CN105294858A

CN105294858A - 一种冻干人凝血因子viii的制备方法

Info

Publication number: CN105294858A
Application number: CN201510879630.5A
Authority: CN
Inventors: 李春洲
Original assignee: Shanghai Zhouyue Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Zhouyue Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-12-05
Filing date: 2015-12-05
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了一种从冷沉淀中制备冻干人凝血因子VIII的方法，包括如下步骤：(1)冷沉淀的溶解与压滤；(2)S/D病毒灭活；(3)DEAE？SephadexA-50凝胶去除维生素K依赖的凝血因子；(4)阴离子交换树脂柱层析纯化FVIII;(5)超滤透析并浓缩洗脱液；(6)浓缩液中加入稳定剂并调节FVIII的效价及PH值；(7)纳米膜除病毒过滤；(8)除菌过滤及分装；(9)冻干；(10)干热病毒灭活。本发明制备工艺采用DEAE？SephadexA-50凝胶吸附去除维生素K依赖的凝血因子，代替传统的氢氧化铝及PEG沉淀方式，具有生产稳定、得率高、质量好的优点；采用三步病毒灭除措施使产品的安全性大大提高。

Description

一种冻干人凝血因子VIII的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种血液制品的制备方法，具体是涉及一种冻干人凝血因子VIII的制备方法。

背景技术

人凝血因子VIII(FVIII）是人体中最重要的凝血因子之一，在肝脏中合成，有2332个氨基酸残基，由两条肽链所组成，重链分子量为90-200kDa；轻链分子量为80kDa，二条肽链间由Ca²⁺连接。在人体内的半衰期8-12小时，血浆中的含量仅为0.05-0.lmg/L。

FVIII缺乏会导致甲型血友病发生，该病是一种遗传性疾病，患者多为男性，发病率约1/10000-1/5000，根据血友病的发病率估算，世界血友病患者约40万人，中国血友病患者人数约为10万人左右。目前登记在册的约1万余人，仅占一成左右。患者出血部位集中于关节、肌肉和内脏。其中，关节反复出血导致骨骼变形，肌肉萎缩；而内脏和颅内出血则会危及生命。甲型血友病因属遗传性疾病，目前尚无根治的方法，只能通过输注FVIII制剂进行替代性治疗，但只要定期输注FVIII制剂，甲型血友病患者完全可以像正常人一样生活，不会影响工作学习。

目前，国内血制品公司供应市场的FVIII产品数量十分有限，不能满足国内甲型血友病患者的使用要求，经常出现无药可供的情况，严重危害患者的健康和生命安全。国内目前血制品厂家的FVIII制备工艺得率普遍较低，一般约10万IU／吨血浆（FVIII含量一般为70-80万IU／吨血浆），同时产品纯度不高，比活一般不高于50IU/mg，另外，产品的外观欠佳，冻干粉不成饼状，复溶后乳光严重，有的还有蛋白析出物。

鉴于此，本发明开发了一种从冷沉淀中制备冻干人凝血因子VIII的新工艺，克服了目前生产工艺普遍存在的得率偏低、比活偏低、产品外观较差等缺点，具有流程简单、纯度高，收率高的优点，可以大规模进行生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种生产工艺稳定，产品得率高，质量优良，使用安全性高的冻干人凝血因子VIII的制备方法。

一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，包括如下步骤：

(1)冷沉淀溶解并过滤：按1:5-20的重量比，将冷沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中，温度控制在15-30℃，搅拌2-4小时，使其充分溶解；然后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，收集澄清滤液，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；

(2)DEAESephadexA-50凝胶吸附：以上滤液中加入预先用热的注射用水溶胀并用平衡缓冲液A平衡的DEAESephadexA-50凝胶，缓慢搅拌0.5-1.5小时，后静置5-30分钟；然后过滤，收集滤液；

(3)S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween-80至1.0%(wt%),TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%(wt%)，搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时，然后用0.45μm滤芯澄清过滤，收集滤液；

(4)阴离子交换柱层析：以上滤液上阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液B充分平衡，上柱结束后，用平衡缓冲液B冲洗柱子，后用洗涤缓冲液洗涤柱子，再用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液，及时用0.45μm滤芯进行过滤，收集滤液；

(5)超滤：用超滤膜包浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-8倍，再浓缩至凝血FVIII活力高于35IU/ml;后移出超滤膜包并后洗膜包；

