pellegrini et al.，(1997)Lancet 349：990-993)。这些方法包括在塑料培养皿里角膜缘活检组织进行2-3星期的培养。一旦边缘细胞融合，用胰蛋白酶处理收集细胞培养物并移植到病人损伤眼睛。有的方法是将角膜缘活检组织放在羊膜上进行生长角膜缘活检组织(Koizumi et al.，(2000)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41：2506-2513；Koizumi etal.，(2000)Comea 19：65-71；Dua et al.，(2000)Surv.Ophthalmol.44：415-425)，但是从这些培养物分离并移植的边缘细胞时间一长就不稳定，难以产生令人满意的眼表面修复，尤其是对严重角膜缘干细胞缺乏的病人(Jun Shimazaki et al.，(2002)Opthalmol.109：1285-1290)。在公布号为20030208266的美国专利中公开的利用羊膜的另一方法是，移植用的上皮干细胞是在经过特殊处理的羊膜上进行体外培养所获得的。这个外科移植物产生的方法不使用任何一种对角膜缘干细胞进行唯一筛选角膜缘干细胞的分离步骤，并且干细胞层在整个移植物上的分布是不均匀的。移植物的这些特点可以导致移植的上皮细胞缺乏稳定性，尤其是对角膜缘干细胞缺乏的病人。
[0011]产生移植物的另一方法是在专利号为0572364的欧洲专利中提出的。它公开了体外培养人眼表面上皮细胞活检组织的方法，活检组织来自眼睛边缘和/或前缘区域，或眼的forrinx和/或结膜区域。细胞培养后，用合适的器具，诸如灭菌的纱布或半刚性的镜片将其移植到眼睛中。但是因为在移植分化的上皮细胞中角膜缘干细胞是有限的，该方法不能矫正严重的角膜缘干细胞缺乏病人的损伤。另外对严重的眼或角膜表面损伤的病人，插入角膜接触镜是不必要的，因为在一个已经有损伤的眼表面上置放角膜接触镜可以引起发炎和不适，使眼的状态进一步恶化，导致其它的并发症。在另一个为WO03/030959的专利申请中，公开了一种使用表面修饰的角膜接触镜进行角膜缘干细胞的培养，治疗角膜损害的角膜修复装置，角膜缘干细胞。该方法有几种缺点，包括角膜缘干细胞在接种到镜片上后是否可以持续性地释放出来帮助治疗损伤眼睛的不确定性，和接种到角膜接触镜的细胞群落可能只有少量的10％的角膜缘干细胞，不足以对严重的角膜缘干细胞缺乏病人进行成功的角膜修复。
[0012]申请号为20020039788的美国专利公开了一种类似的治疗角膜上皮表面损伤或病变的生物工程合成的移植物，其中合成的移植物包括分化了的上皮细胞构成的复层上皮细胞。同样的，这些分化了的上皮细胞移植物具有有限的未分化的角膜缘干细胞数目，其对严重缺乏角膜缘干细胞的病人进行成功的眼修复是必要的。申请号为6,610,538的美国专利公开了利用角膜缘干细胞培养物作为移植物进行体外重建人角膜上皮治疗眼损伤病人的方法角膜缘干细胞。用克隆分析和应用标记，如K19、K12、K3和p63，对该角膜缘干细胞进行选择。然而这些标记众所周知是用来说明对表明角膜细胞的特性对分离的细胞是否未分化却没有特异性。另外，公开的专利中提出的克隆分析来选择的细胞是全克隆细胞，其属于基底边缘层，对选择富集角膜缘干细胞细胞的细胞群落是不必要的。因此这些移植物对于严重的角膜缘干细胞缺乏病人修复眼损伤是不适合的。
[0013]WO 03/093457也公开了一种通过选择表达膜蛋白标记CD34或CD133的干细胞来鉴定和分离角膜组织干细胞的方法，这两个标记都属于分化丛(CD)。但是这些标记特意用于分离人造血系而不是角膜缘干细胞。因此该方法优选用来选择污染角膜组织活检组织的血细胞，对用该方法分离的细胞的未分化状态，则没有评价。
[0014]任何边缘细胞移植的稳定性和成功依赖于其持续再生用于修复眼表面的有活性的角膜缘干细胞的能力。目前使用的治疗角膜缘干细胞缺乏的移植物或被移植物一般含有高比例的分化了的角膜上皮细胞，而不是含量有限的角膜缘干细胞。由于提供的角膜缘干细胞有限，该移植物或被移植物中的供者上皮细胞一般只能存活很短时间。换句话说，移植物可以产生明显的角膜上皮，但是缺少足够的角膜缘干细胞造成不正常的上皮表面和不良的疗效，导致不能修复眼表面和改善视力。所以，可能由于在移植物或被移植物中具有自我再生能力的未分化角膜缘干细胞的供给有限，这些试图为缺乏角膜缘干细胞的眼提供角膜缘干细胞的方法存在严重的局限性。因此，通过提供充足的具有再生和为眼持续提供角膜缘干细胞的能力的角膜缘干细胞数目来提供能更加成功地修复和重建眼表损伤的移植物或被移植物是必要的。角膜缘干细胞角膜缘干细胞。
发明概述
[0015]本发明公开了一种组织系统，其中组织系统包括角膜缘干细胞，其中在组织系统中至少大约30-90％的细胞是未分化干细胞(USCs)。优选地，在组织系统中USCs包括至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的角膜缘干细胞。在不同的实施例中，USCs表达选自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81和干细胞因子组成的组中的一个或多个干细胞标记基因。在一个优选的实施例中，USCs对胚胎阶段特异性抗原标记4(SSEA-4)呈现阳性。在优选的实施例中，在组织系统中至少大约50％、60％、70％、80％、90％或95％的USCs呈现SSEA-4阳性。在其它优选的实施例中，组织系统中的细胞表达选自K3/K12、K19和p63组成的组中的一个或多个细胞表面标记。在其它优选的实施例中，组织系统来自角膜巩膜角膜缘组织。而角膜巩膜角膜缘组织可以来自任意一个合适的哺乳动物，人组织尤其是优选的来源。优选的组织系统是复层组织系统。
[0016]本发明也提供产生组织系统的方法，其中组织系统包括未分化干细胞，该方法包括以下步骤：
(a)分离供者角膜缘组织角膜缘组织；
(b)培养角膜缘组织角膜缘组织来增加培养的的角膜边缘细胞的数量；
(c)通过分选角膜缘细胞将角膜缘干细胞群落从培养的角膜缘细胞中分离出来，从而选择一个或多个干细胞特异表面标记，其中干细胞特异表面标记是由未分化干细胞(USCs)表达的；
(d)培养分离的USCs群落以产生组织系统。
[0017]在优选实施例中，组织系统的角膜缘干细胞至少包括大约40-50％的细胞，在组织系统中更优选至少大约60-70％的细胞，在组织系统中最优选至少大约80-90％的细胞。在其它的优选的实施例中，角膜缘干细胞包括USCs，最优选的是人USCs。优选的是，在组织系统中，USCs至少包括大约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的角膜缘干细胞。在优选的实施例中，USCs表达选自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81和干细胞因子组成的组中的一个或多个干细胞标记基因。在其它的优选实施例中，组织系统中的细胞表达选自K3/K12、K19和p63组成的组中的一个或多个细胞表面标记。用于产生组织系统的角膜缘组织角膜缘组织可以从任何合适的哺乳动物中分离，人组织尤其是优选的来源。优选地，根据上述的方法产生的组织系统适合对受者进行移植、植入或被移植，尤其是对单只眼或双眼患有角膜缘干细胞缺乏症的受者。在其它的优选实施例中，受者和供者是相同的。
[0018]在有关上述产生组织系统的方法的其它优选的实施例中，优选在支持所需角膜缘干细胞和USCs生长的培养基基中进行角膜缘组织角膜缘组织的培养，例如DMEM或F12的培养基基，进一步添加营养血清和选自以下可溶性因子组成的组中的一个或多个可溶性因子：二甲基亚砜(DMSO)、重组人表皮生长因子(rhEGF)、胰岛素、亚硒酸钠、转铁因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)。优选地，将角膜缘组织角膜缘组织的培养到培养中的角膜边缘细胞几乎完全融合为止，例如80％的融合。
