CN115975997B - 一种人凝血因子ix纯化的二次超滤透析液及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特定组成的二次超滤透析液,是含有如下组分的水溶液:0.1~0.18mol/L氯化钠、0.005~0.02mol/L枸橼酸钠、0.01~0.03mol/L盐酸精氨酸;所述二次超滤透析液的pH为6.5~7.4。本发明二次超滤透析液用于纯化人凝血因子IX,通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX,具有很好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制品加工领域,具体涉及一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法。
背景技术
人凝血因子IX(coagulation factorIX,FIX)是一种维生素K依赖的由肝细胞合成并分泌到血液中的单链糖蛋白,由415个氨基酸残基组成,分子量约55KDa,含多糖17%左右。血浆中的含量约为5mg/L,半衰期12~24h。血液内循环的FIX为一种丝氨酸蛋白水解酶形式存在,经其他因子激活后参与活化的内源途径凝血级联反应,对于生理性凝血和止血有重要作用。由于FIX是从健康人血浆中分离的血浆制品,合适的纯化条件和凝胶的使用对FIX比活性有显著性影响,但是目前制备FIX的方法存在FIX比活性低和制备工艺复杂的问题。
例如,蔡骏等人在《柱层析法制备高纯人血FIX研究初探》中报告了一种用DEAE-Sephadex A50凝胶,DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度凝血因子IX的方法,最终FIX比活为35±2.0IU/mg,回收率为30±4%。赵彦鼎等人在《自制填充介质对人血浆凝血因子IX的层析分离》中采用自制的DEAE Bio-Sep FF和肝素Bio-Sep介质,经过两步阴离子交换和一步亲和层析分离纯化FIX。FIX比活达到99.40IU/mg,纯化倍数为3823倍,回收率约为30%;得到的产品比活性都偏低。
又如,公开号CN110257358A的专利申请《一种高纯人凝血因子IX制剂的生产方法》公开了一种采用DEAE Sephadex A50凝胶+非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析制备高纯度人凝血因子的生产方法,该方法通过非Ca2+依赖性IX因子免疫亲和层析提高比活性,所制备的人凝血因子IX的比活性达到196.5IU/mg以上。但该方法采用免疫亲和层析制备人凝血因子IX,生产过程中存在配基脱落的风险,后续工艺中未采用有效的去除工艺;亲和层析步骤中洗脱缓冲液含0~2mol/L氯化镁,该物质对人体有一定毒性,但后续却未见有效的去除工艺。
再如,公开号为CN101291951A的专利申请《一种高纯度的人第Ⅸ凝血因子的制备方法》公开了一种利用2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、阳离子交换层析从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式,该方法通过增加层析工艺步骤的方式提高比活性,所制备的人凝血因子IX比活性较高,可达到150IU/mg。公开号CN111378029A的专利申请《一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法》公开了一种2次阴离子交换层析、肝素亲和层析、疏水层析纯化从血浆来源纯化人第IX凝血因子的制备方式,该方式通过四步层析纯化制备FIX比活性可达到150IU/mg以上的制品。但上述两项专利申请由于其生产工艺繁琐,需经过4次层析步骤,本领域专业人士公知,每经过一次层析纯化步骤,均不可避免地会造成目标蛋白损失,因此该制备工艺产品得率较低;此外,4次层析步骤需消耗大量凝胶填料,生产成本极高,不便于大范围推广。
因此,目前亟需提供一种纯化方式简单,成本低廉的,可快速制备高纯度和高回收率高的FIX的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液,以及使用该二次超滤透析液对人凝血因子IX进行纯化的方法。
本发明提供了一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液,它是含有如下组分的水溶液:0.1~0.18mol/L氯化钠、0.005~0.02mol/L枸橼酸钠、0.01~0.03mol/L盐酸精氨酸;所述二次超滤透析液的pH为6.5~7.4。
进一步地,它是含有如下组分的水溶液:0.12mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.02mol/L盐酸精氨酸;所述二次超滤透析液的pH为7.4。
更进一步地,上述二次超滤透析液还包括0.01mol/L的盐酸赖氨酸和/或0.01mol/L的甘氨酸。
本发明还提供了上述的二次超滤透析液在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
本发明还提供了一种人凝血因子IX纯化方法,包括二次超滤透析步骤,所述二次超滤透析步骤使用上述的二次超滤透析液进行。
进一步地,上述二次超滤透析步骤包括:使用不低于待透析人凝血因子IX样品的5倍体积的二次超滤透析液进行透析。
更进一步地,上述方法包括如下步骤:
(1)预纯化;(2)S/D病毒灭活;(3)二次离子交换层析;(4)二次超滤透析;(5)亲和层析;(6)纳米过滤;
其中,步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤;
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤,所述阴离子交换凝胶是Diamond DEAE、Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE 60;
步骤(5)包括经肝素亲和凝胶进行柱层析的步骤,所述肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF、Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin或HeparinAgarose FF。
进一步地,步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含0.06~0.12mol/L NaCl和0.005~0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;所述洗涤液含0.17~0.23mol/L NaCl和0.005~0.02mol/枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;所述洗脱液含0.5~2.0mol/L NaCl和0.005~0.03mol/L枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE,依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10~0.20mol/L NaCl、0.005~0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;所述洗涤液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20~0.30mol/L NaCl、0.005~0.020mol/L枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;所述洗脱液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33~0.40mol/LNaCl、0.005~0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;