(6)加稳定剂及调节：将FVIII含量稀释至所需值（一般规格为20-30IU/ml)，加入稳定剂，后调PH值至6.50-7.50；

(7)纳米膜除病毒过滤：用0.1μm滤芯串联15-20纳米滤芯进行除病毒过滤；

(8)除菌过滤及分装：用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；

(9)冻干；

(10)干热病毒灭活：在100℃沸水浴中保温0.5-1小时，进行干热病毒灭活。

步骤(1)所述的溶解缓冲液由TRIS（三羟甲基氨基甲烷）、氯化钠及水组成，所述的溶解缓冲液中TRIS的浓度为0.0lM-0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，所述的溶解缓冲液的PH值为6.50-7.50；所述的溶解缓冲液中预先加入肝素钠，肝素钠的加入量为2000IU-10000IU／吨溶解缓冲液。

步骤(2)所述的平衡缓冲液A由TRIS（三羟甲基氨基甲烷）、氯化钠及水组成，所述的平衡缓冲液A中TRIS的浓度为0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，所述的平衡缓冲液A的PH值为6.50-7.50；所述的DEAESephadexA-50凝胶，按溶胀前的干胶计，加入量为0.5-1g/kg滤液。

步骤(4)所述的阴离子交换柱充填的树脂为DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、QsepharoseFF、CaptoQ及QsepharoseHP中的任意一种；所述的平衡缓冲液B、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液均由柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙及水组成；所述的平衡缓冲液B中，柠檬酸钠的浓度为0.01M-0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，氯化钙的浓度为0.005M-0.0l5M,PH值为6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液中，柠檬酸钠的浓度为0.01M-0.02M，氯化钠的浓度为0.2M-0.3M，氯化钙的浓度为0.005M-0.0l5M,PH值为PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液中，柠檬酸钠的浓度为0.0lM-0.02M,氯化钠的浓度为0.5M-2.0M，氯化钙的浓度为0.001M-0.005M,PH值为PH6.50-7.50。

步骤(5)所述的超滤膜包的超滤膜截留分子量为l0K-30K。

步骤(6)所述的稳定剂为蔗糖、甘氨酸、组氨酸中的一种或几种组合；所述蔗糖的加入量为0.1-3%(wt%)，所述甘氨酸的加入量为0.1-3%(wt%)，所述组氨酸的加入量为0.1-3%(wt%）。

本发明的优势在于：(1)本发明采用DEAESephadexA-50凝胶吸附去除维生素K依赖的凝血因子(FII,FVII,FIX,FX)，代替传统的氢氧化铝凝胶吸附或PEG沉淀，去除效率高，FVIII损失小，得率可达20IU／吨血浆，明显高于传统工艺；(2)本发明在悬浮液预处理阶段采用压滤法取代离心法，避免了离心过程中的强剪切力及泡沫，从而避免了FVIII变性失活，产品更加稳定；(3)本发明所述生产工艺制备的产品，冻干粉为白色均匀海绵状，复溶时间快，复溶液澄明，无蛋白析出，几乎无乳光；(4)本发明制备的冻干FVIII产品，干热病毒灭活后，活力损失很少，不大于8%；(5)本发明的生产流程中共采用了S/D病毒灭活、纳米膜过滤去病毒及干热病毒灭活三重病毒灭除措施，对脂包膜病毒、非脂包膜病毒及细小病毒进行有效灭除，极大提高了产品的使用安全性。

附图说明

图1为本发明制备工艺流程框图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明；但不能认为本发明的实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下所做出的若干简单的改变或替换，都应视为属于本发明权利要求书确定的专利保护范围。

实施例一

1，冷沉淀溶解并过滤：将1kg冷沉淀投入9kg溶解缓冲液中（0.02MTRIS-HCL,0.15MNaCL,PH6.50-6.60)，溶解缓冲液中预先加入肝素至2000IU/kg，温度控制在15-20℃，搅拌4小时，使其充分溶解，然后用PALL公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，后洗滤芯，最终收集澄清滤液10.8kg，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；

2,DEAEsephadexA-50凝胶吸附：以上滤液中加入DEAESephadexA-50凝胶10.8g，凝胶加入前用70℃以上的热注射用水溶胀及平衡缓冲液（0.02MTRIS-HCL,0.15MNaCL,PH6.50-6.60）预先平衡，加入后充分搅拌1.5小时，然后用滤布过滤，收集滤液，凝胶再生后重复使用；