[0019]在优选的实施例中，角膜缘组织在合适的支持物如细胞外基质或生物包被表面进行培养，例如，在细胞外基质载体或生物包被的培养皿上进行培养。角膜缘组织角膜缘组织优选地，细胞外基质是人羊膜。支持物可以是生物包被了一个或多个附着因子，诸如纤维蛋白原、层粘蛋白、胶原质胶原蛋白IV、固生蛋白、纤维连接蛋白、胶原蛋白胶原质、牛垂体提取物、EGF、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子、氢化可的松，或它们的组合物。在细胞外基质载体上培养的角膜边缘细胞优选地在分离USCs前，先从支持物上脱离。在优选的实施例中，用对本领域技术人员熟知的方法分选角膜边缘细胞，例如用磁力亲和细胞分选法(MACS)或荧光激活细胞分选法(FACS)分离USCs群落。在其它的实施例中，选择一个或多个的干细胞特异表面标记来分离USCs，包括但不局限于SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox2、Tra-1-60、Tra-1-81、干细胞因子、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117。在一个特别优选的实施例中，用来选择USCs的干细胞特异表面标记是SSEA-4。USCs可以表达一个或多个这些标记，因此可以使用这些标记将USCs从角膜边缘细胞群落中优选出来。在特定的实施例中，分选出的USCs包括至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％SSEA-4阳性的细胞。
[0020]在优选的实施例中，分离出的USCs群落在组织基底上进行培养产生组织系统。在优选的实施例中，所述组织基底是哺乳动物羊膜、MatrigelTM、层粘蛋白、胶原蛋白胶原质IV或胶原蛋白胶原质IV片、固生蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、纤维蛋白原和凝血酶片(纤维蛋白胶、RelisealTM)或它们的任何组合物。组织基底也可以用支持物进行生物包被，包括但不局限于人羊膜、层粘蛋白、胶原蛋白胶原质IV、固生蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、纤维连接蛋白或它们的组合物。在特定的优选实施例中，组织基底是人羊膜，更优选的是用一种支持物进行生物包被的人羊膜。将分离出的USCs群落优选培养在可以增加细胞数量但并不充分分化细胞的培养基中，例如添加了来自未活化的人胚胎纤维原细胞的调整培养基的培养基，添加了人白血病抑制因子的培养基，或添加了一种或多种可溶性因子的培养基，该可溶性因子选自二甲基亚砜、重组人表皮生长因子、胰岛素、亚硒酸钠、转铁因子、氢化可的松和碱性成纤维细胞生长因子组成的组中。
附图说明
[0021]以下附图构成本说明书的一部分并用于进一步说明本发明的特定内容。通过参考一个或多个附图并结合对特定的实施例的具体描述，会对本发明有更好的了解。
[0022]图1.培养终止时，羊膜复层组织系统的H&E染色。
[0023]图2.对培养的角膜缘活检组织样品进行的流式细胞分析。图2A表示未标记的对照细胞。图2B表示用抗小鼠异硫氰酸荧光素(FITC)抗体处理的细胞，即一种次级抗体，作为FITC标记对照。图2C表示用胚胎阶段性特异抗原标记物-4(SSEA-4)抗体(初级抗体)和抗小鼠FITC(次级抗体)标记的细胞。在角膜缘活检组织样品中，大约30％的细胞为SSEA-4标记物阳性。
[0024]图3.为培养的组织系统样品的流式细胞分析。图3A表示未标记的对照细胞。图3B表示用抗小鼠FITC抗体处理的细胞，作为次级抗体标记的对照。图3C表示用SSEA-4抗体(初级抗体)和抗小鼠FITC(次级抗体)标记的细胞。在角膜缘活检组织样品中，大约74％的细胞为SSEA-4标记物阳性。
[0025]图4.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示对SSEA-4的阳性免疫荧光。
[0026]图5.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示对干细胞因子(SCF)的阳性免疫荧光。
[0027]图6.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示对Tra-1-60的阳性免疫荧光。
[0028]图7.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示对Oct-4的阳性免疫荧光。
[0029]图8.对复层组织系统的免疫组化显微照相显示对p63阳性免疫荧光。用Vector Elite试剂盒进行免疫过氧化物酶分析。p63是一种核抗原并且棕色点是细胞在组织系统中的阳性核。
[0030]图9.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示在组织系统的表层中聚集K3/K13阳性细胞。
[0031]图10.对复层组织系统的免疫荧光显微照相显示组织系统中K19的基底层表达。
[0032]图11.对复层组织系统的免疫荧光显微照相表示使用Vector Elite试剂盒，在组织系统中不存在Connexin43表达。在边缘基底上皮细胞中不存在Connexin43的表达。
[0033]图12.为用未分化干细胞标记Oct-4、Nanog、Rex1和BMP2和BMP5的RT-PCR法得到的复层组织系统的细胞群落的基因表达谱。GAPDH表达作为阳性对照也进行了分析。发现所有测试的细胞标记都有表达。
[0034]图13.直方图表示本发明外科采集的在运送培养基中经历12、24、48和72小时的角膜缘活检组织的活性。用角膜缘活检组织发育形成的复层组织系统的成功百分率来测定活性。
[0035]图14.直方图表示复层组织系统在6、12、24和48小时后期培养后的活性。在4℃或室温下转移组织系统，在稍长的时间内会影响组织系统的活性。用细胞在组织系统中的成功百分率(存活)测定活性。
[0036]本发明描述一种组织系统，包括具有自我再生能力并且来自角膜缘组织的未分化干细胞(USCs)，角膜缘组织角膜缘组织，以及产生该组织系统的方法和用途。在此，″组织系统″是指包括USCs的细胞群落，优选的是指适合的组织基底，适于对接受治疗的哺乳动物对象进行移植、植入或被移植给治疗对象。优选地，该组织系统是移植物、植入物或被移植物，例如外科移植物或具有多层细胞集合物的合成移植物。在此，术语″未分化干细胞″或″USCs″是指未分化或本质上未分化细胞或未定向祖细胞，它们表达一个或多个的干细胞特异标记物，优选是胚胎干细胞特异标记物。本发明的USCs表现出ES样细胞的特性和特点，例如ES特异标记物的表达，例如SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex1、Sox、Tra-1-60，和/或在培养物中长期增殖。另外，本发明的USCs在不同环境条件下可以增殖和产生未分化或分化的细胞后代。例如，本发明的USCs具有分化成为角膜上皮细胞的潜能，这对于眼表面的健康功能非常重要。在此，术语″分化″是指未分化干细胞或前体细胞特异化的过程。
[0037]在优选实施例中，具有USCs的组织系统取自人供者的角膜巩膜或角膜缘组织角膜缘组织。具体是，本发明的组织系统具有自我再生能力的USCs，优选是包括大量的USCs，例如至少大约70％，至少大约80％或至少大约90％的USCs。大量或高比例的USCs存在于组织系统中，可以极大地促进组织系统在移植、植入或被移植到哺乳动物治疗对象后，恢复损伤或眼表病患的能力治疗对象。另外，组织系统中高比例的USCs允许系统在长时间内稳定持续地将有活性的角膜缘干细胞对眼表面进行再增殖，这对眼睛表面的健康功能十分重要。在某些实施例中，组织系统是包括细胞外基质载体的复合移植物，例如含有大量USCs的羊膜，其中，大量USCs在细胞外基质载体上进行体外培养。
