CN105998072A

CN105998072A - 一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用

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Publication number: CN105998072A
Application number: CN201610547261.4A
Authority: CN
Inventors: 张治国; 周天琼; 倪燕红; 傅诗丽; 黄嘉华; 高留根
Original assignee: Hangzhou Hua Lian Group Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU HUAJIN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2016-07-08
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2036-07-08
Also published as: CN105998072B

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用。本发明提供了一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用。本发明提供的猪脑提取物的分子量不超过10kDa，也不低于200Da，主要成分为小分子多肽或游离氨基酸、脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等。本发明将猪脑提取物、γ‑氨基丁酸和亚麻籽油粉进行复配，所得组合物经试验表明，能够具有健脑益智的作用。

Description

一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用。

背景技术

我国第一部老龄事业发展蓝皮书——《中国老龄事业发展报告(2013)》2013年初出版。根据蓝皮书，2012年我国老年人口数量达到1.94亿，老龄化水平达到14.3％，预计2013年老年人口数量突破2亿大关，达到2.02亿，老龄化水平达到14.8％。中国老年人口基数大，人口老龄化进程快，老年人慢性病患病率高，且患病率有每5年增长1倍的趋势该病已经成为不容忽视的一种疾病该病已经成为继心脏病、肿瘤、中风后的第四大死亡病因。老年痴呆轻症患者可有健忘、少言寡语、神志淡漠等人格行为改变，重症患者则神情淡漠、缄默不语、或哭笑无常、举动不经。给病人、家庭和社会发展都带来了巨大的挑战，然而其病因及发病机制尚不明确，加之起病隐匿、病情多样，为治疗和预防带来了极大的困难。因此痴呆已成为我国乃至世界面临的一个日渐严重的问题。

老年期痴呆是老年期常见的一组慢性进行性精神衰退性疾病，在老年人的疾病谱和死亡谱中占有重要的位置。目前认为，老年期痴呆是由于慢性或进行性大脑结构的器质性损害引起的高级大脑功能障碍的一组症候群，是患者在意识清醒的状态下出现的持久的全面的智能减退，表现为记忆力、计算力、判断力、注意力、抽象思维能力、语言功能减退，情感和行为障碍，独立生活和工作能力丧失。老年期痴呆包括老年性痴呆(AD)、血管性痴呆(VD)及混合性痴呆等。

猪脑，性寒、味甘，入心、肝、肾经，含有丰富的卵磷脂、胆固醇，能补脑益髓、镇惊安神、益虚劳，是猪科动物猪的脑髓。中药医学认为，动物脏器气味醇厚，为血肉有情之品，较草本药物更易被人体吸收，因而能迅速起效，尤其在调养、补益方面效果明显，即“同气相求”之理。而动物脏器与人体相应内脏在形态、生化特征、组织成分构成与生理功能等方面具有诸多相似性，故古人某一脏器的疾病会以相应的脏器治之，即“以脏补脏”和“以形补形”学说。而猪脑在补脑益智这方面的作用尤为突出。

目前治疗AD疾病的药物多为化学药物，其副作用明显，效果也较为有限，故而，以猪脑为材料研制具有健脑益智作用的产品具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用，本发明提供的猪脑提取物能够具有良好的生物活性。将其与γ-氨基丁酸与亚麻籽油复配，能够起到补脑益智的作用。

本发明提供了一种猪脑提取物的制备方法，其将猪脑依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，然后经过滤、超滤、浓缩、冻干，制得猪脑提取物；

胃蛋白酶与猪脑的质量比为(0.1～0.5)：100；酶解温度为38℃～42℃，pH值为1.6～2.0；时间为5h～7h；

胰蛋白酶与猪脑的质量比为(0.1～0.5)：100；酶解温度为38℃～42℃，pH值为7.3～7.7；时间为5h～7h。

在本发明的实施例中，胃蛋白酶与猪脑的质量比为0.2:100；酶解温度为40℃，pH值为1.8；时间为6h。

本发明中，胰蛋白酶与猪脑的质量比为0.2:100；酶解温度为40℃，pH值为7.5；时间为6h。

胃蛋白酶能够将蛋白质分解，其主要作用部位是芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)或酸性氨基酸(如亮氨酸)所组成的肽键。本发明采用的胃蛋白酶的酶活力为1:3000。

胰蛋白酶示肽链内切酶，能够把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。本发明采用的胰蛋白酶的酶活力为1:12000。

