WO2020189911A1 - 노르안하이드로이카리틴을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

노르안하이드로이카리틴을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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장현덕
안경섭
오세량
박지원
권옥경
류형원
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서울대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases containing noranhydroicaritin, and more specifically, to produce PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) without toxicity to cells. It relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases comprising noranehydroikaritin having an effect of inhibiting and promoting the production of LDLR (low density lipoprotein receptor).
  • the present invention is a method for preventing or treating cardiovascular metabolic diseases comprising administering a health functional food composition for the prevention or improvement of cardiovascular metabolic diseases containing noranehydroikaritin and a composition containing noranehydroikaritin It is about.
  • Cardiovascular metabolic disease refers to a disease caused by metabolic imbalances such as sugars and lipids in a living body, and cardiovascular disease, dyslipidemia, obesity or diabetes, etc. correspond to major diseases.
  • Cardiovascular disease is a disease that occurs in the heart and major arteries, and is the leading cause of death worldwide.
  • Major diseases belonging to cardiovascular diseases include high blood pressure, angina, myocardial infarction, arteriosclerosis, atherosclerosis, stroke, and arrhythmia.
  • Risk factors related to cardiovascular disease include age, sex, smoking, lack of exercise and obesity, but considering the recent westernized diet and rapid lifestyle changes, the accumulation of cholesterol due to lipoproteins is considered a representative cause. I can.
  • Atherosclerosis is the accumulation of fat and fibrous tissue on the inner wall of the artery, causing the vessel wall to become narrowed or blocked. If atherosclerosis is mild, there is no problem with normal activities, but atherosclerosis causes atherosclerotic heart disease if more than 50-70% of the coronary tissue is blocked. Can be. In addition, in severe cases, the cerebral artery or coronary artery may rupture, and in this case, it develops into the cardiovascular system such as cerebrovascular disease and heart disease. Cerebral arteriosclerosis is known to cause encephalopathy, and coronary atherosclerosis is known to cause angina and myocardial infarction. In addition, this can lead to high blood pressure, heart disease, and stroke. Currently, various statin drugs, which are HMG-CoA reductase inhibitors, have been developed as treatments for arteriosclerosis, but the need for more effective treatments is still emerging.
  • Dyslipidemia refers to a state in which total cholesterol, LDL-cholesterol, or triglyceride in the blood is increased or HDL-cholesterol is decreased.
  • Specific examples include, but are not limited to, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, or hypertriglyceridemia. It may be caused by genetic factors, obesity, diabetes, or alcohol, but dyslipidemia may occur due to an increase in blood lipids due to a diet high in fat content.
  • a composition for treating hyperlipidemia Korean Patent Publication No. 2015-0064400
  • Obesity is widely known to cause chronic diseases such as fatty liver, hypertension, diabetes, and cardiovascular disease. According to the 2007 National Health and Nutrition Survey of the Ministry of Health, Welfare and Family Affairs, 31.7% of Korean adults were obese. In addition, 1.7 billion people, which account for about 25% of the world's population, are currently overweight (BMI> 25), and more than 300 million people in western regions including 120 million people in major countries such as the United States, Europe and Japan are obese patients (BMI> 30). As an obesity treatment agent sold at home and abroad, there is'Zenical', whose main ingredient is orlistat, which has been approved by the U.S. FDA, and Xenical, which inhibits lipase action, is said to have side effects of the gastrointestinal system such as fat stool, gas production, and lower absorption of fat-soluble vitamins. Is known.
  • Type II diabetes is non-insulin-dependent diabetes mellitus/NIDDM, and as a substance for treating conventional insulin non-dependent diabetes, PPAR- ⁇ activator, GLP-1 derivative, DPP-IV inhibitor, PTP1B Inhibitors and the like have been developed, but toxicity to the liver, kidneys, muscles, and heart and symptoms of weight gain are known as side effects of each.