步骤(5)所述亲和层析所用肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF,依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含有0.01~0.03mol/L枸橼酸钠,pH值为7.0~8.0;所述洗涤液含有0.1~0.2mol/L氯化钠、0.01~0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为6.5~8.0;所述洗脱液含有0.3~0.6mol/L氯化钠、0.02~0.03mol/L枸橼酸钠、0.015~0.035mol/L盐酸精氨酸,pH值为7.0~8.0;
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
更进一步地,步骤(1)所述平衡液含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗涤液含0.23mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;
步骤(3)所述平衡液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.5;所述洗涤液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/L NaCl、0.020mol/L枸橼酸钠,pH值为7.5;所述洗脱液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.5;
步骤(5)所述平衡液含有0.03mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗涤液含有0.15mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗脱液含有0.35mol/L氯化钠、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸,pH值为7.0。
进一步地,上述步骤(3)所述二次离子交换层析的洗脱液洗脱时,从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1~1.5倍柱体积的洗脱液;
和/或步骤(5)所述亲和层析的洗脱液洗脱时,从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1~1.5倍柱体积的洗脱液。
本发明的有益效果:本发明使用了一种特定组成的二次超滤透析液用于纯化人凝血因子IX,通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX,具有很好的推广应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
实施例1本发明人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法
一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆,调节温度和pH分别为10℃和7.0,按照每1L上清血浆使用1.4g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶,吸附;收集凝胶,依次采用平衡液(含0.06mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠,温度值为10℃,pH值为7.0)、洗涤液(含0.17mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠,温度值为10℃,pH值为7.0)和洗脱缓冲液(含0.5mol/L NaCl和0.005mol/L枸橼酸钠,温度值为10℃,pH值为7.0)处理凝胶,收集洗脱液,一次超滤透析;
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后,再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯),使最终Tween~80和TNBP的浓度分别为1%和0.3%。待制品温度达到24℃开始计时,控制温度24~26℃,时间6小时,每半个小时记录制品温度一次;
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠,pH6.0)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.0和10mS/cm流入层析柱,上样流速为25cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤(即先后用平衡液和缓冲液分别洗涤,下同),平衡液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.10mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠,pH6.0的缓冲液;洗涤液为含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠,pH6.0的洗涤液;平衡和洗涤液流速均为25cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.005mol/L磷酸二氢钠、0.005mol/L磷酸氢二钠、0.33mol/L NaCl、0.005mol/L枸橼酸钠,pH6.0的洗脱缓冲液)进行洗脱,洗脱液流速为25cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是:Capto DEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析,透析液为0.020mol/L枸橼酸钠,0.12mol/L氯化钠,0.02mol/L盐酸精氨酸,pH 7.4的透析缓冲液(溶剂为水)。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.01mol/L枸橼酸钠,pH 7.4)平衡4倍柱体积。将制品温度调节至2.0℃流入层析柱,上样流速为50cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤,平衡液为含0.01mol/L枸橼酸钠,pH 7.4的洗涤液;洗涤液为含0.10mol/L NaCl、0.01mol/L枸橼酸钠,pH 7.4的洗涤液;平衡和洗涤液流速为50cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.28mol/LNaCl、0.01mol/L枸橼酸钠,0.015mol/L盐酸精氨酸,pH 7.4)进行洗脱,洗脱液流速为50cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是:Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒,纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体,用制品量的5倍透析液用量对制品进行透析,透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后,对制品进行计量,并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液,按0.1IU/IU FIX加入肝素钠,混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理,以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法:按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法,具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为95%,FIX比活性为5.10IU/mg。
