CN111560064A - 一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于血液制品领域，具体涉及一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，依次包括：组分I溶解、S/D灭活、低温乙醇沉淀、甘氨酸沉淀、加入氯化钙，阳离子交换层析、阴离子交换层析、超滤、浓缩、稀配、分装、冻干、干热灭活。本发明在人纤维蛋白原提取分离过程中采用了二步沉淀法和二步层析法，提高了人纤维蛋白的纯度，有效去除杂蛋白，可减少临床不良发应的发生，制备得到高浓度、高纯度、溶解性好的人纤维蛋白原，可减少临床用药次数，方便临床用药。

Description

一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺

技术领域

本发明属于血液制品领域，具体涉及一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺。

背景技术

纤维蛋白原(Fg)，由肝细胞合成和分泌，为机体止血生理中重要的凝血因子。贮存稳定性较好，但热稳定性差，在56℃可形成不可逆沉淀，正常人血浆中Fg浓度为2.4～4.0g/L。

Fg作为一种急性时相反应蛋白，其血液含量异常是缺血性心脑血管病等疾病的危险因子。Fg增加往往是机体的一种非特异反应，常见于毒血症、肺炎、胆囊炎、肺结核等感染及肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、脑血栓、心肌梗死等无菌性炎症；另外如外科手术、放射治疗、妊娠期也可见Fg轻度增高。Fg减少较少见，但当其低于1.0g/L时，机体可出现出血征象。一种先天性纤维蛋白原缺乏症是极为罕见的遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝脏不能合成Fg；继发性纤维蛋白原减少的原因是由于纤维蛋白溶解酶溶解纤维蛋白所致，如胎盘早期剥离，分娩时羊水进入血管形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶解酶原，使血中纤维蛋白溶解酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗体内原有的Fg，使其含量减少；严重的肝实质损害，如各种原因引起的肝坏死、慢性肝病晚期等也可出现Fg的减少。

临床上Fg主要用于治疗先天性、获得性纤维蛋白原减少或缺乏症，及严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的凝血障碍。

目前市售的人纤维蛋白原为0.5g/瓶，复溶后体积为25ml，蛋白浓度约为2.5％，纯度约为80％。由于Fg复溶过程耗时长，整个过程需要15～30分钟，需先将产品及灭菌注射用水预温至30～37℃，然后按瓶签标示量注入预温的灭菌注射用水，再置30～37℃水浴中，轻轻摇动使制品溶解。对于临床紧急止血而言，开发高浓度、高纯度、溶解快的Fg(1g/瓶，蛋白浓度为5％)显得很有必要。不仅能够节约临床时间，而且能够减少输注次数。

目前国内人纤维蛋白原的生产厂家只有上海莱仕、华兰生物等几家。大多厂家采用的原料为组分I沉淀，个别采用冷沉淀为原料，其制备工艺为低温乙醇法，产品的浓度约为2.5％，纯度为80％左右，复溶时间较长。在制备工艺中应该注意到溶解性和复溶时间等问题。溶解困难甚至溶解后有大量变性蛋白析出，是由纤维蛋白原激活引起的。纤维蛋白原很容易激活，尤其是在凝血酶存在的情况下，凝血酶将原本可水溶的纤维蛋白原激活成纤维蛋白单体，后者经聚合，并最终形成不溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白再扭结成团，形成纤维蛋白胶，因此，工艺制备过程中容易造成过滤困难及制品复溶时间长。由于制品中同时含有少量的纤维结合蛋白，纤维结合蛋白热稳定性较差，特别是干热灭活时易变性，导致复溶时易蛋白析出。

可见，现有的的人纤维蛋白原仍存在一些问题：(1)纯度不高，产品杂质含量偏多，临床使用易发生播散性血管内凝血、皮疹、心动过速、发热等不良反应；(2)产品的溶解性低，大部分产品复溶需在30～37℃水浴，溶解时间为20分钟左右，有些甚至超过30分钟，在使用时复溶时间过长，不便于临床使用，特别是在急救情况下；(3)产品中含有少量的凝血酶和纤维结合蛋白，有些产品溶解后激活甚至会有大量变性蛋白析出；(4)得率不高，特别是从冷沉淀中提取人纤维蛋白原；(5)现有产品的蛋白浓度为2.5％，含约4％盐酸精氨酸，1.3％枸橼酸钠作为保护剂，临床使用时需多次溶解。

