CN1562339A - 脑蛋白水解物制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种脑蛋白水解物制剂的制备方法。其特征在于：用新鲜或冻存猪脑，加1～2倍体积的纯化水匀浆，加热至85℃，降温后，用盐酸调pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小时，调温至42℃后，用氢氧化纳调pH至7.7～8.0，用胰酶多酶在38～42℃条件下，酶解2～4小时，再调pH值2.5－3.0，－20～－10℃下静置冷冻；在室温条件下过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，取澄清液，用截流分子量为1万的超滤膜超滤，收集透过液,纳滤浓缩，得到的浓缩液经121℃蒸汽灭菌30分钟，得到除菌溶液称为脑蛋白水解物精制品；调配L－色氨酸、L－酪氨酸，添加的各种氨基酸，调配肽图，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成成品，蒸汽灭菌，制成无菌制剂。本发明缩短了生产周期、产量提高、操作简便易行，减少生产环节、避免了药品受污染的机会。
Description
技术领域
本发明涉及药品的制备方法，具体地说是脑蛋白水解物制剂的制备方法。
背景技术
脑蛋白水解物作为健康、新鲜动物大脑组织经多酶酶解提取的一种活性脑多肽类物质，含有多种人脑必需氨基酸及脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等重要元素，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。它可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢。激活腺苷酸环化酶催化其他激素系统。提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。
脑蛋白水解物注射液适用于颅脑外伤及脑血管疾病(脑供血不全、脑梗塞)后遗症伴有的记忆减退及注意力集中障碍的症状改善；适用于神经血管性头痛、智力发育不全、脑动脉硬化、老年性痴呆、脑损伤后遗症、脑血管病等脑神经、血管性疾病引起的认知、记忆、运动、感觉、平衡等脑功能障碍的预防和治疗，无明显毒副作用。对帕金森、疲劳综合征、亚健康状态具有一定效果。
现有的脑蛋白水解物制剂的制备方法之一是：新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，匀浆，加5倍体积的丙酮沉淀，沉淀分离后再加等量乙醚洗涤浸泡1小时，再过滤、真空干燥制成脑粉；脑粉用水溶解后，依次用胃蛋白酶、胰酶双酶水解，水解液离心取上清液，加热沸腾并迅速冷却，然后经板框过滤、超滤及减压浓缩得水解液；水解液分批上Sephadex G-25凝胶层析柱层析，将活性峰收集液经减压浓缩、0.45um微孔过滤制成精品液；根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算氨基酸用量，添加相应氨基酸配制成浓配液，然后稀配、灌装成成品，经蒸汽灭菌成无菌制剂。其缺点是：(1)、设备投资大，生产周期长，生产效率低；用层析方法提纯有效成分，每一过程需要30～48小时，生产周期长；由于生产周期长，为保证药品质量，要求在2～8℃冷库车间进行Sephadex G-25凝胶柱层析，而Sephadex G-25凝胶层析材料必须进口，价格昂贵；按年生产100万支(10ml)脑蛋白水解物注射液计算，上述投入就达200万元人民币以上；使用减压浓缩和离心的步骤，生产效率低，不利于对药品质量的控制。(2)、使用大量的有机化学溶剂，丙酮和乙醚的沸点极低，是易燃、易爆、有毒的危险化学品，乙醚还被用作麻醉剂，使用大量的丙酮和乙醚先将脑蛋白沉淀出来制成脑粉，此步骤非常危险，必须在防爆车间内生产，操作烦琐，污染环境，危害生产操作人员的身体健康。