实施例2本发明人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法
一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆,调节温度和pH分别为12℃和7.2,按照每1L上清血浆使用1.5g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶,吸附;收集凝胶,依次采用平衡液(含0.10mol/L NaCl和0.01mol/L枸橼酸钠,温度值为12℃,pH值为7.2)、洗涤液(含0.20mol/L NaCl和0.015mol/L枸橼酸钠,温度值为12℃,pH值为7.2)和洗脱缓冲液(含1.0mol/L NaCl和0.020mol/L枸橼酸钠,温度值为12℃,pH值为7.2)处理凝胶,收集洗脱液,一次超滤透析;
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后,再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯),使最终Tween~80和TNBP的浓度分别为1%和0.3%。待制品温度达到24℃开始计时,控制温度24~26℃,时间6小时,每半个小时记录制品温度一次;
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠,pH6.8)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至6.8和15mS/cm流入层析柱,上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤,平衡液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.12mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠,pH6.8的洗涤液;洗涤液为含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.28mol/LNaCl、0.010mol/L枸橼酸钠,pH6.8的洗涤液;平衡和洗涤液流速均为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.015mol/L磷酸二氢钠、0.015mol/L磷酸氢二钠、0.36mol/L NaCl、0.010mol/L枸橼酸钠,pH6.8的洗脱缓冲液)进行洗脱,洗脱液流速为100cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是:CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析,透析液为0.020mol/L枸橼酸钠,0.12mol/L氯化钠,0.02mol/L盐酸精氨酸,pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.020mol/L枸橼酸钠,pH7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至5.0℃流入层析柱,上样流速为100cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤,平衡液为含0.020mol/L枸橼酸钠,pH7.4的洗涤液;洗涤液为含0.13mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠,pH7.4的洗涤液;平衡和洗涤液流速为100cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.33mol/LNaCl、0.02mol/L枸橼酸钠、0.025mol/L盐酸精氨酸,pH7.4)进行洗脱,洗脱液流速为100cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是:Capto Heparin、Heparin sepharose 6FF、UW90 Agarose Heparin和HeparinAgarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒,纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体,用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析,透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后,对制品进行计量,并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液,按0.1IU/IU FIX加入肝素钠,混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理,以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法:按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法,具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为93%,FIX比活性为5.21IU/mg。
实施例3本发明一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液及纯化方法一、制备方法
(1)预纯化
取去冷沉淀上清血浆,调节温度和pH分别为15℃和7.4,按照每1L上清血浆使用1.6g DEAE Sephadex A50凝胶干粉的比例加入溶胀后的凝胶,吸附;收集凝胶,依次采用平衡液(含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠,温度值为15℃,pH值为7.4)、洗涤液(含0.23mol/L NaCl和0.02mol/L枸橼酸钠,温度值为15℃,pH值为7.4)和洗脱缓冲液(含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L枸橼酸钠,温度值为15℃,pH值为7.4)处理凝胶,收集洗脱液,一次超滤透析;
(2)S/D病毒灭活
按1IU/ml制品比例加入肝素钠后,再根据制品的体积加入S/D储备液(每升S/D储备液含200g吐温80和60ml磷酸三丁酯),使最终Tween~80和TNBP的浓度分别为1%和0.3%。待制品温度达到24℃开始计时,控制温度24~26℃,时间6小时,每半个小时记录制品温度一次;
(3)二次离子交换层析
将阴离子交换凝胶Diamond DEAE装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠,pH7.5)平衡6倍柱体积。将S/D病毒灭活制品pH和电导分别调节至7.5和20mS/cm流入层析柱,上样流速为200cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复合洗涤,平衡液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/L NaCl、0.020mol/L枸橼酸钠,pH7.5的洗涤液;洗涤液为含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/LNaCl、0.020mol/L枸橼酸钠,pH7.5的洗涤液;平衡和洗涤液流速均为200cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L枸橼酸钠,pH7.5的洗脱缓冲液)进行洗脱,洗脱液流速为200cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的阴离子交换凝胶还可以是:CaptoDEAE、UniGel 80DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl650M和HPDEAE 60。