[0038]优选是，组织系统是移植、植入或被移植到损伤或病患的眼睛并且能够修复眼表面损伤，尤其是对严重角膜缘干细胞缺乏的治疗对象的损伤或病患眼睛。在此，损伤或病患的眼睛严重的角膜缘干细胞缺乏的治疗对象，可能在损伤或病患的眼睛中完全缺乏角膜缘干细胞。在优选实施例中，用于角膜缘活检组织产生USCs组织系统的角膜缘活检组织的供者也是组织系统进行移植、植入或被移植(即同源组织系统)的受者。或者，当角膜缘活检组织的供者不是受者时，供者最好是生物相容性的供者，例如接受移植或被移植的受者的近亲，或可以是生物相容(例如组织相容)的尸体(即异源组织系统)。一般要求移植细胞或组织与接受移植物的受者相同，以避免组织排斥。
[0039]如本发明所述，利用角膜缘组织角膜缘组织作为获得组织系统来源的一个显著优势是从供者获得角膜缘组织角膜缘组织相对容易。该方法仅需要小手术，安全、简便、有效，并且只需要很少角膜角膜缘活检组织。角膜缘组织角膜缘组织是在角膜中发现的，是位于前房外表面的透明、无血管的组织。它保护眼睛不受环境的损害，使光线有效地进入眼睛。角膜主要由两部分组成：(1)前部非角质层鳞状上皮层和(2)下部固有质。人角膜包含三种众所周知的细胞类型：角膜上皮细胞；基底角膜细胞(角膜纤维原细胞)；与基质相关的角膜内皮细胞的基底层。角膜上皮细胞是五至七层细胞厚的多细胞层，覆盖在角膜前表面。通常会发生角膜上皮细胞的自然翻转，其中表面上皮细胞会从上皮表面脱落并被下面的表皮细胞替代。基底上皮细胞从外周向内迁移，以补充深层角膜上皮细胞。
[0040]角膜边缘(又叫角膜巩膜边缘)是在角膜和球根结膜和巩膜之间大约1mm宽的一个环形过渡带。它位于眼球的外表面，象一个小沟，将角膜和巩膜区别开来。它含有很多血管并且参与角膜的新陈代谢。边缘和结膜上皮细胞，与稳定的前眼泪膜一起保持角膜的完整性。虽然已知再补充角膜上皮细胞的来源是成体干细胞，但是这些细胞的确切位置和特性仍是未知数。直到在本发明中分离和鉴定前，还不清楚ES样细胞特性的UCSs群落的存在。本发明描述了一种具有来自角膜巩膜边缘的高比例的UCSs组织系统，可用来恢复损伤或疾患的眼表面。
[0041]典型的分离角膜缘组织角膜缘组织的方法是从供者眼角膜表面上颞象限手术移取0.8-3mm2的一小块角膜缘组织的活检组织。从角膜边缘这样获得活检组织的方法，例如层状角膜切除术，是本领域人员所熟知的。一旦活检组织从供者移取出来活检组织，必须将它转移到一个设备中，以使角膜缘活检组织能在本发明的组织系统中进行培养。在转移过程中具有足量角膜缘活检组织保持活性以便于从中得到组织系统非常重要。优选地，角膜缘活检组织转移并保存在能够支持活检组织活性的培养基中。优选的转移活检组织的培养基包括Dulbecco’s Modified Eagles培养基(DMEM)和Ham’s F-12(比例为1∶1)，添加人脐带血清(3-5％)、DMSO(0.1-0.5％)、rhEGF(0.5-2ng/ml)、胰岛素(0.5-5μg/ml)、转铁因子(0.5-5μg/ml)、亚硒酸钠(0.5-5μg/ml)、氢化可的松(0.1-5μg/ml)、霍乱毒素A(0.01-0.1nmol/ml)、庆大霉素(10-50μg/ml)和两性霉素B(0.5-1.25μg/ml)。优选地，边缘细胞活检组织在从供者手术移取48小时内进行培养。
[0042]在供者的角膜缘组织活检后，将它置放在培养基中用培养介质进行培养，优选的介质是适合的支持物，如细胞外基质或生物包被的表面，例如细胞外基质载体或生物包被培养皿。边缘细胞活检组织可以作为完整的外植体进行培养，或在培养前分散成单个细胞悬液。在优选实施例中，支持物的存在有利于活检组织中的角膜缘干细胞与细胞培养板结合，从而促进角膜缘干细胞的生长。优选是，在培养外植体前，将外植体切成小片。用来培养角膜缘组织支持物的实施例包括但不局限于MatrigelTM和其等同物、哺乳动物羊膜，优选人羊膜、层粘蛋白、固生蛋白、巢蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、胶原-IV、多聚-L-赖氨酸、明胶、多聚L-鸟氨酸、纤维连接蛋白、血小板来源生长因子(PDGF)及类似物，单独或与其它支持物组合物使用。支持物可以用一个或多个的添加生长因子或附着因子处理，例如，纤维蛋白原、层粘蛋白、胶原-IV、固生蛋白、纤维连接蛋白、胶原、牛垂体提取物、EGF、肝生长因子、角化细胞生长因子、氢化可的松或它们的组合物。
[0043]优选人羊膜培养活检边缘组织，并且用本领域人员熟知的方法进行制备(参见，例如专利号为6,152,142的美国专利和Tang et al，(1997)Am.J.Ophthalmol.124：765-774，每一份在此都作为参考)。例如，为促进边缘细胞的生长，羊膜可这样制备，用冻融法、酶分解和机械刮擦去除内源性羊膜上皮细胞，之后用生长因子、细胞外基质化合物和/或粘附-增强分子进行表面处理角膜缘干细胞。羊膜是产生组织系统的优选基质，因为它是促进USCs活性和生长的天然物质。在一个实施例中，将带有基膜或基质面的羊膜平滑地附着在培养板上进行USCs培养。通过以下实施例描述，使用细胞外基质材料或生物包被表面的优选方法。
[0044]一个优选的培养角膜缘活检组织的方法是在将外植体放在细胞外基质或生物包被的细胞培养板之前或之后，将外植体干培养培育几种分钟。然后将少量培养基加到外植体，以便粘附到细胞外基质或生物包被的组织培养表面。经过几小时至1天，轻轻加入另外的培养基，将外植体在37℃的CO2培养箱中培养培养几天，每隔一天更换一次培养基。优选地，当干细胞在培养基中开始增殖之后，将原来的角膜缘活检组织的小片从培养基中移出。在其它的实施例中，可以用角膜缘活检组织产生单细胞悬液，然后培养产生本发明的组织系统。例如冲洗角膜缘活检组织然后进行酶处理，如用胰酶-EDTA(如0.25％处理20-30分钟)或裂解酶(例如4℃过夜)产生包括USCs的单细胞悬液。酶处理使上皮细胞分散，因此在单细胞悬液中，基质或间质细胞中减少或不存在。
[0045]培养角膜缘组织的培养基优选是DMEM或DMEM∶F-12(1∶1)培养基，优选添加营养血清，例如血清或血清为基础的溶液，提供有效保持细胞生长和活性的营养(例如，Knock-out血清、热灭活人血清或人脐带血血清)。培养基中也可以添加生长因子。在此，术语″生长因子″是指结合到细胞表面受体的蛋白质，主要作用是促进细胞增殖和分化。用于培养角膜缘组织的优选生长因子选自表皮生长因子(EGF)、碱性生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、胰岛素、亚硒酸钠、人转铁因子或人白血病抑制因子(hLIF)以及它们的组合物。但是对于本领域研究人员所熟知的任何合适的培养基都可以使用。在某些实施例中，边缘细胞经过可以使USCs在培养基中增殖的细胞因子或其它的生长因子处理。
[0046]角膜缘组织在培养几天后，例如直到细胞融合时，USCs就可以从培养基中分离。优选地，优选地，允许角膜缘组织培养达到至少大约50％、60％、70％、80％、90％或95％的融合。在优选实施例中，边缘细胞首先与细胞外基质或生物包被的细胞培养板解离，优选是通过酶消化，例如用胰酶-EDTA或裂解酶溶液来解离。可以用多种本领域技术人员已知的方法将USCs与培养基中其它的边缘细胞分离，诸如免疫标记和荧光分选法，例如固相吸附、荧光-激活细胞分选(FACS)、磁力亲和细胞分选(MACS)法等。在优选实施例中，USCs通过分选，例如某些细胞表面标记的免疫荧光分选来分离的。两种对本领域研究人员熟知的优选方法是MACS和FACS。
