CN108218981B - 一种人凝血因子viii的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血因子VIII的制备方法，本发明通过对人凝血因子Ⅷ制备过程进行总体研究，对冷沉淀制备、溶解、洗涤液和洗脱液进行筛选，洗脱后山梨酯80、磷酸三丁酯残留量均达到现行药典的要求；透析液进行筛选，最终得到的产品无塌陷、无萎缩，复溶时间快，干热灭活后的FⅧ效价为28.9IU/ml，本发明对制备FⅧ的各个工艺步骤进行优化筛选，得到最优的方案，通过计算各个步骤的回收率，最后得到的FⅧ的回收率为28.91％，有效的增加了血浆制备FⅧ的效率，间接节约了稀缺血浆资源。

Description

一种人凝血因子VIII的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药和血液制品技术领域，尤其涉及一种人凝血因子VIII的制备方法。
背景技术
人凝血因子(human coagulation factorVIII，FVIII)是从健康人血浆分离制备的主要含FⅧ的血浆蛋白制品，主要用于治疗甲型血友病(hemophiliaA，HA)。据世界卫生组织(WHO)和世界血友病联盟(WorldFederationofHemophilia，WFH)报告，全球HA的发病率为15-20/10万，中国约2.27-2.84/10万，对于HA患者需要终生输注FⅧ来维持正常生活(梁小明，黄潘，周星，等.人凝血因子Ⅷ提取工艺研究[J].安徽农业科学，2013，41(30):12043－12044，12048.)。
目前，FⅧ市场仍然呈紧张势态，由于血浆中FⅧ含量甚微，浓度约50-100ng/ml，且极不稳定，传统制备方法收率不高，纯度较低，比活性小于10IU/mg，含有大量杂蛋白，临床使用中副反应大。此外，国内生产FVIII的厂家较少。国内已有专利对FVIII生产工艺进行改进，如申请号CN201410496187.9《一种人凝血因子VIII的制备方法》，采用铝胶吸附，S/D病毒灭活，凝胶柱层析纯化，及超滤浓缩，但其主要对冻干保护3剂进行了优化，得到的产品收率和比活均有所提高，但难以满足市场需求。申请号CN101710678003.4《一种人凝血因子VIII的制备方法》，通过对冷沉淀溶解之后时采用两部压滤法提高了分离效果，并在冻干工艺中增加了复溶复冻工艺，提高了产品的安全性，但其制备步骤较多，增加了成本投入。申请号CN201510748334.1，公开了《一种同时制备高纯人凝血因子VIII及人纤维蛋白原的方法》，步骤包括：(1)冷沉淀与组分I同时投料、溶解；(2)DEAE SephadexA-50凝胶吸附；(3)S/D病毒灭活；(4)阴离子交换柱层析；(5)层析穿透液经两步低温乙醇沉淀纯化、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得人纤维蛋白原；(6)层析洗脱液进一步疏水柱层析；(7)疏水柱洗脱液经超滤、纳米膜过滤、除菌过滤、分装、冻干及干热病毒灭活制得高纯人凝血因子VIII，但其整个工艺过程中，人凝血因子VIII的回收率较低，造成了血浆的浪费。黄璠等对人凝血因子Ⅷ生产冷沉淀制备工艺的优化，提高人凝血因子Ⅷ的质量和产量(黄璠,梁小明,张丽铃,等.人凝血因子Ⅷ生产冷沉淀制备工艺的优化[J].现代医药卫生,2014(15):2254-2255.)；牟蕾等对冻干保护剂配方，得到纯度较高、稳定性和安全性较好的FⅧ制品，确定的保护剂配方对干热灭活的耐受性良好(牟蕾,鲁涛,王黔川,等.一种离子交换层析制备人凝血因子Ⅷ方法的建立及保护剂配方的筛选[J].中国生物制品学杂志,2015,28(11):1206-1210.)。
综上所述，现有的技术没有全面的对生产过程进行因此优化，因此，优化人凝血因子Ⅷ(FⅧ)原液制备工艺，提高FⅧ收得率及纯度的方法势在必行。
发明内容
本发明以上技术问题，提供了一种人凝血因子VIII的制备方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：
1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；
2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；
3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至14℃±2℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度15±5℃，离心机出液速度≤5000ml/min；
4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE SephadexA-50凝胶吸附，A-50凝胶的用量为每份冷沉淀干胶用量为0.0025份，A-50干胶使用前用溶胀液浸泡3h以上，并用平衡液平衡3次，每次不少于10min，吸附pH为6.9，吸附时间30-60min，吸附后离心收集上清液，出液温度15±5℃，每台离心机出液速度≤3000ml/min；
溶胀液配方：溶胀液为含65-80mmol/L氯化钠溶液；
平衡液配方：平衡液为含8-20mmol/L枸橼酸钠和80-100mmol/L氯化钠溶液，pH为6.9-7.0。
5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为1±0.3％(g/g)，磷酸三丁酯的量为0.3±0.1％(g/g)，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度24±1℃，灭活时间为6h；S/D灭活剂的配制：S/D灭活剂含聚山梨酯80的量为11％(g/g)，磷酸三丁酯的量为3.3％(g/g)；
6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5-6个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱锋，得洗脱液；
7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6-7倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ效价为30IU/ml以上；
8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7.0±0.5，除菌过滤；
9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，冻干制品置100±0.5℃水浴灭活30min，包装既得。
进一步，所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min。
