CN111378029A - 一种高稳定性、高纯人凝血因子ix的制备方法 - Google Patents

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Abstract

为了解决现有人凝血因子IX产品的不稳定问题，本发明提供了一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法，属于生物制品领域。本发明公开方法包括如下步骤：(1)血浆去除冷沉淀；(2)阴离子交换层析纯化；(3)病毒灭活；(4)阴离子交换层析纯化；(5)肝素亲和层析纯化；(6)疏水层析纯化；(7)经超滤、深层过滤，或者深层过滤、超滤；以及除菌、除病毒和冻干步骤。本发明还提供了所述方法制备得到的产品，包括高稳定性、高纯度的凝血因子IX原液和冻干品。本发明的工艺由于能制备稳定、高纯度的人凝血因子IX原液，可以支持人凝血因子IX原液配制前的中间品冻存后合批，大大降低了冻干的能耗、减少了操作人员的工作量。

Description

一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法及其制剂。
背景技术
乙型血友病的早期治疗方案为输注新鲜血浆或新鲜冰冻血浆。需输注的剂量大且有高血容量的危险，心脏负荷过重，副作用较大，且病毒感染的风险大，因而血浆不是治疗的理想药剂。为减少这些副作用，20世纪50年代末开始开发人凝血因子IX制剂。由于人凝血因子IX在血浆中含量少，不稳定、易分解，且FII、FVII、人凝血因子IX、FX具有相似的理化性质等，因而纯化人凝血因子IX的难度较大。早期的人凝血因子IX制剂均为人凝血因子IX的浓缩物，即凝血酶原复合物(PCC)。这类制剂的人凝血因子IX比活性一般在0.7～1.0IU/mg，除含人凝血因子IX外还含有其他维生素K依赖因子II、VII、X和蛋白C、蛋白S等杂蛋白。大剂量反复使用此类制剂将激活FVIIa、人凝血因子IXa、FXa和过量的FII、FX及磷脂，有引起广泛性静脉血栓的可能或产生弥散性血管内凝血的危险，因此一般输注该药时需在医院注射，需留院观察以防止意外发生。而且由于溶血性的影响，该药复溶后的浓度低，一般只有20IU/ml，临床用药输注时间通常都在1小时以上。为降低凝血酶原复合物的副作用，随着蛋白分离纯化技术的提高，20世纪90年代开始研制生产高纯的人凝血因子IX制剂，这类制剂去除了FII、FVII、FX等杂蛋白，人凝血因子IX比活性一般在50～200IU/mg。可避免由于其他凝血因子活化诱发的血栓类副反应，致血栓副作用明显减少，是迄今治疗乙型血友病的最佳选择。
人凝血因子IX在分离纯化过程中，存在蛋白结构不稳定易析出的问题。
为了解决这个问题，国外的部分上市产品，比如Grifols生产的AlphaNine
Figure BDA0002342584540000011
贝赋的重组产品Ben人凝血因子IX、Biotest的
Figure BDA0002342584540000012
通常会配备过滤装置，以除去产品复溶后可能产生的蛋白析出物。此举使得人凝血因子IX产品使用较为不便；且经过滤后的溶液，其人凝血因子IX的效价会降低。
使用保护剂也是一种解决该问题的方法。比如CLS生产的Berinin
Figure BDA0002342584540000013
Mono人凝血因子
Figure BDA0002342584540000014
kedrion生产的Aima人凝血因子
Figure BDA0002342584540000015
产品，中国专利CN 105175486 A公开的人凝血因子IX试制品，都添加了比如肝素钠、AT-III保护剂中的一种或两种。而肝素钠的加入可能给人凝血因子IX产品带入肝素钠过敏风险，增加出血风险；AT-III则可能使人出现口干、视力模糊、头昏、面红、心悸、疲乏甚至精神失常等症状。
同样因为人凝血因子IX蛋白结构不稳定易析出的原因，传统人凝血因子IX制备工艺通常只允许血浆吸附后产生的中间品冰冻保存，而不能将配制前的人凝血因子IX中间品冻存后合批以制备原液，同时由于层析柱纯化规模的限制，通常会导致每批次冻干的产品数量少，冻干批次多，生产成本高。
发明内容
为了解决现有产品容易析出的问题，以及因此引发的一系列次生问题，本发明提供了一种高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法及其制剂。
本发明首先提供了一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液的制备方法，包括如下步骤：
(1)血浆去除冷沉淀；
(2)阴离子交换层析纯化：使用凝胶吸附如步骤(1)得到的去冷沉淀血浆，洗涤缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱收集凝血因子IX粗提液；
(3)病毒灭活；
(4)阴离子交换层析纯化：用水稀释病毒灭活后溶液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱收集人凝血因子IX溶液；
(5)肝素亲和层析纯化：稀释步骤(4)的洗脱液，使其氯化钠浓度低于本步骤洗涤缓冲液氯化钠浓度，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(6)疏水层析纯化：加电导调节液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，合并收集流穿和冲洗液；
(7)经超滤、深层过滤，或者深层过滤、超滤，即得。
前述步骤(3)和步骤(4)顺序可以互换。
进一步地，
步骤(2)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.15-0.25M氯化钠，pH为6.5～7.5；
和/或，步骤(2)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.3-1.5M氯化钠，pH为6.5～7.5；
和/或，步骤(4)所述层析柱为Fractogel EMD DMAE、DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、Toyopearl DEAE、Fractogel EMD Amino650M或TOYOPEARL Amino-650M；
和/或，步骤(4)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.15-0.35M氯化钠，pH6.0～7.5；
