CN111657269B - 纤维蛋白胶用于smile来源人角膜透镜保存前的保护处理方法 - Google Patents

纤维蛋白胶用于smile来源人角膜透镜保存前的保护处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，包括角膜透镜收集、外观检验、无菌冲洗、保护处理及无菌转移等步骤，将收集的角膜透镜在进行长期保存之前，使用维蛋白原和凝血酶配制而成的纤维蛋白胶处理液对角膜透镜进行处理，使得角膜透镜表面及其边缘形成一层纤维蛋白胶“保护膜”，从而抑制外界和自身的损伤，维持角膜透镜组织的完整性，且不会对角膜后期的应用产生影响，保证角膜透镜后期使用的安全性；解决了SMILE手术取出的角膜透镜边缘部损伤随着时间的推移向角膜透镜中心部位蔓延的问题，有助将SMILE来源人角膜透镜应用于临床的研究，并为充分利用SMILE来源人角膜透镜这一资源提供技术支撑，具有非常重要的社会及经济价值。

Description

纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理 方法
技术领域
本发明涉及纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法。
背景技术
角膜病变是我国第二位致盲眼病，根据世界卫生组织统计，全球现约有6000万的角膜疾病患者，其中约500万为我国患者，并且每年全球新增角膜疾病患者多达15万人。目前，角膜移植仍然是恢复视力的主要手段，然而我国角膜材料严重匮乏，与庞大的需求相比，杯水车薪。虽然，如今已有两种脱细胞猪角膜产品被中国食药局批准，但其临床应用后存在移植物透明度不佳，视力恢复延迟等诸多问题。
飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(Small Incision Lenticule Extraction，SMILE)是近年来角膜屈光手术领域最大的发展之一，其将分秒激光精准定位的立体切割技术用于近视及散光的矫正，具有极高的安全性、有效性、稳定性及可预测性。SMILE手术是在角膜基质层内特定深度切割出一定大小和厚度的角膜透镜，角膜透镜的直径一般为6.0～6.6mm，中央厚度为60～150μm，边缘厚度为10～30μm。这部分通过SMILE手术从角膜基质层内取出的组织我们称为“角膜透镜”。每年我国开展的SMILE手术约一百万台，SMILE来源的角膜透镜量非常丰富。研究表明，角膜透镜预期可用于矫正远视和近视、治疗老视，以及用于治疗圆锥角膜、角膜营养不良、角膜溃疡、角膜穿孔、边缘角膜变性(周边角膜的免疫性、非感染性疾病)、角膜基质变薄等角膜疾病，还可以利用其构建组织工程化生物角膜的载体等，应用前景广阔。
经研究发现，SMILE手术取出的角膜透镜，可能由于激光原因或分离角膜透镜时受到钝性分离的牵引力略有所不同的原因，导致角膜透镜的边缘部位发生损伤，这种损伤随着时间的推移可能向角膜透镜中心部位蔓延，影响其后期的应用。然而，而目前专门针对SMILE手术取出后角膜透镜的损伤保护措施甚少，以往SMILE手术中取出的角膜透镜这一“副产品”边缘部位损伤严重往往被拋弃，并未得到有效的利用。
发明内容
针对上述存在的问题及考虑到角膜透镜具有广泛的临床应用前景，本发明提供一种纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，在角膜透镜取出后，在进行长期保存之前，使用维蛋白原和凝血酶对角膜透镜进行处理，使得角膜透镜表面及其边缘形成一层纤维蛋白胶“保护膜”，从而抑制外界和自身的损伤。具体技术方案如下：
本发明提供的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，包括如下步骤：
步骤1：角膜透镜收集：将SMILE手术取出的角膜透镜立即置入含有角膜中期保存液的透明无菌冻存管中，并冰置；
步骤2：外观检验：透过透明无菌冻存管检查收集的角膜透镜外观，检验合格的角膜透镜，迅速用冰盒转移至下一操作步骤；
步骤3：无菌冲洗：在超净工作台上，使用专用的无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液或生理盐水对其表面反复冲洗；
步骤4：保护处理：使用配制好的纤维蛋白胶处理液按照规定步骤对冲洗后的角膜透镜进行保护处理，使其表面和边缘形成一层保护膜；
步骤5：无菌转移：将经保护处理后的角膜透镜再次转移至含有角膜中期保存液的无菌冻存管中，旋紧外盖，标记后，于2～8℃环境下存储。
作为优选的技术方案的，步骤1和步骤5中，所述透明无菌冻存管的规格均为2ml；所述角膜中期保存液均为OptisolTM-Gs角膜中期保存液。
作为优选的技术方案的，步骤2中，所述检验合格的角膜透镜，其外观呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。
作为优选的技术方案的，步骤3中，所述无菌冲洗的冲洗时间为2min～15min。