通过对人纤维蛋白原发明专利的查询对比国内现有的人纤维蛋白原的发明专利，如：

ZL200810046747.5公开了一种人纤维蛋白原制剂的制备方法，制备工艺中包括血浆的溶解、组分I制备，进行二步低温乙醇沉淀制备人纤维蛋白原。此法制备的人纤维蛋白原蛋白含量为2.5～3.5％，含盐酸精氨酸、枸橼酸钠作为处方保护剂。

ZL201110078557.3公开了一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，制备工艺中包括FI沉淀的溶解及过滤、S/D灭活、第一次甘氨酸沉淀、DEAE-650M柱层析、第二次甘氨酸沉淀、配制、分装及冻干、干热灭活。该法采用二步甘氨酸沉淀结合DEAE-650M柱层析，制备的制品蛋白含量为2.5％，采用盐酸精氨酸、枸橼酸钠作为处方保护剂，纯度为85％左右。

CN201710941269.3公开了一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法，制备工艺中包括组分Ⅰ沉淀溶解、过滤；S/D病毒灭活；Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析；一次超滤浓缩；肝素亲和层析；二次超滤浓缩；检测配制；分装冻干；轧盖及干热灭活。制备的制品蛋白含量为2.2～2.4％，采用甘氨酸、枸橼酸钠作为保护剂。

CN201810054783.X公开了一种人纤维蛋白原的制备方法，制备工艺中包括组分I的制备、DEAE-650M柱层析、第一步甘氨酸沉淀、第二步甘氨酸沉淀、检测配制；分装冻干；轧盖及干热灭活。制备的制品蛋白含量为2.4％，采用甘氨酸、盐酸精氨酸、甘露醇、枸橼酸钠作为保护剂。

鉴于目前市场人纤维蛋白原的制备工艺和临床应用状况，开发出新的高纯度、高浓度和溶解性好的人纤维蛋白原提取工艺显得尤为必要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺。

本发明所采取的技术方案如下：一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，包括以下步骤：

(1)组分I溶解：组分I采用10～15倍重量的溶解液①进行溶解；

(2)S/D灭活：步骤(1)溶解后的组分I采用S/D进行灭活，并过滤收集得到过滤液Ⅰ；

(3)低温乙醇沉淀：步骤(2)得到的过滤液Ⅰ采用低温乙醇沉淀法处理收集得到沉淀物Ⅰ，加入溶解液②将沉淀物Ⅰ溶解、过滤得到过滤液Ⅱ；

(4)甘氨酸沉淀：步骤(3)得到的过滤液Ⅱ采用甘氨酸沉淀法得到沉淀物Ⅱ，加入溶解液③将沉淀物Ⅱ溶解、过滤得到过滤液Ⅲ；

(5)氯化钙处理：过滤液Ⅲ用溶解液③经100KD的超滤膜透析；加入氯化钙进行反应处理，反应后过滤得到过滤液Ⅳ；

(6)阳离子交换层析：将步骤(5)得到的过滤液Ⅳ采用阳离子交换树脂层析，填料上柱前用溶解液③平衡，收集上柱流穿液，用平衡液，经100KD的超滤膜透析，过滤收集过滤液Ⅴ；

(7)阴离子交换层析：将步骤(6)得到的过滤液Ⅴ采用阴离子交换树脂层析，填料上柱前用平衡液平衡，收集上柱流穿液，

(8)浓缩、稀配：用透析液，经30KD的超滤膜透析，使蛋白液浓缩，按蛋白液体积加入脯氨酸至终浓度为1～3％，调节pH至6.5～7.5；

(9)分装、冻干、干热灭活：将步骤(8)的制得物采用除菌滤芯过滤分装，分装后进行冷冻干燥，封装并采用干热病毒灭活。

将组分I溶解，经S/D灭活后，进行1步低温乙醇沉淀，去除部分杂蛋白；再进行1步甘氨酸沉淀，进一步去除部分杂蛋白。本发明通过在制备过程中采用低温乙醇沉淀和甘氨酸沉淀两种不同原理的沉淀法联用，可从不同的原理去除杂蛋白，提升人纤维蛋白原的纯度。

