CN102166200A - 一种含猪脑蛋白水解物的冻干组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含猪脑蛋白水解物的冻干组合物及其制备方法，该含猪脑蛋白水解物的冻干组合物由猪脑蛋白水解物、甘露醇、氢氧化钠和还原型谷胱甘肽组成。该含猪脑蛋白水解物的冻干组合物能够克服现有脑蛋白注射液稳定性差、多肽类物质易受环境影响发生聚合等问题，更适于临床使用。

Description

一种含猪脑蛋白水解物的冻干组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药用制剂领域，具体地说，涉及一种含猪脑蛋白水解物的冻干组合物及其制备方法。

背景技术

脑外伤、脑血管病后遗症严重威胁着人类健康，脑蛋白水解物中含有生物活性低分子多肽和人体必需的16种氨基酸，有利于细胞内蛋白质的合成，有效地维护中枢神经系统免受侵害，提高大脑抗缺氧能力，改善细胞的供血状况。

研究表明，脑蛋白注射液稳定性差，在长期保存及长途运输过程中，多肽类物质易受环境影响发生聚合而影响产品质量，容易发生临床过敏反应。

发明内容

本发明的目的是针对现有脑蛋白注射液存在的稳定性差、不易长期存放等问题，提供一种稳定性好、存放时间长的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物。

本发明的另一目的是提供上述冻干组合物的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物，该组合物由猪脑蛋白水解物、甘露醇、氢氧化钠和还原型谷胱甘肽组成。

前述的组合物，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物250-600、甘露醇10-100、还原型谷胱甘肽1-5.5和氢氧化钠5-8。

优选地，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物300-400、甘露醇20-50、还原型谷胱甘肽1.5-3和氢氧化钠5-7。

更优选地，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物350、甘露醇35、还原型谷胱甘肽1.5和氢氧化钠6。

本发明还提供制备上述含猪脑蛋白水解物的冻干组合物的方法，该方法包括以下步骤：

1)将处方量的猪脑蛋白水解物、甘露醇和还原型谷胱甘肽加入适量注射用水中，搅拌至完全溶解，得溶液I；2)将氢氧化钠加入适量注射用水中溶解，然后将氢氧化钠溶液加入溶液I中，搅拌均匀，使混合液的pH值为5～6，得溶液II；3)将溶液II除菌后冷冻干燥制成粉末状的组合物。

前述的方法，步骤3)中除菌采用的是0.2μm微孔滤膜过滤除菌。

前述的方法，所述猪脑蛋白水解物的制备方法为：1)将冷冻猪脑用注射用水清洗2-3遍后，自然解冻，向猪脑中加入猪脑重量1-2倍的注射用水，进行匀浆；2)将匀浆液置水解罐中，用HCl调pH值3.5-5，加热至40-50℃，按匀浆液重量加入5-12％的胃蛋白酶，酶解15-20小时后，煮沸30min，冷却至30-40℃，得水解液A；3)NaOH调水解液A的pH值7.5-8.5，按水解液A重量加入2-10％胰酶，酶解温度40-50℃，酶解3-6小时后，煮沸30min，冷却至40-50℃，过滤，得粗滤液B；4)向粗滤液B中按其重量0.5-1％加入药用活性炭加热至90-100℃搅拌吸附20-25min后，冷却至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤除炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得精滤液C；5)将精滤液C冷冻干燥后即得粉末状的猪脑蛋白水解物。

本发明提供的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物能够克服现有脑蛋白注射液稳定性差、多肽类物质易受环境影响发生聚合等问题，更适于临床使用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、配方(重量：mg)：猪脑蛋白水解物250、甘露醇10、还原型谷胱甘肽1、氢氧化钠5。