[0047]分选技术如免疫荧光染色技术包括利用合适的干细胞标记，将USCs与培养基中的其它的细胞分离。用于将USCs与培养的边缘细胞分离的合适的干细胞特异表面标记包括但不局限于SSEA-4、SSEA-3、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117。在优选实施例中，USCs是通过MACS利用细胞表面标记诸如SSEA-4得到分离的。用该方法，增加的细胞表面阳性标记USCs群落是来自角膜缘活检组织细胞培养的混合群落。或者，通过选择不具有细胞表面标记的USCs，将细胞分类去除不需要的细胞。在将USCs与角膜缘组织分离的实施例中，USCs对以下细胞表面标记呈现阴性：CD34、CD45、CD14、CD133、CD106、CD11c、CD123和HLA-DR。
[0048]经过分选而增加的的边缘细胞培养物含有至少有大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的USCs。在优选实施例中，分离的细胞至少大约有50％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的SSEA-4阳性USCs。在其它实施例中，通过筛选某些基因标记的表达，在包含边缘细胞的混合细胞培养物中筛选USCs。在混合边缘细胞培养物的实例中，可以通过基因标记的表达确认USCs群落，诸如SSEA-4、SSEA-3、OCT-4、Nanog、TDGF、UTX-1、FGF-4、Tra-1-60、Tra-1-81、干细胞因子(SCF)、Sox2、Rex1和其它的未分化细胞的基因标记以及它们的组合物。
[0049]当含有丰富USCs的边缘细胞群落用上述之一的方法被分离后，分离的细胞优选地在支持USCs生长和用于移植、植入或被移植给损伤或病患眼睛的组织系统发育的培养基中进行培养。在这些条件下培养的组织系统优选是包括至少大约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的USCs。在一个优选实施例中，分离的USCs是在用于培养含有USCs的组织系统的加富培养基的存在下的组织基底上进行培养。优选地，组织基底与天然眼表面有相似的特性，例如清晰、薄、有弹性、生物相容、无血管和无抗原性，并且能够支持USCs的生长和在移植、植入或被移植后的正常分化。
[0050]在优选实施例中，组织基底选自哺乳动物的羊膜，MatrigelTM和其等同物、层粘蛋白、固生蛋白、巢蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、凝血酶、胶原质-IV、胶原质-IV片、多聚-L-赖氨酸、明胶、多聚-L-鸟氨酸、纤维连接蛋白、血小板源性生长因子(PDGF)、凝血酶片(纤维蛋白Sealant、RelisealTM，Reliance Life Sciences)等或它们的组合物。在其它的实施例中，组织基底是胶原质或纤维蛋白胶，胶质可以进一步包括产生组织系统所需的其它细胞类型，包括但不局限于纤维原细胞，诸如角膜间质纤维原细胞、间叶细胞组织的衍生物，以及上皮细胞，如角膜上皮细胞。又在其它实施例中，组织基底是一种水凝胶，例如一种合成的水凝胶，一种软性水凝胶接触镜片或多聚HEMA基质。在优选实施例中，组织基底在组织系统移植、植入或被移植后，将被逐渐体内重吸收。另外，组织基底优选是非抗原性并且促进上皮化而没有明显纤维血管生长。
[0051]本发明用于产生组织系统的组织基底优选是人羊膜，可以用本领域技术人员熟知的方法进行制备。人羊膜可以带有上皮层完整使用，或将上皮细胞剥去使用。以下实施例公开了制备人羊膜的优选方法。在其它的优选实施例中，用添加的支持物对组织基底进行生物包被，例如促进USCs结合到组织基底的物质。所使用的添加支持物优选自纤维蛋白原、层粘蛋白、胶原质IV、固生蛋白、纤维连接蛋白、胶原质、牛垂体提取物、EGF、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子、氢化可的松或它们的组合物。
[0052]用于培养边缘细胞产生组织系统的优选加富培养基是DMEM或DMEM∶F-12(1∶1)培养基，优选添加营养血清，例如血清或血清为基础的溶液，提供有效保持USCs生长和活性的营养(例如，knock-out血清、热灭活人血清或人脐带血血清)。培养基中也可以添加生长因子。该培养基也可以由来自灭活人胚胎纤维原细胞培养基(例如30-50％)或添加hLIF(例如4-12ng/ml)或其它促进USCs生长的生长因子的培养基的调整培养基进行加富。用于培养边缘细胞的其它因子优选自DMSO、氢化可的松、EGF、bFGF、LIF、胰岛素、亚硒酸钠、人转铁因子、层粘蛋白、纤维连接蛋白和类似物及其组合物。优选地，用于培养任一阶段边缘细胞的生长促进剂是人重组体来源的。在移植、植入或被移植前，加富培养基也可以用于组织系统的转移。
[0053]在其它的优选实施例中，用于制备组织系统的培养基包括用于转移角膜缘活检组织的培养基、用于培养活检组织的培养基、用于培养角膜缘干细胞的加富培养基和用于转移组织系统的培养基，不包括动物源的任何血清或其它因子，有利于帮助组织系统污染异种成分的风险降到最小，从而人在使用该组织系统时是安全的。
[0054]对于那些可应用于培养USCs的涉及细胞培养和ES细胞培养的一般技术，，操作者可以参考标准教科书和综述，例如：E.J.Robertson，″畸胎癌和胚胎干细胞：一种实用的方法″，ed.，IRL Press Ltd.1987；Hu和Aunins(1997)，Curr.Opin.Biotechnol.8：148-153；Kitano(1991)，Biotechnology17：73-106；Spier(1991)，Curr.Opin.Biotechnol.2：375-79；Birch和Arathoon(1990)，Bioprocess Technol.10：251-70；Xu et al.(2001)，Nat.Biotechnol.19(10)：971-4；和Lebkowski et al.(2001)Cancer J.7 Suppl.2：S83-93，每一篇在此都可作为参考。
[0055]包含USCs的边缘细胞在合适的培养基中进行培养或传代使USCs保持本质上的未分化状态。虽然群落中USCs群体会与邻近分化的细胞相邻，然而USCs培养物在群落是在合适的条件下培养或传代时，可以保持本质上未分化，并且每一个USCs构成细胞群主要的比例。本质上未分化的未分化干细胞培养物包含至少大约20％的未分化USCs，和包含至少大约40％、60％、80％或90％的USCs。例如当经常更换培养基时，培养物中的USCs必须保持合适的细胞密度和亚培养，防止它们分化。在长期培养时，当细胞传代时，它们会分散成小的xibaotuan或单细胞悬液。典型地，当细胞的单细胞悬液获得后将它们接种到另一个细胞培养级别的培养皿中。
[0056]培养物可以被系列传代，至少为20、40、60、80、100或更多代，而USCs没有本质上的分化。包含USCs的边缘细胞培养物可以被冷冻保存，在不同的时间点被进一步使用而不丢失分化潜能，优选在包括来自人脐带血的10-90％热灭活血清和5-10％的DMSO的的冷冻培养基中保存。包含USCs的边缘细胞培养物优选地在每次传代后被保存，例如通过冷冻保存，以便从一个单一角膜缘活检组织产生更多或加倍的组织系统。这些冷冻保存的培养物也可以作为未分化、具有自我再生能力和具有活性的角膜缘干细胞的来源，用于在将来任何一个给定的时间点进行使用。角膜缘干细胞例如这些冷冻保存培养物可以用于产生额外的组织系统，以防由于免疫抑制、之前的手术并发症、感染等等，导致受者的组织系统失败进行自体使用。这些冷冻保存培养物还可以为生物相容病人产生额外的组织系统。这些冷冻保存培养物还能避免在组织系统失败时，从供者要移走更多的组织系统的需要，从而防止将来自体角膜缘干细胞来源枯竭的风险。
[0057]在此公开的组织系统中的细胞可以通过筛选某些干细胞特异标记物的表达筛选到USCs，诸如SSEA-4、SSEA-3、OCT-4、Nanog、TDGF、UTX-1、FGF-4、Tra-1-60、Tra-1-81、干细胞因子(SCF)、Sox2、Rex1和未分化细胞的其它基因标记或它们的组合物。这些干细胞特异标记物的阳性表达，尤其是ES细胞特异标记的表达，表明组织系统含有USCs，并出ES样细胞的特性和特点。组织系统的细胞也有角化细胞的特点，例如筛选到显示组织系统的细胞具有角膜特性的特异标记的表达，诸如p63、K3、K12、K19等等，或它们的组合物。可以分析组织系统的形态和表现型，例如用免疫荧光或免疫过氧化物酶分析。从本发明的组织系统还可以筛选到其它的标记来确定分化水平，如有的话，对于利用组织系统修复眼损伤而进行成功的移植、植入或被移植的是必要的。