  • noranhydroicaritin used in the present invention is a compound having a molecular weight of 354.3629 having the formula C20H18O6 ( Komatsu et al. 1970), a flavonoid contained in Gosam ( ⁇ , [Sophora flavescens] Aiton) It is known as a family compound.
  • no specific disease inhibitory activity has been known of noranehydroikaritin, but kaempferol, the parent of noranehydroikaritin, is effective in inhibiting allergic asthma, anticancer, anti-inflammatory, and antioxidant. Is only known.
  • the present inventors have made intensive research efforts to develop a composition that is derived from a natural product and has an excellent preventive or therapeutic effect on cardiovascular metabolic diseases while showing safety, and as a result, the flavonoid-based compound obtained from Gosam, noranehydroikaritin In the absence of cytotoxicity, it was confirmed that there is an effect of preventing or treating cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the production of PCSK9 and promoting LDLR production, and the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic disease, comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving cardiovascular and metabolic diseases, comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving cardiovascular and metabolic diseases, comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cardiovascular metabolic diseases, comprising administering a composition comprising noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Noranehydroikaritin a component extracted from Gosam of the present invention, is excellent in preventing or treating cardiovascular metabolic diseases.
  • the noranehydroikaritin of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is not toxic to cells, so while ensuring safety, inhibits the production of PCSK9 and promotes the production of LDLR to prevent cardiovascular metabolic disease or It has high utilization as a therapeutic composition.
  • the noranehydroikaritin of the present invention is a food composition for preventing or improving cardiovascular metabolic diseases, a health functional food composition for preventing or improving cardiovascular metabolic diseases, and a composition comprising noranehydroikaritin as an active ingredient. It can be used as a method for preventing or treating cardiovascular metabolic diseases, including the step of administering.
  • Figure 2 shows the cell viability of HEK293T cells treated by concentrations of noranehydroikaritin.
  • Figure 3 shows the amount of PCSK9 mRNA in HepG2 cells treated with each concentration of noranehydroikaritin and camperol.
  • Figure 4 shows the amount of LDLR mRNA in HepG2 cells treated with noranehydroikaritin and camperol at each concentration.
  • Figure 5 shows the PCSK9 promoter-reporter construct-transfected HEK293T cells treated by concentrations of noranehydroikaritin, and shows the PCSK9 luciferase activity of HEK293T cells.
  • FIG. 6 shows the results of comparing the expression levels by performing immunoblotting targeting PCSK9 and LDLR.
  • Figure 8 shows the SREBP luciferase activity by treatment with each concentration of noranehydroikaritin and camperol in HEK293T cells transfected with the SREBP promoter-reporter construct.
  • FIG. 10 shows changes in expression of a protein (LDLR) involved in arteriosclerosis when a combination treatment of noranehydroikaritin and statins was performed on HepG2 cells stimulated with PCSK9.
  • LDLR protein
  • FIG. 11 is a view of PCSK9, a protein involved in arteriosclerosis, when a combination treatment of noranehydroikaritin and pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, or simvastatin in HepG2 cells. It shows the expression change.
  • Figure 12 is a HepG cell with noranehydroikaritin and atorvastatin (Atorvastatin), rosuvastatin (Rosuvastatin), pravastatin (Pravastatin), pitavastatin (Pitavastatin), fluvastatin (Fluvastatin), or simvastatin (Simvastatin) It shows the changes in the expression of LDLR, a protein involved in arteriosclerosis, when treated in combination.
  • LDLR a protein involved in arteriosclerosis
  • FIG. 13 shows a mouse arteriosclerosis model treated with PCSK9 and noranehydroikaritin.
  • FIG. 15 shows the degree of recovery by noranehydroikaritin after carotid-ligation in a mouse arteriosclerosis model.
  • TNF-a IL-1B
  • MCP-1 proinflammatory cytokines secreted when an inflammatory response occurs
  • the level of PCSK9 was confirmed through immunofluorescence.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cardiovascular metabolic diseases, comprising, as an active ingredient, noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof in order to solve the above problems and achieve the object of the present invention Provides.
  • noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases.
  • Noranhydroicaritin of the present invention is a compound having a molecular weight of 354.3629 having the formula C 20 H 18 O 6 , and is a flavonoid contained in the roots of Gosam, especially among Gosam ( ⁇ , [Sophora flavescens] Aiton). ) Is a family compound.
  • the "flavonoid” is a yellow pigment that is widely contained in plants, has a carbon skeleton structure in which two phenyl groups are bonded through a C3 chain, and is known as a substance having various activities in vivo.
  • pharmaceutically acceptable means exhibiting properties that are not toxic to cells or individuals exposed to the composition
  • pharmaceutically acceptable salt means that cations and anions are caused by electrostatic attraction. It refers to a salt in a form that can be used pharmaceutically among the salts that are bound substances. Usually, it can be a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or acidic amino acid, etc. I can.
  • Kempferol of the present invention is a compound having a molecular weight of 286.24 having a formula C 15 H 10 O 6 , belongs to a flavonoid-based compound. In nature, it is present in a large number following quercetin, and is contained in the form of glycosides in broccoli, grapes, apples, and onions. It is known that camperol acts as an antioxidant by reducing oxidative stress and can reduce the risk of various cancers when consumed (Kim and Choi, 2013).
  • Gosam ( ⁇ , [Sophora flavescens] Aiton) of the present invention is a perennial plant belonging to the dicotyledonous plant Rosaceae legumes. It is also known as the thief's staff, the nerd, and the snake's sperm tree. The height is 80-120cm, and there are yellow short hairs throughout, and the roots are enlarged and have a very bitter taste.
  • dried roots are called gosam, and are known to be prescribed for indigestion, jaundice, and hemorrhoids.
  • stems and leaves are decoated and used as insecticides.
  • cardiovascular metabolic disease refers to a disease caused by metabolic imbalances such as sugars and lipids in a living body, and may include cardiovascular diseases and metabolic diseases, but is not limited thereto.
  • the "cardiovascular disease” is a disease that occurs in the heart and major arteries, and major diseases include high blood pressure, angina, myocardial infarction, arteriosclerosis, atherosclerosis, stroke, arrhythmia, etc., and accumulation of cholesterol in blood vessels (total cholesterol, LDL cholesterol, an increase in triglycerides, and a decrease in HDL cholesterol) can be considered as representative causes.
  • the "metabolic disease” is not particularly limited, but may include a metabolic disease caused by abnormal sugar metabolism or lipid metabolism.
  • the term "metabolic disease caused by abnormal sugar metabolism” of the present invention refers to a disease caused by an imbalance in the metabolic process of sugar in a living body, and is not particularly limited thereto, but includes diabetes, prediabetes, type 2 diabetes, etc. Can include.
  • the term "metabolic disease due to abnormal lipid metabolism” refers to a disease caused by an imbalance in the metabolism of lipids in vivo, and includes, but is not limited to, cardiovascular disease, dyslipidemia, obesity, etc. I can.
  • toxic in the present invention means "the adverse effects of a chemical, physical or biological agent on living organisms and ecosystems”.
  • LDL low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • LDLR is a protein that binds to LDL, a transporter of major cholesterol in the blood, and serves to maintain the plasma level of LDL by mediating the endocytosis of LDL rich in cholesterol. Do it.
  • LDLR is a cell-surface receptor that recognizes apoprotein B100 inserted in the outer phospholipid layer of LDL particles, and endocytosis of LDL through LDLR occurs in all nucleated cells, but mainly removes about 70% of blood LDL from the liver. .
  • the amount of LDLR mRNA was confirmed through RealTime-PCR after treatment with noranehydroikaritin by concentration in HepG2 cells (Fig. 4). Through this, it was confirmed that noranehydroikaritin has an effect of increasing LDLR production, so that it can lower blood cholesterol levels, and thus can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases.
