WO2023136573A1 - 돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023136573A1
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disease
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hydrolyzate
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신재준
김경민
김민주
황윤미
윤선명
김대은
양진욱
배근원
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유니메드제약주식회사
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving memory, cognitive ability, or preventing or treating cranial nerve disease, comprising a pig brain enzymatic hydrolyzate.
  • the brain has many functions, but the most important ones are memory and cognition. If a human does not have cognitive ability and memory ability, it is difficult to carry out daily life and becomes a problem in survival.
  • Memory and cognitive impairment is the first symptom experienced by people with Alzheimer's disease and is also the most common symptom.
  • patients suffer from recent memory impairment, which prevents them from remembering details of recent conversations or work. .
  • remote long-term memory for events in the distant past is relatively well maintained.
  • the cerebral cortex involved in the storage of long-term memories is damaged, and these memories of the past gradually become impaired.
  • dementia which is a cognitive disorder, which means that cognitive functions such as memory, language ability, time-space grasping ability and judgment, and abstract thinking ability are continuously and overall deteriorated due to brain function damage. In some cases, it can cause many problems in daily life.
  • Dementia is a kind of brain disease, and its causes are known to be caused by various causes, such as Alzheimer's disease and vascular dementia, as well as degenerative brain diseases such as Parkinson's disease, head trauma, and infectious diseases. Therefore, it can be said that efforts to treat and manage dementia disease, which is rapidly increasing along with the exponential increase in the elderly population, are urgently needed.
  • Dementia is caused by irreversible destruction of cranial nerves due to brain atrophy, reduction of nerve cells, and appearance of senile plaques, resulting in various acquired cognitive dysfunction symptoms such as memory, language disorders, and behavioral disorders. refers to a syndrome that Dementia is classified into degenerative diseases caused by Alzheimer's disease, vascular dementia and Parkinson's disease, metabolic diseases caused by hypothyroidism, and other dementias caused by brain tumors or infectious diseases.
  • acetylcholinesterase (AChE) inhibitors such as donepezil, galantamine, and rivastigmine are used clinically as drugs to improve dementia, but their treatment efficiency is low and side effects are severe. There is currently no effective treatment.
  • the present invention provides a pig brain enzymatic hydrolyzate containing a pig brain-derived peptide.
  • the present invention provides a food composition for improving memory, cognitive function, or preventing or improving cranial nerve disease, comprising a pig brain enzymatic hydrolyzate.
  • the present invention provides a health functional food composition for improving memory, improving cognitive function or preventing or improving brain nerve disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for improving memory, improving cognitive function or preventing or improving cranial nerve disease.
  • the present invention provides a pig brain enzymatic hydrolyzate containing at least one of the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the present invention provides a food composition or health functional food composition for improving memory, cognitive function, or preventing or improving cranial nerve disease, comprising a pig brain enzymatic hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for improving memory, improving cognitive function, or preventing or treating cranial nerve disease, comprising an enzymatic hydrolyzate of pig brain as an active ingredient.
  • the pig brain enzyme hydrolyzate may include a pig brain-derived peptide.
  • the pig brain enzyme hydrolyzate may be hydrolyzed by one or more hydrolysing agents.
  • composition may be formulated into a dosage form selected from the group consisting of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills.
  • the porcine brain enzymatic hydrolyzate may have nerve cell protection and/or brain-derived neurotrophic factor (BDNF) generating ability.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • the porcine brain enzyme hydrolyzate may have acetylcholinesterase inhibitory activity and/or reactive oxygen species (ROS) inhibitory activity.
  • ROS reactive oxygen species
  • the cranial nerve disease may be selected from the group consisting of Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, senile dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease, Lewy Body Dementia, Frontotemporal Dementia, cerebral infarction, stroke, and epilepsy. there is.
  • the present invention improves memory and cognitive function, including the step of administering or ingesting a composition containing as an active ingredient a composition containing at least one of the peptides composed of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and a pig brain enzyme hydrolyzate as an active ingredient
  • a method for improving or preventing or treating cranial nerve disease is provided.
  • composition comprising at least one of the peptides of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, as an active ingredient, improving memory, improving cognitive function, or preventing or treating cranial nerve disease.
  • the peptide according to the present invention or the enzymatic hydrolyzate of pig brain containing the same is excellent in improving memory, improving cognitive function, preventing or treating (or improving) brain nerve diseases, and does not exhibit toxicity, such as health functional food compositions, pharmaceutical compositions, etc. can be usefully used.
  • FIG. 1 is a process diagram schematically showing a manufacturing process of a pig brain enzymatic hydrolyzate according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the cytotoxicity evaluation results for the peptide according to an embodiment of the present invention.
  • 3a and 3b are graphs showing the neuroprotective ability of peptides according to an embodiment of the present invention (*, p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001).
  • 3c and 3d are graphs showing brain-derived neurotrophic factor (BDNF) generating ability of peptides according to an embodiment of the present invention (*, p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001) .
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • 3e is a graph showing beta-amyloid aggregation of a peptide (brPEP-1) according to an embodiment of the present invention.
  • 3f is a graph showing reactive oxygen species (ROS) of peptides according to an embodiment of the present invention (*, p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001).
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 4 is a graph showing the cytotoxicity evaluation results for the pig brain enzymatic hydrolysate according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the neuronal cell protective ability of the enzymatic hydrolyzate of pig brain according to an embodiment of the present invention (*, p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • Figure 7 shows the protein (Caspase-3, ChAT) expression characteristics of the pig brain enzymatic hydrolyzate according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 is a graph showing the acetylcholinesterase (acetylcholinesterase) inhibitory ability of the pig brain enzyme hydrolyzate according to an embodiment of the present invention (*, p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01).
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 10 is a graph showing the beta-aggregation inhibitory ability of a pig brain enzymatic hydrolyzate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows a schematic diagram of a passive avoidance test (a) and a result (b) of analyzing the memory improvement effect of a pig brain enzyme hydrolyzate through a passive avoidance test (different letters or subscripts on the bar graph are p ⁇ 0.05 means there is a significant difference between each other)
  • Figure 12 shows the Y maze test (Y maze test) schematic diagram (a) and the result (b) of analyzing the memory improvement effect of the pig brain enzyme hydrolyzate through the Y maze test (different letters or subscripts on the bar graph are p ⁇ 0.05 means there is a significant difference between each other).
  • FIG. 13 shows a schematic diagram of the Novel object test (a) and the result of analyzing the memory improvement effect of the pig brain enzymatic hydrolyzate (b) through the Novel object test (different letters or subscripts on the bar graph are different from each other at p ⁇ 0.05). means there is a significant difference).
  • Figure 14 shows the result of analyzing the memory improvement effect of the pig brain enzyme hydrolyzate through the Morris water-maze test (a) and the Morris water-maze test (a) (different letters on the bar graph) or the subscript means there is a significant difference between each other at p ⁇ 0.05).
  • the present invention provides a pig brain enzymatic hydrolyzate containing at least one of the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or the peptide consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the peptide may be used as a food composition or pharmaceutical composition.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.1 ppm to 300 ppm in the hydrolyzate of the pig brain enzyme. More preferably, it may be included in a concentration of 1 to 30 ppm.
  • the present invention provides a composition for improving memory, improving cognitive function, preventing or treating (or improving) neurological disorders, comprising a pig brain enzymatic hydrolyzate as an active ingredient.
  • the composition may be a food composition, health food composition, health functional food composition or pharmaceutical composition.
  • the pig brain enzyme hydrolyzate may include a pig brain-derived peptide.
  • the pig brain enzyme hydrolyzate may be hydrolyzed by one or more hydrolysing agents.
  • the hydrolyzate may be produced by primary hydrolysis and secondary hydrolysis.
  • the primary hydrolysis may be performed by adding a proteolytic enzyme to a solid solution (pork brain sludge solution), and at this time, it may be performed at 40 ⁇ 20 ° C. for 1 to 20 hours. However, it is not limited thereto.
  • the secondary hydrolysis may be performed by adding a proteolytic enzyme to the solid solution in which the primary hydrolysis was performed, and at this time, it may be performed at 40 ⁇ 20 ° C. for 1 to 20 hours. However, it is not limited thereto.
  • composition may be formulated into a dosage form selected from the group consisting of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills.
  • the porcine brain enzymatic hydrolyzate may have nerve cell protective ability and/or brain-derived neurotrophic factor (BDNF) generating ability, and also have acetylcholinesterase inhibitory activity and/or reactive oxygen species (ROS) inhibitory activity.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • ROS reactive oxygen species
  • the cranial nerve disease may be selected from the group consisting of Alzheimer's disease, mild cognitive impairment, senile dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease, Lewy Body Dementia, Frontotemporal Dementia, cerebral infarction, stroke, and epilepsy. there is.