[0058]本发明的组织系统在产生后，必须转移到受者部位进行移植、植入或被移植。优选地，用于转移组织系统的方法能够保持组织系统足够的活性使其在转移后仍然可以被用作移植物、植入物或被移植物。在一个优选实施例中，组织系统是在含有转移培养基的特殊设计的容器中进行转移的，优选培养基是用于培养包含USCs的组织系统的加富培养基。特殊设计的转移容器优选地包括一个便携式的、圆柱状的箱体，上端开口接受组织系统，下端封闭。在箱体的上端安装有平行结构，使组织系统固定在培养基插入物上，有一个盖子用于关闭箱体的开口端。可以用特殊细胞培养级塑料-1、医用级的不锈钢，例如SS 316 L或其它任何合适的级别、医用级别的硅树脂或其它任何合适的细胞培养级别的材料制作转移容器。优选地，转移容器以一个安全的方式容纳组织系统，从而使组织系统在转移中受到的损害的机会最小。
[0059]本发明的包含USCs的组织系统可应用于治疗中，例如作为移植物、植入物或被移植物用于单眼或双眼角膜缘干细胞缺乏症的治疗对象。本发明的组织系统可以用于任何需要治疗的治疗对象，包括但不局限于人、灵长类和家庭的、农场、宠物或体育用动物，诸如狗、马、猫、羊、猪、牛、大鼠、小鼠等等。在此，术语″可治疗″、″治疗″、″处理″、″去处理″或″医治″是指治疗处理措施和预防性或预防方法。治疗包括但不局限于减轻或去除特殊疾病、疾患、损伤或紊乱的症状，或减慢或削弱病情恶化，或治愈已有的疾病或紊乱。对需要这样治疗的治疗对象，要用有效治疗用量的组织系统来恢复或重新产生功能。在此，组织系统的″有效治疗用量″是指足以用来获得或改善角膜缘干细胞缺失、损伤、障碍或恶化的治疗对象角膜缘干细胞生理效果的用量。所使用的细胞或组织的有效治疗用量依赖于治疗对象的需要、年龄、生理条件和健康状况，以及所需要的治疗效果、所要治疗的组织面积的大小、植入部位、病状程度、选择的递送途径和治疗策略。这些组织系统优选地以使它们被移植到所需部位并且重组或再生功能缺失区域的方式，施用给病人。
[0060]在优选实施例中，本发明的组织系统用于治疗眼损伤或眼疾病尤其是眼表受损的对象。或者，所公开的组织系统可以用于治疗其它的将受益于来自角膜缘组织的未分化干细胞的疾病或损伤，角膜缘组织例如修复皮肤的烧伤部位。所公开的组织系统尤其适合治疗主要是角膜缘干细胞缺乏的对象，此症状可能由遗传因素引起，诸如先天性无虹膜症、多发性内分泌缺乏相关性角膜炎、limbitis、原发症，或次级角膜缘干细胞缺失，可由获得性条件引起角膜缘干细胞，诸如Steven-Johnson综合症、感染(如严重的细菌角膜炎)、眼表肿瘤、化学药品或热损伤或暴露于紫外线照射、多次外科手术或冷冻疗法引起的角膜缘干细胞的创伤性破坏、角膜内上皮肿瘤，外围溃疡或炎症性角膜炎、缺血性角膜炎、角膜病变、角膜接触镜或镜片清洗液引起的毒性效果、免疫病症、眼斑痕类天疱疮、翼状胬肉、假翼状胬肉，等等。优选地，组织系统是移植、植入或被移植给治疗对象，并且能够修复治疗对象眼损伤或眼疾病，优选地，给治疗对象的损伤或患眼提供稳定的角膜缘干细胞群落。在优选实施例中，组织系统的移植、植入或被移植促进上皮形成，保持正常上皮形态、减少炎症、减少疤痕、减少组织粘连、减少脉管形成和提高眼睛视力。
[0061]例如，可以移植、植入或被移植组织系统来修复损伤的角膜。许多这样的方法是本领域的技术人员所熟知的。其中有一种方法为角膜缘环状切开术，随后去除裸露巩膜的周边结膜下疤痕和发炎的组织。角膜的纤维血管组织可以用板层角膜切除术去除。组织系统可以根据受者眼睛大小按比例调整，然后移植或被移植给相应受者角膜缘区域。或者，组织系统全部作为板层角膜组织来使用，作为板层角膜移植来移植或被移植而覆盖整个区域。然后用缝合或任何本领域技术人员熟知的其它方法，将移植、植入或被移植的组织系统施用到损伤部位。
[0062]以下举例为本发明的优选实施例。本领域技术人员应当意识到，在按照发明人发现的技术实施的实例中公开的技术，在本发明的实际应用中有很好的功能，因此可以作为实际应用中的优选模式。但是本领域技术人员应该明白在不脱离本发明的实质精神和范围的情况下，在本发明的启发下，可以改变一些本发明中的特异实施例，取得相同或相似的结果。
实施例1
[0063]1)收集角膜缘活检组织
[0064]在开始收集病人的角膜缘活检组织前，首先要征得审查委员会的同意。并要获得每位病人和供者的同意，根据Helsinki协定对所有的人治疗对象进行治疗。用板层角膜切除术从供者眼角膜表面上颞象限手术移取0.8mm2至2mm2的角膜缘组织的活检组织。这些区域尤其富含角膜缘干细胞。切除后的活检组织立即放进2ml的装满转移培养基的转移小瓶中。转移培养基由Dulbecco′s Modified Eagles培养基(DMEM)和Ham′s F-12培养基(DMEM∶F-12；1∶1)组成，添加了5％的胎牛血清(FBS)或5％的人脐带血血清、0.5％二甲基亚砜(DMSO)、2ng/ml重组人表皮生长因子(rhEGF)、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁因子、5μg/ml亚硒酸钠、0.5μg/ml氢化可的松、0.1nmol/L霍乱毒素A、50μg/ml庆大霉素和1.25μg/ml两性霉素B。血样也从每个供者收集血样并与每个角膜缘活检组织一起转移到中心cGMP设施中。血样立即用于传染性疾病的检测，包括乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、梅毒和CMV。
[0065]2)培养角膜缘活检组织产生角膜缘干细胞培养物
[0066]来自角膜缘活检组织的角膜缘组织先用荣格(ringer)溶液(含青霉素、链霉素和庆大霉素的PBS)洗几次然后切成小片。将这些角膜缘组织的小片进行干培养2-5分钟然后以圆形方式放在插入物中的生物包被的羊膜上。将少量含10％knock-out血清(150-200μl)的DMEM培养基加到每个培养皿中，促使活检组织小片粘附到生物包被的细胞培养物上。第二天，将2ml同样的培养基加到培养皿中，在37℃的CO2培养箱中培养培养4-5天。4-5天后，培养的角膜缘干细胞开始增殖。此时，用无菌镊子轻轻、仔细地将活检组织从培养基中移出，使培养基中剩余的角膜缘干细胞继续增殖。该方法避免培养过程中，间叶细胞或纤维原细胞的生长。允许角膜缘干细胞长到大约80％融合，典型的是在培养后7至21天。
[0067]3)从培养的角膜缘干细胞中分离未分化干细胞以及组织系统的产生
[0068]当角膜缘细胞培养达到需要的融合水平后，用磁亲和细胞分选(MACS)方法对培养细胞分选，将未分化的多能角膜缘干细胞分离出来。先用0.05％胰酶-EDTA分散培养细胞。加入等量含有胰酶抑制剂或胎牛血清的培养基来中和胰酶。随之用移液管将细胞制成单细胞悬液，并用血球计计数。然后，离心细胞，重悬为每200μl磷酸盐缓冲液(PBS)中含有107个细胞的浓度。细胞在4℃下，与1μl初级抗体SSEA-4(1∶60，Chemicon)培养一同培养30分钟。在与SSEA-4初级抗体一同培养后，细胞用PBS清洗两次去除未结合抗体。向200μl的细胞悬液中加入20μl与SSEA-4初级抗体结合的山羊抗小鼠异硫酸酯荧光素(FITC)-结合的次级抗体的珠子悬液(1∶10，Miltenyi Biotec)，充分混合，在4℃培养培养20分钟。细胞用PBS清洗3遍去除任何未结合的次级抗体。
[0069]根据厂商(Miltenyi Biotec)的使用说明，将细胞悬液通过MACS磁选柱分离SSEA-4阳性细胞。先收集阴性产物，柱用PBS洗两遍。然后从磁力架上取下柱，就可收集含有SSEA-4SSEA-4阳性细胞的阳性产物。