  • PCSK9 Protein convertase subtilisin/kexin type 9
  • PCSK9 Protein convertase subtilisin/kexin type 9
  • LDLR receptor LDLR of LDL. If PCSK9 binds to LDLR after the LDLR-LDL conjugate is absorbed into the cell from the liver and other cell membranes, PCSK9 decomposes LDLR, so that LDLR no longer binds to LDL particles. To prevent playback.
  • PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9
  • noranehydroikaritin in order to confirm the inhibitory effect of noranehydroikaritin on the production of PCSK9, after treatment with noranehydroikaritin at different concentrations in HepG2 cells, the amount of PCSK9 mRNA was confirmed through RealTime-PCR (Fig. 3). Through this, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the production of PCSK9, increasing LDLR, and reducing the level of blood cholesterol.
  • the HEK293T cell extract was treated with noranehydroikaritin by concentration, and PCSK9 through luciferase assay. It was confirmed that the expression of is suppressed (Fig. 5). Through this, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the expression of the gene of PCSK9, increasing LDLR, and reducing blood cholesterol levels.
  • AMP-activated protein kinase of the present invention is an enzyme comprising a regulatory ⁇ / ⁇ subunit and a catalytic ⁇ subunit that detects a low energy state by monitoring the ratio of ATP to AMP. It serves to maintain the energy homeostasis of.
  • AMPK is activated by phosphorylation of threonine 172 by LKB1 and CaMKK (Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase), which are the higher enzymes of AMPK during muscle contraction and exercise (phospho-AMPK, pAMPK).
  • AMPK is a target molecule for two hormones derived from adipose tissue, leptin and adiponectin, and these hormones are major regulators of energy metabolism and glucose homeostasis (Ewart and Kennedy, 2012; Penumathsa et al. 2009; Samovski et al. 2012).
  • PPAR Peroxisome proliferator activated receptor
  • noranehydroikaritin can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by increasing the expression of PPAR ⁇ and ⁇ to promote absorption and catabolism of fatty acids in the blood.
  • SREBP sterolregulatory element binding protein
  • SREBP-1a and SREBP-1c are known to be mainly involved in the synthesis of fatty acids and triglycerides
  • SREBP-2 is known to be involved in cholesterol metabolism.
  • Hyperinsulinemia caused by insulin resistance increases the expression of SREBP-1c in the liver, thereby increasing the biosynthesis of fatty acids and consequently causing the accumulation of triglycerides in the liver tissue.
  • SREBP-1c is a transcription factor that increases the expression of the aceryl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) genes, which are liposynthetic enzymes, and increases the expression of ACC and FAS, causing fatty acid accumulation in hepatocytes. .
  • ACC aceryl-CoA carboxylase
  • FAS fatty acid synthase
  • AMP-activated protein kinase a type of serine/threonine kinase, which is activated when the intracellular energy (ATP) is deficient, thereby preventing intracellular energy production. It is an enzyme that increases.
  • AMPK AMP-activated protein kinase stimulates the catabolic processes that produce ATP, such as beta-oxidation of fatty acids, and inhibits ATP consumption processes such as adipogenesis. Therefore, AMPK activation inhibits liposynthesis by inhibiting the expression of liposynthetic enzyme through down-regulation of SREBP-1c activity.
  • noranehydroikaritin in one embodiment of the present invention, as a result of confirming whether the expression of SREBP is inhibited through treatment of HEK293T cells with noranehydroikaritin and camperol, respectively, and through luciferase assay, the same concentration of camperol In contrast to the rather increased activity of SREBP1 and 2 luminescent enzymes compared to the control group, it was confirmed that noranehydroikaritin significantly decreased SREBP1 and 2 luminase activity compared to the control group as well as camperol (FIG. 8). From this, noranehydroikaritin can be used in the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by down-regulating the expression of the SREBP gene to inhibit the synthesis of fatty acids and cholesterol in the liver.
  • the pharmaceutical composition may further include a statin drug, but is not limited thereto.