  • Prevention in the present specification refers to all actions that delay memory decline or cognitive decline by administration of the composition of the present invention, and “treatment” and “improvement” mean memory decline or cognitive impairment by administration of the composition of the present invention. means any action that improves or beneficially changes the symptoms of
  • the term "health functional food” refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body.
  • 'functionality' means obtaining useful effects for health purposes, such as adjusting nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • the formulation of the health functional food may also be manufactured without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • the health functional food composition of the present invention has the advantage of not having side effects that may occur when taking liquid or powder formulations for a long time, and is excellent in portability, so that it is effective in preventing or improving alcohol-induced liver damage, drug addiction or hangover. It can be taken as a supplement for
  • the pig brain enzyme hydrolyzate may be included in an amount of 1% to 20% (% by weight) based on the total weight of the composition, but is not necessarily limited thereto, and the active ingredient
  • the mixing amount of can be appropriately determined according to each purpose of use such as prevention, health or treatment.
  • the formulation of the health functional food may be in the form of a powder, granule, pill, tablet, or capsule, as well as a general food or beverage form.
  • the type of food is not particularly limited, and examples of food to which the substance can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, and dairy products including ice cream. , various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., and may include all foods in a conventional sense.
  • the active ingredient in general, in the case of a liquid form when preparing food or beverage, may be added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on 100 parts by weight of the raw material.
  • the amount in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since the present invention uses fractions from natural products, there is no problem in terms of safety, so the above range The above amount can also be used.
  • beverages may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the beverage according to the present invention.
  • the health functional food composition according to the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, It may contain glycerin, alcohol, and carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not limited, but is generally selected from the range of 0.01 to 0.1 parts by weight based on 100 parts by weight of the functional food composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in content as long as it contains the active ingredient, but preferably, the pig brain enzymatic hydrolyzate may be included in an amount of 5 to 30% by weight based on the total weight of the composition. However, it is not limited thereto. At this time, if the active ingredient is less than the above concentration range, there is a problem that it is difficult to exert a desirable preventive or therapeutic effect, and if it exceeds the above concentration range, the change in the expected effect may be insignificant.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated according to conventional methods into oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions may be included.
  • carrier or excipient or diluent examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, undecided various compounds or mixtures including vaginal cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • a solid preparation for oral administration may be prepared by mixing the jasmon with at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. .
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, water-insoluble agents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspensions.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol gelatin, and the like can be used.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition, body weight, disease severity, drug type, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the amount of the active ingredient included in the composition of the present invention is generally 0.0001 to 2,000 mg/kg per day, preferably 0.001 to 2,000 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several times. However, the scope of the present invention is not limited by the dosage.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. All modes of administration can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • Example 1 Porcine brain enzymatic hydrolyzate preparation
  • the blood is removed from the pig brain by removing foreign substances with constant water.
  • the blood-removed pig brain is shredded using a blender to facilitate degreasing.
  • the shredded pig brain is degreased using alcohol (ethanol, isopropyl alcohol, etc.) to remove fat and foreign substances.
  • Add proteolytic enzyme (pepsin) to the degreased pig brain and perform the first enzymatic hydrolysis for 1 to 20 hours. After the first enzymatic hydrolysis is completed, filtration is performed for solid-liquid separation.
  • a proteolytic enzyme pancreatin
  • pancreatin pancreatin
  • the proteolytic enzyme is inactivated by heating, and the pig brain enzymatic hydrolyzate is contacted with a filter aid and filtered to adsorb and purify.
  • 1 to 5 times (w/w) alcohol ethanol
  • ethanol ethanol
  • the pig brain enzymatic hydrolyzate obtained in Example 1 was diluted 1/2 by adding 100 ⁇ l of D.W. to 100 ⁇ l of the sample. 950 ⁇ l of D.W was added to 50 ⁇ l of the diluted solution, diluted 1/20, and the solution filtered with a syringe filter was analyzed by ms/ms ionization analysis by HPLC system of ACQUITY UPLC I-Class PLUS (Waters) and Xevo TQ-XS (Waters) MS system It was sequenced through.
  • Peptide sequence of indicator component of pig brain enzyme hydrolysate No. m/z RT (min) Charge Sequence Content in hydrolyzate (ppm) brPEP-1 403.22 7.6
  • PSIS SEQ ID NO: 1 5-30 ppm brPEP-2 418.72 8.4 2
  • GPAGPQGPR SEQ ID NO: 2
  • a peptide having the same mass and ms/ms ionization form as the peptide identified from the pig brain hydrolysate was synthesized from Anygen (www.anygen.com) to confirm that the pig brain enzyme was consistent with the peptide present in the hydrolyzate, and then experiment was conducted.
  • SH-SY5Y cells a human neural cell line, were purchased from the Korea Cell Line Bank (Cat No. 22266) and used, and Roswell containing 10% Fetal bovine serum (FBS, Cytiba), 100 IU/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin.
  • FBS Fetal bovine serum
  • Cytiba Fetal bovine serum
  • penicillin 100 IU/ml
  • streptomycin 100 IU/ml
  • streptomycin 100 IU/ml
  • RPMI 1640 Park Memorial Institute
  • both the peptides brPEP-1 and brPEP-2 selected as marker components were 93.05% ⁇ 2.23% and 108.47% ⁇ 5.20% at 40ug/mL (w/v), respectively.
  • the cell viability was over 90%, and it was confirmed that there was no problem with safety against cytotoxicity (FIG. 2).
  • human neuronal cell lines were used to confirm the cell protective ability against neuronal cell death caused by beta-amyloid treatment at a non-toxic concentration or less. did
  • SH-SY5Y was treated with beta-amyloid, which is a major pathological feature of Alzheimer's disease, and toxic to induce neuronal cell death.
  • human neuroblastoma SH-SY5Y cells were dispensed and cultured in a 24 well plate to be 1X10 5 /well. Thereafter, two kinds of peptides according to an embodiment of the present invention (peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) were pretreated and cultured for 24 hours at each concentration, and then beta-amyloid was treated at a concentration of 40uM in each well and further cultured for 24 hours.
  • BDNF is a brain-derived neurotrophic factor and is a brain-derived neurotrophic factor.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were placed in a 75T flask to confirm the memory improvement function of the sample by confirming the ability to produce BDNF, a protein involved in the signal transduction system of metabolic processes that affect cognitive function (memory, thinking ability).
  • seeding was performed on a 6-well cell culture plate at 2*10 ⁇ 5. After one week of cultivation in a 37°C, 5% CO 2 humidity chamber, the pig brain enzyme hydrolyzate (PBEH) according to an embodiment of the present invention was treated by concentration.
  • PBEH pig brain enzyme hydrolyzate
  • cell lysate was obtained and BDNF was measured using Bosterbio's BDNF KIT (#EK0307). Thereafter, cell number correction was performed by protein assay and corrected by protein content.
  • Thioflavin T Assays were performed to determine how much brPEP-1 according to an embodiment of the present invention can inhibit beta-amyloid aggregation.
  • Thioflavin T shows fluorescence in response to beta-amyloid. After culturing SH-SY5Y cells, each treatment with brPEP-1, 24 hours later, treatment with beta-amyloid 20uM for 24 hours, washing with PBS (pH 7.4) and treatment with Thioflabin T 5uM 1mL before cell harvesting. After that, it was measured at 450 nm excitation and 482 nm emission wavelengths using an ELISA reader (TECAN, Infinite M200 pro).
  • brPEP-1 showed beta-amyloid aggregation inhibition by about 62% after 18 hours at 0.002ug/ml, and this is the concentration present in total nitrogen of 25ug/ml of the pig brain enzyme hydrolyzate of this raw material, and this raw material is about 65 after 18 hours. It was confirmed that the beta-amyloid aggregation inhibitory ability was similar at the % level (FIG. 3e).
  • DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate). DCF-DA is converted to DCF within cells by reactive oxygen species and emits fluorescence.
  • SH-SY5Y cells were cultured, treated with brPEP-1 and brPEP-2 according to an embodiment of the present invention, and 24 hours later, treated with H 2 O 2 100uM for 24 hours
  • brPEP-1 and brPEP-2 showed 24% and 17% inhibitory activity at 2ug/ml, respectively, and it was confirmed that the concentration was significantly effective (FIG. 3f).
  • the memory improvement effect was analyzed using the pig brain enzymatic hydrolyzate prepared in Example 1 (including the peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2).
  • the content of the peptides in the hydrolyzate of the pig brain enzyme is 5 to 30 ppm, respectively.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were purchased from the Korea Cell Line Bank (Cat No. 22266) and used, and Roswell containing 10% Fetal bovine serum (FBS, Cytiba), 100 IU/ml penicillin, and 100 ⁇ g/ml streptomycin. Using Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (RPMI 1640, Cytiba) medium, 5% CO 2 , the experiment was conducted by culturing in an incubator at 37 ° C.
  • pig brain enzymatic hydrolysate PBEH
  • MTT methylthiazol tetrazolium bromide
  • SH-SY5Y was treated with beta-amyloid, which is a major pathological feature of Alzheimer's disease, and toxic to induce neuronal cell death.