在蛋白液中加入氯化钙，将存在的凝血酶原激活为凝血酶，用阳离子交换树脂去除凝血酶，防止制品在储存和使用过程中激活，降低临床用药风险；将蛋白液进行阴离子交换层析去除包括纤维结合蛋白等杂蛋白，进一步提升人纤维蛋白原的纯度；产品处方中加入脯氨酸增加产品的溶解性和稳定性；得益于工艺的优势，产品浓度提高的同时，产品的辅料用量并未明显提高，即降低了辅料的风险；溶解时可室温溶解，方便临床的使用。

优选地，步骤(1)中，组分I加入10～15倍重量的溶解液①进行溶解，搅拌1～2小时，溶解时水浴温度为30～37℃；其中溶解液①的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、蔗糖。

优选地，步骤(3)中，步骤(2)得到的过滤液Ⅰ降温至0～5℃，加入50％，-25℃的低温乙醇至乙醇的终含量为6％～10％，控制温度为0～5℃，搅拌30分钟，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为0～5℃，收集沉淀得到沉淀物Ⅰ；按沉淀重量10倍加入溶解液②，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅱ；溶解液②的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

优选地，步骤(4)中，步骤(3)得到的过滤液Ⅱ降温至20～30℃，根据过滤液体积加入氯化钠和甘氨酸混合粉末至氯化钠终含量为1.3～2.0mol/L，甘氨酸含量为1.3～2.0mol/L，搅拌30分钟，控制温度为20～30℃，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为20～30℃，收集沉淀得到沉淀物Ⅱ，将沉淀物Ⅱ按沉淀重量10倍加入溶解液③，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅲ。

优选地，步骤(5)中，步骤(4)得到的过滤液Ⅲ用溶解液③，经100KD的超滤膜透析，调节pH至6.8～7.2，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅳ。

优选地，步骤(6)中，阳离子交换树脂为CM-Sephrose-FF凝胶。

优选地，溶解液③的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

优选地，步骤(7)中，阴离子交换树脂为Capto-Q XP凝胶。

优选地，平衡液的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸；所述透析液的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

本发明可制备出5％高浓度的人纤维蛋白原，并以脯氨酸、盐酸精氨酸、枸橼酸钠作为辅料，可提升人纤维蛋白原的稳定性和溶解时间。

优选地，步骤(9)中冷冻干燥的具体参数设置如下：

①制品常温进柜；

②60分钟从常温降至-5℃，保持60分钟；

③120分钟降至-35℃，保持240分钟；

④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；

⑤120分钟升温至-20℃，保持480分钟；

⑥180分钟升温至0℃，保持1200分钟；

⑦240分钟升温至20℃，保持480分钟；

⑧180分钟升温至30℃，保持360分钟；

⑨抽极限真空，压塞，出柜。

通过自行研究的冻干工艺，可降低制品中的水分，提高制品的稳定性，改善制品外观。

本发明的有益效果如下：

1、在血浆原料日趋紧缺的今天，通过从FI中提取纤维蛋白原，提高人纤维蛋白原的纯度和得率，可提升血浆的综合利用率，从而提升企业的综合竞争力。

2、人纤维蛋白原提取分离过程中采用了二步沉淀法和二步层析法，提高了人纤维蛋白的纯度，有效去除杂蛋白，可减少临床不良发应的发生。

3、制备高浓度、高纯度、溶解性好的人纤维蛋白原，可减少临床用药次数，方便临床用药。

本发明方法制备的产品与《中国药典》(2015年版，三部)中描述的人纤维蛋白原在关键质量指标的对比如下表所示。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为本发明的流程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：以45kg组分I沉淀(折合血浆6吨)为例，具体制备工艺如下：

溶液的配制：(以配制1L为例)

溶解液①：14g枸橼酸钠+9g氯化钠+11g蔗糖，pH 7.0；

溶解液②：14g枸橼酸钠+9g氯化钠+11g盐酸精氨酸，pH 7.0；

溶解液③：9g枸橼酸钠+8.8g氯化钠+3.6g盐酸精氨酸，pH 7.0；

S/D液：110g聚山梨酯80+33g磷酸三丁酯；

平衡液：9g枸橼酸钠+2.4g氯化钠+3.6盐酸精氨酸，pH 7.0；

透析液：11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g盐酸精氨酸，pH 7.0。

(1)、取组分I沉淀45kg，加入450kg的溶解液①进行溶解，搅拌1小时，溶解时水浴温度为30～37℃；

(2)、将步骤(1)溶解后的蛋白液进行离心，收集上清液，称重为489.2kg，加入S/D液48.9kg，搅拌均匀，温度控制在24～26℃，连续保温6小时。用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液468.5kg；