3,S/D病毒灭活：以上滤液中加入Tween80至1.0%(wt%),TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%(wt%)，搅匀后升温至24-26℃，后保温6小时，然后用0.45μm滤芯过滤，收集滤液；4，阴离子交换柱层析：以上病毒灭活后的滤液上CaptoQ柱，柱子预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液组成为0.02MNa-citrate,0.15MNacL,0.0lMCacL₂,PH6.50-6.60；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液（0.02MNa-citrate，0.2MNaCL,0.01MCaCL₂:PH6.50-6.60）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液（0.021MNa-citrate,2.0MNaCL,0.001MCaCL₂,PH6.50-6.60）洗脱，收集纯化的FVIII溶液；

5，用30K分子量的超滤膜（0.1M²）浓缩以上洗脱液，然后恒体积透析4倍，再次浓缩；后移出超滤膜包并后洗膜包，测得FVIII效价为36.5IU/ml;

6，将以上浓缩液稀释至FVIII效价30IU/ml，加入甘氨酸至1.5%(wt%)，后调PH值至6.90-7.10;

7，用0.1μm滤芯串联20纳米滤芯进行除病毒过滤;

8，用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；

9，冻干；

10，干热病毒灭活：在100℃沸水浴中保温30分钟，进行干热病毒灭活。

实施例二

1，冷沉淀溶解并过滤：将1kg冷沉淀投入19kg溶解缓冲液中（0.02MTRIS-HcL,0.075MNaCL,PH7.40-7.50)，溶解缓冲液中预先加入肝素至10000IU/kg，温度控制在25-30℃，搅拌2小时，使其充分溶解，然后用PALL公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，后洗滤芯，最终收集澄清滤液21.2kg，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；

2,DEAESephadexA-50凝胶吸附：以上滤液中加入DEAESephadexA-50凝胶10.6g，凝胶加入前用70℃以上的热注射用水溶胀及平衡缓冲液（0.02MTRIS-HCL,0.075MNaCL,PH7.40-7.50）预先平衡，加入后充分搅拌1小时，然后用滤布过滤，收集滤液，凝胶再生后重复使用；

3,S/D病毒灭活：同实施例一；

4，阴离子交换柱层析：以上病毒灭活后的滤液上DEAESepharoseFF柱，柱子预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液组成为0.01MNa-citrate,0.075MNacL,0.005MCacL₂,PH7.40-7.50；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液（0.0lMNa-citrate,0.15MNaCL,0.005MCaCL₂,PH7.40-7.50）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液（0.01MNa-citrate,0.5MNaCL,0.005MCaCL₂,PH7.40-7.50）洗脱，收集纯化的FVIII溶液；

5，用30K分子量的超滤膜（0.1M²）浓缩以上洗脱液，然后恒体积透析6倍，再次浓缩；后移出超滤膜包并后洗膜包，测得FVIII效价为36.7IU/ml;

6，以上浓缩液加入WFI，将FVIII效价稀释至30IU/ml，后加入组氨酸至1.5%(wt%)，甘氨酸至1.5%(wt%)，后调PH值至6.90-7.10;

7-10，同实施例一。

实施例三

1，冷沉淀溶解：将1kg冷沉淀投入14kg溶解缓冲液中（0.02MTRIS-HcL,0.1MNacL,PH6.90-7.10)，溶解缓冲液中预先加入肝素至6000IU/kg，温度控制在20-25℃，搅拌3小时，使其充分溶解；然后用PALL公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，后洗滤芯，最终收集澄清滤液15.9kg，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；

2,DEAESephadexA-50凝胶吸附：以上滤液中加入DEAESephadexA-50凝胶12g，凝胶加入前用70℃以上的热注射用水溶胀及平衡缓冲液（0.02MTRIS-HCL,0.1MNaCL,PH6.90-7.10）预先平衡，加入后充分搅拌45分钟，然后用滤布过滤，收集滤液，凝胶再生后重复使用；

3,S/D病毒灭活：同实施例一；

4，阴离子交换柱层析：以上病毒灭活后的滤液上QSePharose4FF柱，柱子预先用平衡缓冲液充分平衡，平衡缓冲液组成为0.02MNa-citrate,0.1MNacL,0.0l5MCacL₂,PH6.90-7.10)；上柱结束后，用平衡缓冲液冲洗柱子，后用洗涤缓冲液（0.02MNa-citrate，0.2MNaCL,0.015MCaCL₂,PH6.90-7.10）洗涤柱子，再用洗脱缓冲液（0.02MNa-citrate,1MNaCL,0.002MCaCL₂,PH6.90-7.10）洗脱，收集纯化的FVlll溶液；

5，用10K分子量的超滤膜（0.1M²）浓缩以上洗脱液，然后恒体积透析5倍，再次浓缩；后移出超滤膜包并后洗膜包，测得FVIII效价为35.9IU/ml;