  • human neuroblastoma SH-SY5Y cells were dispensed and cultured in a 24 well plate to be 1X10 5 /well. Thereafter, the pig brain enzymatic hydrolyzate (PBEH) according to the embodiment of the present invention was treated and cultured for 24 hours prior to each concentration, and then beta-amyloid was treated at a concentration of 40uM in each well and further cultured for 24 hours.
  • PBEH pig brain enzymatic hydrolyzate
  • the pig brain enzymatic hydrolyzate (PBEH) according to the embodiment of the present invention exhibited 25% and 52% of neuroprotective ability at 25ug/ml and 50ug/ml of total nitrogen (FIG. 5).
  • BDNF is a brain-derived neurotrophic factor and is a brain-derived neurotrophic factor.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were placed in a 75T flask to confirm the memory improvement function of the sample by confirming the ability to produce BDNF, a protein involved in the signal transduction system of metabolic processes that affect cognitive function (memory, thinking ability).
  • seeding was performed on a 6-well cell culture plate at 2*10 ⁇ 5. After one week of cultivation in a 37°C, 5% CO 2 humidity chamber, the pig brain enzyme hydrolyzate (PBEH) according to an embodiment of the present invention was treated by concentration.
  • PBEH pig brain enzyme hydrolyzate
  • cell lysate was obtained and BDNF was measured using Bosterbio's BDNF KIT (#EK0307). Thereafter, the cell number was corrected by protein content by performing protein assay.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Bio-Rad, USA a polyvinylidene difluoride membrane
  • blocking buffer 5% skim milk
  • Antibodies against Caspase-3, ChAT and GAPDH were diluted 1:1,000 in Tris-buffered saline (TBS-T) containing 0.1% (v/v) tween-20 and reacted with polyvinylidene difluoride overnight at 4°C.
  • TBS-T Tris-buffered saline
  • the secondary antibody anti-rabbit IgG conjugated HRP for each antibody was diluted with TBS-T (1:2,000), reacted at room temperature for 2 hours, and then developed using the ECL kit (Bio-Rad, USA).
  • Acetylcholinesterase AChE
  • ADChE Acetylcholinesterase
  • pig brain enzymatic hydrolyzate (PBEH) exhibited inhibitory activity of about 23% and 26% at 25 and 50ug/ml of total nitrogen, whereas at 100ug/ml of ginkgo leaf extract, it was inhibited by about 21% in a concentration-dependent manner. It was confirmed that (Fig. 8).
  • ROS reactive oxygen species
  • DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate). DCF-DA is converted to DCF within cells by reactive oxygen species and emits fluorescence.
  • pig brain enzymatic hydrolyzate (PBEH) according to an embodiment of the present invention and ginkgo biloba extract currently registered as individually recognized raw materials are treated, After 24 hours, treatment with 100uM H 2 O 2 for 24 hours, treatment with 20 ⁇ M DCF-DA before cell harvesting, incubation at 37°C for 30 minutes, washing with PBS (pH 7.4) and 1% Triton X-100 After dissolving the cells by treating the cells, they were measured at 480 nm excitation and 530 nm emission wavelengths using an ELISA reader (TECAN, Infinite M200 pro).
  • PBEH pig brain enzymatic hydrolyzate
  • Porcine brain enzyme hydrolyzate (PBEH) showed 43% and 60% of inhibitory activity at 25 and 50ug/ml of total nitrogen, respectively, and it was confirmed that the concentration was significantly effective. Results similar to total nitrogen of 25ug/ml of brain enzyme hydrolysate were confirmed (FIG. 9).
  • Thioflavin T Assays to determine how much the pig brain enzymatic hydrolyzate and the ginkgo biloba extract currently registered as an individually approved raw material according to an embodiment of the present invention can inhibit the aggregation of beta-amyloid was performed.
  • Thioflavin T shows fluorescence in response to beta-amyloid.
  • Pig brain enzymatic hydrolyzate showed about 66% of beta-amyloid aggregation inhibition at 25ug/ml of total nitrogen, and ginkgo biloba leaf extract, a raw material registered as an individually approved type, showed about 46% of beta-amyloid at 100ug/ml. It was confirmed to exhibit an aggregation inhibitory ability (FIG. 10).
  • the passive avoidance test measures the time it takes to move to the dark room when the white paper is placed in the light room.
  • the first and second tests are conducted at 8-hour intervals, and when the white paper moves to the dark room, electrical stimulation is applied to the dark room. After learning that they should not move, the time required to proceed from the light room to the dark room was measured after 16 hours.
  • the High-PBEH group had a long migration time similar to the normal group (in FIG. 11B, in order from the left, MD-control, Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control).
  • the latency time of the normal group was longer than that of the induced group. It was confirmed that memory improved with delay.
  • the Y maze test is a spontaneous alternation and recognition memory test for spatial learning and memory research, and is sensitive to hippocampal damage, genetic manipulation, and amnestics, so memory function can be tested.
  • the Y-maze test is a method for evaluating instantaneous spatial cognition in the form of short-term memory. After setting the three branches as A, B, and C, respectively, the white paper was carefully placed on one branch, allowed to move freely for 8 minutes, and the branches containing the white paper were recorded in order. 1 point (actual alternation) was given by counting the cases of entering each branch in turn. Alternation behavior was defined as non-overlapping entry into all three.
  • the normal number of rotations was less in the induced group than in the normal control group.
  • the normal rotation (%) of the total number of rotations was higher in the Medium-PBEH (0.159 ml/kg) and High-PBEH groups (0.478 ml/kg) than in the induced group (in Fig. 12b, MD in order from the left).
  • -control Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control).
  • Each white paper was placed in a plexiglass box on the first day of the test and allowed to explore novel objects for 5 minutes on the first day, 20 minutes on the second day, and 20 minutes on the third day.
  • the box was divided into four areas and two identical objects were placed in the center of the diagonal area. Place the rat next to the box and allow it to explore the object freely for 10 minutes, wash the object and equipment with 75% ethanol to remove the rat's odor, and after 1 hour, place one of two identical objects of the same size Replaced with similar object but different shape and color.
  • the induced group showed a lower degree of recognizing new objects than the normal group, and the positive control group showed similar values to the normal group.
  • the pig brain enzyme hydrolyzate intake group improved the degree of recognizing new objects in a concentration-dependent manner, and the High-PBEH group had the highest recognition rate, confirming that cognition improved (in Fig. 13b, MD-control, Positivel in order from the left). -control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control).
  • a Morris water maze test was performed (FIG. 14).
  • the underwater maze is used to study spatial memory and learning, putting the animal in the water and checking the time it takes to find a hidden escape platform.
  • the medium-PBEH (0.159 ml/kg) and high-PBEH (0.478ml/kg) intake group of pig brain enzyme hydrolysate showed a shorter time to first discover the platform compared to the induced group, and the pig brain enzyme hydrolyzate intake It was confirmed that the time the group stayed near the platform was longer than that of the normal group, and it can be seen that the hydrolyzate of the pig brain enzyme obtained in Example is effective for spatial memory (in FIG. 14b, MD-control, Positivel in order from the left) -control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control).
  • hippocampal tissue was analyzed in the following manner.
  • the hippocampus was divided into two parts, one part was lysed with RIPA buffer containing protease inhibitors and the other part was lysed with Trizol reagent (Invitrogen, Rockville, MD, USA) to extract total RNA.
  • the hippocampus RIPA buffered lysate was centrifuged at 5000 ⁇ g for 10 minutes, and lipid peroxidation (MDA) assay kit (Abcam, Cambridge, UK) and cholesterol kit (Abcam, Cambridge, UK) were used in the supernatant by colorimetric method. Peroxide and cholesterol contents were measured. Asan Pharm).
  • MDA lipid peroxidation
  • the supernatant was deproteinized with 1.5N perchloric acid, and the glycogen content was calculated from the glucose concentration derived from glycogen hydrolyzed by ⁇ -amyloglucosidase in acid buffer.
  • Glucose concentration was measured using a glucose kit (Asan Pharmaceutics, Seoul, Korea). Triglycerides were extracted from the hippocampus with a chloroform-methanol solution (2:1, v/v) and resuspended in pure chloroform. The neutral fat content of chloroform was measured using a neutral fat colorimetric kit (Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea).
  • Serum TNF- ⁇ and IL-1beta concentrations were measured using ELISA kits (eBioscience; San Diego, CA, USA), and serum concentrations of AST and ALT were measured using AST and ALT kits (Asan Pharmaceutics, Seoul, Korea). measured.
  • Cholesterol content in the hippocampal tissue was significantly higher in the induced group than in the normal group, and cholesterol content was lowered in the positive control group and the pig brain enzymatic hydrolysate intake group.