(3)、将步骤(2)的制得物降温至0～5℃，加入50％，-25℃的低温乙醇至乙醇的终含量为6％～10％，控制温度为0～5℃，搅拌30分钟，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为0～5℃，收集沉淀，称重39.3kg。加入溶解液②393kg，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液，计量体积431.6L；

(4)、将步骤(3)的制得物降温至20～30℃，根据过滤液体积加入氯化钠和甘氨酸混合粉末至氯化钠终含量为1.3mol/L，甘氨酸含量为1.6mol/L，搅拌30分钟，控制温度为20～30℃，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为20～30℃，收集沉淀，称重32.6kg。加入溶解液③326kg，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液，称重356.7kg；

(5)、将步骤(4)的制得物用溶解液③，经100KD的超滤膜透析3遍，将蛋白液冲出，计量体积386.4L，加入氯化钙至终浓度为1～10mmol/L，调节pH至6.5～7.0，搅拌30分钟，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液381.5L；

(6)将步骤(5)制得物上柱层析，层析所用的填料为CM-Sepharose-FF凝胶，该凝胶上柱前用溶解液③平衡，收集上柱流穿液425.6L；

(7)、将步骤(6)的制得物用平衡液，经100KD的超滤膜透析6遍，将蛋白液冲出，调节pH至6.8～7.2，搅拌均匀，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液375.3L；

(8)、将步骤(7)制得物上柱层析，层析所用的填料为Capto-Q XP凝胶，该凝胶上柱前用平衡液平衡，收集上柱流穿液389.2L；

(9)、将步骤(8)的制得物经30KD浓缩至的超滤膜透析6遍，将蛋白液浓缩至蛋白浓度6％以上，进行检测蛋白含量，按蛋白含量5.3％进行稀释，得稀配液124.3L，按蛋白液体积加入脯氨酸至终浓度为1～3％，调节pH至6.5～7.5；

(10)、将步骤(9)的制得物经0.2μm除菌滤芯过滤分装，分装规格为25ml/瓶，分装好的制品传入冻干柜，进行冷冻干燥；出柜轧盖；99～100℃、30分钟干热病毒灭活；送检，检验合格后包装、入库；

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

对阳离子交换树脂和阴离子交换树脂进行筛选优化，具体研究如下：

取组分I溶解、S/D灭活、低温乙醇沉淀、甘氨酸沉淀、进行层析纯化，对层析所用的凝胶进行筛选优化研究，收集流穿液，进行检测

①CM-Sepharose-FF+Capto-Q XP

②EMD SO3+DEAE-650M

③SP Sepharose XL+Q Sepharose Fast Flow

④ESHMUNO S+Fractogel-TMAE

研究结果如下

通过以上实验结果可以发现，采取①层析方案外观较好，纯度较高，未检出凝血酶。

对处方液进行筛选优化，具体研究如下：

步骤(9)中，取经Capto-Q XP凝胶层析收集的流穿液，经不同的处方液进行超滤，稀配，分装，冻干，99～100℃、30分钟干热病毒灭活处理，检测。处方分组研究如下：

①11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g盐酸精氨酸+10～30g脯氨酸，pH 7.0，1L。

②11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g盐酸精氨酸+25g甘氨酸，pH 7.0，1L。

③11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g亮氨酸+25g赖氨酸，pH 7.0，1L。

④11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g甘氨酸+25g缬氨酸，pH 7.0，1L。

⑤11g枸橼酸钠+9g氯化钠+25g组氨酸+25g缬氨酸，pH 7.0，1L。

⑥22g枸橼酸钠+9g氯化钠+8.2g盐酸精氨酸，pH 7.0，1L。

研究结果如下

通过以上实验结果可以发现，处方液中的组分会明显影响产品的外观、复溶时间和凝固活力。采取①处方可以增加本品的溶解性和稳定性。

本实施例所得产品的关键指标检测报告如下表所示：以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于包括以下步骤：