作为优选的技术方案的，步骤4中，所述纤维蛋白胶处理液为外用冻干人纤维蛋白粘合剂，其含有冻干人纤维蛋白原和冻干人凝血酶两种血浆蛋白成分；使用前需将所述冻干人纤维蛋白原和冻干人凝血酶分别配制成纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，再用于角膜透镜的保护处理。
作为优选的技术方案的，步骤4中，所述保护处理的步骤为：先将纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，静置，使角膜透镜的表面和边缘形成一层保护膜。所述静置时间优选为1min～6min。所述纤维蛋白原溶液的浓度优选为0.005～0.2g/ml，所述凝血酶溶液的浓度优选为10～300IU/ml。
前述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，所述纤维蛋白原溶液的配制方法为：将冻干纤维蛋白原和灭菌注射用水均置于30～37℃的水浴中温热3min～6min后，按所需浓度将灭菌注射用水注入纤维蛋白原中，继续水浴至完全溶解。所述凝血酶溶液的配制方法为：将冻干人凝血酶和40mmol/L浓度的氯化钙溶液预温至室温，再将所述氯化钙溶液注入凝血酶瓶中使其溶解，即可。
本发明的有益效果是：
本发明方法，首次将纤维蛋白胶用于SMILE手术取出后角膜透镜的损伤保护。在保护处理过程中，先将纤维蛋白胶处理液滴加在角膜透镜的表面及边缘再滴加凝血酶溶液，二者混合后形成呈白色粘稠状粘合剂溶液即纤维蛋白胶，其在角膜透镜的边缘形成“锁边”防护，并在角膜透镜表面形成一层“保护膜”，有效了抑制角膜透镜的损伤延伸，从而维持角膜透镜组织的完整性。
本发明采用的纤维蛋白原溶液浓度控制在0.005～0.2g/ml，凝血酶溶液的浓度控制在10～300IU/ml，建立合适的纤维蛋白胶浓度及硬度，保护角膜透镜的同时而不对其性能造成影响。
另外，本发明所用的纤维蛋白胶处理液中的纤维蛋白原和凝血酶均选自冻干人纤维蛋白原、冻干人凝血酶两种血浆蛋白成分，不会对角膜后期的应用产生影响，保证角膜透镜的安全性。
总体而言，本发明通过将纤维蛋白胶用于SMILE手术取出后角膜透镜的保存前处理，解决了SMILE手术取出的角膜透镜边缘部损伤随着时间的推移向角膜透镜中心部位蔓延的问题，有助将SMILE来源人角膜透镜应用于临床的研究，充分利用了SMILE来源人角膜透镜这一资源，具有非常重要的社会及经济价值。
附图说明
图1为角膜透镜组织切片显微镜电镜图；
其中：
a为新鲜角膜透镜组织切片显微镜电镜图，
b为经纤维蛋白胶处理后的角膜透镜组织切片显微镜电镜图，
c为未经纤维蛋白胶处理的角膜透镜组织切片显微镜电镜图；
图2为角膜透镜透射电镜图；
其中：
a为新鲜角膜透镜透射电镜图，
b为经纤维蛋白胶处理的角膜透镜透射电镜图，
c为未经纤维蛋白胶处理的角膜透镜透射电镜图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例1为配制纤维蛋白胶处理液，实施例2～6为纤维蛋白胶处理液用于角膜透镜保存前处理，实施例7为效果例。
实施例1
本实施例为配制用于角膜透镜保护处理的纤维蛋白胶处理液，该处理液为外用冻干人纤维蛋白粘合剂，其为混合包装，主要包括冻干人纤维蛋白原、冻干人凝血酶两种血浆蛋白成分，及附带的其他辅助用液和医用材料。其保护原理是：冻干纤维蛋白原溶于灭菌注射用水中形成纤维蛋白原溶液，冻干凝血酶溶于氧化钙溶液中形成凝血酶溶液；在使用过程中，上述两种溶液混合后形成呈白色粘稠状胶体粘合剂溶液，即纤维蛋白胶，其在角膜透镜的边缘形成“锁边”防护，并在角膜透镜表面形成一层“保护膜”，有效了抑制角膜透镜的损伤延伸，从而维持角膜透镜组织的完整性。
所述纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的具体配制方法如下：
(1)常规消毒瓶塞以及使用过程中所用一切器具，同时，溶液配制过程亦应保持无菌。
(2)纤维蛋白原溶液的配制：
首先将装有冻干纤维蛋白原的产品瓶及灭菌注射用水瓶置于30～37℃的水浴中温热3min～6min；然后使用注射器吸取灭菌注射用水注入高浓度纤维蛋白原瓶中，浓度根据需求控制在0.005～0.2g/ml；将瓶重新置于水浴中，轻轻摇动瓶子，注意应避免产生气泡；10～15min后取出瓶子，在光亮处目检判定纤维蛋白原是否完全溶解，溶液应呈现透明且无不溶性颗粒；若溶解不完全，则将瓶重新置于水浴中，延长水浴时间，直至完全溶解，备用。
(3)凝血酶溶液的配制：
配制前将冻干人凝血酶产品瓶和40mmol/L浓度氯化钙溶液瓶预温至室温；使用注射器将40mmol/L氯化钙溶液注入凝血酶瓶中，浓度控制在10～300IU/ml；轻轻摇动瓶子，使其溶解，备用。
应注意，用于溶解凝血酶的注射器和针头，应严格与溶解纤维蛋白原的注射器与针头区分开来，以防止两溶液提前接触产生凝固。
实施例2