  • Glycogen content in hippocampal tissue was higher in the normal group than in the induced group, and the pig brain enzymatic hydrolysate intake was higher in the Low-PBEH (0.053 ml/kg) and Medium-PBEH (0.159 ml/kg) groups.
  • Peroxide content of hippocampal tissue was confirmed by MDA content.
  • MDA content Peroxide content of hippocampal tissue was confirmed by MDA content.
  • the effect was lowered as much as the normal control group.
  • TNF- ⁇ an inflammatory cytokine
  • Hippocampal triglycerides (mg/g) 47.5 ⁇ 3.10 47.1 ⁇ 1.75 47.4 ⁇ 4.36 44.7 ⁇ 3.66 46.2 ⁇ 3.96 46.4 ⁇ 2.45 Hippocampal cholesterol (mg/g) 18.0 ⁇ 1.21a 15.0 ⁇ 1.43b 15.5 ⁇ 1.27b 13.6 ⁇ 0.76c 14.5 ⁇ 1.33bc 12.2 ⁇ 0.82 d Hippocampal glycogen (mg/g liver) 30.5 ⁇ 0.28b 31.5 ⁇ 0.33ab 30.9 ⁇ 0.36b 32.5 ⁇ 0.21a 32.3 ⁇ 0.42 a 32.7 ⁇ 0.38a Hippocampal lipid peroxides (MDA ⁇ mol/g tissue) 3.85 ⁇ 0.53 a 2.94 ⁇ 0.35b 3.35 ⁇ 0.54ab 2.91 ⁇ 0.47b 2.43 ⁇ 0.44 c 2.31 ⁇ 0.36c Hippocampal TNF-a contents (ng/g tissue) 4.08 ⁇ 0.26 a 3.

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Abstract

본 발명은 돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 신경세포 보호능, BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능, 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및 활성산소종 (ROS) 억제능을 나타낼 수 있다.

Description

돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 2022년 1월 11일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2022-0004195호 및 2022년 11월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2022-0143631호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
뇌가 가지는 기능은 여러 가지가 있지만, 가장 중요한 것은 기억 능력 및 인지능력이다. 인간에게 인지능력 및 기억 능력이 없는 경우, 일상생활을 수행하기 힘들고 생존에도 문제가 된다.
기억 인지장애는 알츠하이머 질환자들이 처음으로 겪는 증상이며 또한 가장 흔한 증상이다. 알츠하이머병의 초기에 환자들은 최근의 대화나 일의 내용을 자세하게 기억하지 못하는 최근 기억(recent memory) 장애를 겪게 되는데, 이는 해마의 신경세포가 손상되어 최근 기억을 저장하는 기능이 떨어진 데에서 기인한다. 하지만 이 시기에는 먼 과거에 있었던 사건들에 대한 과거 기억(remote long-term memory)은 상대적으로 잘 유지된다. 그러나 병이 점차 진행됨에 따라 장기기억의 저장과 관련된 대뇌피질이 손상되면서 이러한 과거의 기억도 점차 장애를 보이게 된다.
한편 노인성 질병 중에서도 가장 문제가 되고 있는 것은 인지장애인 치매(dementia)는 뇌기능이 손상되어 기억력, 언어능력, 시공간 파악능력 및 판단력, 그리고 추상적 사고력 등의 인지기능이 지속적이고 전반적으로 떨어지는 것을 의미하여 심한 경우에는 일상생활에 많은 지장이 나타나게 된다. 치매는 일종의 뇌질환으로 그 원인으로서는 알츠하이머병과 혈관성 치매뿐만 아니라 파킨슨병 등의 퇴행성 뇌질환들과 두부외상, 감염성 질환 등 다양한 원인들에 의해 발생되는 것으로 알려져 있다. 따라서 노인인구의 기하급수적 증가와 더불어 급증하고 있는 치매질환을 치료하고 관리하기 위한 노력이 절실하다고 할 수 있다. 치매(dementia)는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력과 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다. 치매는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 혈관성 치매 및 파킨슨 질환에 의한 퇴행성 질환, 갑상선 기능 감소증에 의한 대사성 질환, 뇌종양 또는 감염성 질환 등에 기인하는 기타 치매로 분류된다. 현재 치매 개선 약물로서는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE)의 저해제인 도네피질(donepezil), 갈란타민(galantamine) 및 리바스티크민(rivastigmine) 등이 임상에서 사용되고 있으나 치료효율이 낮고 부작용이 심하여 효과적인 치료제가 없는 실정이다.
본 발명은 돼지뇌 유래 펩타이드를 포함하는 돼지뇌 효소가수분해물을 제공한다.
본 발명은 돼지뇌 효소가수분해물을 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 제공한다.
본 발명은 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 돼지뇌 유래 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 하나 이상의 가수분해제에 의해 가수분해된 것일 수 있다.
상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 신경세포 보호능 및/또는 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 가질 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및/또는 활성산소종 (ROS) 억제능을 가질 수 있다.
상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여 또는 복용시키는 단계를 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 돼지뇌 효소가수분해물은 기억력 개선, 인지기능 개선, 뇌신경질환 예방 또는 치료(또는 개선) 효과가 우수하며, 독성을 나타내지 않는 바 건강기능식품 조성물, 약학적 조성물 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 제조 공정을 개략적으로 나타내는 공정도다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드에 대한 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 신경세포보호능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01; ***, p <0.001).
도 3c 및 도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01; ***, p <0.001).
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 (brPEP-1)의 beta-amyloid aggregation을 나타내는 그래프이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 ROS (Reactive Oxygen Species)를 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01; ***, p <0.001).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물에 대한 세포독성평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 신경세포보호능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01; ***, p <0.001).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 BDNF (brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05 ; ** p <0.01; ***, p <0.001).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 단백질(Caspase-3, ChAT) 발현 특성을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 활성산소종 (ROS, reactive oxygen species) 억제능을 나타내는 그래프이다 (*, p <0.05; ** p <0.01).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물의 Beta-aggregation 억제능을 나타내는 그래프이다.
도 11은 수동회피실험 (passive avoidance test) 모식도 (a) 및 수동회피실험을 통해 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력 개선효과를 분석한 결과(b)를 나타내는 것이다 (막대그래프 위 상이한 문자 또는 첨자는 p < 0.05에서 서로 간에 유의적인 차이가 있다는 것을 의미함)
도 12는 Y 미로 테스트 (Y maze test) 모식도 (a) 및 Y 미로 테스트을 통해 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력 개선효과를 분석한 결과(b)를 나타내는 것이다 (막대그래프 위 상이한 문자 또는 첨자는 p < 0.05에서 서로 간에 유의적인 차이가 있다는 것을 의미함).
도 13은 Novel object test 모식도 (a) 및 Novel object test를 통해 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력 개선효과를 분석한 결과(b)를 나타내는 것이다 (막대그래프 위 상이한 문자 또는 첨자는 p < 0.05에서 서로 간에 유의적인 차이가 있다는 것을 의미함).
도 14는 Morris 수중 미로 테스트 (Morris water-maze test) 모식도 (a) 및 Morris 수중 미로 테스트를 통해 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력 개선효과를 분석한 결과(b)를 나타내는 것이다 (막대그래프 위 상이한 문자 또는 첨자는 p < 0.05에서 서로 간에 유의적인 차이가 있다는 것을 의미함).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 제공한다.
상기 펩타이드는 식품 조성물 또는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 펩타이드는 돼지뇌 효소가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 300 ppm의 농도로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 1 ~ 30 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은, 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선, 뇌신경질환 예방 또는 치료용 (또는 개선용) 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 식품 조성물, 건강식품 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 돼지뇌 유래 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 하나 이상의 가수분해제에 의해 가수분해된 것일 수 있다.
더욱 바람직하게, 상기 가수분해물은 1차 가수분해 및 2차 가수분해에 의해 생성될 수 있다.
상기 1차 가수분해는 단백질분해효소를 고형물 용해액 (돼지뇌 슬러지 용해액)에 투입하여 수행할 수 있으며, 이때 1~20시간 동안 40±20℃에서 수행할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 2차 가수분해는, 1차 가수분해를 수행한 고형물 용해액에 단백질분해효소를 투입하여 수행할 수 있으며, 이때 1~20시간 동안 40±20℃에서 수행할 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 돼지뇌 효소가수분해물은 신경세포 보호능 및/또는 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 가질 수 있으며, 또한 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및/또는 활성산소종 (ROS) 억제능을 가질 수 있다.