本发明中，酶解前的猪脑经过清洗，并去除结缔组织，然后低温匀浆破碎。所述低温匀浆破碎的温度为0℃～8℃。

过滤的孔径为300目；所述超滤的孔径为10kDa。

过滤采用无纺布，其孔径为300目，过滤后取滤液，弃除残渣。

超滤采用超滤膜，孔径为10kDa，过滤后取滤液，弃除残渣。

经过过滤和超滤后，所得滤液经过浓缩，以方便进行冻干。所述浓缩采用纳滤，纳滤膜截留分子量不低于200Da，压力为0.8MPa。

纳滤不仅能够将提取物体积浓缩，并且能够去除其中的小分子物质，如无机盐、葡萄糖、蔗糖等。通常，被去除的物质分子量不超过200Da。本发明中，纳滤的次数为3次。

猪脑提取物的分子量不超过10kDa，也不低于200Da，主要成分为小分子多肽或游离氨基酸、脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等。

将浓缩所得的物质再经过过滤，然后进行冻干。

此次过滤的目的是除去细菌及潜在的衣原体、支原体等小分子病毒，孔径为0.22μm。

冻干的程序为：

-50℃～-35℃常压冷冻2h～4h后，

使真空度低于20Pa，

然后-20℃冷冻3～8小时、0℃保持6～10小时，再15℃～25℃保持2h～4h。

冻干之后，将所得产物粉碎，即为猪脑提取物。

写一些实施例中，冻干的程序为：

-40℃常压冷冻3h后，

使真空度低于20Pa，

然后-20℃冷冻5小时、0℃保持8小时，再20℃保持3h。

冻干之后，将所得产物粉碎，即为猪脑提取物。

所述粉碎至粒径为80目～100目。

本发明提供的制备方法制备的猪脑提取物。

本发明提供的猪脑提取方法采用低温匀浆，工具酶提取，低分子量超滤相结合的方法，提取小分子多肽类活性物质，方法简便，不涉及过多化学试剂，安全有效，且保证了产品有效成分不被破坏。

本发明还提供了一种组合物，包括本发明提供方法制备的猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉；其中，猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉的质量比为(2～10)：(5～15)：(5～15)。

一些实施例中，猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉的质量比为2:5:5。

一些实施例中，猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉的质量比为5:2:2。

一些实施例中，猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉的质量比为2:3:3。

猪脑提取物能刺激神经元的能量代谢，改善大脑的血液供应，促进有氧代谢，并使葡萄糖更容易通过血-脑脊液屏障，还能降低脑内乳酸浓度，提高警觉程度、注意力、记忆力等，主要用于脑血管疾病引起的脑细胞及功能损伤。

γ-氨基丁酸(GABA)又名4-氨基丁酸(4-aminobutyricaeid,4-AB，γ-氨酪酸,白色或近白色结晶性粉末，分子式为C4H9N02,相对分子量103.2,熔点(mp)203℃-205℃(分解)。GABA能够降低血压，调节脑血管，促进乙酞胆碱合成,使脑细胞活动旺盛,促进脑组织新陈代谢和恢复脑细胞功能；调节心律失常、治疗癫痫，改善脂质代谢、防止动脉硬化、防止皮肤老化、调节激素分泌等功能；减轻慢性疾病如关节炎疼痛；另外其具有类似于谷氨酸甜味,能够增强食品风味,以及在胃酸分泌的中枢调节中起重要作用。γ-氨基丁酸通常由以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成。本发明对γ-氨基丁酸的获取方式不做限定，凡以γ-氨基丁酸为原料制备本发明所述组合物的实施皆在本发明的保护范围之内。本发明使用的γ-氨基丁酸购自浙江益万生物技术有限公司。