(4)二次超滤透析
用制品量的7倍透析液用量对制品进行透析,透析液为0.020mol/L枸橼酸钠,0.12mol/L氯化钠,0.02mol/L盐酸精氨酸,pH 7.4透析缓冲液。
(5)亲和层析
将肝素亲和凝胶Heparin Bestarose FF装填在固定床层析柱内,装填好的层析柱使用平衡液(含0.030mol/L枸橼酸钠,pH7.4)平衡5倍柱体积。将制品温度调节至10.0℃流入层析柱,上样流速为150cm/h。上样完成后使用平衡和洗涤液进行复核洗涤,平衡液为含0.03mol/L枸橼酸钠,pH 7.4的洗涤液;洗涤液为含0.23mol/L NaCl、0.03mol/L枸橼酸钠,pH 7.4的洗涤液;平衡和洗涤液流速为150cm/h。洗涤后的层析柱使用洗脱液(含0.40mol/LNaCl、0.03mol/L枸橼酸钠、0.035mol/L盐酸精氨酸,pH7.4)进行洗脱,洗脱液流速为150cm/h,当280nm紫外吸收出峰时开始收集洗脱液,共收集1倍柱体积。本步骤的肝素亲和凝胶还可以是:Capto Heparin、Heparin sepharose 6FF、UW90 Agarose Heparin和Heparin Agarose FF。
(6)纳米过滤
洗脱后制品经纳米膜过滤去除病毒,纳米滤膜规格≤20nm。
(7)超滤配制
收集的纳米过滤后液体,用制品量的6倍透析液用量对制品进行透析,透析液成分含盐、糖醇、氨基酸或其混合物。透析结束后,对制品进行计量,并抽样检测原液pH、蛋白浓度和FIX活性。按照分装规格添加透析缓冲液,按0.2IU/IU FIX加入肝素钠,混匀。
(8)除菌分装后的制品应立即冻干。冻干后的制品经100℃、30min干热处理,以灭活可能残留的污染病毒。干热处理完成后即得人凝血因子IX成品。
二、检测
1、检测方法
(1)FIX收率的检测方法:按《中国药典》2020年版三部“人凝血因子IX效价测定法(通则3519)”检定。
(2)蛋白含量检测方法采用Lowry法,具体参照《中国药典》2020年版三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
2、检测结果
(1)FIX回收率
二次超滤透析前后活性回收率为94%,FIX比活性为4.98IU/mg。
实验例1、本发明二次超滤透析液的筛选
1、洗涤液的筛选
参照实施例2的制备方法,仅按照表1调整透析液的组成,其他条件均不变,进行FIX纯化,不同的透析液组成得到的FIX活性回收率和比活性结果如表1所示:
表1
可见,实验号2、5、6、8、9~12的透析液组成用于FIX纯化过程的二次超滤透析步骤,能够获得较高收率(不低于79%)和高比活性(不低于4.3IU/mg)的FIX。其中,实验号10的添加剂组成为氯化钠0.12mol/L、枸橼酸钠0.02mol/L、盐酸精氨酸0.02mol/L且pH为7.4的透析液进行二次超滤透析处理后的FIX收率和比活性高,为最优选的方案。
综上,本发明提供了一种特定组成的二次超滤透析液,用于纯化人凝血因子IX,通过精简的纯化步骤即可获得收率和比活力高的人凝血因子IX,具有很好的推广应用前景。
Claims (8)
1.一种人凝血因子IX纯化的二次超滤透析液,其特征在于,它是由如下组分制成的水溶液:0.12mol/L氯化钠、0.02 mol/L枸橼酸钠、0.02 mol/L盐酸精氨酸;所述二次超滤透析液的pH为7.4。
2.权利要求1所述的二次超滤透析液在人凝血因子IX纯化过程中的应用。
3.一种人凝血因子IX纯化方法,其特征在于,包括二次超滤透析步骤,所述二次超滤透析步骤使用权利要求1所述的二次超滤透析液进行。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述二次超滤透析步骤包括:使用不低于待透析人凝血因子IX样品的5倍体积的二次超滤透析液进行透析。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)预纯化;(2)S/D病毒灭活;(3)二次离子交换层析;(4)二次超滤透析;(5)亲和层析;(6)纳米过滤;
其中,步骤(1)包括取去冷沉淀的上清血浆经DEAE Sephadex A50凝胶进行柱层析和超滤透析的步骤;
步骤(3)包括经阴离子交换凝胶进行柱层析的步骤,所述阴离子交换凝胶是DiamondDEAE、Capto DEAE、UniGel 80 DEAE、DEAE Sepharose FF、DEAE Toyopearl 650M或HPDEAE60;
步骤(5)包括经肝素亲和凝胶进行柱层析的步骤,所述肝素亲和凝胶是HeparinBestarose FF、Capto Heparin、Heparin sepharose FF、UW90 Agarose Heparin或HeparinAgarose FF。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述柱层析依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含0.06~0.12mol/L NaCl和0.005~0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;所述洗涤液含0.17~0.23mol/L NaCl和0.005~0.02mol/枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;所述洗脱液含0.5~2.0mol/L NaCl和0.005~0.03mol/L枸橼酸钠,pH值为7.0~7.4;
步骤(3)所述二次离子交换层析所用阴离子交换凝胶是Diamond DEAE,依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.10~0.20mol/L NaCl、0.005~0.02mol/L枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;所述洗涤液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20~0.30mol/L NaCl、0.005~0.020mol/L 枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;所述洗脱液含0.005~0.025mol/L磷酸二氢钠、0.005~0.025mol/L磷酸氢二钠、0.33~0.40mol/L NaCl、0.005~0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为6.0~7.5;
步骤(5)所述亲和层析所用肝素亲和凝胶是Heparin Bestarose FF,依次采用平衡液、洗涤液和洗脱液过凝胶柱,所述平衡液含有0.01~0.03 mol/L枸橼酸钠,pH值为7.0~8.0;所述洗涤液含有0.1~0.2 mol/L氯化钠、0.01~0.02 mol/L枸橼酸钠,pH值为6.5~8.0;所述洗脱液含有0.3~0.6 mol/L氯化钠、0.02~0.03 mol/L枸橼酸钠、0.015~0.035 mol/L盐酸精氨酸,pH值为7.0~8.0;
