CN1386547A - 高凝固性纤维蛋白原胶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高凝固性纤维蛋白原胶,它由组份A冻干纤维蛋白原、组份B含有纤维蛋白原活性增强因子的生理缓冲盐溶液、组份C冻干凝血酶和组份D含有CaCl2的生理缓冲盐溶液组成;也可以由组份1含有纤维蛋白原活性增强因子的纤维蛋白原溶液和组份2凝血酶溶液组成。使用时以组份B将组份A溶解,组份D将组份C溶解,然后同时喷涂到手术或出血创面即可形成一层纤维蛋白膜,起到封闭创面或止血止渗的作用;双组份高凝固性纤维蛋白原胶可溶化后直接使用。它明显降低了凝血酶的用量,降低了成本,增强了纤维蛋白原活性和粘合强度,具有高效的止血和促进伤口愈合作用,另外联合使用纤维蛋白原活性增强因子还具有抗菌、抑制创面感染的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种高凝固性纤维蛋白原胶，具体的说是涉及一种能迅速形成纤维蛋白胶，具有高度止血和封闭创面的作用的纤维蛋白原、纤维蛋白原活性增强因子和少量凝血酶组成的药物组合物。
技术背景
纤维蛋白原胶是模拟血凝的最后阶段反应由血浆蛋白成份组成的一种复合制剂，它可以通过凝血酶从纤维蛋白原释放纤维蛋白肽形成具有一定强度的纤维蛋白凝块。应用于临床可起到封闭创面，止血和伤口愈合的作用。纤维蛋白原胶己在欧洲、日本和加拿大获准生产。工业化制造的纤维蛋白原胶已在许多外科手术中显示出特有的价值，迄今还未发现明显的毒性和不良反应，但是有报道提及个别病人采用纤维蛋白原胶后产生自身抗凝血酶抗体，引起了严重出血，分析认为是由于纤维蛋白原胶中凝血酶含量太大所致。
凝血酶可以从动物血液或人血液中提取制得，但是工艺复杂成本也高，而且凝血酶用量较大，有导致严重出血的危险。目前市售纤维蛋白原胶中凝血酶的含量为300～600U/ml。因此降低纤维蛋白原胶中的凝血酶含量不仅是经济方面考虑的需要，也是临床的需要。本发明通过对纤维蛋白原胶凝固活性调解因素的研究，发现了一些具有使纤维蛋白原凝固活性明显增强的物质，这些物质在少量存在的情况下能增强纤维蛋白原凝固性，通过少量凝血酶作用即可迅速形成纤维蛋白胶，因此大大地减少了凝血酶的用量，降低了纤维蛋白原胶的生产成本。本发明中凝血酶的用量为10～100U/ml，是目前市售纤维蛋白原胶用量的1/6～1/30。而纤维蛋白原活性增强因子多为高分子聚合物，用量一般很少。
纤维蛋白原活性增强因子是具有聚阳离子特性的高分子化合物，在水溶液中解离形成聚阳离子。形成具有一定电荷密度的集团。通过静电作用和体积排斥作用，使纤维蛋白原分子的空间结构发生改变，充分暴露出凝血酶的作用位点，因此使纤维蛋白原处于高度活性状态，纤维蛋白原凝固性增强因子在这一组份中起到催化剂的作用。本发明是在这一新的研究发展的基础上提出的。
发明内容
本发明的目的是采用纤维蛋白原活性增强因子，降低现有纤维蛋白原胶组份中凝血酶的用量，降低成本，提高生物胶的效果，并避免由于凝血酶用量过大，而引起严重出血的危险，以提供一种高凝固性纤维蛋白原胶。
本发明的目的是这样实现的：它由A、B、C、D四个组份构成，其特征在于组份A是冻干纤维蛋白原，含量为20～120mg/ml；组份B是含有纤维蛋白原活性增强因子的生理缓冲盐溶液；组份C是冻干凝血酶，含量为10～100U/ml；组份D是含有CaCI2的生理缓冲盐溶液，pH6～8。
另外，本发明也可以由双组份组成，将组份A溶于组份B制成组份1含有纤维蛋白原活性增强因子的纤维蛋白原生理缓冲盐溶液，纤维蛋白原含量20～120mg/ml，在-20℃以下保存；将组份C溶于组份D制成组份2含有凝血酶的CaCI2生理缓冲盐溶液，凝血酶含量为10～100U/ml，CaCl240mM，pH6～8，在-20℃以下保存。
其中，所述的纤维蛋白原胶为人血纤维蛋白原、牛血纤维蛋白原或猪血纤维蛋白原。
其中，所述的纤维蛋白原活性增强因子包括：组蛋白、血小板第4因子、多聚赖氨酸、富组氨酸糖蛋白、鱼精蛋白、聚二甲基二烯丙基氯化铵、碱性蛋白、β-血栓球蛋白、阳离子蛋白、聚阳离子化合物、亚甲蓝或链霉素。
其中，所述的高凝固性纤维蛋白原胶四组份中组份A纤维蛋白原和组份C凝血酶为冷冻干燥品。双组份高凝固性纤维蛋白原胶组份1和组份2为液体，在-20℃以下保存。
其中，组份A可以从动物血液或人血液中提取制备：将动物或人的血浆，加入乙醇溶液，低温搅拌，并离心收集沉淀，收集的沉淀物加入溶解液适量溶解，然后用双缩脲法测定蛋白的浓度，最终将纤维蛋白原的浓度调至20～120mg/ml，分装入瓶中，在-40℃～-20℃冷冻至完全冻结，用冷冻干燥机冷冻干燥12-24小时，冷冻干燥品在4℃保存。
其中，组份B为纤维蛋白原活性增强因子磷酸缓冲盐溶液，优选渗透压为270～320mOsm，钠含量为148～163mM/L，氯含量123～135mM/L，PH6～8。