  • statins of the present invention is a drug that lowers serum cholesterol concentration by acting as a competitive inhibitor of HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) reductase involved in the early stages of cholesterol biosynthesis, It is used interchangeably with “statin-based drugs” in the present specification.
  • the statins inhibit cholesterol synthesis in hepatocytes and increase the expression of low density lipoprotein receptor (LDLR), thereby lowering the level of low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) in blood.
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • HDL-C high density lipoprotein-cholesterol
  • the statin may be atorvastatin, rosuvastatin, pitavastatin, pravastatin, simvastatin, or fluvastatin, but HMG- As long as it has an inhibitory activity of CoA reductase, it is not particularly limited thereto.
  • statin drugs that appear in proportion to the effect include elevated liver levels and rhabdomyolysis, and research on the mechanism shows that LDLR is increased, but PCSK9 is also increased in proportion to it. Research on is important. Specifically, the side effect may be a concomitant increase in PCSK9. In particular, if the LDL-C of the treatment target is not obtained even with statins, the statin is increased to the maximum dose, but combination therapy using other drugs is recommended. Although the effect can be expected, as side effects can occur so much, research on the concurrent administration of adjuvant drugs that can compensate for this is in the spotlight, and through the increase of LDLR and the decrease of PCSK9 when administered together, more excellent cardiovascular and metabolic diseases can occur. Preventive or therapeutic effects can be expected.
  • the inhibitory effect of the protein related to arteriosclerosis was confirmed in HepG2 cells when the combination treatment of noranehydroikaritin and statin was confirmed, and in the HepG2 cells pretreated with PCSK9, the inhibition of PCSK9 when the combination treatment of noranehydroikaritin and statin It was confirmed that there is an effect (FIGS. 9 to 12). From this, noranehydroikaritin can be treated in combination with statin-based drugs to alleviate side effects that increase PCSK9 as well as LDLR when the statin-based drug is treated. In this case, when noranehydroikaritin is treated alone In contrast, pAMPK, LDLR, and PPAR ⁇ expressions are synergistic, and can be used to prevent or treat cardiovascular metabolic diseases by reducing fatty acids and cholesterol in blood.
  • composition of the present invention means that it is prepared for the purpose of preventing or treating diseases, and each can be formulated and used in various forms according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and diluents or excipients such as lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, and surfactants.
  • lubricants such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and diluents or excipients such as lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, and surfactants.
  • lubricants wetting agents
  • flavoring agents emulsifying agents
  • suspending agents emulsifying agents
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, It can be prepared by mixing gelatin or the like. Further, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, and other excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As a base for suppositories Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a buffering agent, a painless agent, a solubilizing agent, an isotonic agent, a stabilizer, a base agent, and the like, may be prepared by additionally including a carrier known in the art.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” may mean a carrier, excipient, or diluent that does not irritate an organism and does not impair the biological activity and properties of the compound to be injected, and specifically, a non-naturally occurring carrier).
  • the kind of the carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable can be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a food composition for preventing or improving cardiovascular metabolic diseases comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a health functional food composition for preventing or improving cardiovascular and metabolic diseases comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • noranehydroikaritin, pharmaceutically acceptable salts and cardiovascular metabolic diseases are as described above.
  • the term "food” of the present invention means meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages , Vitamin complexes, health functional foods and health foods, fermented tea, etc., and all foods in the usual sense are included.
  • the term "functional food” of the present invention is the same term as food for special health use (FoSHU), and is processed medicine to effectively display bioregulatory functions in addition to nutritional supply. , It means food with high medical effect.
  • the term “function (sex)” means obtaining useful effects for health purposes such as controlling nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body.
  • the food product of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and during the production, raw materials and ingredients commonly added in the art may be added to prepare it.
  • the formulation of the food may be prepared without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present invention may be prepared in various forms of formulation, and unlike general drugs, there are no side effects that may occur when taking drugs for a long time using food as a raw material, and has an advantage of excellent portability.