亚麻籽油粉是以亚麻籽油为原料，经微囊包埋技术制成的亚麻籽油微囊粉，富含W-3系多不饱和脂肪酸——“α-亚麻酸”。ω-3系多不饱和脂肪酸是生命的核心物质，是维持人体进化、保持身体健康的人体必需脂肪酸，人体自身无法合成，只能从食物中摄取来满足身体需要。α-亚麻酸是ω-3系不饱和脂肪酸家族的“家长”，其在人体肝脏内、在去饱和酶和延长酶的作用下，能够转化成为人体必需的生命活性因子——EPA(二十碳五烯酸，俗称血管清道夫)和DHA(二十二碳六烯酸，俗称脑黄金)。亚麻籽油富含ω-3系多不饱和脂肪酸——“α-亚麻酸”。世界科学家对α-亚麻酸历经50余年的研究发现，α-亚麻酸对提高大脑细胞功能、提高记忆力、预防老年痴呆症、预防心脑血管疾病、癌症、糖尿病等具有显著效果。本发明对亚麻籽油粉的获取方式不做限定，凡以亚麻籽油粉为原料制备本发明所述组合物的实施皆在本发明的保护范围之内。本发明使用的亚麻籽油粉购自淳安天龙生物科技有限公司。

本发明将猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉进行复配，所得组合物经试验表明，能够具有健脑益智的作用。

实验表明，以本发明提供的组合物能够显著减少跳台小鼠的错误次数。

本发明提供的组合物在制备健脑益智的产品中的应用。

一种保健品，其包括本发明提供的组合物和保健品中可接受的辅料。

本发明提供的保健品中，所述组合物的质量分数为1％～80％。

作为优选，该保健品的剂型为口服液剂。

口服液中，本发明提供的组合物的质量分数为1％～5％。

作为优选，口服液中辅料为木糖醇和水。

其中，木糖醇的质量分数为2％～5％。

一些实施例中，每升口服液中包括：

口服液以木糖醇为辅料，能够提高适口性，掩盖猪脑提取物的不良气味，使其口感舒适，甜而不腻。

本发明提供了一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用。本发明提供的猪脑提取物的分子量不超过10kDa，也不低于200Da，主要成分为小分子多肽或游离氨基酸、脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等。本发明将猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉进行复配，所得组合物经试验表明，能够具有健脑益智的作用。

具体实施方式

本发明提供了一种猪脑提取物、含有该猪脑提取物的组合物及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的材料和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1猪脑提取物的制备

取健康猪脑，清洗、去除结缔组织后，冷冻匀浆。

每1000g匀浆，加入2g胃蛋白酶，调节pH值为1.8，40℃酶解6h；然后加入2g胰蛋白酶调节pH值为7.5，40℃酶解6h。

酶解后匀浆经过300目无纺布过滤弃除残渣，然后经过10kDa的滤膜超滤弃除残渣。

超滤获得的滤液，经过纳滤机纳滤3遍(压力0.8MPa)；

所得滤液经过过滤后，冻干。

冻干程序为-50℃℃冷冻2小时后，开启真空泵。当真空度低于20Pa后，使冻品温度上升至-20℃，恒温3小时，继续对冻品加温至0℃左右，恒温6小时，再加热至15℃℃以后恒温2小时。

冻干后的产品经粉碎，制得猪脑提取物47.8g，多肽含量25.7％。

实施例2猪脑提取物的制备

取健康猪脑，清洗、去除结缔组织后，冷冻匀浆。

每1000g匀浆，加入1g胃蛋白酶，调节pH值为1.6，42℃酶解7h；然后加入5g胰蛋白酶调节pH值为7.3，42℃酶解5h。

超滤获得的滤液，经过纳滤机纳滤3遍(压力0.8MPa)；

所得滤液经过过滤后，冻干。

冻干程序为-35℃冷冻4小时后，开启真空泵。当真空度低于20Pa后，使冻品温度上升至-20℃，恒温8小时，继续对冻品加温至0℃左右，恒温10小时，再加热至25℃℃以后恒温4小时。

冻干后的产品经粉碎，制得猪脑提取物55.3g，多肽含量27.8％。

实施例3猪脑提取物的制备

取健康猪脑，清洗、去除结缔组织后，冷冻匀浆。

每1000g匀浆，加入5g胃蛋白酶，调节pH值为2.0，38℃酶解5h；然后加入1g胰蛋白酶调节pH值为7.7，38℃酶解7h。

超滤获得的滤液，经过纳滤机纳滤3遍(压力0.8MPa)；

所得滤液经过过滤后，冻干。

冻干程序为-43℃冷冻3小时后，开启真空泵。当真空度低于20Pa后，使冻品温度上升至-20℃，恒温5.5小时，继续对冻品加温至0℃左右，恒温8小时，再加热至20℃℃以后恒温3小时。