将眼科医院SMILE手术后的角膜透镜收集至含OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置冰盒上，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。迅速用冰盒转移至超净工作台中，在超净工作台中进行以下操作：外观检查合格后使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间10min；先将实施例1中配制的0.05g/ml纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将实施例1中配制的100IU/ml凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，等待4min；再转移至含有OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置于2～8℃冰箱中存储。
实施例3
将眼科医院SMILE手术后的角膜透镜收集至含OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置冰盒上，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。迅速用冰盒转移至超净工作台中，在超净工作台中进行以下操作：外观检验合格后使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间6min；先将实施例1中配制的0.02g/ml纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将50IU/ml凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，等待5min；再转移至含有OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置于2～8℃冰箱中存储。
实施例4
将眼科医院SMILE手术后的角膜透镜收集至含OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置冰盒上，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。迅速用冰盒转移至超净工作台中，在超净工作台中进行以下操作：外观检验合格后使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间5min；先将实施例1中配制的0.03g/ml纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将100IU/ml凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，等待4min；再转移至含有OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置于2～8℃冰箱中存储。
实施例5
将眼科医院SMILE手术后的角膜透镜收集至含OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置冰盒上，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。迅速用冰盒转移至超净工作台中，在超净工作台中进行以下操作：外观检验合格后使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间4min；先将实施例1中配制的0.2g/ml纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将300IU/ml凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，等待1min；再转移至含有OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置于2～8℃冰箱中存储。
实施例6
将眼科医院SMILE手术后的角膜透镜收集至含OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置冰盒上，观察其外观应呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。迅速用冰盒转移至超净工作台中，在超净工作台中进行以下操作：外观检验合格后使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液冲洗角膜透镜表面，冲洗时间15min；先将实施例1中配制的0.005g/ml纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将10IU/ml凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，等待6min；再转移至含有OptisolTM-Gs角膜中期保存液的2ml无菌冻存管中，放置于2～8℃冰箱中存储。