[0070]4)用羊膜制备组织系统的组织基底
[0071]虽然有几种合适的细胞外基质载体可以作为培养角膜缘干细胞的组织基底，诸如MatrigelTM、纤维蛋白原、PDGF、层粘蛋白、EGF或胶原质V，但是用人羊膜来培养角膜缘干细胞。羊膜培养物制备先从收集人胎盘膜开始。任意从剖腹产手术收集胎盘膜并在转移培养基中转移到实验室，转移培养基由添加50单位/ml青霉素、50单位/ml链霉素、100μg/ml新霉素和2.5μg/ml两性霉素B的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液(DPBS)组成。胎盘膜在手术后3小时内转移到实验室。血样也从每个供者收集并用上面描述的方法进行传染性疾病诊断试验。
[0072]一旦得到胎盘，用洗涤培养基洗去上面的粘液和血凝块。洗涤培养基由DPBS组成，添加了50单位/ml青霉素、50单位/ml链霉素、100μg/ml新霉素和2.5μg/ml两性霉素B。用无菌剪刀将胎盘组织从羊膜上除掉，将羊膜至少彻底洗7次去除所有血凝块。然后，用钝性镊子剥除羊膜的浆膜，羊膜上皮一侧用洗涤培养基洗5次。然后将羊膜上皮一侧朝上地放在无菌的硝化纤维膜上。将羊膜切成5cm×5cm面积的小片，每个小片放进装满冷冻培养基的冷冻小瓶中，冷冻培养基由含50％甘油的DMEM组成。在使用前，每一批次加工的羊膜进行无菌、无支原体或内毒素污染的检查。每个批次的羊膜小片在-80℃保存。
[0073]在用这些羊膜小片制备用于培养角膜缘干细胞的羊膜培养物时，先将它们在室温下融化20分钟。然后用钝性镊子从硝化纤维膜上将每个羊膜移出，优选地，不要撕坏表面，放在100mm培养皿中的无菌玻璃载片上。然后加入少量0.25％胰酶(1.0-1.5ml)覆盖羊膜，并在37℃培养培养30分钟。在培养培养后，用细胞刮刀在无菌条件下刮下羊膜的上皮层。用洗涤溶液冲洗羊膜3次。经过加工处理的羊膜，行使培养物细胞外载体基质或组织基底的功能，被放在含有0.4μM径迹蚀刻对苯二酸聚乙烯(PET)膜插入物(Millipore)的培养板上。用10号Ethilon非吸收缝合或用医用级硅O形环将羊膜被固定在PET插入物上。
[0074]不论何种方法，羊膜应该平展在膜插入物上，将羊膜裸露的上皮侧对着插入膜的内侧而基质侧背向膜插入物地插入在将羊膜固定到插入物之前，现将羊膜均一地展开，例如将硅O形环插到羊膜的底部，或将羊膜缝合到插入物的基底膜上。整个结构在装满培养基的6孔培养板中培养培养至少2小时。之后，去除培养基，将羊膜单独用层粘蛋白、纤维蛋白原或胶原质IV一起预培养包被或用它们的组合物预包被。羊膜用培养基清洗两次，并在培养基中培养又培养30分钟，然后羊膜作培养角膜缘干细胞备用。
[0075]5)培养分离的包含USCs的角膜缘干细胞和产生组织系统。
[0076]包含USCs的SSEA-4阳性细胞洗两次后，接种到培养基中的人羊膜的组织基底上。在加富培养基中，用层粘蛋白生物包被羊膜促进USCs粘附到羊膜。优选地，培养基是DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)，用来自2天的灭活人胚胎纤维原细胞的30％调整培养基进行加富。进一步优选地，培养基添加10％knock-out血清或10％热灭活人脐带血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、转铁因子(5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(0.5μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(1.25μg/ml)。在37℃的CO2培养箱中，在该培养基中培养USCs10-15天，直到获得带有大量USCs群落的复层组织系统。图1显示在中止培养时，用苏木精和曙红(H&E)染色的人羊膜上的复层组织系统。苏木精将带负电的核酸诸如细胞核和核糖体染成蓝色，而曙红将蛋白质染成粉色。10-15天后，培养的组织系统作移植备用。
[0077]或者，细胞悬液按以前所述通过MACS磁选柱分离SSEA-4阳性细胞后，将细胞接种到含有培养基的MatrigelTM-包被的培养皿中。该培养基是DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)，添加了10％knock-out血清或10％热灭活人脐带血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、转铁因子(5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(0.5μg/ml)、bFGF(4ηg/ml)、hLIF(10ηg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(1.25μg/ml)。分离的细胞在37℃的CO2培养箱中培养8-10天或直到获得含有大量USCs群落的复层组织系统。组织系统作移植备用。
[0078]当分选和分离的细胞在培养基中融合后，一些USCs培养物解离并且按1∶3的比例重新接种到新鲜生物包被的细胞培养皿中。然后USCs生长并连续传代，经过至少40群体倍增次数或大约13代。
实施例2
[0079]包含未分化干细胞的组织系统的分析和特性
[0080]如实施例1所总结，包含USCs的组织系统来自角膜缘活检组织。为更好地了解来自角膜缘组织的组织系统的细胞群落，用流式细胞术、免疫荧光和免疫过氧化物酶分析，和确定未分化细胞各种细胞标记的存在与否的分子分析方法，分析组织系统中的细胞。
[0081]1)流式细胞术分析
[0082]用流式细胞术将角膜缘活检组织培养物的细胞群落和在组织系统中的细胞群落进行比较分析以检测SSEA-4标记物。首先，在用前述的MACS分选方法选择细胞后，收集半融合期角膜缘活检组织培养物的细胞和生长在羊膜组织基底的组织系统的细胞。对两个细胞群落分别进行分析。收集的细胞群落置于无菌的PBS中并且重悬成细胞悬液。然后，100μl等分试样的细胞用0.2％Triton X-100渗透测定核抗原。将细胞分成三组。第一组细胞作为对照不用抗体标记。第二组细胞在4℃与SSEA-4初级抗体(Chemicon，1∶60)一起培养培养20分钟。第三组不与SSEA-4初级抗体培养一起培养。然后第二组和第三组细胞用PBS清洗并且与抗小鼠FITC-结合次级抗体(Sigma，1∶500)一起在黑暗条件下培养培养20分钟。
[0083]在与次级抗体培养一起培养后，所有三个组的细胞用PBS清洗，并重悬于400-500μI的PBS中，放进FACS Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson)中。用光散射鉴定细胞，基于10,000道，以用于调节背景荧光的对照样品作对照，确定对数荧光的数值。使用CELL QUEST软件(Becton Dickinson)进行分析。流式细胞分析角膜缘活检组织细胞的结果如图2所示，而图3表示对组织系统中包含USCs的细胞进行相同的分析。图2表示只有大约30％的培养的角膜缘活检组织细胞是SSEA-4阳性细胞。相反，图3显示的组织系统中的SSEA-4阳性细胞群落增加到74％，表明组织系统中存在高百分比的USCs。
[0084]2)免疫荧光和免疫过氧化物酶分析
[0085]用免疫荧光和免疫过氧化物酶分析对组织系统的形态和表现型进行分析。首先，用PBS冲洗去石蜡部分的组织系统，用PBS中的0.2％ triton X-100渗透，用1％的牛血清白蛋白/PBS封闭，在室温下用以下初级抗体(用1％BSA/PBS稀释抗体)培养2小时：SSEA-4(1∶60，Chemicon)、干细胞因子(1∶250，Santacruz)、Tra-1-60(1∶40，Chemicon)、Oct-4(1∶100，Chemicon)、Connexin43(1∶200，Chemicon)、p63(1∶150，USBiologicals)、K3/K12(1∶200，ICN)和K19(1∶100，Cymbus Biotechnology)培养。然后该部分用FITC-标记的次级抗体在室温下培养1小时(Sigma)。之后，将该部分置放在免疫荧光固定培养基中，用荧光显微镜(Nikon)照相。按照Vector Elite试剂盒的厂商的实验方案进行免疫过氧化物酶分析。用于免疫过氧化物酶分析的染料是二氨基联苯胺四盐酸盐。