상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서 내 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 기억력 저하 또는 인지능력 저하를 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 기억력 저하 또는 인지능력 장애의 증세가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 액상, 분말 제형 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 알코올로 인한 간손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 돼지뇌 효소가수분해물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 1 % ~ 20 % (중량 %)로 포함될 수 있으나, 이에 반드시 한정되는 것은 아니고, 유효성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 액상의 경우, 상기 유효성분은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 기능성식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게 상기 돼지뇌 효소가수분해물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 5 ~ 30 중량 %로 포함될 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다. 이때, 유효성분이 상기 농도 범위 미만인 경우, 바람직한 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 기대하는 효과의 변화가 미미할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 자스몬에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 일반적으로 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 돼지뇌 효소가수분해물에 대한 단기기억 행동실험(Y 미로실험, 수동회피실험, 신물질탐색시험)에서 농도 의존적으로 단기 기억력이 회복되는 것으로 확인되었다 (Y 미로실험: 공간인지능력을 확인하는 행동시험, 수동회피실험: 자극에 대해 기억하고 회피하는 행동을 확인할 수 있는 행동시험, 신물질탐색시험: 새로운 물질을 탐색하는 인지하는 행동을 보는 행동시험).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실시예 1. 돼지뇌 효소가수분해물 제조
돼지뇌를 해빙기에서 해동한 후 상수로 이물을 제거한 돼지뇌를 탈혈한다. 혈액을 제거시킨 돼지뇌를 믹서기를 이용하여 탈지가 용이하도록 파쇄한다. 파쇄된 돼지뇌를 지방 및 이물질 제거를 위해 주정 (에탄올, 이소프로필알코올 등)을 이용하여 탈지한다. 탈지가 완료된 돼지뇌에 단백질분해효소(펩신)를 넣고 1 ~ 20 시간 동안 1차 효소가수분해를 한다. 1차 효소가수분해가 완료된 후 고액분리를 위해 여과를 진행한다. 여과 완료 후 돼지뇌 1차 가수분해물에 단백질분해효소(판크레아틴)를 넣고 1 ~ 20 시간 동안 2차 효소가수분해를 한다. 2차 효소가수분해가 완료된 후 가열하여 단백질분해효소를 불활성화시키고, 상기 돼지뇌 효소가수분해물을 여과보조제에 접촉시킨 뒤 여과하여 흡착 정제한다. 이후 돼지뇌 가수분해물 여과액에 1 ~ 5배(w/w) 주정 (에탄올)을 넣어 1 ~ 30시간 방치 후 필터로 여과한다. 여과한 액을 농축한 후 제균 여과한 액을 소분하고 멸균하였다. 최종적으로 고순도의 돼지뇌 효소가수분해물을 얻었다(도 1 참조).
실험예 1. 돼지뇌 효소가수분해물의 펩타이드 확인 및 펩타이드 효능 분석
1-1. 돼지뇌 효소가수분해물의 펩타이드 확인
실시예 1에서 얻어진 돼지뇌 효소가수분해물을 시료 100 ㎕ 에 D.W 100 ㎕ 를 더하여 1/2 로 희석한다. 희석액 50 ㎕ 에 D.W 950 ㎕ 를 더하여 1/20 로 희석하고 syringe filter로 여과한 액을 ACQUITY UPLC I-Class PLUS (Waters)의 HPLC 시스템과 Xevo TQ-XS (Waters) MS 시스템의 ms/ms 이온화 분석을 통하여 서열분석하였다.
<분석조건>
- 컬럼 : ACQUITY UPLC　 BEH C18 (2.1 Χ 50 ㎜, 1.7 ㎛, Waters)
- 유량 : 200 ㎕/min
- 이동상 A : H2O/FA=100/0.1(v/v)
이동상 B : Acetonitrile/FA = 100/0.1 (v/v)
- Gradient
분 (min) A (%) B (%)
0 98 2
5 98 2
15 84 16
16 70 30
18 5 95
27 5 95
29 98 2
35 98 2
상기의 기기 조건으로 분석하여 얻어진 결과는 다음과 같다.
분석결과, 총 4종의 펩타이드를 분석하였고, 이 중에서 돼지뇌 유래 펩타이드로 2 종의 펩타이드를 확인하였다. 가장 안정적으로 재현성을 나타내는 하기 2종을 지표 물질로 선정하였다.
돼지뇌 효소가수분해물 지표성분의 펩타이드 서열
No. m/z RT (min) Charge Sequence 가수분해물 내 함량 (ppm)
brPEP-1 403.22 7.6 1 PSIS
(서열번호 1)		 5-30 ppm
brPEP-2 418.72 8.4 2 GPAGPQGPR
(서열번호 2)		 5-30 ppm
LC/MS EIC 크로마토그램 (m/z 403.2)의 비교를 통해 PSIS 표준용액과 돼지뇌효소가수분해물 검액의 PSIS 성분에 대한 머무름 시간을 확인한 결과 PSIS 피크에 대한 머무름 시간이 일치함을 확인하였다. 또한, LC/MS EIC 크로마토그램 (m/z 418.7)의 비교를 통해 GPAGPQGPR 표준용액과 돼지뇌효소가수분해물 검액의 GPAGPQGPR 성분에 대한 머무름 시간을 확인한 결과 GPAGPQGPR 피크에 대한 머무름 시간이 일치함을 확인하였다.
이후 돼지뇌 가수분해물로부터 확인된 펩타이드와 동일한 mass 및 ms/ms 이온화 형태를 갖는 펩타이드를 애니젠 (www.anygen.com)으로부터 합성하여 돼지뇌 효소가수분해물 내 존재하는 펩타이드와 일치함을 확인하고 이후 실험을 진행하였다.
1-2. 펩타이드의 세포 독성 평가
인간 신경세포주인 SH-SY5Y 세포는 한국세포주은행 (Cat No. 22266)에서 분양 받아 사용하였으며, 10 % Fetal bovine serum (FBS, Cytiba)와 100 IU/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (RPMI 1640, Cytiba) 배지를 이용하여 5 % CO2, 37℃ incubator에서 배양하여 실험을 진행하였다.
인간 신경세포주 SH-SY5Y를 배양 후 다양한 농도의 돼지뇌 효소가수분해물 유래 펩타이드를 첨가한 후 세포생존율을 확인하기 위해 MTT(methylthiazol tetrazolium bromide, Sigma Aldrich)를 시행하였다. 24 well plate (BD, Falcon)에 각 well에 세포들을 적당량 (1X105/well) seeding 하여, 각각 농도 별로 시료들을 처리하고 37℃ incubator에서 48시간 배양 후에 세포생존율을 확인하였다. MTT용액을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 지표성분으로 선정된 펩타이드 brPEP-1, brPEP-2 모두 각각 40ug/mL (w/v)에서 93.05 %± 2.23 %, 108.47 %± 5.20 % 로 나타났다. 실험을 진행한 모든 농도 (0.4 ~ 40ug/ml)에서 세포 생존율이 90 % 이상이었으며, 세포독성에 대한 안전성에 전혀 문제가 없는 것으로 확인되었다 (도 2).
1-3. 펩타이드의 신경세포 보호능 (Neuro-protective effect) 평가
펩타이드 2종(서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드)의 기억력개선의 효능을 평가를 위해 인간 신경세포주를 이용하여 무독성 농도 이하에서 beta-amyloid 처리 함으로써 발생되는 신경세포 사멸에 대한 세포 보호능을 확인하였다.
신경세포보호능을 측정하기 위해, SH-SY5Y에 알츠하이머의 주요 병리학적 특징인 베타아밀로이드를 처리하여 독성을 주어 신경세포사멸을 유도하였다. 구체적으로, 사람신경모세포종인 SH-SY5Y cell을 24 well plate에 1X105/well이 되도록 분주하고 배양하였다. 이후 본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 2종 (서열번호 1, 서열번호 2의 펩타이드)을 농도별로 24시간 전처리하여 배양 후, 각 well에 beta-amyloid를 40uM 농도로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하는 방법으로 결과를 확인하였다.
도 3a에서 나타내는 바와 같이, amyloid beta 25-35를 처리한 그룹에서 정상대조군에 비해 63.7 % (p < 0.001)로 세포 생존율이 감소하였으나, 서열번호 1의 펩타이드 (PSIS)를 전처리한 후 40μM amyloid beta 25-35를 24 시간 동안 처리한 경우, 약 21 ~ 30 %수준의 신경세포보호능을 나타내었다. 또한 도 3b에서 나타내는 바와 같이, amyloid beta 25-35를 처리한 그룹에서 정상대조군에 비해 63.9 % (p < 0.001)로 세포 생존율이 감소하였으나, 서열번호 2의 펩타이드 (GPAGPQGPR)를 전처리한 후 40μM amyloid beta 25-35를 24 시간 동안 처리한 경우, 약 18 ~ 31 % 수준의 신경세포보호능을 나타내었다.
1-4. brPEP-1, brPEP-2의 BDNF 생성능 평가
BDNF는 Brain-derived neurotrophic factor로 뇌 유래 신경영양인자이다. 인지기능(기억력, 사고능력)에 영향을 주는 대사과정의 신호전달체계에 관여하는 단백질 BDNF의 생성능을 확인하여 시료의 기억력 개선 기능성을 확인하기 위해, 75T flask에 인간신경모세포종인 SH-SY5Y 세포를 배양하여 confluency가 80~90%가 되었을 때, 2*10^5으로 6well cell culture plate에 seeding하였다. 37℃, 5% CO2 humidity chamber에서 일주일 배양 후 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)을 농도별로 처리하였다. 37℃, 5% CO2 humidity chamber에서 48시간 배양 후 cell lysate를 얻어 Bosterbio사의 BDNF KIT(#EK0307)를 이용하여 BDNF를 측정하였다. 이후 세포 수 보정은 protein assay를 진행하여 단백질 함량으로 보정하였다.