冻干后的产品经粉碎，制得猪脑提取物51.6g，多肽含量26.4％。

实施例4～6组合物的制备

按表1处方制备组合物：

表1实施例4～6

	猪脑提取物	γ-氨基丁酸	亚麻籽油粉
				实施例4	2g(实施例1)	5g	5g
实施例5	5g(实施例2)	10g	10g
				实施例6	10g(实施例3)	15g	15g

按照表1处方，将各组分粉碎后，混合，制得组合物。

对比例1～2组合物的制备

按表2处方制备组合物：

表2对比例1～2

	猪脑提取物	γ-氨基丁酸	亚麻籽油粉
				对比例1	10g(实施例1)	15g	--
对比例2	10g(实施例1)	--	15g

按照表2处方，将各组分粉碎后，混合，制得组合物。

实施例7

对实施例4～6和对比例1～2的组合物的总氮含量、γ-氨基丁酸的标示含量进行检测。

γ-氨基丁酸含量检测方法

试剂(1)标准溶液制备准确称取0.05gγ-氨基丁酸标准品(准确至0.0001g)，用水溶解定容至100mL，用0.22um滤膜过滤，收集滤液，作为标准溶液。

(2)样品溶液制备准确称取0.05g-0.25g样品(准确至0.0001g)，用水溶解定容至100mL，经超声波溶解后，用0.22um滤膜过滤，收集滤液，作为待测样品溶液。

(3)0.4mol/L硼酸缓冲液制备准确称取2.47g硼酸(准确至0.0001g)，加水约80mL，用NaOH将PH调至10.2，用水定容至100mL。

(4)衍生试剂制备称取0.1g领苯二醛(OPA)，用1mL乙腈溶解，加130uL巯基乙醇，用0.4mol/L硼酸缓冲液定容至10mL。

(5)柱前衍生化精密量取规定体积样品溶液及5.0uL衍生试剂，混合反应约2min后进样。

色谱条件(1)流动相

A相：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000mL；然后加入220uL三乙胺，搅拌并滴加5％的醋酸调PH至7.20±0.02；最后加入5mL四氢呋喃，混合后过滤，备用。

B相：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解定容至1000mL；然后滴加2％的醋酸将PH调至7.2±0.02，再按乙酸钠溶液：乙腈：甲醇＝1:2:2(体积比)混合后过滤，备用。

梯度洗脱程序见表3。

表3洗脱梯度

时间/min	A/％	B/％	流速/(mL/min)
				0	92	8	1.0
20	60	40	1.0
				24	0	100	1.5
24.5	0	100	1.5
				26.5	100	0	1.0
28	92	8	1.0

(2)柱温：40℃。

(3)流速：1.0mL/min。

(4)检测波长：338nm。

标准曲线分别准确吸取标准溶液(0.5mg/mL)2uL、4uL、5uL、10uL、12uL，按衍生试剂制备和柱前衍生化进行色谱分析，以峰面积-标准溶液的进样量作图，绘制标准曲线和回归方程，线性相关系数R应为0.9990以上。

试样测定取已制备好的试样按照衍生试剂制备方法进行测定。记录色谱峰的保留时间和峰面积，试样和标准溶液的衍生化处理至进样的时间应保持一致。根据色谱峰的峰面积，以外标法计算出相应的γ-氨基丁酸的浓度。样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围之内。

分析结果计算样品中γ-氨基丁酸的含量按一下公式计算：

X_{1} = \frac{A_{i} \times m_{s} / V_{s}}{A_{s} \times m / V} \times 100 %

式中：X₁示样品中γ-氨基丁酸的含量，％；

A_i示样品中γ-氨基丁酸的峰面积；

m_s示γ-氨基丁酸标准品的质量，单位为克(g)；

V_s示γ-氨基丁酸标准品的稀释体积，单位为毫升(mL)；

A_s示γ-氨基丁酸标准品的峰面积；

m示称取样品的质量，单位为克(g)；

V示样品的稀释体积，单位为毫升(mL)。

计算结果保留小数点后两位有效数字。

实验结果如表4：

表4：产品主要指标情况

	总氮标示含量％	γ-氨基丁酸标示含量％
			实施例4	108.3	103.1
实施例5	110.2	102.9
			实施例6	106.7	104.5
对比例1	105.3	104.6
			对比例2	104.5	/
猪脑提取物(25g)	162.5	/