[0086]复层组织系统中该部分的免疫荧光和免疫过氧化物酶分析表明，有大约30-70％的SSEA-4阳性细胞(图4)、大约25-45％的SCF阳性细胞(图5)、大约30-40％的Tra-1-60阳性细胞(图6)、大约45-55％的Oct-4阳性细胞(图7)和大约50-70％的p63阳性细胞(图8)。在组织系统中也检测到K3/K12阳性(图9)，和K19的基底层表达(图10)。该组织系统部分的分析也表明不存在connexin43(图11)。该组织系统部分中干细胞特异表面标记的存在确定了组织系统中具有自我再生能力USCs的存在。其它的标记，如K3/K12、K19和p63，表明了组织系统中角膜缘干细胞的角膜特征，对于成功使用组织系统进行眼修复是十分重要的。
[0087]3)分子分析
[0088]为进一步表明组织系统中USCs的特征，用RT-PCR对细胞表达以下未分化干细胞标记基因进行分析：Oct-4、Nanog、Rex1、骨形态发生蛋白2(BMP2)和骨形态发生蛋白5(BMP5)。分化时，Oct-4、Nanog和Rex1的表达被下调。BMPs的表达表明了细胞是外胚层起源。在所有细胞中无处不在的″看家″基因GAPDH的表达，也被作为阳性对照被分析。用测序确认RT-PCR产物。
[0089]简要地说，用TRIzol方法(Gibco-BRL)对从实施例1产生的组织系统中分离的细胞总RNA进行分离。用RNase-OUT核糖核酸酶抑制剂(InvitrogenInc，USA)处理的1μg总RNA使用小鼠莫洛尼氏白血病毒Superscript II和oligo dT(Invitrogen Inc，USA)的引导反应，通过反转录进行cDNA合成。在每个聚合酶链式反应(PCR)中，使用Abgene 2X PCR master mix和合适的引物，通过PCR将20μl的cDNA扩增。用对不同外显子特异的单个引物，选择能够区分cDNA和基因组DNA的PCR。用于扩增Oct-4、Nanog、Rex1、BMP2、BMP5和GAPDH cDNAs(Genosys)的引物列在下面表1中。用于热循环(ABIBiosystems 9700)扩增PCR产物的扩增条件是：94℃ 30秒；退火温度Tm℃(52-65℃)1分钟和72℃ 1分钟，进行30-35循环。
表1
    基因 引物序列   退火温度(℃)  PCR产物的大小
    GAPDH 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′(SEQ ID NO：1)5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′(SEQ ID NO：2)   60  890
    Oct-4 5′-CGRGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG-3′(SEQIDNO：3)5′-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC-3′(SEQ ID NO：4)   58  247
    Nanog 5′-CCTCCTCCATGGATCTGCTTATTCA-3′(SEQ ID NO：5)5′-CAGGTCTTCACCTGTTTGTAGCTGAG-3′(SEQ ID NO：6)   52  262
    Rex1 5′-GCGTACGCAAATTAAAGTCCAGA-3′(SEQ ID NO：7)5′-CAGCATCCTAAACAGCTCGCAGAAT-3′(SEQ ID NO：8)   56  306
    BMP2  5′-GGAAGAACTACCAGAAACGCG-3′(SEQ ID NO：9)5′-AGATGATCAGCCAGAGGAAAA-3′(SEQ ID NO：10)   55  657
    BMP5 5′-AAGAGGACAAGAAGGACTAAAAATAT-3′(SEQ ID NO：11)5′-GTAGAGATCCAGCATAAAGAGAGGT-3′(SEQ ID NO：12)   55  303
[0090]该实验结果如图12所示，所有检测的基因都表达了。Oct-4、Nanog和Rex1标记物的表达表明了组织系统中的USCs是未分化的。
实施例3
[0091]含未分化干细胞组织系统的活性研究：
[0092]在对含有USCs、具有活性的组织系统进行体外培养之前，对角膜缘活检组织进行评估，确定活检组织在转移中保持多长时间。手术后在4℃下，角膜缘活检组织在以下培养基中被转移或保存12、24、48和72小时：DMEM和Ham′s F-12(比例1∶1)，添加了人脐带血血清(3-5％)、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、转铁因子(5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(0.5μg/ml)、霍乱毒素A(0.1nmol/l)、庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(1.25μg/ml)。在这段时间后，培养活检组织产生如实施例1描述的含有USCs的组织系统。图13表示，在从治疗对象手术收集活检组织并开始培养组织系统起大约12、24、48和72小时成功的百分比。如图13所示，外植体优选地在收集活检组织大约24小时内进行培养，用活检组织产生组织系统取得最大成功大约在12小时之内。但是活检组在手术收集后直到大约72小时仍然保持有显著的产生组织系统的能力。
[0093]对实施例1中产生的组织系统在转移过程中的活力进行评价，确定培养的组织系统作为组织移植物在从培养物中取出后多长时间内保持活性。将组织系统放在包含转移培养基的特殊设计的容器中，在室温或4℃下进行转移。转移培养基由DMEM和F-12(DMEM∶F-12；1∶1)组成，用30％的来自2天灭活人胚胎纤维原细胞的调整培养基加富，进一步添加10％knock-out血清或10％热灭活人脐带血的血清、DMSO(0.5％)、rhEGF(2ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、转铁因子(5μg/ml)、亚硒酸钠(5μg/ml)、氢化可的松(0.5μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和两性霉素B(1.25μg/ml)。间隔6、12、24和48小时测定组织系统的活性。用以下参数分析转移培养基中组织系统的活性，诸如培养基的pH、细胞活性、死细胞的百分比和组织系统结构的完整性(例如通过平片估算)。
[0094]图14表示在不同时期后培养组织系统的活性由转移组织系统时的温度而定。在4℃下转移组织系统的结果比在室温下转移的结果稍好，在头12小时转移保持出色的活性，48小时后仍保持良好的活性。
[0095]本发明公开的和主张的所有组合物和方法，按照本发明，都可以实施，没有不适当的实验。根据优选实施例，本发明的内容和方法已经公开，很明显，对本领域技术人员来说，对本发明的内容和/或方法和方法中的步骤或步骤顺序所做的更动都不脱离本发明的实质精神和范围的情况。尤其是，某些化学或生理相关的试剂可以代替公开的试剂并取得相同或相似的结果是显而易见的。而本领域技术人员清楚所有这样相似的替代物和更动都在本发明的实质精神和范围内，如所附权利要求所限定。
序列表
<110>Totey，Satish M.