进一步，所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min。
进一步，所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液。
近一步，TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，上样浓度为7-10IU/ml，层析流速为110cm/h。
近一步，所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 6.9-7.1，温度15±5℃。
近一步，所述的洗涤液，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 6.9-7.1，温度15±5℃。
近一步，所述的洗脱液，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7.0，温度15±5℃.
近一步，所述的透析液，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6.7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.0±0.5。
近一步，所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3.6h；搁板温度2.5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13.7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11.5小时；其中在在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa。
有益效果，本发明相对于现有技术，具有以下特点：
1)通过对人凝血因子Ⅷ制备过程进行总体研究，研究发现原料冰冻血浆融化的温度和速度是保证冷沉淀质量的关键，通过条件筛选，在其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min的条件下进行制备，得到的冷血浆的回收率高达84.71％，提高了原料血浆中FⅧ在冷沉淀中的回收量。
2)在肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min，该条件下得到的FⅧ13.71为IU/ml，用pH为6.9的酸溶液进行沉淀，通过DEAE Sephadex A-50凝胶吸附进一步吸附除杂，随后进行层析分离，对洗涤液和洗脱液进行帅选，洗脱后山梨酯80、磷酸三丁酯残留量均达到现行药典的要求；透析液进行筛选，最终得到的产品无塌陷、无萎缩，复溶时间快，干热灭活后的FⅧ效价为28.9IU/ml，符合《中国药典》三部(2015版)的相关规定。
3)本发明对制备FⅧ的各个工艺步骤进行优化筛选，得到最优的方案，通过计算各个步骤得回收率，按照实施例1-3最后得到的FⅧ的回收率为28.91％，有效的增加了血浆制备FⅧ的效率，间接节约了稀缺血浆资源。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：
1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；
2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；
3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至14℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度15℃，离心机出液速度≤5000ml/min；
4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE SephadexA-50凝胶吸附，A-50凝胶的用量为每千克冷沉淀干胶用量为0.0025kg，A-50干胶使用前用溶胀液浸泡3h以上，并用平衡液平衡3次，每次不少于10min，吸附pH为6.9，吸附时间60min，吸附后离心收集上清液，出液温度15℃，每台离心机出液速度≤3000ml/min；
溶胀液配方：溶胀液为含70mmol/L氯化钠溶液；
平衡液配方：平衡液为含15mmol/L枸橼酸钠和85mmol/L氯化钠溶液，pH为6.9。
5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为1％(g/g)，磷酸三丁酯的量为0.3％(g/g)，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度24±1℃，灭活时间为6h；S/D灭活剂的配制：S/D灭活剂含聚山梨酯80的量为11％(g/g)，磷酸三丁酯的量为3.3％(g/g)；
6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5-6个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱锋，得洗脱液；
7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6-7倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ效价为30IU/ml以上；
8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7.0，除菌过滤；
9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，冻干制品置100℃水浴灭活30min，包装既得。
所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min。
所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min。
所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液。
TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，层析流速为110cm/h。
所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 7.0，温度15℃。
所述的洗涤液，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 6.9，温度15℃。
所述的洗脱液，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7.0，温度15℃.
