CN115975997A - 一种人凝血因子ix纯化的二次超滤透析液及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特定组成的二次超滤透析液，是含有如下组分的水溶液：0.1～0.18mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠、0.01～0.03mol/L盐酸精氨酸；所述二次超滤透析液的pH为6.5～7.4。本发明二次超滤透析液用于纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制品加工领域，具体涉及一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法。
背景技术
人凝血因子IX(coagulation factorIX,FIX)是一种维生素K依赖的由肝细胞合成并分泌到血液中的单链糖蛋白，由415个氨基酸残基组成，分子量约55KDa，含多糖17％左右。血浆中的含量约为5mg/L，半衰期12～24h。血液内循环的FIX为一种丝氨酸蛋白水解酶形式存在,经其他因子激活后参与活化的内源途径凝血级联反应，对于生理性凝血和止血有重要作用。由于FIX是从健康人血浆中分离的血浆制品，合适的纯化条件和凝胶的使用对FIX比活性有显著性影响，但是目前制备FIX的方法存在FIX比活性低和制备工艺复杂的问题。
例如，蔡骏等人在《柱层析法制备高纯人血FIX研究初探》中报告了一种用DEAE-Sephadex A50凝胶，DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子IX的方法，最终FIX比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4％。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子IX的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质，经过两步阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FIX。FIX比活达到99.40IU/mg，纯化倍数为3823倍，回收率约为30％；得到的产品比活性都偏低。
又如，公开号CN110257358A的专利申请《一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法》公开了一种采用DEAE Sephadex A50凝胶+非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析制备高纯度人凝血因子的生产方法，该方法通过非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析提高比活性，所制备的人凝血因子IX的比活性达到196.5IU/mg以上。但该方法采用免疫亲和层析制备人凝血因子IX，生产过程中存在配基脱落的风险，后续工艺中未采用有效的去除工艺；亲和层析步骤中洗脱缓冲液含0～2mol/L氯化镁，该物质对人体有一定毒性，但后续却未见有效的去除工艺。
再如，公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性，所制备的人凝血因子IX比活性较高，可达到150IU/mg。公开号CN111378029A的专利申请《一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法》公开了一种2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析纯化从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式，该方式通过四步层析纯化制备FIX比活性可达到150IU/mg以上的制品。但上述两项专利申请由于其生产工艺繁琐，需经过4次层析步骤，本领域专业人士公知，每经过一次层析纯化步骤，均不可避免地会造成目标蛋白损失，因此该制备工艺产品得率较低；此外，4次层析步骤需消耗大量凝胶填料，生产成本极高，不便于大范围推广。
因此，目前亟需提供一种纯化方式简单，成本低廉的，可快速制备高纯度和高回收率高的FIX的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液，以及使用该二次超滤透析液对人凝血因子IX进行纯化的方法。
本发明提供了一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液，它是含有如下组分的水溶液：0.1～0.18mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠、0.01～0.03mol/L盐酸精氨酸；所述二次超滤透析液的pH为6.5～7.4。
进一步地，它是含有如下组分的水溶液：0.12mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.02mol/L盐酸精氨酸；所述二次超滤透析液的pH为7.4。
更进一步地，上述二次超滤透析液还包括0.01mol/L的盐酸赖氨酸和/或0.01mol/L的甘氨酸。
本发明还提供了上述的二次超滤透析液在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
本发明还提供了一种人凝血因子IX纯化方法，包括二次超滤透析步骤，所述二次超滤透析步骤使用上述的二次超滤透析液进行。
进一步地，上述二次超滤透析步骤包括：使用不低于待透析人凝血因子IX样品的5倍体积的二次超滤透析液进行透析。
更进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)二次离子交换层析；(4)二次超滤透析；(5)亲和层析；(6)纳米过滤；
其中，步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤；
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤，所述阴离子交换凝胶是Diamond DEAE、Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE 60；
步骤(5)包括经肝素亲和凝胶进行柱层析的步骤，所述肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF、Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin或HeparinAgarose FF。
进一步地，步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.06～0.12mol/L NaCl和0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗涤液含0.17～0.23mol/L NaCl和0.005～0.02mol/枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗脱液含0.5～2.0mol/L NaCl和0.005～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10～0.20mol/L NaCl、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗涤液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20～0.30mol/L NaCl、0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗脱液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33～0.40mol/LNaCl、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；
步骤(5)所述亲和层析所用肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含有0.01～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～8.0；所述洗涤液含有0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.5～8.0；所述洗脱液含有0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.0～8.0；
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
更进一步地，步骤(1)所述平衡液含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗涤液含0.23mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；
步骤(3)所述平衡液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；所述洗涤液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/L NaCl、0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；所述洗脱液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；
步骤(5)所述平衡液含有0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗涤液含有0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗脱液含有0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.0。
进一步地，上述步骤(3)所述二次离子交换层析的洗脱液洗脱时，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液；