和/或，步骤(4)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.25-0.40M氯化钠，pH为6.0～7.5；
和/或，步骤(4)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.35-0.60M氯化钠，pH为6.5～8.0：
和/或，步骤(5)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(5)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.20-0.35M氯化钠，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(5)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.45～1M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(6)所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M、Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M；
和/或，步骤(6)所述电导调节液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、2.0-2.8M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(6)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、1.5M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(7)所述深层过滤使用的是普通滤板；所述超滤的截留分子量为10～30KD。
进一步地：
步骤(2)所述洗涤缓冲液是0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.15-0.25M氯化钠、pH为6.5～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(2)所述洗脱缓冲液是0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.3-1.5M氯化钠、pH为6.5～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(4)所述层析柱为Fractogel EMD DMAE、DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、Toyopearl DEAE、Fractogel EMD Amino650M或TOYOPEARL Amino-650M；
和/或，步骤(4)所述平衡缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸盐、0.15-0.35M氯化钠、pH6.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(4)所述洗涤缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸盐、0.25-0.40M氯化钠、pH为6.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(4)所述洗脱缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸盐、0.35-0.60M氯化钠、pH为6.5～8.0的混合溶液；
和/或，步骤(5)所述平衡缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸盐、pH为7.0～7.5的溶液；
和/或，步骤(5)所述洗涤缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸盐、0.20-0.35M氯化钠、pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(5)所述洗脱缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸钠、0.45～1M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸、pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(6)所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M、Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M；
和/或，步骤(6)所述电导调节液是0.01-0.03M枸橼酸钠、2.0-2.8M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸、pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(6)所述平衡缓冲液是0.01-0.03M枸橼酸钠、1.5M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸、pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(7)所述深层过滤使用的是普通滤板；所述超滤的截留分子量为10～30KD。
进一步地，步骤(2)所述凝胶为DEAE Sepharose A50凝胶。
进一步地，步骤(4)和/或步骤(5)所述洗脱缓冲液含有0.5M氯化钠。
进一步地，步骤(5)所述层析柱为Heparin Sepharose 6FF、Heparin SepharoseCL6B、Capto Heparin或AF-Heparin HC-650M。
进一步地，步骤(6)所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M。
进一步地，所述电导调节液含有2.5M氯化钠。
进一步地，所述平衡缓冲液含有1.5M氯化钠。
进一步地，步骤(6)所述电导调节液的添加量与步骤(5)洗脱液体积相同。