2、猪脑蛋白水解物的制备方法：

1)将冷冻猪脑用注射用水清洗2-3遍后，自然解冻，向猪脑中加入等重量的注射用水，进行匀浆；2)将匀浆液置水解罐中，用HCl调pH值4，加热至45℃，按匀浆液重量加入10％的胃蛋白酶，酶解20小时后，煮沸30min，冷却至30℃，得水解液A；3)NaOH调水解液A的pH值8，按水解液A重量加入10％胰酶，酶解温度45℃，酶解5小时后，煮沸30min，冷却至45℃，过滤，得粗滤液B；4)向粗滤液B中按其重量1％加入药用活性炭加热煮沸，搅拌吸附20min后，冷却至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤除炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得精滤液C；5)将精滤液C冷冻干燥后即得粉末状的猪脑蛋白水解物。

3、含猪脑蛋白水解物的冻干组合物的制备方法：

1)将处方量的猪脑蛋白水解物、甘露醇和还原型谷胱甘肽加入适量注射用水中，搅拌至完全溶解，得溶液I；

2)将氢氧化钠加入适量注射用水中溶解，然后将氢氧化钠溶液加入溶液I中，搅拌均匀，使混合液的pH值为5，得溶液II；

3)将溶液II经0.2μm微孔滤膜过滤除菌后冷冻干燥制成粉末状的组合物。

实施例2

1、配方(重量：mg)：猪脑蛋白水解物600、甘露醇100、还原型谷胱甘肽5.5和氢氧化钠8。

2、猪脑蛋白水解物的制备方法：

1)将冷冻猪脑(来源于健康动物)用注射用水清洗2-3遍后，自然解冻，向猪脑中加入等重量的注射用水，进行匀浆；2)将匀浆液置水解罐中，用HCl调pH值5，加热至50℃，按匀浆液重量加入12％的胃蛋白酶，酶解18小时后，煮沸30min，冷却至40℃，得水解液A；3)NaOH调水解液A的pH值8.5，按水解液A重量加入8％胰酶，酶解温度50℃，酶解6小时后，煮沸30min，冷却至40℃，过滤，得粗滤液B；4)向粗滤液B中按其重量0.8％加入药用活性炭加热煮沸，搅拌吸附25min后，冷却至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤除炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得精滤液C；5)将精滤液C冷冻干燥后即得粉末状的猪脑蛋白水解物。

3、含猪脑蛋白水解物的冻干组合物的制备方法：

1)将处方量的猪脑蛋白水解物、甘露醇和还原型谷胱甘肽加入适量注射用水中，搅拌至完全溶解，得溶液I；

2)将氢氧化钠加入适量注射用水中溶解，然后将氢氧化钠溶液加入溶液I中，搅拌均匀，使混合液的pH值为6，得溶液II；

3)将溶液II经0.2μm微孔滤膜过滤除菌后冷冻干燥制成粉末状的组合物。

实施例3

1、配方(重量：mg)：猪脑蛋白水解物350、甘露醇35、还原型谷胱甘肽1.5和氢氧化钠6。

2、猪脑蛋白水解物的制备方法：

1)将冷冻猪脑(来源于健康动物)用注射用水清洗2-3遍后，自然解冻，向猪脑中加入等重量的注射用水，进行匀浆；2)将匀浆液置水解罐中，用HCl调pH值4，加热至45℃，按匀浆液重量加入10％的胃蛋白酶，酶解20小时后，煮沸30min，冷却至35℃，得水解液A；3)NaOH调水解液A的pH值8，按水解液A重量加入10％胰酶，酶解温度50℃，酶解5小时后，煮沸30min，冷却至45℃，过滤，得粗滤液B；4)向粗滤液B中按其重量1％加入药用活性炭加热煮沸，搅拌吸附25min后，冷却至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤除炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得精滤液C；5)将精滤液C冷冻干燥后即得粉末状的猪脑蛋白水解物。