     Kashyap，subhadra D.
<120>来自角膜缘的未分化干细胞组织系统
<130>REL494/4-005US/71000
<140>TO BE ASSIGNED
<141>2005-01-25
<150>74/MUM/04
<151>2004-01-27
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt                                         26
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
catgtgggcc atgaggtcca ccac                                           24
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
cgrgaagctg gagaaggaga agctg                                        25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
caagggccgc agcttacaca tgttc                                        25
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>6
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<210>7
<211>23
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<213>Homo sapiens
<400>7
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<211>25
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<213>Homo sapiens
<400>8
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<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>9
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<210>10
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<213>Homo sapiens
<400>10
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<210>11
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<213>Homo sapiens
<400>11
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<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>12
gtagagatcc agcataaaga gaggt                                        25

Claims (48)

1.一种包含角膜缘干细胞的组织系统，其中在组织系统中至少大约30-90％的角膜缘干细胞是未分化干细胞。
2.权利要求1的组织系统，其中未分化干细胞表达选自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干细胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117组成的组中的一个或多个干细胞特异标记。
3.权利要求1的组织系统，其中未分化干细胞表达SSEA-4。
4.权利要求3的组织系统，其中表达SSEA-4的未分化干细胞在组织系统中至少包含大约50-90％的角膜缘干细胞。
5.权利要求1的组织系统，其中角膜缘干细胞表达选自K3/K12、K19和p63组成的组中的一个或多个细胞表面标记。
6.权利要求1的组织系统，其中组织系统是来自角膜巩膜缘组织。
7.权利要求6的组织系统，其中角膜巩膜缘组织是人组织。
8.权利要求1的组织系统，其中组织系统是复层组织系统。
9.权利要求1的组织系统，其中组织系统适合移植、植入或被移植给受者。
10.一种产生组织系统的方法，其中组织系统包含角膜缘干细胞，该方法包括以下步骤：
(a)从供者分离角膜缘组织；
(b)在培养基中培养角膜缘组织使之扩增为角膜缘细胞；
(c)通过分选角膜缘细胞将角膜缘干细胞群落从培养的角膜缘细胞中分离出来，从而选择一个或多个干细胞特异表面标记，其中干细胞特异表面标记是由未分化干细胞表达的；
(d)培养分离的角膜缘干细胞群落产生组织系统。
11.权利要求10的方法，其中角膜缘干细胞包括未分化干细胞。
12.权利要求11的方法，其中未分化干细胞在组织系统中至少包含大约70％的角膜缘干细胞。
13.权利要求11的方法，其中未分化干细胞表达选自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干细胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54、CD117组成的组中的一个或多个干细胞特异标记。
14.权利要求13的方法，其中未分化干细胞表达SSEA-4。
15.权利要求14的方法，其中表达SSEA-4的未分化干细胞在组织系统中至少包含大约50-90％的角膜缘干细胞。
16.权利要求10的方法，其中未分化干细胞表达选自K3/K12、K19和p63组成的组中的一个或多个细胞表面标记。
17.权利要求10的方法，其中角膜缘组织是从人供者分离的。
18.权利要求10的方法，其中组织系统适合移植、植入或被移植给受者。
19.权利要求18的方法，其中受者的单眼或双眼缺乏角膜缘干细胞。
20.权利要求18的方法，其中供者和受者为相同个体。
21.权利要求18的方法，其中供者与受者是生物相容的。
22.权利要求10的方法，其中角膜缘组织在生物包被的表面或细胞外基质载体上进行培养。
23.权利要求22的方法，其中生物包被的表面是生物包被的培养皿。
24.权利要求23的方法，其中培养皿是用一个或多个附着因子进行生物包被，该附着因子选自纤维蛋白原、层粘蛋白、胶原质IV、固生蛋白、纤维连接蛋白、胶原质、牛垂体提取物、EGF、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子和氢化可的松组成的组。
25.权利要求22的方法，其中细胞外基质选自MatrigelTM、哺乳动物羊膜、层粘蛋白、RelisealTM、凝血酶、固生蛋白、巢蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、胶原质-IV、多聚-L-赖氨酸、明胶、多聚-L-鸟氨酸、纤维连接蛋白和血小板源性生长因子(PDGF)组成的组。
26.权利要求22的方法，其中细胞外基质是人羊膜。
27.权利要求22的方法，其进一步包括在分离角膜缘干细胞之前分离培养的角膜缘细胞的步骤。
28.权利要求10的方法，其中角膜缘组织是在添加了选自二甲基亚砜、重组人表皮生长因子、胰岛素、亚硒酸钠、转铁因子、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子和白血病抑制因子组成的组中的一种或多种可溶性因子的培养基中进行培养。
29.权利要求10的方法，其中角膜缘细胞用磁亲和细胞分选(MACS)法进行分选。
30.权利要求10的方法，其中角膜缘细胞是用荧光激活细胞分选法(FACS)进行分选。
31.权利要求10的方法，其中用于分离角膜缘细胞的一个或多个干细胞特异表面标记选自SSEA-4、SSEA-3、Oct-4、Nanog、Rex-1、干细胞因子、Tra-1-60、CD73、CD105、CD31、CD54和CD117组成的组。
32.权利要求10的方法，其中用于分离角膜缘细胞的干细胞特异表面标记是SSEA-4。
33.权利要求10的方法，其中分离的角膜缘干细胞群落在组织基底上进行培养产生组织系统。
34.权利要求33的方法，其中组织基底包括生物包被的支持物。
35.权利要求34的方法，其中生物包被的支持物是选自纤维蛋白原、层粘蛋白、胶原质IV、固生蛋白、纤维连接蛋白、胶原质、牛垂体提取物、EGF、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子和氢化可的松组成的组中的一个或多个附着因子。
36.权利要求33的方法，其中组织基底选自人羊膜、层粘蛋白、胶原质IV、固生蛋白、纤维蛋白原、巢蛋白、透明质酸、RelisealTM、凝血酶、MatrigelTM和纤维连接蛋白组成的组。
37.权利要求33的方法，其中组织基底是人羊膜。
38.权利要求35的方法，其中人羊膜是由选自层粘蛋白、胶原质IV、固生蛋白、纤维蛋白原、巢蛋白、透明质酸、RelisealTM、凝血酶、MatrigelTM和纤维连接蛋白组成的组中的一个或多个附着因子进行生物包被。
39.权利要求10的方法，其中分离的角膜缘干细胞群落在用来自灭活人胚胎纤维原细胞的调整培养基加富的培养基中进行培养。
40.权利要求10的方法，其中分离的角膜缘干细胞群落在用人白血病抑制因子加富的培养基中进行培养。
41.权利要求10的方法，其中分离的角膜缘干细胞群落是在添加选自二甲基亚砜、重组人表皮生长因子、胰岛素、亚硒酸钠、转铁因子和氢化可的松所组成的组中的一种或多种可溶性因子的培养基中进行培养。
42.权利要求10的方法，其进一步包括分离的角膜缘干细胞群落的连续传代，至少有10、15或20次传代。
43.权利要求10的方法，其进一步包括在冷冻培养基中对角膜缘干细胞群落进行冷冻保存。
44.权利要求43的方法，其中冷冻培养基包含10-90％热灭活人脐带血血清和5-10％DMSO的培养基。
45.权利要求42的方法，其中角膜缘干细胞群落优选在每次传代后进行冷冻保存。
46.权利要求18的方法，其进一步包括将组织系统在包含转移培养基的转移容器中转移给受者。
47.权利要求46的方法，其中转移容器包括一个便携式的、圆柱状的箱体，上端开口接受组织系统，下端封闭，在箱体的上端安装有平行结构用于支撑组织系统，以及一个用于关闭箱体上端开口的盖子。
48.权利要求47的方法，其中转移容器是用特殊组织培养级塑料-1或医用级不锈钢制备的。
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