进一步地，步骤(7)所述的深层过滤是采用含有硅藻土或珍珠岩助滤剂的滤板过滤。
本发明提供一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液的制备方法，其是将前述方法的步骤(3)和步骤(4)交换顺序得到的制备方法。
本发明还提供了一种人凝血因子IX的中间品，其是通过前述方法制备得到的人凝血因子IX中间品，其反复冻融后能用于人凝血因子IX冻干产品的制备
进一步地，所述反复冻融的次数≤5次。
进一步地，所述反复冻融的时间间隔≤7个月。
本发明还提供了一种人凝血因子IX的中间品，其是通过前述方法制备得到的人凝血因子IX中间品，其可冰冻保存，不同批次所述人凝血因子IX的中间品溶解后合并，能用于人凝血因子IX原液配制。
进一步地，所述其在冰冻保存期间，能耐受反复冻融。
进一步地，所述反复冻融的次数≤5次。
进一步地，所述反复冻融的时间间隔≤7个月。
本发明还提供了一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液，其是以前述方法制备得到的人凝血因子IX溶液；
所述人凝血因子IX溶液不含有肝素钠、肝素和AT-III。
本发明还提供了一种高纯度人凝血因子IX冻干品的制各方法，它包括前述方法步骤(1)～(7)；
它还包括除菌、除病毒和冻干步骤。
前述的冻干品制各方法中，所述除病毒方法为干热灭活法。
前述的冻干品制备方法中，所述除病毒方法为纳米膜过滤法。
本发明还提供一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX冻干品，它是使用前述方法制备而成，所述冻干品不含有肝素钠、肝素和AT-III，它是使用前述方法制备而成。
本发明还提供了一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX复溶液的制备方法，其是将前述冻干品溶解制备得到的人凝血因子IX复溶液。
本发明还提供了一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX复溶液，它是含有前述冻干品的溶液，所述复溶液的人凝血因子IX浓度为20～200IU/mL。
本发明可以在不加入肝素钠或AT-III的情况下，制备出性状稳定的人凝血因子IX，由此得到的人凝血因子IX冻干品还具有高纯度(150IU/mg以上)、复溶后浓度高(最高可达200IU/mL)的特点。
本发明的方法由于能制备稳定的人凝血因子IX溶液，可以支持不同批次人凝血因子IX原液配制前的中间品冰冻保存后的合并。通过本发明的方法制备得到的人凝血因子IX中间品冰冻保存后能用于人凝血因子IX原液配制，进而能实现合批冻干，大大降低了冻干的能耗、减少了操作人员的工作量。通过本发明的方法制备得到的人凝血因子IX中间品在冰冻保存期间可耐受反复冻融，人凝血因子IX反复冻融5次后效价收率在90％以上且活化凝血因子活性检测合格。因此，本发明方法耐受度高，可应对断电、冰箱制冷故障等突发情况，减少因反冻融而不得不废弃中间品带来的损失，降低生产成本。
另外，本发明的凝血因子IX在高浓度(200IU/mL)下对兔红细胞无溶血和凝聚作用，临床安全性更高。
综上所述，本发明的方法和产品具有良好的市场前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所述的“合批”指不同批次之间的中间品的合并。
本发明所述的S/D母液的工作浓度为：TNBP 0.27-0.33％、Tween-80 0.8-1.2％。
本发明实施例S/D母液的工作浓度为：TNBP 0.3％、Tween-80 1.0％。
发明人在工艺开发和具体试验条件优化的过程中发现，本发明公开的高稳定性、高纯人凝血因子IX的制备方法，其层析步骤先两步阴离子凝胶层析、再接肝素亲和层析、再接疏水层析的顺序一旦变更，或者不配合深层过滤的方法，都将无法实现本发明的合批冻干的有益效果，即使进行试验条件的优化，最终得到的冻干产品复溶后可见异物判定不合格率高，不合格程度严重，不适于扩大生产。
在具体的实施方式中，本发明第一步阴离子凝胶层析介质可选DEAESepharoseA50。本发明第二步阴离子凝胶层析介质可选Fractogel EMD DMAE、DEAESepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、Toyopearl DEAE、Fractogel EMD Amino 650M或TOYOPEARL Amino-650M。本发明肝素亲和层析介质可选Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL6B、Capto Heparin或AF-Heparin HC-650M。本发明疏水层析介可选Toyopearl Phenyl 650M、Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
发明人在工艺开发和具体试验条件的优化过程中发现，现有技术公开的人凝血因子IX制备工艺，比如三步层析法或三步层析法配合硫酸铵分级沉淀或PEG分级沉淀得到的凝血因子IX原液配制前的中间品冰冻保存后合批，进一步进行人凝血因子IX原液配制、合批冻干，所得冻干产品复溶后可见异物判定不合格率高，不合格程度严重，同样不适于扩大生产。现有上市人凝血因子IX冻干产品复溶后的浓度最高为100IU/mL，在这一现有浓度下，体外溶血性试验结果为阴性。发明人惊喜地发现，本发明的人凝血因子IX冻干产品复溶后的浓度最高可达200IU/mL，这意味着临床应用溶血副作用将更低、更安全。
实施例1高纯人凝血因子IX的制备
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)将新鲜冰冻血浆解冻后，控制血浆温度0～4℃，4000rpm离心15min，去除冷沉淀，收集上清。将去冷沉淀血浆升温至4℃；
(2)将DEAE Sepharose A50干胶用注射用水溶胀后，缓冲液(0.25M枸橼酸钠，0.15M氯化钠，pH7.5)平衡，然后加入去冷沉淀血浆中，搅拌吸附40～50min。
(3)过滤血浆，收集凝胶，加入300g洗涤缓冲液(0.05M枸橼酸钠，0.16M氯化钠，pH7.5)搅拌5～10min，放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶3次。再加入洗脱缓冲液(0.05M枸橼酸钠，0.5M氯化钠，pH7.5)洗脱凝胶3次，每次搅拌10～15min，收集洗脱液。用0.45μm滤膜过滤洗脱液，得到凝血因子IX粗提液。