3、含猪脑蛋白水解物的冻干组合物的制备方法：

1)将处方量的猪脑蛋白水解物、甘露醇和还原型谷胱甘肽加入适量注射用水中，搅拌至完全溶解，得溶液I；

2)将氢氧化钠加入适量注射用水中溶解，然后将氢氧化钠溶液加入溶液I中，搅拌均匀，使混合液的pH值为5.5，得溶液II；

3)将溶液II经0.2μm微孔滤膜过滤除菌后冷冻干燥制成粉末状的组合物。

对比例1

同CN1666777A中实施例1。

1、组分：健康动物脑组织水解物400ml，甘露醇100g，pH值5.0-7.0。

2、制备工艺：分装后冷冻干燥法

在洁净室中，将健康动物的脑组织经过处理和匀浆，酶解，脱脂，离心，超滤后制得原料药。根据原料含量取约400ml，加注射用水400ml，加注射用甘露醇100g，搅拌溶解，测定溶液pH值应在5.0-7.0，加注射用水至1000ml，经0.1％(w/v)针用活性炭除杂质、热原，0.22μm微孔滤膜除菌过滤，按规格灌装于已灭菌的瓶中，在-40℃预冻2h，从-37℃～0℃升华干燥，0℃～37℃再干燥，37℃保温2-3h，轧盖，封口，包装制得以脑蛋白水解物为主药、甘露醇为赋形剂的粉针剂。

对比例2

同CN1666777A中实施例2。

1、组分：健康动物脑组织水解物800ml，右旋糖酐100g，pH值5.0-7.0。

2、制备工艺：冷冻干燥后分装法

在洁净室中，将健康动物的脑组织经过处理和匀浆，酶解，脱脂，离心，超滤后制得原料药。根据原料含量取约800ml，加注射用水800ml，加注射用右旋糖酐100g，搅拌溶解，测定溶液pH值应在5.0-7.0，加注射用水至2000ml，经0.1％(w/v)针用活性炭除杂质、热原，0.22μm微孔滤膜除菌过滤得无菌溶液。将无菌溶液放置大盘内无菌冻干，粉碎，按规格分装，轧盖，封口，包装制得以脑蛋白水解物为主药、右旋糖酐为赋形剂的粉针剂。

对比例3

同CN1666777A中实施例3。

1、组分：健康动物脑组织水解物400ml，山梨醇100g，pH值5.0-7.0。

2、制备工艺：减压干燥后分装法

在洁净室中，将健康动物的脑组织经过处理和匀浆，酶解，脱脂，离心，超滤后制得原料药。根据原料含量取约400ml，加注射用水400ml，加注射用山梨醇100g，搅拌溶解，测定溶液pH值应在5.0-7.0，加注射用水至1000ml，经0.1％(w/v)针用活性炭除杂质、热原，0.22μm微孔滤膜除菌过滤得无菌溶液。将无菌溶液放置大盘内减压干燥，粉碎，按规格分装，轧盖，封口，包装制得以脑蛋白水解物为主药、山梨醇为赋形剂的粉针剂。

实验例1安全性试验

对实施例制备的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物和对比例制备的含猪脑蛋白水解物的冻干粉针剂进行安全性试验考察，试验方法及结果如下：

一、血管刺激性实验

取体重为2.0-2.5kg的健康兔子78只，随机分为空白对照组、阳性实验1～8组、实验1～4组，每组6只，采用兔耳缘静脉缓慢注射，注射量为10ml/kg。其中空白对照组采用氯化钠注射液，阳性对照1-8组分别采用实施例1～3制备的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物，实验1～4组分别采用对比例1～3制备的粉针剂，分别加注射用水溶解后注射。

每天一次，连续给药7天，于最后一次给药24小时后剪短兔耳，置于10％甲醛溶液中固定标本，然后送病理进行组织学检查(在兔耳缘静脉的不同部位的5处取材，即从注射初始部位开始向心端每隔1cm作一切片)。

经兔耳缘静脉病理学检查，空白对照组和阳性对照1～8组的耳缘静脉管壁完整，内皮细胞结构清楚，无明显病变，血管轻度扩张充血，无炎细胞浸润。实验1～4组出现部分血管轻度扩张充血，本发明的各个实验组血管正常，未见有血管轻度扩张、血管变性、坏死等明显刺激反应。