시험 결과, 서열번호 1의 펩타이드 (PSIS) 및 서열번호 2의 펩타이드 (GPAGPQGPR) 모두 신경세포성장인자 BDNF 생성능이 우수한 것으로 확인되었다 (도 3c, 도 3d).
1-5. brPEP-1 beta-amyloid aggregation 확인
본 발명의 실시예에 따른 brPEP-1이 beta-amyloid의 응집을 얼마나 저해할 수 있는지를 알아보기 위해 티오플라빈 T 에세이(Thioflavin T Assays)를 수행하였다. 티오플라빈 T는 beta-amyloid에 반응하여 fluorescence를 나타낸다. SH-SY5Y 세포를 배양한 후 brPEP-1를 각각을 처리하고 24시간 뒤, beta-amyloid 20uM을 24시간 처리하여 배양 후 세포를 수확하기 전에 PBS(pH 7.4)로 세척하고 Thioflabin T 5uM을 1mL 처리한 뒤 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)기를 이용하여 450 nm excitation 과 482 nm emission 파장에서 측정하였다.
Thioflavin T가 아밀로이드 응집체들과 결합함으로써, Thioflavin T 고유의 형광 스펙트럼의 세기로 응집 수준을 확인할 수 있었다. 시간별 Thioflavin T를 확인한 결과, beta-amyloid를 처리하지 않은 군(N)보다 beta-amyloid를 처리한 군(CTL)에서 형광의 세기가 높아지는 것을 확인하였다.
brPEP-1은 0.002ug/ml에서 18시간 후 약 62% 정도 beta-amyloid aggregation 억제능을 나타내었고, 본 원료 돼지뇌효소가수분해물 총질소 25ug/ml에 존재하는 농도이며 본 원료는 18시간 후 약 65% 수준으로 유사한 beta-amyloid aggregation 억제능을 나타내는 것으로 확인하였다(도 3e).
1-6. brPEP-1, brPEP-2의 활성산소종 (ROS) 억제능 확인
H2O2에 의한 세포 내 활성산소종의 생성을 측정하기 위하여 형광 DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 세포 내의 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 세포 내에서 DCF로 전환되어 형광을 발한다. 세포 내 활성산소종의 양을 측정하기 위하여 SH-SY5Y 세포를 배양한 후 본 발명의 실시예에 따른 brPEP-1, brPEP-2를 처리하고 24시간 뒤, H2O2 100uM을 24시간 처리하여 배양 후 세포를 수확하기 전에 20μM DCF-DA를 처리하고 37℃에서 30분간 배양 후 PBS(pH 7.4)로 세척하고 1% triton X-100으로 세포에 처리하여 세포를 용해시킨 뒤, ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)기를 이용하여 480 nm excitation 과 530 nm emission 파장에서 측정하였다. brPEP-1, brPEP-2는 2ug/ml에서 각각 24%, 17%의 억제능을 보였고, 농도 유의적으로 효과가 있음을 확인였다 (도 3f).
실험예 2. 돼지뇌 유래 펩타이드를 포함하는 가수분해물의 효능 분석
실시예 1에서 제조한 돼지뇌 효소가수분해물(서열번호 1 및 서열번호 2의 펩타이드 포함)을 이용하여 기억력 개선 효능을 분석하였다. 돼지뇌 효소가분해물 내 상기 펩타이드의 함량은 각각 5 ~ 30 ppm 이다.
2-1. 세포독성평가
사람신경모세포종인 SH-SY5Y 세포는 한국세포주은행 (Cat No. 22266)에서 분양 받아 사용하였으며, 10 % Fetal bovine serum (FBS, Cytiba)와 100 IU/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 포함된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium (RPMI 1640, Cytiba) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ incubator에서 배양하여 실험을 진행하였다.
SH-SY5Y(사람신경모세포종)을 배양 후 다양한 농도의 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)을 첨가한 후 세포생존율을 확인하기 위해 MTT(methylthiazol tetrazolium bromide, Sigma Aldrich)를 시행하였다. 24 well plate (BD, Falcon)에 각 well에 세포들을 적당량 (1X105/well) seeding 하여, 각각 농도 별로 시료들을 처리하고 37℃ incubator에서 48시간 배양 후에 세포생존율을 확인하였다. MTT용액을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH) 시료는 모두 총 질소 50ug/ml까지 무독성인 것으로 확인되었다 (도 4).
2-2. 신경세포 보호능 (Neuro-protective effect)
신경세포보호능을 측정하기 위해, SH-SY5Y에 알츠하이머의 주요 병리학적 특징인 베타아밀로이드를 처리하여 독성을 주어 신경세포사멸을 유도하였다. 구체적으로, 사람신경모세포종인 SH-SY5Y cell을 24 well plate에 1X105/well이 되도록 분주하고 배양하였다. 이후 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물 (PBEH)을 농도별로 24시간 전 처리하여 배양 후, 각 well에 beta-amyloid를 40uM 농도로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하는 방법으로 결과를 확인하였다.
확인 결과, 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)은 총질소 25ug/ml, 50ug/ml에서 25%, 52%의 신경세포보호능을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 5).
2-3. BDNF 생성능
BDNF는 Brain-derived neurotrophic factor로 뇌 유래 신경영양인자이다. 인지기능(기억력, 사고능력)에 영향을 주는 대사과정의 신호전달체계에 관여하는 단백질 BDNF의 생성능을 확인하여 시료의 기억력 개선 기능성을 확인하기 위해, 75T flask에 인간신경모세포종인 SH-SY5Y 세포를 배양하여 confluency가 80~90%가 되었을 때, 2*10^5으로 6well cell culture plate에 seeding하였다. 37℃, 5% CO2 humidity chamber에서 일주일 배양 후 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)을 농도별로 처리하였다. 37℃, 5 % CO2 humidity chamber에서 48시간 배양 후 cell lysate를 얻어 Bosterbio사의 BDNF KIT(#EK0307)를 이용하여 BDNF를 측정하였다. 이후 세포 수 보정은 protein assay를 진행하여 단백질 함량으로 보정하였다.
시험 결과, 돼지뇌 효소가수분해물 (PBEH)은 총 질소 6.25, 25, 50ug/ml에서 각각 30%, 41%, 47%의 BDNF 생성능을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 6).
2-4. Protein expression (Caspase-3, ChAT)
apoptosis 과정에서 다양한 단백질과 신호전달 물질들이 관여하는데, 이 과정을 거쳐 caspase-3의 활성화가 촉진되면, PARP의 절단을 유발하여 apoptosis가 일어나게 된다. 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물, 대조군으로써 건강기능식품 원료 은행물추출물을 처리함으로써 caspase-3의 활성화 감소에 따라 beta-amyloid에 대한 사멸을 억제할 수 있는지를 확인하고자 아래와 같이 시험을 진행하였다.
SH-SY5Y 세포를 분주하고 약 7일 뒤 confluency가 90%가 되었을 때, 상기 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)을 24시간 처리 후 beta-amyloid 20uM를 처리하여 배양 후 차가운 PBS로 세척하여 RIPA Buffer로 Lysate를 얻었다. Protein assay를 이용하여 단백질의 농도를 확인한 후 동량의 세포파쇄액과 2×sample buffer를 혼합하여 100℃에서 5분 가열하여 단백질의 변성을 유도한 후 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 시행하였다. 전기영동이 끝난 gel의 단백질은 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad, USA)으로 옮겼다. blocking buffer(5 % skim milk)와 상온에서 1시간 반응시켰다. Caspase-3, ChAT및 GAPDH에 대한 항체는 0.1 %(v/v)의 tween-20이 함유된 Tris-buffered saline(TBS-T)에 1:1,000으로 희석하여 polyvinylidene difluoride 과 4℃에서 overnight하여 반응시켰으며, 각 항체에 대한 이차항체 anti-rabbit IgG conjugated HRP는 TBS-T로 희석 (1:2,000)하여 상온에서 각각 2시간 반응시킨 후 ECL kit(Bio-Rad, USA)를 이용하여 현상하였다
시험 결과, Caspase-3와 ChAT 모두 유효한 수준으로 밴드의 intensity 차이가 있어 기억력 개선 가능성이 있음을 확인하였다 (도 7).
2-5. 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능
Acetylcholinesterase (AChE)의 활성을 억제하여 acetylcholine의 분해를 억제함으로써 신경연접 내의 아세틸콜린 농도를 증가시킬 수 있고, 이로써 인지기능의 향상을 유도한다. 돼지뇌 효소가수분해물의 AChE의 억제능을 확인하기 위하여 하기 시험을 수행하였다.