(4)将事先配制的S/D母液加入到上述的凝血因子IX粗提液中，使TNBP终浓度为0.3％、Tween-80浓度至1.0％，调节混合液温度至24～26℃，搅拌6h。
(5)S/D灭活后的凝血因子粗提液维持在15～25℃，用1M盐酸调节粗提液pH，注射用水稀释电导率至与平衡缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.22M氯化钠，pH6.2)一致。稀释后粗提液上样离子交换层析柱Fratogel EMD DMAE，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡。上样结束后用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.02M枸橼酸钠，0.28M氯化钠，pH6.5)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.02M枸橼酸钠，0.5M氯化钠，pH7.7洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是：DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEAE、Toyopearl DEAE、Fractogel EMD Amino 650M或TOYOPEARL Amino-650M。
(6)用稀释液(0.02M枸橼酸钠，pH7.2)稀释上述洗脱液至原重量的2.4倍，1M盐酸调节pH至7.2。然后上亲和层析Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.02M枸橼酸钠，pH7.2)充分平衡，上样完成后用洗涤缓冲液(0.02M枸橼酸钠，0.25M氯化钠，pH7.2)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.02M枸橼酸钠，0.6M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.2)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是其它肝素亲和层析柱，例如：Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(7)在上述洗脱液中加入1倍体积的电导调节液(0.02M枸橼酸钠，2.5M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.2)。然后上疏水层析Toyopearl Phenyl 650M柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.02M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.2)平衡，上样完成后继续用平衡缓冲液冲洗，合并收集流穿液及冲洗液。本步骤的层析柱还可以是Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(8)用10KD分子量的超滤膜浓缩透析上述流穿冲洗液(透析液为0.02M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.0～7.5)，得到超滤后人凝血因子IX溶液。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含硅藻土助滤剂的滤板过滤，收集滤液。
(10)上述滤液经0.1μm滤芯预过滤后，用20nm滤芯进行除病毒过滤，得纳滤后人凝血因子IX溶液。
(11)用(8)所述透析液稀释纳滤后人凝血因子IX溶液，配制至所需浓度，经0.22μm滤芯除菌过滤并分装，10ml/瓶。
(12)冻干。
(13)检测冻干后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
FIX效价测定方法采用一期法，具体参照《中国药典》2015年三部通则3519人凝血因子IX效价测定法。
蛋白含量检测方法采用Lowry法，具体参照《中国药典》2015年三部通则0731第二法福林酚法(Lowry法)方法1。
3.活性检测结果
冻干品比活为150IU/mg。
实施例2高纯人凝血因子IX的制各
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)将新鲜冰冻血浆解冻后，控制血浆温度0～4℃，4000rpm离心15min，去除冷沉淀，收集上清。将去冷沉淀血浆升温至8℃；
(2)将DEAE Sepharose A50干胶用注射用水溶胀后，缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.08M氯化钠，pH7.5)平衡，然后加入去冷沉淀血浆中，搅拌吸附40～50min。
(3)过滤血浆，收集凝胶，加入洗涤缓冲液(0.05M枸橼酸钠，0.16M氯化钠，pH6.5搅拌5～10min，放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶3次。再加入洗脱缓冲液(0.25M枸橼酸钠，0.3M氯化钠，pH6.5)洗脱凝胶3次，每次搅拌10min，收集洗脱液。用0.45μm滤膜过滤洗脱液，得到凝血因子IX粗提液。
(4)将事先配制的S/D母液加入到上述的凝血因子IX粗提液中，使TNBP终浓度为0.3％、Tween-80浓度至1.0％，调节混合液温度至24～26℃，搅拌6h。
(5)S/D灭活后的凝血因子粗提液维持在15～25℃，用1M盐酸调节粗提液pH，注射用水稀释电导率至与平衡缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.15M氯化钠，pH6.0一致。稀释后粗提液上样离子交换层析柱Fratogel EMD DMAE，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡。上样结束后用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.25M氯化钠，pH6.0)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.35M氯化钠，pH7.5)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是：DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、ToyopearlDEAE、Fractogel EMD Amino 650M或TOYOPEARL Amino-650M。