和/或步骤(5)所述亲和层析的洗脱液洗脱时，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液。
本发明的有益效果：本发明使用了一种特定组成的二次超滤透析液用于纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1本发明人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法
一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为10℃和7.0，按照每1L上清血浆使用1.4g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.06mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)、洗涤液(含0.17mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)和洗脱缓冲液(含0.5mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠，温度值为10℃，pH值为7.0)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.0和10mS/cm流入层析柱，上样流速为25cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤(即先后用平衡液和缓冲液分别洗涤，下同)，平衡液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的缓冲液；洗涤液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的洗涤液；平衡和洗涤液流速均为25cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.33mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠，pH6.0的洗脱缓冲液)进行洗脱，洗脱液流速为25cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.020mol/L枸橼酸钠，0.12mol/L氯化钠，0.02mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4的透析缓冲液(溶剂为水)。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.01mol/L枸橼酸钠，pH 7.4)平衡4倍柱体积。将制品温度调节至2.0℃流入层析柱，上样流速为50cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤，平衡液为含0.01mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；洗涤液为含0.10mol/L NaCl、0.01mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为50cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.28mol/LNaCl、0.01mol/L枸橼酸钠，0.015mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4)进行洗脱，洗脱液流速为50cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为95％，FIX比活性为5.10IU/mg。
实施例2本发明人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法
一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为12℃和7.2，按照每1L上清血浆使用1.5g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.10mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)、洗涤液(含0.20mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)和洗脱缓冲液(含1.0mol/L NaCl和0.020mol/L枸橼酸钠，温度值为12℃，pH值为7.2)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.8和15mS/cm流入层析柱，上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的洗涤液；洗涤液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.28mol/LNaCl、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的洗涤液；平衡和洗涤液流速均为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.36mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠，pH6.8的洗脱缓冲液)进行洗脱，洗脱液流速为100cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.020mol/L枸橼酸钠，0.12mol/L氯化钠，0.02mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至5.0℃流入层析柱，上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤，平衡液为含0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；洗涤液为含0.13mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.33mol/LNaCl、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸，pH7.4)进行洗脱，洗脱液流速为100cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharose 6FF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.1IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为93％，FIX比活性为5.21IU/mg。
实施例3本发明一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆，调节温度和pH分别为15℃和7.4，按照每1L上清血浆使用1.6g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶，吸附；收集凝胶，依次采用平衡液(含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)、洗涤液(含0.23mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)和洗脱缓冲液(含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L枸橼酸钠，温度值为15℃，pH值为7.4)处理凝胶，收集洗脱液，一次超滤透析；
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后，再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯)，使最终Tween～80和TNBP的浓度分别为1％和0.3％。待制品温度达到24℃开始计时，控制温度24～26℃，时间6小时，每半个小时记录制品温度一次；
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.5)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至7.5和20mS/cm流入层析柱，上样流速为200cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤，平衡液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.5的洗涤液；洗涤液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/LNaCl、0.020mol/L枸橼酸钠，pH7.5的洗涤液；平衡和洗涤液流速均为200cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH7.5的洗脱缓冲液)进行洗脱，洗脱液流速为200cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是：CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的7倍透析液用量对制品进行透析，透析液为0.020mol/L枸橼酸钠，0.12mol/L氯化钠，0.02mol/L盐酸精氨酸，pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内，装填好的层析柱使用平衡液(含0.030mol/L枸橼酸钠，pH7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至10.0℃流入层析柱，上样流速为150cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤，平衡液为含0.03mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；洗涤液为含0.23mol/L