(1)组分I溶解：组分I采用10～15倍重量的溶解液①进行溶解；

(2)S/D灭活：步骤(1)溶解后的组分I采用S/D进行灭活，并过滤收集得到过滤液Ⅰ；

(3)低温乙醇沉淀：步骤(2)得到的过滤液Ⅰ采用低温乙醇沉淀法处理收集得到沉淀物Ⅰ，加入溶解液②将沉淀物Ⅰ溶解、过滤得到过滤液Ⅱ；

(4)甘氨酸沉淀：步骤(3)得到的过滤液Ⅱ采用甘氨酸沉淀法得到沉淀物Ⅱ，加入溶解液③将沉淀物Ⅱ溶解、过滤得到过滤液Ⅲ；

(5)氯化钙处理：过滤液Ⅲ用溶解液③经100KD的超滤膜透析；加入氯化钙进行反应处理，反应后过滤得到过滤液Ⅳ；

(6)阳离子交换层析：将步骤(5)得到的过滤液Ⅳ采用阳离子交换树脂层析，填料上柱前用溶解液③平衡，收集上柱流穿液，用平衡液，经100KD的超滤膜透析，过滤收集过滤液Ⅴ；

(7)阴离子交换层析：将步骤(6)得到的过滤液Ⅴ采用阴离子交换树脂层析，填料上柱前用平衡液平衡，收集上柱流穿液；

(8)浓缩、稀配：用透析液，经30KD的超滤膜透析，使蛋白液浓缩，按蛋白液体积加入脯氨酸至终浓度为1～3％，调节pH至6.5～7.5；

(9)分装、冻干、干热灭活：将步骤(8)的制得物采用除菌滤芯过滤分装，分装后进行冷冻干燥，封装并采用干热病毒灭活。

2.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(1)中，组分I加入10～15倍重量的溶解液①进行溶解，搅拌1～2小时，溶解时水浴温度为30～37℃；其中溶解液①的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、蔗糖。

3.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(3)中，步骤(2)得到的过滤液Ⅰ降温至0～5℃，加入50％，-25℃的低温乙醇至乙醇的终含量为6％～10％，控制温度为0～5℃，搅拌30分钟，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为0～5℃，收集沉淀得到沉淀物Ⅰ；按沉淀重量10倍加入溶解液②，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅱ；溶解液②的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

4.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(4)中，步骤(3)得到的过滤液Ⅱ降温至20～30℃，根据过滤液体积加入氯化钠和甘氨酸混合粉末至氯化钠终含量为1.3～2.0mol/L，甘氨酸含量为1.3～2.0mol/L，搅拌30分钟，控制温度为20～30℃，进行离心，离心条件为10000转/分钟，离心出液温度控制为20～30℃，收集沉淀得到沉淀物Ⅱ，将沉淀物Ⅱ按沉淀重量10倍加入溶解液③，搅拌溶解1小时，溶解温度为30～37℃，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅲ。

5.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(5)中，步骤(4)得到的过滤液Ⅲ用溶解液③，经100KD的超滤膜透析，调节pH至6.8～7.2，用1μm的滤芯进行过滤，收集过滤液得到过滤液Ⅳ。

6.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(6)中，阳离子交换树脂为CM-Sephrose-FF凝胶。

7.根据权利要求1、4-6中任一项所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：溶解液③的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

8.根据权利要求1或6所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(7)中，阴离子交换树脂为Capto-Q XP凝胶。

9.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：平衡液的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸；所述透析液的组成包括枸橼酸钠、氯化钠、盐酸精氨酸。

10.根据权利要求1所述的高浓度人纤维蛋白原的制备工艺，其特征在于：步骤(9)中冷冻干燥的具体参数设置如下：

①制品常温进柜；

②60分钟从常温降至-5℃，保持60分钟；

③120分钟降至-35℃，保持240分钟；

④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；

⑤120分钟升温至-20℃，保持480分钟；

⑥180分钟升温至0℃，保持1200分钟；

⑦240分钟升温至20℃，保持480分钟；

⑧180分钟升温至30℃，保持360分钟；

⑨抽极限真空，压塞，出柜。

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