(6)用稀释液(0.01M枸橼酸钠，pH7.0)稀释上述洗脱液至原重量的2.4倍，1M盐酸调节pH至7.0～7.5。然后上亲和层析Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.01M枸橼酸钠，pH7.0)充分平衡，上样完成后用洗涤缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.20M氯化钠，pH7.0)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.01M枸橼酸钠，0.45M氯化钠，2g/L盐酸精氨酸，0.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.0)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是其它肝素亲和层析柱，例如：Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(7)在上述洗脱液中加入1倍体积的电导调节液(0.01M枸橼酸钠，2.0M氯化钠，2g/L盐酸精氨酸，0.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.0)。然后上疏水层析Toyopearl Phenyl 650M柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.01M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，2g/L盐酸精氨酸，0.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.0)平衡，上样完成后继续用平衡缓冲液冲洗，合并收集流穿液及冲洗液。本步骤的层析柱还可以是Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(8)用10KD分子量的超滤膜浓缩透析上述流穿冲洗液(透析液为0.02M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，2g/L盐酸精氨酸，0.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.0～7.5)，得到超滤后人凝血因子IX溶液。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含硅藻土助滤剂的滤板过滤，收集滤液。
(10)上述滤液经0.1μm滤芯预过滤后，用20nm滤芯进行除病毒过滤，得纳滤后人凝血因子IX溶液。
(11)步骤(10)所得纳滤后人凝血因子IX溶液-40℃以下冰冻保存。
(12)水浴解冻上述纳滤后人凝血因子IX溶液，控制解冻后溶液温度15～25℃，合批。
(13)用步骤(8)所述透析液稀释纳滤后人凝血因子IX溶液，配制至所需浓度，经0.22μm滤芯除菌过滤并分装，10ml/瓶。
(14)冻干。
(15)检测冻干后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
方法同实施例1。
3.活性检测结果
冻干品纯度为160IU/mg。
4.结论
本实施例将步骤(10)得到的中间品经过冰冻、解冻后，中间品外观上无沉淀，且由此中间品制得的冻干产品符合药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
表明本发明支持中间品冻存与冻干前的合批，利于节约冻干步骤的人力和能源消耗。实施例3高纯人凝血因子IX的制备
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)将新鲜冰冻血浆解冻后，控制血浆温度0～4℃，4000rpm离心15min，去除冷沉淀，收集上清。将去冷沉淀血浆升温至15℃；
(2)将DEAE Sepharose A50干胶用注射用水溶胀后，缓冲液(0.25M枸橼酸钠，
0.018M氯化钠，pH8.0平衡，然后加入去冷沉淀血浆中，搅拌吸附50min。
(3)过滤血浆，收集凝胶，加入洗涤缓冲液(0.025M枸橼酸钠，0.25M氯化钠，pH7.5)搅拌10min，放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶3次。再加入洗脱缓冲液(0.01M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，pH6.5)洗脱凝胶3次，每次搅拌15min，收集洗脱液。用0.45μm滤膜过滤洗脱液，得到凝血因子IX粗提液。
(4)将事先配制的S/D母液加入到上述的凝血因子IX粗提液中，使TNBP终浓度为0.3％、Tween-80浓度至1.0％，调节混合液温度至24～26℃，搅拌6h。
(5)S/D灭活后的凝血因子粗提液维持在15～25℃，用1M盐酸调节粗提液pH，注射用水稀释电导率至与平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.35M氯化钠，pH7.5)一致。稀释后粗提液上样离子交换层析柱Fratogel EMD DMAE，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡。上样结束后用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.4M氯化钠，pH7.5洗涤，再用洗脱缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.6M氯化钠，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是：DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、ToyopearlDEAE、Fractogel EMD Amino 650M或TOYOPEARLAmino-650M。