75T flask에 인간신경모세포종인 SH-SY5Y 세포를 배양하여 confluency가 80~90 %가 되었을 때, 2*10^5 (2×105)으로 6well cell culture plate(BD, Falcon)에 seeding하였다. 37℃, 5% CO2 humidity chamber에서 일주일 배양 후 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH) 및 양성대조군으로 현재 개별인정형 원료로 등록되어 있는 은행잎추출물, 의약품 Donepezil을 각각을 농도별로 처리하였다. 37℃, 5% CO2 humidity chamber에서 48시간 배양 후 cell lysate를 얻어 abcam사의 AChE KIT(#ab138871)를 이용하여 AChE 활성을 측정하였다. 이후 세포 수 보정은 protein assay를 진행하여 단백질 함량으로 보정하였다.
시험 진행 결과, 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)은 총 질소 25, 50ug/ml에서 약 23%, 26% 억제능을 나타내는 것으로 확인되었고, 이에 반해 은행잎 추출물 100ug/ml에서 약 21% 농도 의존적으로 억제되는 것으로 확인되었다(도 8).
2-6. 활성산소종 (ROS) 억제능
H2O2에 의한 세포 내 활성산소종의 생성을 측정하기 위하여 형광 DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 세포 내의 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 세포 내에서 DCF로 전환되어 형광을 발한다. 세포 내 활성산소종의 양을 측정하기 위하여 SH-SY5Y 세포를 배양한 후 본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH), 현재 개별인정형 원료로 등록되어 있는 은행잎추출물 각각을 처리하고 24시간 뒤, H2O2 100uM을 24시간 처리하여 배양 후 세포를 수확하기 전에 20μM DCF-DA를 처리하고 37℃에서 30분간 배양 후 PBS(pH 7.4)로 세척하고 1 % triton X-100으로 세포에 처리하여 세포를 용해시킨 뒤, ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)기를 이용하여 480 nm excitation 과 530 nm emission 파장에서 측정하였다. 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)은 총질소 25, 50ug/ml에서 각각 43 %, 60 %의 억제능을 보였고, 농도 유의적으로 효과가 있음을 확인하였으며, 은행잎추출물 100ug/ml에서 약 35.9%로 돼지뇌 효소가수분해물의 총질소 25ug/ml와 유사한 결과를 확인하였다 (도 9).
2-7. Beta-aggregation 억제능
본 발명의 실시예에 따른 돼지뇌 효소가수분해물 및 현재 개별인정형 원료로 등록되어 있는 은행잎추출물이 beta-amyloid의 응집을 얼마나 저해할 수 있는지를 알아보기 위해 티오플라빈 T 에세이(Thioflavin T Assays)를 수행하였다. 티오플라빈 T는 beta-amyloid에 반응하여 fluorescence를 나타낸다. SH-SY5Y 세포를 배양한 후 돼지뇌 효소가수분해물(PBEH) 및 현재 개별인정형 원료로 등록되어 있는 은행잎추출물 각각을 처리하고 24시간 뒤, beta-amyloid 20uM을 24시간 처리하여 배양 후 세포를 수확하기 전에 PBS(pH 7.4)로 세척하고 Thioflabin T 5uM을 1mL 처리한 뒤 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)기를 이용하여 450 nm excitation 과 482 nm emission 파장에서 측정하였다.
Thioflavin T가 아밀로이드 응집체들과 결합함으로써, Thioflavin T 고유의 형광 스펙트럼의 세기로 응집 수준을 확인할 수 있었다. 시간별 Thioflavin T를 확인한 결과, beta-amyloid를 처리하지 않은 군(N)보다 beta-amyloid를 처리한 군(CTL)에서 형광의 세기가 높아지는 것을 확인하였다.
돼지뇌 효소가수분해물(PBEH)은 총질소 25ug/ml에서 약 66%의 beta-amyloid aggregation 억제능을 나타내었고, 개별인정형으로 등록된 원료인 은행잎추출물은 100ug/ml에서 약 46%의 beta-amyloid aggregation 억제능을 나타내는 것으로 확인되었다(도 10).
실험예 3. 동물행동 시험
3-1. 수동회피실험(passive avoidance test)
상기 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력/인지능력 개선 효과를 확인하기 위하여 수동회피실험을 수행하였다 (도 11).
실험방법
passive avoidance test는 백서를 light room에 놓았을 때 dark room으로 이동하는데 걸리는 시간을 측정하는 것으로 1번째와 2번째는 8시간 간격으로 진행하고, 백서가 dark room으로 이동할 때 전기자극을 주어 dark room으로 이동하면 안 된다는 것을 학습시키고 16시간 후에 light room에서 dark room으로 진행하는데 걸리는 시간을 측정하였다.
실험결과
도 11에서 나타내는 바와 같이, 2번째 trial에서는 High-PBEH 군이 정상군과 유사하게 이동시간이 길었다 (도 11b에서, 좌측부터 순서대로 MD-control, Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control임). 3번째 trial에서는 유발군에 비해 정상군의 latency time이 길었으며, Medium-PBEH (0.159 ml/kg)와 High- PBEH (0.478 ml/kg)군들은 정상군과 유사하게 dark room으로 이동하는 시간이 늦어져 기억력이 좋아진 것을 확인하였다.
3-2. Y 미로 테스트 (Y maze test)
상기 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력/인지능력 개선 효과를 확인하기 위하여 Y 미로 테스트를 수행하였다 (도 12). Y 미로 테스트는 공간 학습 및 기억 연구를 위한 자발적 교대와 인식 기억 테스트로 해마 손상, 유전자 조작, 기억 소거제에 민감하여 기억기능을 테스트할 수 있다.
실험방법
Y- maze test는 단기기억형태의 순간 공간인지력을 평가하기 위한 방법으로 Y-미로는 규격(길이50.5cm, 너비 20cm, 높이 20cm, 3개의 arm)으로 제작한 Y자 모양의 사방이 막힌 미로에서 세 가지를 각각 A,B, C로 정한 후 한 쪽 가지에 백서를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 후 백서가 들어간 가지를 순서대로 기록하였다. 각 가지에 차례로 들어간 경우를 헤아려 1점(실제변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 세 가지 모두에 겹치지 않게 들어가는 것으로 정의하였다.
실험결과
실험결과, 정상대조군에 비해 유발군에서 정상적인 회전수가 적었다. 총 회전 수 중 정상적인 회전 (%)이 Medium-PBEH (0.159 ml/kg)와 High-PBEH군 (0.478 ml/kg)들은 유발군에 비해서 높은 값을 나타내었다 (도 12b에서, 좌측부터 순서대로 MD-control, Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control임).
3-3. Novel object test
상기 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력/인지능력 개선 효과를 확인하기 위하여 Novel object test를 수행하였다 (도 13). 새로운 물체를 인식하는 것을 조사하는 것으로 %로 나타내고 100%는 모두 인식하는 것으로 값이 100에 가까울수록 기억력이 좋은 것이다.
실험방법
각각의 백서는 테스트 첫날 plexiglass 박스에 첫째날 5분, 둘째날 20분, 셋째날 20분 동안 백서에게 새로울 물체를 탐색하도록 허용한다. 넷째 날, 상자를 4개의 영역으로 나누고 대각선 영역 중앙에 동일한 물체 2개를 배치하였다. rat을 상자 옆에 놓고 10분 동안 물건을 자유롭게 탐색할 수 있게 허용하고, rat의 냄새를 제거하기 위해 물체와 장비를 75 % 에탄올로 세척하고 1시간 후, 두 개의 동일 한 물체 중 하나를 크기는 비슷하지만 모양과 색상이 다른 물체로 교체하였다.
백서가 새로운 물체와 기존의 물체를 탐색하는데 소요되는 시간을 5분 동안 기록했다. 탐색적 행동은 백서가 코나 앞발로 물체의 냄새를 맡고 만지는 것으로 정의하나, rat이 물체 위에 앉거나 돌아서는 것은 탐색 행동으로 간주하지 않았다.
실험결과
실험결과, 유발군은 정상군에 비해 새로운 물체를 인식하는 정도가 낮았으며, 양성대조군은 정상군과 유사한 값을 나타내었다. 돼지뇌효소가수분해물 섭취군은 농도 의존적으로 새로운 물체를 인식하는 정도가 향상되었고, High-PBEH군의 인식률이 가장 높아져 인지력이 향상됨을 확인하였다 (도 13b에서, 좌측부터 순서대로 MD-control, Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control임).
3-4. Morris 수중 미로 테스트 (Morris water-maze test)
상기 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력/인지능력 개선 효과를 확인하기 위하여 Morris 수중 미로 테스트를 수행하였다 (도 14). 수중미로는 공간기억과 학습을 연구하는데 쓰이며, 동물을 물 안에 넣고 숨겨진 탈출 플랫폼을 찾는 시간을 확인한다.