  • the "health food” refers to a food having an active health maintenance or promotion effect compared to general food, and a health supplement food refers to a food for the purpose of health supplementation.
  • a health supplement food refers to a food for the purpose of health supplementation.
  • the terms health functional food, health food, and health supplement food are used interchangeably.
  • the health functional food is a food prepared by adding the composition of the present invention to food materials such as beverages, teas, spices, chewing gum, confectionery, or encapsulating, powdering, suspension, etc. It means bringing about an effect, but unlike general drugs, it has the advantage of having no side effects that may occur when taking the drug for a long time by using food as a raw material.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier, the kind of carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the food composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve smell, taste, vision, and the like.
  • vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like may be included.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr); And amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
  • the food composition includes preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleaching and highly bleaching, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydride, etc.) Oxytoleuene (BHT), etc.), coloring agent (tar color, etc.), coloring agent (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasoning (MSG sodium glutamate, etc.), sweetener (dulsin, cyclamate, saccharin, etc.) , Sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), expanding agents (alum, D-potassium hydrogen stannate, etc.), reinforcing agents, emulsifying agents, thickening agents (thickening agents), coating agents, gum base agents, foam inhibitors, solvents, improving agents, etc. It
  • the food composition of the present invention may be used as a health drink composition, and in this case, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as an additional ingredient, such as a conventional beverage.
  • the natural carbohydrates described above include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the health beverage composition of the present invention.
  • health beverage compositions include various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or a carbonation agent. In addition, it may contain flesh for the manufacture of natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These ingredients may be used independently or in combination. Although the ratio of these additives is not very important, it is generally selected from 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health beverage composition of the present invention.
  • a method for preventing or treating cardiovascular metabolic diseases comprising administering a pharmaceutical composition comprising noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • the noranehydroikaritin, pharmaceutically acceptable salts and cardiovascular metabolic diseases are as described above.
  • prevention of the present invention means any action that suppresses or delays the onset of cardiovascular and metabolic diseases by administration of the composition.
  • the prevention may be understood as an act of inhibiting or delaying the onset of cardiovascular and metabolic diseases by using the pharmaceutical composition of the present invention, but is not particularly limited thereto.
  • improvement of the present invention means any action that at least reduces the degree of cardiovascular metabolic disease.
  • treatment of the present invention refers to any action in which symptoms caused by cardiovascular metabolic disease are improved or beneficially changed by administration of a pharmaceutical composition.
  • the treatment may be understood as an act of improving the symptoms of cardiovascular metabolic disease or alleviating pathological symptoms by using the pharmaceutical composition of the present invention, but is not particularly limited thereto.
  • the “individual” refers to all animals including humans who have or may develop cardiovascular metabolic disease.
  • administration means introducing or treating the pharmaceutical composition of the present invention to an individual by an appropriate method, and specifically, using the pharmaceutical composition of the present invention, noranehydroikaritin and statin-based drugs May be administered in combination.
  • the statin-based drug may be atorvastatin or rosuvastatin, but is not limited thereto.
  • the noranehydroikaritin and statin-based drugs may be administered concurrently to an individual in simultaneous, sequential, or reverse order.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, and the pharmaceutically effective amount is an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects. To mean, it can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well known in the medical field.
  • the route and method of administering the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and in order to achieve the object of the present invention, the composition may follow any route and method of administration that can reach the individual.
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention contains noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, and the pharmaceutical composition inhibits PCSK9 production and PCSK9 gene expression without toxicity to cells. , Has the effect of generating LDLR.
  • noranehydroikaritin after treatment with noranehydroikaritin at different concentrations in HepG2 cells, the amount of LDLR mRNA was confirmed through RealTime-PCR (FIG. 4). As a result, it was confirmed that noranehydroikaritin has an effect of increasing LDLR production, so that it can lower blood cholesterol levels, and thus can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases.