(6)用稀释液(0.03M枸橼酸钠，pH7.5)稀释上述洗脱液至原重量的2.4倍，1M盐酸调节pH至7.5。然后上亲和层析Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，pH7.5)充分平衡，上样完成后用洗涤缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.35M氯化钠，pH7.5)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.03M枸橼酸钠，1M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是其它肝素亲和层析柱，例如：Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(7)在上述洗脱液中加入1倍体积的电导调节液(0.03M枸橼酸钠，2.8M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)。然后上疏水层析Toyopearl Phenyl 650M柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)平衡，上样完成后继续用平衡缓冲液冲洗，合并收集流穿液及冲洗液。本步骤的层析柱还可以是Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(8)用30KD分子量的超滤膜浓缩透析上述流穿冲洗液(透析液为0.03M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)，得到超滤后人凝血因子IX溶液。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含珍珠岩助滤剂滤板过滤，收集滤液。
(10)上述滤液经0.1μm滤芯预过滤后，用20nm滤芯进行除病毒过滤，得纳滤后人凝血因子IX溶液。
(11)步骤(10)所得纳滤后人凝血因子IX溶液-40℃以下冰冻保存。
(12)水浴解冻上述纳滤后人凝血因子IX溶液，控制解冻后溶液温度15～25℃，合批。
(13)冻干后制品经100℃、30min干热病毒灭活。
(14)检测干热后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
方法同实施例1。
3.活性检测结果
冻干品纯度为153IU/mg。
4.结论
本实施例将步骤(10)得到的中间品经过冰冻、解冻后，中间品外观上无沉淀，且由此中间品制得的冻干产品符合药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
表明本发明支持中间品冻存与冻干前的合批，利于节约冻干步骤的人力和能源消耗。
实施例4高纯人凝血因子IX的制备
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)～(8)同实施例1的步骤(1)～(8)。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含硅藻土助滤剂滤板过滤，收集滤液。
(10)用透析液(0.02M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.0～7.5)稀释步骤(9)的滤液，配制至所需浓度，经0.22μm滤芯除菌过滤并分装，10ml/瓶。
(11)冻干。
(12)冻干后制品经100℃、30min干热病毒灭活。
(13)检测干热后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
方法同实施例1。
3.活性检测结果
冻干品纯度为170IU/mg。
实施例5高纯人凝血因子IX的制备
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)～(8)同实施例2的步骤(1)～(8)。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含硅藻土助滤剂滤板过滤，收集滤液
(10)用透析液(0.02M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，3.5g/L盐酸精氨酸，1.0g/L盐酸赖氨酸，pH7.0～7.5)稀释步骤(9)的滤液，配制至所需浓度，经0.22μm滤芯除菌过滤并分装，10ml/瓶。
(11)冻干。
(12)冻干后制品经100℃、30min干热病毒灭活。
(13)检测干热后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
方法同实施例1。
3.活性检测结果
冻干品纯度为165IU/mg。
实施例6高纯人凝血因子IX的制备
1.高纯人凝血因子IX的制备步骤如下：
(1)将新鲜冰冻血浆解冻后，控制血浆温度0～4℃，4000rpm离心15min，去除冷沉淀，收集上清。将去冷沉淀血浆升温至15℃；
(2)将DEAE Sepharose A50干胶用注射用水溶胀后，缓冲液(0.25M枸橼酸钠，0.018M氯化钠，pH8.0平衡，然后加入去冷沉淀血浆中，搅拌吸附50min。
(3)过滤血浆，收集凝胶，加入洗涤缓冲液(0.025M枸橼酸钠，0.25M氯化钠，pH7.5)搅拌10min，放掉洗涤液，如此反复冲洗凝胶3次。再加入洗脱缓冲液(0.01M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，pH7.5)洗脱凝胶3次，每次搅拌15min，收集洗脱液。用0.45μm滤膜过滤洗脱液，得到凝血因子IX粗提液。
(4)将事先配制的S/D母液加入到上述的凝血因子IX粗提液中，使TNBP终浓度为0.3％、Tween-80浓度至1.0％，调节混合液温度至24～26℃，搅拌6h。
(5)S/D灭活后的凝血因子粗提液维持在15～25℃，用1M盐酸调节粗提液pH，注射用水稀释电导率至与平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.35M氯化钠，pH7.5)一致。稀释后粗提液上样离子交换层析柱Fratogel EMD DMAE，层析柱预先用平衡缓冲液充分平衡。上样结束后用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.4M氯化钠，pH7.5洗涤，再用洗脱缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.6M氯化钠，pH8.0)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是：DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、ToyopearlDEAE、Fractogel EMD Amino 650M或TOYOPEARLAmino-650M。