其次，中国发明专利公开了一种“脑蛋白水解物注射液生产工艺”，其内容是：新鲜猪脑去除表面的粘膜及血渍等，加2倍体积的水匀浆，用双层纱布过滤，滤液先用胃蛋白酶水解，用盐酸调pH到1.5-1.6，水浴温度40-45℃，时间为6-8小时，再用氢氧化钠调pH到7.6-7.7，加胰酶(胰酶先溶解于0.02N的氯化钙溶液中于4℃下活化30分钟)水解，40-45℃水浴水解4-6小时，得到水解液，加盐酸调pH值2.5-3.0，-20～-10℃下静置10-30小时；在室温条件下，用双层纱布过滤，再加入1/2体积的水，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为0.5-1.0um的微孔滤膜过滤澄清，取澄清液，依次用截流分子量为7万和1万的超滤膜超滤，得到的超滤液再用截流分子量为1000的超滤膜进行浓缩，得到的浓缩液加热到100℃沸腾15分钟，然后迅速冷却到25℃以下，再依次经过0.5-1um孔径的微孔滤膜和截流分子量为7万和1万的超滤膜，得到的超滤液再经121℃蒸汽灭菌30分钟得到的除菌溶液称为脑蛋白水解的混合多肽、氨基酸溶液精制品；根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的氨基酸用量，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配装针成成品药液，经121℃蒸汽灭菌30分钟成无菌制剂。其缺点是：(1)使用超滤膜进行超滤浓缩回收率低：该工艺虽然采用了超滤技术，但使用的是截流分子量为1000的超滤膜进行浓缩，使有效活性成分脑多肽不同程度的丢失，也就是在透过液中流失，大大降低了收率。(2)多次经过0.5-1um孔径的微孔滤膜和截流分子量为7万和1万的超滤膜，得到超滤液，使操作比较烦琐。
发明内容
本发明目的是提供一种不使用有机化学溶剂，以物理的方法取代化学试剂沉淀法来提取脑蛋白水解物生产制剂的制备方法，能达到现有工艺的分离效果。
本发明的脑蛋白水解物注射液的制备方法是：用新鲜(或冻存)猪脑去除表面的包膜及血管等，加1～2倍体积的纯化水匀浆，隔水蒸汽加热至80～85℃，15分钟，快速降温至40～45℃时，用盐酸调pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小时(或沉淀分离取上清)，调温至40～42℃，用氢氧化纳调pH至7.7～8.0，用胰酶多酶(包含胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶)，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶0.5～1小时，在38～42℃条件下，酶解2～4小时，然后再用盐酸调pH值2.5～3.0，-20～-10℃下静置冷冻12～48小时；在室温条件下，用多层纱布过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为0.2～1.0um的微孔无机膜过滤澄清，取澄清液，用截流分子量为1万的超滤膜超滤，收集透过液，再用截流分子量为100～1000的纳滤膜进行纳滤浓缩，弃透过液，得到的浓缩液经121℃蒸汽灭菌30分钟，该除菌溶液为脑蛋白水解物精制品；调配L-色氨酸、L-酪氨酸，根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成半成品，再经115～121℃蒸汽灭菌30分钟，制成无菌制剂，达到国家药品(WS1-XG-25-2000)质量标准。
本发明的脑蛋白水解物制剂为注射液和冻干粉针剂。
冻干粉针剂的制备方法与注射液的方法基本相同，只是在配制成浓配液后，加入赋型剂(例如甘露醇、右旋糖苷等)，用0.2um孔径的微孔滤膜除菌过滤、分装、低温真空冷冻干燥成成品，制成无菌冻干粉针剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、舍弃了化学沉淀步骤，新鲜动物脑组织直接经多酶酶解，再用澄清方式去除水不溶物，经澄清、超滤、纳滤技术提纯、浓缩，可除去杂蛋白，使杂质峰面积小于5％，达到现有工艺的分离效果；再调配L-色氨酸、L-酪氨酸，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成半成品，制成无菌制剂，用高效液相色谱法(HPLC)，以凝胶色谱柱分析，其色谱图(肽图)应与对照溶液的色谱图基本一致，而其溶液色谱图中与对照溶液色谱图中不一致的峰面积不得过5.0％。本工艺具有安全、高效、处理速度快速、设备投入少，无污染、操作方便等优点。
2、采用多酶酶解法，以澄清技术、超滤技术和纳滤技术提纯、浓缩脑蛋白水解物，优点是生产周期大大缩短、产量提高、生产环境要求降低、操作简便易行。同时，减少生产环节、缩短生产周期就意味着减少了药品可能受污染的机会，就可降低药品在生产过程中变质的几率。
3、降低了生产成本，生产可采用密闭式生产，采用物理方法，无泄漏、无污染、符合GMP要求。