NaCl、0.03mol/L枸橼酸钠，pH 7.4的洗涤液；平衡和洗涤液流速为150cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.40mol/LNaCl、0.03mol/L枸橼酸钠、0.035mol/L盐酸精氨酸，pH7.4)进行洗脱，洗脱液流速为150cm/h，当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液，共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是：Capto Heparin、Heparin sepharose 6FF、UW90 Agarose Heparin和Heparin Agarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒，纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体，用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析，透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后，对制品进行计量，并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液，按0.2IU/IU FIX加入肝素钠，混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理，以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法：按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为94％，FIX比活性为4.98IU/mg。
实验例1、本发明二次超滤透析液的筛选
1、洗涤液的筛选
参照实施例2的制备方法，仅按照表1调整透析液的组成，其他条件均不变，进行FIX纯化，不同的透析液组成得到的FIX活性回收率和比活性结果如表1所示：
表1
可见，实验号2、5、6、8、9～12的透析液组成用于FIX纯化过程的二次超滤透析步骤，能够获得较高收率(不低于79％)和高比活性(不低于4.3IU/mg)的FIX。其中，实验号10的添加剂组成为氯化钠0.12mol/L、枸橼酸钠0.02mol/L、盐酸精氨酸0.02mol/L且pH为7.4的透析液进行二次超滤透析处理后的FIX收率和比活性高，为最优选的方案。
综上，本发明提供了一种特定组成的二次超滤透析液，用于纯化人凝血因子IX，通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX，具有很好的推广应用前景。
Claims (10)
1.一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液，其特征在于，它是含有如下组分的水溶液：0.1～0.18mol/L氯化钠、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠、0.01～0.03mol/L盐酸精氨酸；所述二次超滤透析液的pH为6.5～7.4。
2.如权利要求1所述的二次超滤透析液，其特征在于，它是含有如下组分的水溶液：0.12mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.02mol/L盐酸精氨酸；所述二次超滤透析液的pH为7.4。
3.如权利要求1或2所述的二次超滤透析液，其特征在于，还包括0.01mol/L的盐酸赖氨酸和/或0.01mol/L的甘氨酸。
4.权利要求1～3任一项所述的二次超滤透析液在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
5.一种人凝血因子IX纯化方法，其特征在于，包括二次超滤透析步骤，所述二次超滤透析步骤使用权利要求1～3任一项所述的二次超滤透析液进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二次超滤透析步骤包括：使用不低于待透析人凝血因子IX样品的5倍体积的二次超滤透析液进行透析。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预纯化；(2)S/D病毒灭活；(3)二次离子交换层析；(4)二次超滤透析；(5)亲和层析；(6)纳米过滤；
其中，步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤；
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤，所述阴离子交换凝胶是DiamondDEAE、Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE60；
步骤(5)包括经肝素亲和凝胶进行柱层析的步骤，所述肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF、Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin或HeparinAgarose FF。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.06～0.12mol/L NaCl和0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗涤液含0.17～0.23mol/LNaCl和0.005～0.02mol/枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；所述洗脱液含0.5～2.0mol/LNaCl和0.005～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～7.4；
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10～0.20mol/L NaCl、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗涤液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20～0.30mol/L NaCl、0.005～0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；所述洗脱液含0.005～0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005～0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33～0.40mol/LNaCl、0.005～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.0～7.5；
步骤(5)所述亲和层析所用肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF，依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱，所述平衡液含有0.01～0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.0～8.0；所述洗涤液含有0.1～0.2mol/L氯化钠、0.01～0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为6.5～8.0；所述洗脱液含有0.3～0.6mol/L氯化钠、0.02～0.03mol/L枸橼酸钠、0.015～0.035mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.0～8.0；
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述平衡液含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗涤液含0.23mol/LNaCl和0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；
步骤(3)所述平衡液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/LNaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；所述洗涤液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/L NaCl、0.020mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；所述洗脱液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.5；
步骤(5)所述平衡液含有0.03mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗涤液含有0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠，pH值为7.4；所述洗脱液含有0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸，pH值为7.0。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述二次离子交换层析的洗脱液洗脱时，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液；
和/或步骤(5)所述亲和层析的洗脱液洗脱时，从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1～1.5倍柱体积的洗脱液。
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