所述的透析液，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6.7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.0。
所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3.6h；搁板温度2.5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13.7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11.5小时；其中在在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa。
实施例2
一种人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：
1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；
2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；
3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至12℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度10℃，离心机出液速度≤5000ml/min；
4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE SephadexA-50凝胶吸附，A-50凝胶的用量为每kg冷沉淀干胶用量为0.0025k，A-50干胶使用前用溶胀液浸泡3h以上，并用平衡液平衡3次，每次不少于10min，吸附pH为6.9，吸附时间30-60min，吸附后离心收集上清液，出液温度10℃，每台离心机出液速度≤3000ml/min；
溶胀液配方：溶胀液为含65mmol/L氯化钠溶液；
平衡液配方：平衡液为含8mmol/L枸橼酸钠和80mmol/L氯化钠溶液，pH为6.9。
5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为0.7％(g/g)，磷酸三丁酯的量为0.2％(g/g)，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度23℃，灭活时间为6h；S/D灭活剂的配制：S/D灭活剂含聚山梨酯80的量为11％(g/g)，磷酸三丁酯的量为3.3％(g/g)；
6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱锋，得洗脱液；
7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ效价为30IU/ml以上；
8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7.0±0.5，除菌过滤；
9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，冻干制品置100℃水浴灭活30min，包装既得。
所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min。
所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min。
所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液。
TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，层析流速为110cm/h。
所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 6.9，温度10℃。
所述的洗涤液，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 6.9，温度10℃。
所述的洗脱液，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7.0，温度10℃。
所述的透析液，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6.7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 6.5。
所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3.6h；搁板温度2.5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13.7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11.5小时；其中在在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa。
实施例3
一种人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：
1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；
2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；
3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至16℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度20℃，离心机出液速度≤5000ml/min；
4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE SephadexA-50凝胶吸附，A-50凝胶的用量为每kg冷沉淀干胶用量为0.0025kg，A-50干胶使用前用溶胀液浸泡3h以上，并用平衡液平衡3次，每次不少于10min，吸附pH为6.9，吸附时间30-60min，吸附后离心收集上清液，出液温度20℃，每台离心机出液速度≤3000ml/min；
溶胀液配方：溶胀液为含80mmol/L氯化钠溶液；
平衡液配方：平衡液为含20mmol/L枸橼酸钠和100mmol/L氯化钠溶液，pH为6.9。
5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为1.3％(g/g)，磷酸三丁酯的量为0.4％(g/g)，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度25℃，灭活时间为6h；S/D灭活剂的配制：S/D灭活剂含聚山梨酯80的量为11％(g/g)，磷酸三丁酯的量为3.3％(g/g)；
6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5.6个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱锋，得洗脱液；
7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6-7倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ效价为30IU/ml以上；
8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7.5，除菌过滤；
9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，冻干制品置100℃水浴灭活30min，包装既得。
所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min。
所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min。
所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液。
TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，层析流速为110cm/h。
所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 7.1，温度20℃。
所述的洗涤液，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7.1，温度20℃。
所述的洗脱液，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7.0，温度20℃.