结果表明，实施例4～6制得产品的总氮标示含量和γ氨基丁酸的标示含量高于对比例。

实施例8

1、实验方案

健康雄性SPF级ICR小鼠70只，体重18±2g，按体重平均分为5组，每组14只，分笼饲养。实验组设置和给药方案见表2。各组小鼠连续灌胃给药35天后，进行小鼠跳台实验。

表5药效协同实验给药方案

分组	给药量
		空白对照组(NC)	--
猪脑提取物	55mg/kg/d
		实施例6	55mg/kg/d
对比例1	55mg/kg/d
		对比例2	55mg/kg/d

注：空白对照组给予等量生理盐水。

2、跳台实验

实验共2d，第1天为学习阶段，第2天为测试阶段，学习阶段将小鼠放入DT-200小鼠跳台测试箱内适应环境3min，通32V交流电，记录5min内跳下平台的错误次数作为学习成绩，24h后进行重复跳台实验，记录潜伏期和错误次数，作为小鼠测试成绩。

3、实验结果

猪脑提取物、实施例6和对比例1组第1天错误次数无明显差异，实施例6和对比例1组第2天潜伏期延长(P＜0.05)，错误次数明显减少(P＜0.05)。

表6猪脑酶解物对各组小鼠记忆巩固能力的影响(n＝14)

组别	第1天错误次数	第2天潜伏期	第2天错误次数
				NC	4.58±2.39	46.79±29.53	3.47±1.28
猪脑提取物	4.35±2.27	89.63±76.05	2.72±1.59
				实施例6	4.67±1.38	142.54±102.31	1.45±1.08
对比例1	4.59±2.08	134.72±87.03	2.64±1.78
				对比例2	4.38±2.32	99.87±86.53	2.69±1.98

本发明提供的组合物进行上述动物试验后结果显示能够显著提高记忆力，且其效果显著优于对比例1～2(P<0.05)，并显著优于猪脑提取物(P<0.05)；发明提供的组合物产生了协同作用。本发明实施例4～5制备的组合物的实验效果与实施例6的效果相似。

根据黄继汉等人(药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算。中国临床药理学与治疗学，2004；9(9)：1069-1072.)报道的方法，小鼠等效剂量为成人的12.33倍，即成人用量为2～4 mg/kg(成人体重以50kg计)。

实施例9口服液的制备

按表7处方制备口服液，每1000mL口服液含有：

表7口服液

	组合物来源	木糖醇含量/g
			处方1	实施例4	20
处方2	实施例5	20
			处方3	实施例6	50
处方4	对比例1	50
			处方5	对比例2	50
处方6	对比例2	0

按照表5处方，将组合物粉碎后，溶解于纯化水，制得口服液。

口味评价试验

取处方1～6制得的营养液，由10名评审员进行官能评价，然后算出平均得分。评分标准：优4.1-5分，良好3.1-4分，中等2.1-3分，较差1.1-2，差0-1分。评分见下表。

对比1：按照处方2的方法，但是不添加木糖醇。

营养液评分表8：

表8营养液评分

结果表明，处方1～4的口服液口感较佳，最佳的为处方2的口服液。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种猪脑提取物的制备方法，其特征在于，将猪脑依次经胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，然后经过滤、超滤、浓缩、冻干，制得猪脑提取物；

所述胃蛋白酶与猪脑的质量比为(0.1～0.5)：100；酶解温度为38℃～42℃，pH值为1.6～2.0；时间为5h～7h；

所述胰蛋白酶与猪脑的质量比为(0.1～0.5)：100；酶解温度为38℃～42℃，pH值为7.3～7.7；时间为5h～7h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过滤的孔径为300目；所述超滤的孔径为10kDa。

3.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述浓缩采用纳滤，纳滤膜截留分子量不低于200Da，压力为0.8MPa。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的程序为：

-50℃～-35℃常压冷冻2h～4h后，

使真空度低于20Pa，

5.权利要求1～4任一项所述制备方法制备的猪脑提取物。

6.根据权利要求5所述的猪脑提取物，其特征在于，其分子量不大于10kDa，不小于200Da。

7.一种组合物，其特征在于，包括权利要求5或6所述的猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉；所述猪脑提取物、γ-氨基丁酸和亚麻籽油粉的质量比为(2～10)：(5～15)：(5～15)。

8.权利要求7所述的组合物在制备健脑益智的产品中的应用。

9.一种保健品，其特征在于，包括权利要求7所述的组合物和保健品中可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的保健品，其特征在于，权利要求7所述组合物的质量分数为1％～80％。