실험방법
Morris water-maze test를 실시하여 표적 분면 시간(target quadrant time), 표적을 지나간 횟수(Number of crossing platform) 및 수영패턴(swimming pattern)은 컴퓨터 프로그램으로 작동하는 카메라로 측정하였고 분석하였다. Morris water-maze test는 원형수조(높이 40 cm × 지름 1.5 m)에 수면에서 1 cm 정도 낮게 지름 12 cm인 표적(target)을 원형수조바닥에 설치하고 물(22°C-25°C)을 받아 탈지분유를 풀어 표적을 보이지 않도록 하고 검사는 실험 첫날에 zone1에 백서를 놔두고, zone5에 있는 platform을 찾았다. 수중 미로 테스트는 3번 진행되었고, 1일차와 2일차에서는 zone5에 있는 platform을 찾는 방법을 훈련하였고, 5일째에 기억력을 평가하기 위해, zone5의 잠복시간, 방문 빈도 및 지속시간을 측정하였다. 테스트는 600초 동안 진행되었다.
실험결과
실험결과, 돼지뇌효소가수분해물의 Medium-PBEH(0.159 ml/kg)와 High-PBEH　（0.478ml/kg）섭취군이 유발군에 비해 처음 플랫폼 발견하는 시간이 짧았으며, 돼지뇌효소가수분해물 섭취군은 플랫폼 부근에 머무르는 시간도 정상군 만큼 길어진 것으로 확인되었는바, 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물이 공간기억력에 효과적인 것을 알 수 있다 (도 14b에서, 좌측부터 순서대로 MD-control, Positivel-control, Low-PBEH, Medium-PBEH, High-PBEH, Normal-control임).
3-5.해마의 조직 분석
상기 실시예에서 수득한 돼지뇌 효소가수분해물의 기억력/인지능력 개선 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 해마의 조직을 분석하였다.
실험방법
해마를 두 부분으로 나누었고, 한 부분은 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액으로 용해되었고 다른 부분은 전체 RNA를 추출하기 위해 Trizol 시약(Invitrogen, Rockville, MD, USA)으로 용해하였다. 해마 RIPA 완충용해물은 5000×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 이용하여 지질과산화(MDA) assay kit(Abcam, Cambridge, UK)와 콜레스테롤 키트(Abcam, Cambridge, UK)를 사용하여 비색법으로 지질과산화물과 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 아산약품). 상등액은 1.5N 과염소산으로 단백질을 제거하고, 글리코겐 함량은 산 완충액에서 α-amyloglucosidase에 의해 가수분해된 글리코겐에서 유래된 포도당 농도로부터 계산되었다.
포도당 농도는 포도당 키트(Asan Pharmaceutics, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 트리글리세라이드는 해마에서 클로로포름-메탄올 용액(2:1, v/v)으로 추출하고 순수한 클로로포름에 재현탁하였다. 클로로포름의 중성지방 함량은 중성지방 비색 키트(아산약품, 서울, 한국)를 사용하여 측정하였다.
혈청 TNF-α 및 IL-1beta 농도는 ELISA 키트(eBioscience; San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, AST 및 ALT의 혈청 농도는 AST 및 ALT 키트(Asan Pharmaceutics, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.
실험결과
해마조직 내 콜레스테롤 함량은 유발군이 정상군에 비해 현저히 높았으며, 양성대조군과 돼지뇌 효소가수분해물 섭취군은 콜레스테롤 함량을 낮추었다.
해마조직의 글리코겐 함량은 유발군에 비해 정상군에서 높았으며 돼지뇌 효소가수분해물 섭취에서는 Low-PBEH (0.053 ml/kg)와 Medium-PBEH(0.159 ml/kg)군에서 높아졌다.
해마조직의 과산화물을 MDA 함량으로 확인하였는데 유발군이 정상군에 비해 높았으며 양성대조군과 돼지뇌 효소가수분해물 섭취군에서 감소하였다. 특히 Medium-PBEH(0.159 ml/kg)군과 Hgh-PBEH(0.478ml/kg)군에서 정상대조군만큼 낮아지는 효과를 확인하였다.
뇌의 조직에 염증 cytokine인 TNF-α 함량도 과산화물과 유사한 함량을 나타내었으며 대조군이 정상대조군에 비해 높았으며 양성대조군과 돼지뇌 효소가수분해물 섭취군 Medium-PBEH군과 High-PBEH군에서 감소하는 것으로 확인되었다.
MD-control Positivel-
control		 Low-PBEH Medium- PBEH High-PBEH Normal-
control
Hippocampal
triglyceride (mg/g)		 47.5±3.10 47.1±1.75 47.4±4.36 44.7±3.66 46.2±3.96 46.4±2.45
Hippocampal
cholesterol (mg/g)		 18.0±1.21a 15.0±1.43b 15.5±1.27b 13.6±0.76c 14.5±1.33bc 12.2±0.82d
Hippocampal
glycogen (mg/g liver)		 30.5±0.28b 31.5±0.33ab 30.9±0.36b 32.5±0.21a 32.3±0.42a 32.7±0.38a
Hippocampal
lipid peroxides
(MDA μmol/g tissue)		 3.85±0.53a 2.94±0.35b 3.35±0.54ab 2.91±0.47b 2.43±0.44c 2.31±0.36c
Hippocampal
TNF-a contents
(ng/g tissue)		 4.08±0.26a 3.41±0.19b 3.85±0.27ab 3.43±0.24b 3.44±0.81b 3.20±0.11c
Acetylcholienesterase activity (U/mg protein) 0.66±0.09a 0.32±0.07d 0.59±0.07ab 0.53±0.07b 0.41±0.07c 0.12±0.05e
Relative mRNA expression of hippocampal
TNF-α(AU)		 1a 0.88±0.07b 0.97±0.09a 0.91±0.09ab 0.82±0.09bc 0.78±0.09c
Relative mRNA expression of hippocampal
IL-1beta (AU)		 1a 0.94±0.09a 1.01±0.09a 0.92±0.09ab 0.83±0.07b 0.79±0.08b
Relative mRNA expression of hippocampal
BDNF (AU)		 1c 1.54±0.19a 1.07±0.11c 1.25±0.15b 1.43±0.11a 1.36±0.11ab
Relative mRNA expression of hippocampal
CNTF (AU)		 1c 1.63±0.33b 1.09±0.18c 1.39±0.21c 1.59±0.21b 3.13±0.64a
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
[과제 정보]
과제고유번호: G0210300-01
과제번호: 2021년0210300-0
부처명: 농림축산식품부
연구관리전문기관: 한국식품연구원
연구사업명: 식품 기능성평가 지원사업
연구과제명: 돼지뇌효소가수분해물의 기억력 개선에 미치는 영향과 기전연구
주관기관 : 유니메드제약주식회사
연구기간 : 21.04 ~ 21.12

Claims (29)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 하나 이상의 단백질 분해효소에 의해 가수분해된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩타이드는 돼지뇌 효소가분해물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 신경세포 보호능 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및 활성산소종 (ROS) 억제능을 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  8. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 하나 이상의 단백질 분해효소에 의해 가수분해된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 펩타이드는 돼지뇌 효소가분해물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 신경세포 보호능 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서,
    상기 돼지뇌 효소가수분해물은 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및 활성산소종 (ROS) 억제능을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 청구항 8에 있어서,
    상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 펩타이드는 돼지뇌 효소가수분해물로부터 정제되거나 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 돼지뇌 효소가수분해물.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 펩타이드는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 돼지뇌 효소가수분해물.
  18. 청구항 17에 있어서
    상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 돼지뇌 효소가수분해물.
  19. 청구항 15에 있어서,
    상기 펩타이드는 신경세포 보호능 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 것을 특징으로 하는 돼지뇌 효소가수분해물.
  20. 청구항 15에 있어서,
    상기 펩타이드는 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및 활성산소종 (ROS) 억제능을 나타내는 것을 특징으로 하는 돼지뇌 효소가수분해물.
  21. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 펩타이드는 돼지뇌 효소가수분해물로부터 정제되거나 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 펩타이드는 식품 조성물 또는 약학적 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  24. 청구항 21에 있어서,
    상기 펩타이드는 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  25. 청구항 23에 있어서
    상기 뇌신경질환은 알츠하이머 병, 경도인지장애, 노인성 치매, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal Dementia)뇌경색, 뇌졸중 및 뇌전증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  26. 청구항 21에 있어서,
    상기 펩타이드는 신경세포 보호능 및 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 생성능을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  27. 청구항 21에 있어서,
    상기 펩타이드는 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase) 억제능 및 활성산소종 (ROS) 억제능을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  28. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여 또는 복용시키는 단계를 포함하는 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료 방법.
  29. 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성되는 펩타이드 중 하나 이상이 포함된 돼지뇌 효소가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 기억력 개선, 인지기능 개선 또는 뇌신경질환 예방 또는 치료 용도.
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