步骤(6)所述纳米过滤所用纳米滤膜规格为≤20nm。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述平衡液含0.12mol/L NaCl和0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗涤液含0.23mol/L NaCl和0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗脱液含2.0mol/L NaCl和0.03mol/L 枸橼酸钠, pH值为7.4;
步骤(3)所述平衡液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.20mol/LNaCl、0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.5;所述洗涤液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.30mol/L NaCl、0.020mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.5;所述洗脱液含0.025mol/L磷酸二氢钠、0.025mol/L磷酸氢二钠、0.40mol/L NaCl、0.02mol/L 枸橼酸钠,pH值为7.5;
步骤(5)所述平衡液含有0.03 mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗涤液含有0.15 mol/L氯化钠、0.02 mol/L枸橼酸钠,pH值为7.4;所述洗脱液含有0.35 mol/L氯化钠、0.02 mol/L枸橼酸钠、0.025 mol/L盐酸精氨酸,pH值为7.0。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述二次离子交换层析的洗脱液洗脱时,从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1~1.5倍柱体积的洗脱液;
和/或步骤(5)所述亲和层析的洗脱液洗脱时,从洗脱液出现具有280nm紫外吸收峰产物时开始收集1~1.5倍柱体积的洗脱液。
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Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007046631A1 (en) * | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Green Cross Corporation | Method for manufacturing high purified factor ix |
CN102924562A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-02-13 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种人凝血因子ⅷ的干热处理稳定剂及其用途 |
CN105175486A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-23 | 上海洲跃生物科技有限公司 | 一种高纯人凝血因子ix的制备方法 |
CN105821024A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-08-03 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种制备人凝血酶原复合物的方法 |
CN108218981A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-06-29 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | 一种人凝血因子viii的制备方法 |
CN110257358A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-20 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种高纯人凝血因子ix制剂的生产方法 |
CN111378029A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 四川远大蜀阳药业有限责任公司 | 一种高稳定性、高纯人凝血因子ix的制备方法 |
CN111560064A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-08-21 | 博雅生物制药集团股份有限公司 | 一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺 |
CN113563457A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-10-29 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子ⅷ和纤溶酶原的方法 |
-
2022
- 2022-12-19 CN CN202211633932.0A patent/CN115975997B/zh active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007046631A1 (en) * | 2005-10-18 | 2007-04-26 | Green Cross Corporation | Method for manufacturing high purified factor ix |
CN102924562A (zh) * | 2012-11-19 | 2013-02-13 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种人凝血因子ⅷ的干热处理稳定剂及其用途 |
CN105175486A (zh) * | 2015-10-20 | 2015-12-23 | 上海洲跃生物科技有限公司 | 一种高纯人凝血因子ix的制备方法 |
CN105821024A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-08-03 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种制备人凝血酶原复合物的方法 |
CN108218981A (zh) * | 2018-01-19 | 2018-06-29 | 贵州泰邦生物制品有限公司 | 一种人凝血因子viii的制备方法 |
CN111378029A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 四川远大蜀阳药业有限责任公司 | 一种高稳定性、高纯人凝血因子ix的制备方法 |
CN110257358A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-09-20 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种高纯人凝血因子ix制剂的生产方法 |
CN111560064A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-08-21 | 博雅生物制药集团股份有限公司 | 一种高浓度人纤维蛋白原的制备工艺 |
CN113563457A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-10-29 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种同时制备人纤维蛋白原、凝血因子ⅷ和纤溶酶原的方法 |
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