所述的透析液，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6.7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸；pH 7.55。
所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3.6h；搁板温度2.5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13.7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11.5小时；其中在在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa。
实施例4-7冷沉淀制备条件如表1所示。
表1实施例4-7冷沉淀制备条件
水温度 搅拌速度 离心转速 出液温度 进液速度
实施例4 28℃ 150r/min 13800r/min 4℃ 3kg/min
实施例5 28℃ 95r/min 13800r/min 2℃ 4kg/min
实施例6 28℃ 95r/min 14000r/min 4℃ 3.3kg/min
实施例7 25℃ 100r/min 13000r/min 2℃ 3.3kg/min
实施例4-7的其它制备步骤与实施例1相同。
实施例8-13所述的冷沉淀溶解，如表2所示。
表2实施例8-13所述的冷沉淀溶解
Figure BDA0001553434440000131
Figure BDA0001553434440000141
实施例8-13的其它制备步骤与实施例1相同。
实施例14-19所述的酸沉淀，其pH如表3所示。
表3实施例14-19所述的酸沉淀
酸溶液pH
实施例14 6.3
实施例15 6.5
实施例16 6.8
实施例17 7.1
实施例18 7.5
实施例14-18的其它制备步骤与实施例1相同。
实施例19-24洗涤液组成由表4所示，其它成分未发生任何变化。
表4实施例19-24洗涤液组成
氯化钠mmol/L 枸橼酸钠mmol/L
实施例19 120 12
实施例20 120 14
实施例21 100 10
实施例22 150 10
实施例23 160 10
实施例19-23的其它制备步骤与实施例1相同。
实施例24-27的洗脱液配方如表5所示。
表5实施例24-27的洗脱液配方
氯化钠mmol/L 枸橼酸钠mmol/L
实施例24 180 20
实施例25 250 20
实施例26 200 15
实施例27 200 28
实施例24-27的其它制备步骤与实施例1相同。
实施例28
超滤透析液为75mmol/L氯化钠，8mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，15g/L甘氨酸，25g/L甘露醇；pH 7.0，其它制备步骤同实施例1。
实施例29
实施例29所述的透析液，60mmol/L氯化钠，8mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，8g/L白蛋白，30g/L盐酸精氨酸；pH 7.0，其它制备步骤同实施例1。
实验例
1)冷沉淀制备条件评价
按照实施例1-7的方法冷沉淀制备，其中每个实验组的原料血浆为240kg参照文献报道的方法(李青,刘晓,文圆,等.人凝血因子Ⅷ工艺过程效价检测与分析[J].中国生物制品学杂志,2017,30(2):186-191.)对各组制备的冷沉淀进行评价，其中每个实验组测量3次，求平均值，结果如表6所示。
表6冷沉淀制备结果
血浆FⅧ效价(IU/ml) 去冷沉淀血浆FⅧ效价(IU/ml) 回收率％ 冷沉淀量g
实施例1 0.85 0.13 84.71 2104
实施例2 0.80 0.14 82.50 2045
实施例3 0.68 0.16 76.47 1983
实施例4 0.66 0.25 62.12 1537
实施例5 0.84 0.22 73.81 1684
实施例6 0.71 0.23 67.61 1889
实施例7 0.50 0.19 62.00 1475
2)冷沉淀溶解条件评价
表2冷沉淀溶解效果评价
FⅧ效价(IU/ml)
实施例1 13.71
实施例2 12.56
实施例3 12.02
实施例8 11.05
实施例9 10.27
实施例10 9.71
实施例11 9.56
实施例12 12.03
实施例13 12.10
3)酸沉淀条件评价
表7酸沉淀效果评价结果
Figure BDA0001553434440000161
Figure BDA0001553434440000171
4)洗涤液对FⅧ效价影响
表8洗涤液对FⅧ效价影响
层析上柱FⅧ效价(IU/ml) 洗涤样效价(IU/ml)
实施例1 9.38 0.02
实施例2 9.56 0.01
实施例3 9.00 0.02
实施例19 9.21 0.08
实施例20 9.47 0.1
实施例21 9.00 0.16
实施例22 9.52 0.2
实施例23 9.47 0.15
5)洗脱液对FⅧ效价和比活影响
表9洗脱液对FⅧ效价和比活影响
Figure BDA0001553434440000181
6)灭活后FⅧ效价