(6)用稀释液(0.03M枸橼酸钠，pH7.5)稀释上述洗脱液至原重量的2.4倍，1M盐酸调节pH至7.5。然后上亲和层析Heparin Sepharose 6FF柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，pH7.5)充分平衡，上样完成后用洗涤缓冲液(0.03M枸橼酸钠，0.35M氯化钠，pH7.5)洗涤，再用洗脱缓冲液(0.03M枸橼酸钠，1M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)洗脱，收集洗脱液。本步骤的层析柱还可以是其它肝素亲和层析柱，例如：Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(7)在上述洗脱液中加入1倍体积的电导调节液(0.03M枸橼酸钠，2.8M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)。然后上疏水层析Toyopearl Phenyl650M柱，层析柱预先用平衡缓冲液(0.03M枸橼酸钠，1.5M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)平衡，上样完成后继续用平衡缓冲液冲洗，合并收集流穿液及冲洗液。本步骤的层析柱还可以是Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M。
(8)用30KD分子量的超滤膜浓缩透析上述流穿冲洗液(透析液为0.03M枸橼酸钠，0.12M氯化钠，7g/L盐酸精氨酸，3.5g/L盐酸赖氨酸，pH7.5)，得到超滤后人凝血因子IX溶液。
(9)上述超滤后人凝血因子IX溶液经含珍珠岩助滤剂滤板过滤，收集滤液。
(10)上述滤液经0.1μm滤芯预过滤后，用20nm滤芯进行除病毒过滤，得纳滤后人凝血因子IX溶液。
(11)步骤(10)所得纳滤后人凝血因子IX溶液反复冻融5次，-40℃以下冰冻保存。
(12)水浴解冻上述纳滤后人凝血因子IX溶液，控制解冻后溶液温度15～25℃。
(13)冻干后制品经100℃、30min干热病毒灭活。
(14)检测干热后产品，符合欧洲药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
2.活性检测
方法同实施例1。
3.活性检测结果
冻干品纯度为151IU/mg。
4.结论
本实施例将步骤(10)得到的中间品经过反复冻融5次，中间品外观上无沉淀，且由此中间品制得的冻干产品符合药典相关标准，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
表明本发明支持中间品冻存与冻干前的合批，利于节约冻干步骤的人力和能源消耗；同时，本发明公开方法可应对断电、冰箱制冷故障等突发情况，减少中间品因反冻融而不得不废弃的损失，从而降低生产成本。
实验例1溶血性研究
1.剂量设计
实验试剂：实施例1-实施例6所得人凝血因子IX。
用不同量的注射用水溶解稀释冻干高纯人凝血因子IX制剂，使IX效价分别为25±5IU/ml(A1)、50±5IU/ml(A2)、100±5IU/ml(A3)、200±10IU/ml(A4)，以此作为样品进行溶血性与凝聚性检查。具体实验剂量设计见表1。
表1溶血性研究实验剂量表
Figure BDA0002342584540000131
Figure BDA0002342584540000141
供试品对照组A1～A4分别为供试品A1～A4的空白对照。
2.试验结果
37±0.5℃静置3小时后，阴性对照管(0.9％氯化钠注射液)红细胞全部下沉，上清液无色透明，适当振摇后下沉的红细胞重新分散，未出现溶血和凝聚现象；阳性对照管(灭菌注射用水)溶液澄明红色，管底无红细胞残留，判定为全溶血。以上结果提示本试验体系正常可靠。
37±0.5℃静置3小时后，实施例1所得人凝血因子IX供试品组(A1～A4)红细胞全部下沉，上清液无色透明，适当振摇后下沉的红细胞重新分散，未出现溶血和凝聚现象。每组平行管结果一致。
实施例2-实施例6所得人凝血因子IX供试品组试验结果同上。
3.结论
本发明工艺所得人凝血因子IX在最高200IU/mL浓度下对兔红细胞无溶血和凝聚作用，体外溶血试验结果为阴性。
实验例2FIX中间品反复冻融试验
1.试验设计
实施例1～实施例5合批之前中间品取样，反复冻融5次，检测中间品冻融前后FIX效价，并计算效价收率；检测中间品活化凝血因子活性。
FIX效价测定方法采用一期法，具体参照《中国药典》2015年三部通则3519人凝血因子IX效价测定法。
活化凝血因子活性检测方法采用《中国药典》2015年四部通则3423活化的凝血因子活性检查法。
Figure BDA0002342584540000151
实施例1～实施例5所得成品在2-8℃低温储存24个月后，FIX效价未见明显变化，复溶后可见异物判定符合中国药典标准。
综上，本发明可以在不加入肝素钠或AT-III的情况下，制备出性状稳定的人凝血因子IX，由此得到的人凝血因子IX冻干品还具有高纯度、复溶后浓度高的特点；另外，本发明的凝血因子IX在高浓度下对兔红细胞无溶血和凝聚作用，安全可靠。本发明的方法和产品具有良好的市场前景。

Claims (11)

1.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血浆去除冷沉淀；
(2)阴离子交换层析纯化：使用凝胶吸附如步骤(1)得到的去冷沉淀血浆，洗涤缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱收集凝血因子IX粗提液；
(3)病毒灭活；
(4)阴离子交换层析纯化：用水稀释病毒灭活后溶液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(5)肝素亲和层析纯化：稀释或超滤透析步骤(4)的洗脱液，使其氯化钠浓度低于本步骤洗涤缓冲液氯化钠浓度，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，洗涤缓冲液洗涤层析柱，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