实施例7效果例
本实施例是任意取出实施例2～6中保护处理后保存12h的角膜透镜，再次用无菌等渗磷酸缓冲液反复冲洗后，然后再将其分别浸泡在4％多聚甲醛、2.5％戊二醛中进行超微结构组织切片观察和超微结构-透射电镜观察，同时采用刚收集的新鲜角膜透镜和未经胶原蛋白胶保护处理保存12h的角膜透镜作对比。结果如图1和图2所示。
(1)超微结构-组织切片观察：
显微镜下观察，经纤维蛋白胶保护处理的角膜透镜(b)无增厚和水肿，并且胶原纤维排列整齐、紧密，与新鲜角膜透镜(a)外观无显著差异；而未经胶原蛋白胶处理的角膜透镜(c)有水肿现象，角膜透镜中央厚，角膜纤维结构松散、规则性较差。
(2)超微结构-透射电镜观察
透射电镜下观察，经纤维蛋白胶保护处理的角膜透镜(b)胶原纤维无显著变化，边缘规整，胶原纤维完整，并且排列均匀、规则、无明显分离，与新鲜角膜透镜(a)外观无显著差异；而未经胶原蛋白胶处理的角膜透镜(c)边缘不规整，胶原纤维出现断裂，规则性较差。
由上述观察可以看出，经本发明方法处理后的角膜透镜能长期保持新鲜的状态，透镜的胶原纤维长期排列整齐、紧密；且边缘长久保持规整无损伤，解决了SMILE手术取出的角膜透镜边缘部损伤随着时间的推移向角膜透镜中心部位蔓延的问题，有助将SMILE来源人角膜透镜应用于临床的研究，为充分利用SMILE来源人角膜透镜这一资源，提供重要的技术支持，具有非常重要的社会及经济价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：角膜透镜收集：将SMILE手术取出的角膜透镜立即置入含有角膜中期保存液的透明无菌冻存管中，并冰置；
步骤2：外观检验：透过透明无菌冻存管检查收集的角膜透镜外观，检验合格的角膜透镜，迅速用冰盒转移至下一操作步骤；
步骤3：无菌冲洗：在超净工作台上，使用无菌转移环将角膜透镜取出，并用无菌等渗磷酸缓冲液或生理盐水对其表面反复冲洗；
步骤4：保护处理：使用配制好的纤维蛋白胶处理液按照规定步骤对冲洗后的角膜透镜进行保护处理，使其表面和边缘形成一层保护膜；所述保护处理的具体步骤为：先将纤维蛋白原溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，再将凝血酶溶液滴于角膜透镜的表面及边缘，静置，使角膜透镜的表面和边缘形成一层保护膜；
步骤5：无菌转移：将经保护处理后的角膜透镜再次转移至含有角膜中期保存液的无菌冻存管中，旋紧外盖，标记后，于2～8℃环境下存储。
2.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：步骤1和步骤5中，所述透明无菌冻存管的规格均为2ml；所述角膜中期保存液均为OptisolTM-Gs角膜中期保存液。
3.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：步骤2中，所述检验合格的角膜透镜，其外观呈无色透明、双面平整、光滑，且无破损和无明显缺陷。
4.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：步骤3中，所述无菌冲洗的冲洗时间为2min～15min。
5.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：步骤4中，所述纤维蛋白胶处理液为外用冻干人纤维蛋白粘合剂，其含有冻干人微纤维蛋白原和冻干凝血酶两种血浆蛋白成分；使用前需将所述冻干人微纤维蛋白原和冻干凝血酶分别配制成纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液，再用于角膜透镜的保护处理。
6.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：所述静置时间为1min～6min。
7.根据权利要求1所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：所述纤维蛋白原溶液的浓度为0.005～0.2g/ml，所述凝血酶溶液的浓度为10～300IU/ml。
8.根据权利要求7所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：所述纤维蛋白原溶液的配制方法为：将冻干纤维蛋白原和灭菌注射用水均置于30~37℃的水浴中温热3min～6min后，按所需浓度将灭菌注射用水注入纤维蛋白原中，继续水浴至完全溶解。
9.根据权利要求7所述的纤维蛋白胶用于SMILE来源人角膜透镜保存前的保护处理方法，其特征在于：所述凝血酶溶液的配制方法为：将冻干人凝血酶和40mmol/L浓度的氯化钙溶液预温至室温，再将所述氯化钙溶液注入凝血酶瓶中使其溶解，即可。
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