6，以上浓缩液加入WFI，将FVIII效价稀释至30IU/ml，后加入甘氨酸至2%(wt%)，后调PH值至6.90-7.10;

7-10，同实施例一。

表FVIII试制品收率及比活数据统计

Claims

1.一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)冷沉淀溶解并过滤

按1：5-20的重量比，将冷沉淀投入预先配制的溶解缓冲液中，温度控制在15-30℃，搅拌2-4小时，使其充分溶解；然后用颇尔公司生产的Supradur50P滤板串联0.45μm滤芯过滤，收集澄清滤液，过滤前用溶解缓冲液预洗滤板及滤芯；

(2)DEAESephadexA-50凝胶吸附

以上滤液中加入预先用热的注射用水溶胀并用平衡缓冲液A平衡的DEAESephadexA-50凝胶，缓慢搅拌0.5-1.5小时，后静置5-30分钟；然后用滤布过滤，收集滤液；

(3)S/D病毒灭活

以上滤液中加入Tween-80至1.0%(wt%),TNBP（磷酸三丁酯）至0.3%(wt%)，搅匀后升温至24-26℃，后保温6-8小时，然后用0.45μm滤芯澄清过滤，收集滤液；

(4)阴离子交换柱层析

以上滤液上阴离子交换柱，柱子预先用平衡缓冲液B充分平衡，上柱结束后，用平衡缓冲液B冲洗柱子，后用洗涤缓冲液洗涤柱子，再用洗脱缓冲液洗脱柱子，收集洗脱液即为纯化的FVIII溶液，及时用0.45μm滤芯进行过滤，收集滤液；

(5)超滤

用超滤膜包浓缩以上滤液，然后恒体积透析4-8倍，再浓缩至FVIII效价高于35IU/ml，后移出超滤膜包并后洗膜包；

(6)加稳定剂及调节

将FVIII效价调节至所需值（一般规格为20-30IU/ml)，加入稳定剂，后调PH值至6.50-7.50；

(7)纳米膜除病毒过滤

用0.1μm滤芯串联15-20纳米滤芯进行除病毒过滤；

(8)除菌过滤及分装

用0.22μm滤芯对产品进行除菌过滤并分装；

(9)冻干；

(10)干热病毒灭活

在100℃沸水浴中保温0.5-1小时，进行干热病毒灭活。

2.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤(1）所述的溶解缓冲液由TRIS（三羟甲基氨基甲烷）、氯化钠及水组成，所述的溶解缓冲液中TRIS的浓度为0.0lM-0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，所述的溶解缓冲液的PH值为6.50-7.50。

3.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的溶解缓冲液中预先加入肝素钠，肝素钠的加入量为2000IU-10000IU／吨溶解缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的平衡缓冲液A由TRIS（三羟甲基氨基甲烷）、氯化钠及水组成，所述的平衡缓冲液A中TRIS的浓度为0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，所述的平衡缓冲液A的PH值为6.50-7.50。

5.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的DEAESephadexA-50凝胶，按溶胀前的干胶计，加入量为0.5-1g/kg滤液。

6.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的阴离子交换柱充填的树脂为DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、QSepharoseFF、CaptoQ及QSepharoseHP中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述的平衡缓冲液B、洗涤缓冲液及洗脱缓冲液均由柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙及水组成；所述的平衡缓冲液B中，柠檬酸钠的浓度为0.01M-0.02M，氯化钠的浓度为0.075M-0.15M，氯化钙的浓度为0.005M-0.0l5M,PH值为PH6.50-7.50；所述的洗涤缓冲液中，柠檬酸钠的浓度为0.01M-0.02M，氯化钠的浓度为0.2M-0.3M，氯化钙的浓度为0.005M-0.0l5M,PH值为PH6.50-7.50；所述的洗脱缓冲液中，柠檬酸钠的浓度为0.0lM-0.02M,氯化钠的浓度为0.5M-2.0M，氯化钙的浓度为0.001M-0.005M,PH值为PH6.50-7.50。

8.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的超滤膜包的超滤膜截留分子量为l0K-30K。

9.根据权利要求1所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述的稳定剂为蔗糖、甘氨酸、组氨酸中的一种或几种组合，所述蔗糖的加入量为0.1-3%(wt%)，所述甘氨酸的加入量为0.1-3%(wt%)，所述组氨酸的加入量为0.1-3%(wt%）。

10.根据权利要求1-9所述的一种冻干人凝血因子VIII的制备方法，其特征在于：人凝血因子VIII产品在整个制备流程中经过S/D病毒灭活、纳米膜过滤及干热三步病毒灭活或去除步骤。