(6)疏水层析纯化：加电导调节液，上样，平衡缓冲液冲洗层析柱，合并收集流穿和冲洗液；
(7)经超滤、深层过滤，或者深层过滤、超滤，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(2)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.15-0.25M氯化钠，pH为6.5～7.5；
和/或，步骤(2)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.25M枸橼酸盐或磷酸盐、0.3-1.5M氯化钠，pH为6.5～7.5；
和/或，步骤(4)所述层析柱为FractogelEMD DMAE、DEAE Sepharose FF、DEAE-Toyopearl 650M、Q-Sepharose FF、Capto DEA、Toyopearl DEAE、Fractogel EMD Amino650M或TOYOPEARL Amino-650M；
和/或，步骤(4)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.15-0.35M氯化钠，pH6.0～7.5；
和/或，步骤(4)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.25-0.40M氯化钠，pH为6.0～7.5；
和/或，步骤(4)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.35-0.60M氯化钠，pH为6.5～8.0；
和/或，步骤(5)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(5)所述洗涤缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.20-0.35M氯化钠，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(5)所述洗脱缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、0.45～1M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5的混合溶液；
和/或，步骤(6)所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M、Octyl Sepharose CL-4B或Toyopearl PPG-600M；
和/或，步骤(6)所述电导调节液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、2.0-2.8M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(6)所述平衡缓冲液包含0.01-0.03M枸橼酸盐、1.5M氯化钠、2～7g/L盐酸精氨酸、0.5～3g/L盐酸赖氨酸，pH为7.0～7.5；
和/或，步骤(7)所述深层过滤使用的是普通滤板；所述超滤的截留分子量为10～30KD。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述凝胶为DEAE Sepharose A50凝胶；
和/或，步骤(4)和/或步骤(5)所述洗脱缓冲液含有0.5M氯化钠；
和/或，步骤(5)所述层析柱为Heparin Sepharose 6FF、Heparin Sepharose CL6B、Capto Heparin或AF-Heparin HC-650M；
和/或，步骤(6)所述层析柱为Toyopearl Phenyl 650M；
和/或，步骤(6)的电导调节液含有2.5M氯化钠；
和/或，步骤(6)的平衡缓冲液含有1.5M氯化钠；
和/或，步骤(6)所述电导调节液的添加量与步骤(5)洗脱液体积相同；
和/或，步骤(7)所述的深层过滤是采用含有硅藻土或珍珠岩助滤剂的滤板过滤。
4.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液的制备方法，其特征在于，其是将权利要求1-3任一所述方法的步骤(3)和步骤(4)交换顺序得到的制备方法。
5.一种人凝血因子IX的中间品，其特征在于：其是通过权利要求1-4任一所述方法制备得到的人凝血因子IX中间品，其反复冻融后能用于人凝血因子IX冻干产品的制备；优选的，所述反复冻融的次数≤5次；更优选地，所述反复冻融的时间间隔≤7个月。
6.一种人凝血因子IX的中间品，其特征在于：其是通过权利要求1-4任一所述方法制备得到的人凝血因子IX的中间品，其可冰冻保存，不同批次所述人凝血因子IX的中间品溶解后合并，能用于人凝血因子IX原液配制；
优选的，所述中间品在冰冻保存期间，能耐受反复冻融；优选的，所述反复冻融的次数≤5次；优选地，所述反复冻融的时间间隔≤7个月。
7.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX原液，其特征在于：它是以权利要求1-4任一所述方法制各得到的人凝血因子IX溶液；
所述人凝血因子IX溶液不含有肝素钠、肝素或AT-III。
8.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX冻干品的制备方法，其特征在于：它包括权利要求1-4任一所述方法步骤(1)～(7)；
它还包括除菌、除病毒和冻干步骤；
优选的，所述除病毒方法为干热灭活法或纳米膜过滤法。
9.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX冻干品，其特征在于，所述冻干品不含有肝素钠、肝素或AT-III；
所述冻干品是采用如权利要求8所述方法制备得到的。
10.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX复溶液的制备方法，其特征在于，其是将权利要求9所述冻干品溶解制备得到的人凝血因子IX复溶液。
11.一种高稳定性、高纯度人凝血因子IX复溶液，其特征在于，复溶液的人凝血因子IX浓度为20～200IU/mL；复溶液不含有肝素钠、肝素或AT-III；
所述复溶液是权利要求9所述冻干品的复溶液。
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