二、溶血实验

实验观察了氯化钠空白对照组、阳性对照1-8组与实验1-4组对家兔血的体外溶血作用，其中空白对照组采用氯化钠注射液，阳性对照1～8组分别采用实施例1～3制备的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物，实验1～4组分别采用对比例1～3制备的粉针剂，分别加注射用水溶解后注射。

结果表明37℃、3小时，实验1～4组出现了红细胞聚集现象，而其余空白对照组及阳性对照1～8组均无溶血现象，未见红细胞聚集现象出现。

三、过敏实验

观察豚鼠静脉注射氯化钠空白对照组、阳性实验1～8组与实验1～4组的过敏反应，其中空白对照组采用氯化钠注射液，阳性对照1～8组分别采用实施例1～3制备的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物，实验1～4组分别采用对比例1～3制备的冻干粉针剂，分别加注射用水溶解后注射。

具体方法是：实验动物间日给予腹腔注射对比例1的含猪脑蛋白水解物的冻干粉针剂致敏，连续三次，然后将实验动物分为空白对照组、阳性对照1～8组、实验1～4组，共12组，并于致敏开始的第14天及21天分别攻击给药，立即观察1小时。

结果显示，实验1～4组出现了竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕、咳嗽或罗音、抽搐、虚脱、死亡等现象，其余各组未出现上述现象。

实验例2稳定性实验

室温下放置9个月，分别放置0天、1个月、3个月、6个月、9个月及12个月按照中国药典2000年版附录IXB中规定检测澄明度，观察溶液外观，结果见表1和表2：

表1稳定性检测数据

表2稳定性检测数据

结果显示：对比例1、2在1个月后，溶液略有浑浊，3个月后，3个对比例均出现浑浊；而本发明制备的实施例外观和澄明度一直保持在稳定的状态。上述结果表明，本发明的含猪脑蛋白水解物的冻干组合物稳定性和溶解度好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种含猪脑蛋白水解物的冻干组合物，其特征在于，该组合物由猪脑蛋白水解物、甘露醇、氢氧化钠和还原型谷胱甘肽组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物250-600、甘露醇10-100、还原型谷胱甘肽1-5.5和氢氧化钠5-8。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物300-400、甘露醇20-50、还原型谷胱甘肽1.5-3和氢氧化钠5-7。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，该组合物由以下重量份的成分组成：猪脑蛋白水解物350、甘露醇35、还原型谷胱甘肽1.5和氢氧化钠6。

5.一种制备权利要求1-4任一项所述组合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将处方量的猪脑蛋白水解物、甘露醇和还原型谷胱甘肽加入适量注射用水中，搅拌至完全溶解，得溶液I；

2)将氢氧化钠加入适量注射用水中溶解，然后将氢氧化钠溶液加入溶液I中，搅拌均匀，使混合液的pH值为5～6，得溶液II；

3)将溶液II除菌后冷冻干燥制成粉末状的组合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中除菌采用的是0.2μm微孔滤膜过滤除菌。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，猪脑蛋白水解物的制备方法为：

1)将冷冻猪脑用注射用水清洗2-3遍后，自然解冻，向猪脑中加入猪脑重量1-2倍的注射用水，进行匀浆；

2)将匀浆液置水解罐中，用HCl调pH值3.5-5，加热至40-50℃，按匀浆液重量加入5-12％的胃蛋白酶，酶解15-20小时后，煮沸30min，冷却至30-40℃，得水解液A；

3)NaOH调水解液A的pH值7.5-8.5，按水解液A重量加入2-10％胰酶，酶解温度40-50℃，酶解3-6小时后，煮沸30min，冷却至40-50℃，过滤，得粗滤液B；

4)向粗滤液B中按其重量0.5-1％加入药用活性炭加热至90-100℃搅拌吸附20-25min后，冷却至室温，用0.45μm微孔滤膜过滤除炭，再用0.22μm微孔滤膜过滤，得精滤液C；

5)将精滤液C冷冻干燥后即得粉末状的猪脑蛋白水解物。