其中，组份C也可以从动物血液或人血液中提取制备：将动物或人的血浆溶于蒸馏水中，用酸调节PH，离心，收集沉淀物为凝血酶复合物；在30℃条件下，将凝血酶原复合物溶于1～2倍的0.9％NaCI溶液中，搅拌均匀，加入1.5％的氯化钙，搅拌，在4℃下放置，保证凝血酶原转成凝血酶，离心弃去沉淀，上清液加入等量预冷至4℃的丙酮，搅拌均匀，在4℃冰箱中过夜。然后离心，收集沉淀，上清液回收丙酮。沉淀丙酮洗涤并研细，在冷箱中放置，然后过滤，沉淀分别用乙醇和乙醚洗涤，放置在于干燥器中干燥，得凝血酶粗品，把粗品溶于适量的0.9％ NaCI溶液中，在0℃放置，然后过滤，滤出的沉淀再用0.9％NaCI溶液溶解，在0℃放置，过滤，合并两次滤液，调节pH值，然后离心，弃去沉淀，收集上层清液，在上清液中加入2倍量预冷至4℃的丙酮，静置，离心。收集沉淀，沉淀再浸泡于冷丙酮中。静置过夜，然后过滤，沉淀分别用无水乙醇、乙醚洗涤，干燥即得凝血酶，凝血酶的活性为500～1000U/mg，将凝血酶用1％的白蛋白溶液溶解，分装，冷冻干燥，4℃保存。
其中，组份D为含有40mM/L CaCl2的磷酸缓冲盐溶液，pH约为6～8。
使用时以组份B将组份A溶解，组份D将组份C溶解，然后同时喷涂到手术或出血创面即可形成一层纤维蛋白膜，起到封闭创面或止血止渗的作用；双组份高凝固性纤维蛋白原胶可溶化后直接使用。在使用过程中含有纤维蛋白原活性增强因子的溶解液有一定促进冻干组份纤维蛋白原溶解的作用，便于临床使用。
本发明与现有技术相比，明显降低了凝血酶用量，减少了成本，增强了纤维蛋白原活性和粘合强度，具有高效的止血和促进伤口愈合作用，另外联合使用纤维蛋白原活性增强因子还具有抗菌、抑制创面感染的作用。纤维蛋白原活性增强因子能使纤维蛋白胶轻度收缩，挤出水份，形成具有一定强度的封闭膜，粘合创面更加牢固。
本发明与市场产品的比较
| 纤原含量 | 凝血酶 | 增强因子 | 凝固时间 | 膜外观强度 | |
| 本发明制品 | 20 -120mg/ml | 10 ～100U/ml | 有 | 9-12秒 | 膜状，有弹性 |
| 市售品 | 20 -120mg/ml | 200 ～600U/ml | 无 | 12-15秒 | 凝胶状，无弹性 |
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明：
实施例1：
①纤维蛋白原的纯化：取500ml猪血浆，加入95ml55％(v/v)的乙醇，使乙醇的终浓度为8％，在-3℃条件下搅拌1个时，低温(-4℃-4℃)离心收集沉淀，离心速度3000转/分，离心20-30分钟，收集的沉淀物加入溶解液(柠檬酸三钠0.6％，葡萄糖2.5％，氯化钠0.42％)适量溶解，然后用双缩脲法测定蛋白的浓度，最终将纤维蛋白原的浓度调至20mg/ml，分装入青霉素瓶中，每瓶5ml，在-40℃～-20℃冷冻至完全冻结，用冷冻干燥机冷冻干燥12-24小时，冷冻干燥品在4℃保存，为组份A。
②组份B为磷酸缓冲盐溶液，渗透压为270～320mOsm，钠含量为148～163mM/L，氯含量123～135mM/L，PH6.8～7.8，多聚赖氨酸2mg/ml，过滤分装到无菌青霉素瓶中，每瓶2.5ml。
③凝血酶的纯化：把猪血浆溶于蒸馏水中，用1％浓度的醋酸调节PH至5.3。在离心机上离心15分钟，弃去上清液，收集沉淀物为凝血酶复合物；在30℃条件下，将凝血酶原复合物溶于1～2倍的0.9％NaCI溶液中，搅拌均匀，加入1.5％的氯化钙，搅拌15分钟，在4℃下放置2小时，保证凝血酶原转成凝血酶，离心弃去沉淀，上清液移入搪瓷桶中。加入等量的预冷至4℃的丙酮，搅拌均匀，在4℃冰箱中过夜。然后离心，收集沉淀，上清液回收丙酮。沉淀丙酮洗涤并研细，在冷箱中放置3天，然后过滤，沉淀分别用乙醇和乙醚洗涤一次，放置在于干燥器中干燥，得凝血酶粗品，把粗品溶于适量的0.9％NaCI溶液中，在0℃放置6小时以上，然后用滤纸过滤，滤出的沉淀再用0.9％NaCI溶液溶解，在0℃放置6小时以上，过滤，合并两次滤液，用1％醋酸溶液调节pH值5.5然后离心，弃沉淀，收集上层清液，在清液中加入2倍量预冷至4℃的丙酮，静置3小时，离心30分钟。收集沉淀，沉淀再浸泡于冷丙酮中。静置过夜，然后过滤，沉淀分别用无水乙醇、乙醚各洗涤一次，干燥即得凝血酶，凝血酶的活性为500-1000U/mg，将凝血酶用1％的白蛋白溶液溶解，分装青霉素小瓶中，每瓶凝血酶含量为75-125U，冷冻干燥，4℃保存。为组份C。
④组份D为含有40mM/L CaCl2的磷酸缓冲盐溶液，pH为6.8-7.8。无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml。
实施例2。
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，组蛋白3mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存，组份2。