附图说明
图1是本发明的标准品肽图图谱。
图2是本发明的样品的肽图图谱。
具体实施方式
实施例1：
1、取新鲜猪脑100公斤，去除表面的包膜及血管等，边匀浆边加入100L的纯化水(以下简称为水)，隔水蒸汽加热至85℃，15分钟，快速降温至40℃时，用6mol/L盐酸调pH至1.5，加3Kg胃蛋白酶酶解3小时后，用12mol/L氢氧化纳调pH至8.0，加2Kg胰酶多酶(胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶)，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶1小时，在42℃条件下，酶解2小时，然后再用6mol/L盐酸调pH值至3.0，-20℃下静置冷冻12小时；在室温条件下，用多层纱布过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为1.0um的微孔滤膜过滤澄清，取澄清液，用截流分子量为1万的超滤膜超滤，收集透过液，再用截流分子量为400的纳滤膜进行纳滤浓缩，弃透过液，得到的浓缩液经121℃蒸汽灭菌30分钟，该除菌溶液为脑蛋白水解物精制品；调配L-色氨酸、L-酪氨酸，根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，用高效液相色谱法(HPLC)，以凝胶色谱柱分析，其色谱图(肽图见图1)应与对照溶液的色谱图(见图2)基本一致，而其溶液色谱图中与对照溶液色谱图中不一致的峰面积不得过5.0％，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成半成品，再经115℃蒸汽灭菌30分钟，制成无菌注射液。
实施例2、
取新鲜猪脑100公斤，去除表面的包膜及血管等，边匀浆边加入200L的纯化水(以下简称为水)，隔水蒸汽加热至80℃，15分钟，快速降温至45℃时，用6mol/L盐酸调pH至2.0，加3Kg胃蛋白酶酶解12小时后，用12mol/L氢氧化纳调pH至7.7，加2Kg胰酶多酶，使用前加入0.04mol/L CaCl2活化胰酶多酶0.5小时，在38℃条件下，酶解4小时，然后再用6mol/L盐酸调pH值至2.0，-10℃下静置冷冻48小时；在室温条件下，用多层纱布过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为0.2um的微孔滤膜过滤澄清，取澄清液，用截流分子量为1万的超滤膜超滤，收集透过液，再用截流分子量为400的纳滤膜进行纳滤浓缩，弃透过液，得到的浓缩液经121℃蒸汽灭菌30分钟，得到除菌溶液称为脑蛋白水解物精制品；调配L-色氨酸、L-酪氨酸，根据所需药液量，按国家药品监督管理局2000年12月28日颁布的药品标准(编号WS1-XG-25-2000)计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，见图1，与上述溶液配制成浓配液，加入赋型剂右旋糖苷40，用0.2um孔径的微孔滤膜过滤、分装、低温真空冷冻干燥成成品，制成无菌冻干粉针剂。
Claims (2)
1.一种脑蛋白水解物制剂的制备方法，其特征在于：用新鲜或冻存猪脑去除表面的包膜及血管，加1～2倍体积的纯化水匀浆，隔水蒸汽加热至80～85℃，15分钟，快速降温至40～45℃时，用盐酸调pH至1.5～2.0，用胃蛋白酶酶解3～12小时或沉淀分离取上清，调温至40～42℃后，用氢氧化纳调pH至7.7～8.0，用胰酶多酶在38～42℃条件下，酶解2～4小时，然后再用盐酸调pH值2.5～3.0，-20～-10℃下静置冷冻12～48小时；在室温条件下，过滤，加氢氧化钠调pH值到中性，用孔径为0.2～1.0um的微孔无机膜过滤澄清，取澄清液，用截流分子量为1万的超滤膜超滤，收集透过液，再用截流分子量为100～1000的纳滤膜进行纳滤浓缩，弃透过液，得到的浓缩液经121℃蒸汽灭菌30分钟，该除菌溶液为脑蛋白水解物精制品；调配L-色氨酸、L-酪氨酸，根据所需药液量，计算需要添加的各种氨基酸用量，调配肽图，与上述溶液配制成浓配液，然后稀配、灌装成半成品，再经115～121℃蒸汽灭菌30分钟，制成无菌制剂。
2、根据权利要求1所述的脑蛋白水解物制剂的制备方法，其特征在于所述的制剂为注射液和冻干粉针剂。
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