表9灭活后FⅧ效价测量结果
Figure BDA0001553434440000182
通过以上分析，本发明通过对人凝血因子Ⅷ制备过程进行总体研究，研究发现原料冰冻血浆融化的温度和速度是保证冷沉淀质量的关键，通过条件筛选，在其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min的条件下进行制备，得到的冷血浆的回收率高达84.71％，提高了原料血浆中FⅧ在冷沉淀中的回收量。
在肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4.1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1.8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7.0，继续溶解30min，该条件下得到的FⅧ13.71为IU/ml，用pH为6.9的酸溶液进行沉淀，通过DEAE Sephadex A-50凝胶吸附进一步吸附除杂，随后进行层析分离，对洗涤液和洗脱液进行帅选，洗脱后山梨酯80、磷酸三丁酯残留量均达到现行药典的要求；透析液进行筛选，最终得到的产品无塌陷、无萎缩，复溶时间快，干热灭活后的FⅧ效价为28.9IU/ml，符合《中国药典》三部(2015版)的相关规定。
本发明对制备FⅧ的各个工艺步骤进行优化筛选，得到最优的方案，通过计算各个步骤得回收率，按照实施例1-3最后得到的FⅧ的回收率为28.91％，有效的增加了血浆制备FⅧ的效率，间接节约了稀缺血浆资源。

Claims (1)

1.一种人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)冷沉淀制备：制备血浆冷沉淀；
2)溶解：冷沉淀溶解，得溶解液；
3)酸沉淀：用醋酸溶液调节溶液pH，并降温至14℃ ± 2℃，酸沉淀后离心收集上清液，出液温度15± 5℃，离心机出液速度≤5000ml/min；
4)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：将步骤3)得到的上清液中加入DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，吸附后离心收集上清液；DEAE Sephadex A-50凝胶的用量为每份血浆冷沉淀干胶用量为0.0025份；
5)S/D病毒灭活：将步骤4)得到的上清液用S/D灭活剂进行灭活，使制品聚山梨酯80的量为1± 0 .3％g/g，磷酸三丁酯的量为0 .3± 0 .1％g/g，制品蛋白浓度≤50mg/ml，灭活温度24± 1℃，灭活时间为6h；
6)TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析：柱平衡液冲洗5-6个柱体积，将步骤5)得到的灭活液进行上样，洗涤液洗涤至基线平稳，洗脱液洗脱，收集洗脱峰，得洗脱液；
7)超滤：步骤6)得到的洗脱液进行浓缩，得浓缩液，浓缩液用透析液进行6-7倍体积透析，最后一次透析完后浓缩至人凝血因子Ⅷ 效价为30IU/ml以上；
8)半成品制备：将步骤7)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液，按出品规格用超滤透析液进行配制，制品pH为7 .0± 0.5，除菌过滤；
9)成品制备：将步骤8)得到的人凝血因子Ⅷ 溶液进行分批、分装，冻干，压塞出柜，干热病毒灭活，包装既得；
所述的制备血浆冷沉淀，其循环水温度为28℃，搅拌速度为95r/min，离心转速为13800r/min，出液温度为2℃，进液速度为3.3kg/min；
所述的冷沉淀溶解，肝素钠的注射用水溶液加入量为沉淀的4 .1倍，溶解温度为11℃，溶解时间为1 .8h，用醋酸溶液调节溶液pH值至7 .0，继续溶解30min；
所述的柱平衡液，其为90mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙，pH 6 .9-7 .1，温度15± 5℃；
所述的洗涤液 ，120mmol/L氯化钠，10mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 6 .9-7 .1，温度15± 5℃；
所述的洗脱液 ，200mmol/L氯化钠，20mmol/L枸橼酸钠，120mmol/L甘氨酸，1mmol/L氯化钙；pH 7 .0，温度15± 5℃；
所述的透析液 ，50mmol/L氯化钠，6mmol/L枸橼酸钠，1mmol/L氯化钙，6 .7g/L白蛋白，35g/L盐酸精氨酸，pH7 .0± 0.5；
所述的冻干，隔板温度降至-45℃，并保持3 .6h；搁板温度2 .5h升温至-30℃，保持13h；隔板经32h升温至0℃，保持13 .7h；搁板温度4h升温至30℃，保温11 .5小时；其中在冷冻干燥和解析干燥过程中真空度不大于30Pa；
所述的酸沉淀，是用pH等于6.9的酸溶液；
所述TOYOPEARL DEAE-650M凝胶柱层析，其柱子高20cm，层析流速为110cm/h。
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