实施例3：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，聚二甲基二烯丙基氯化铵(分量200,000)1mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例4：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，血小板第4因子2mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例5：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，富组氨酸糖蛋白2mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例6：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，鱼精蛋白2.5mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例7：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，β-血栓球蛋白质1.5mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例8：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，亚甲蓝2mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
实施例9：
①按实施例1中的方法制备纤维蛋白原，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，纤维蛋白原含量40mg/ml，链霉素2.5mg/ml，-20℃冰箱保存。组份1。
②按实施例1中的方法制备凝血酶，无菌过滤分装到青霉素瓶中，每瓶2.5ml，凝血酶为50U/ml，CaCl240mM，-20℃冰箱保存。组份2。
本发明的实施效果检验
①实施例1的效果测试：
a.将组份A用组份B溶解，组份C用组份D溶解，溶解时间5分钟。
b.凝固时间测定，取组份A溶解液0.1ml加入小试管中，再加入组份C溶液0.1ml，用秒表计时，凝固时间9-12秒。
c.强度测定：在直径3.57cm，高0.2cm(表面积为10cm2)。无菌器皿内，加入组份A和组份C的溶液各2ml，37℃条件下，放置10分钟，将膜从皿中完整取出，形状为膜状，有弹性。绕屈180°5次以上无发生断裂现象。
②实施例2至9的效果测试
a.将组份1和组份2在37℃条件下溶解。
b.凝固时间测定，取组份1溶解溶液0.1ml加入小试管中，再加入组份2溶液0.1ml，用秒表计时，凝固时间9-12秒。
c.强度测定：在直径3.57cm，高0.2cm(表面积为10cm2)。无菌器皿内，加入组份1和组份2的溶液各2ml，37℃条件下，放置10分钟，将膜从皿中完整取出，形状为膜状，有弹性。绕屈180°5次以上无发生断裂现象。
Claims (6)
1.高凝固性纤维蛋白原胶，它由A、B、C、D四个组份构成，其特征在于组份A是冻干纤维蛋白原，含量为20～120mg/ml；组份B是含有纤维蛋白原活性增强因子的生理缓冲盐溶液；组份C是冻干凝血酶，含量为10～100U/ml；组份D是含有CaCI2的生理缓冲盐溶液，pH6～8。
2.根据权利要求1所述的高凝固性纤维蛋白原胶，其中，所述的四个组份中将组份A溶于组份B制成组份1含有纤维蛋白原活性增强因子的纤维蛋白原生理缓冲盐溶液，纤维蛋白原含量20～120mg/ml，在-20℃以下保存；将组份C溶于组份D制成组份2含有凝血酶的CaCI2生理缓冲盐溶液，凝血酶含量为10～100U/ml，CaCl240mM，pH6～8，在-20℃以下保存。
3.根据权利要求1所述的高凝固性纤维蛋白原胶，其中，所述的纤维蛋白原胶为人血纤维蛋白原、牛血纤维蛋白原或猪血纤维蛋白原。
4.根据权利要求1所述的高凝固性纤维蛋白原胶，其中，所述的纤维蛋白原活性增强因子包括：组蛋白、血小板第4因子、多聚赖氨酸、富组氨酸糖蛋白、鱼精蛋白、聚二甲基二烯丙基氯化铵、碱性蛋白、β-血栓球蛋白、阳离子蛋白、聚阳离子化合物、亚甲蓝或链霉素。
5.根据权利要求1所述的高凝固性纤维蛋白原胶，其中，所述的高凝固性纤维蛋白原胶四组份中组份A纤维蛋白原和组份C凝血酶为冷冻干燥品。
6.根据权利要求2所述的高凝固性纤维蛋白原胶，其中，所述的组份1和组份2为液体，在-20℃以下保存。
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