  • noranehydroikaritin after treatment with noranehydroikaritin by concentration in HepG2 cells, the amount of PCSK9 mRNA was confirmed through RealTime-PCR (FIG. 3). As a result, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the production of PCSK9, increasing LDLR, and reducing blood cholesterol levels.
  • the PCSK9 promoter-reporter construct transfected HEK293T cells were treated with noranehydroikaritin by concentration, and the expression of PCSK9 was achieved through luciferase assay. It was confirmed whether it was suppressed (Fig. 5). As a result, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the expression of the gene of PCSK9, increasing LDLR, and reducing blood cholesterol levels.
  • the pharmaceutical composition may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, and sucrose, in the extract of the mixture. (sucrose) or lactose (lactose), it is prepared by mixing gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included. .
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.
  • an adjuvant for relieving side effects of statin-based drugs comprising as an active ingredient noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • noranehydroikaritin or a pharmaceutically acceptable salt thereof for alleviating side effects of statin drugs.
  • the noranehydroikaritin, pharmaceutically acceptable salts, and statin-based drugs are as described above.
  • the “adjuvant” refers to a substance that is administered in combination with a statin-based drug to alleviate the side effects thereof and thus enhance the preventive or therapeutic effect of cardiovascular metabolic diseases, but is not limited thereto.
  • Statin drugs have side effects that increase the expression of LDLR as well as increase PCSK9 in proportion to it.By co-administering noranehydricaritin as an adjuvant to compensate for this, the effect of increasing LDLR and reducing PCSK9 was achieved at the same time. , Better preventive or therapeutic effects of cardiovascular and metabolic diseases can be expected.
  • a method of alleviating side effects of statin-based drugs comprising the step of co-administering norhydroikaritin and statin-based drugs.
  • the noranehydroikaritin, pharmaceutically acceptable salts, statin drugs, subjects and administration are as described above.
  • Example 1 Separation of noranehydroikaritin from Sophora ginseng extract
  • Fraction SF Fraction SF Fr containing noranehydroikaritin by UPLC-QTof-MS analysis. 7 was concentrated, and a mixed solvent of distilled water (A) and MeOH (B) was used as a mobile phase using a reverse phase column (YMC ODS AQ, 250 ⁇ 20 mm, 5 ⁇ m, Japan) in PLC2020 prep-HPLC (YMC, Japan). Column chromatography was performed under the conditions of 0-5 min 30% (B), 5-35min 60% (B), and 35-40 min 100% (B) to separate noranehydroikaritin.
  • A distilled water
  • MeOH MeOH
  • the isolated noranehydroikaritin had a retention time of 5.75 minutes, UV 224 271, nm, and high resolution electronspray ionization mass spectrometry (HRESIMS) values of 353.1055 [MH]- molecular formula of C 2 0H 18 O 6 in UPLC analysis.
  • HRESIMS high resolution electronspray ionization mass spectrometry
  • HepG2 cells human liver hepatocellular carcinoma
  • HepG2 cells were suspended in DMEM (Welgene Inc.) medium to which 10% Fetal bovine Serum was added at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml and inoculated into 96-well plates by 100 ⁇ l. After 4 hours, samples of camperol and noranehydroikaritin were treated in well plates at concentrations of 2.5, 5, 10 and 20 ⁇ M, respectively. After incubation for 24 hours, 5 ⁇ l of MTT (5 mg/ml) was added to the well plate, followed by incubation for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, and DMSO was added to each well plate by 100 ⁇ l for reaction, and the absorbance was measured at 570 nm.
  • DMEM Fetal bovine Serum
  • Atorvastatin Ato
  • Rosuvastatin Ros
  • the cell viability was a relative value when the value of the negative control group treated with only DMSO was set to 100%. It was calculated according to the equation. The results are shown in FIG. 1.
  • noranehydroikaritin showed a higher cell viability at the same concentration than the control atorvastatin or rosuvastatin, and in particular, showed a high cell viability of 90% or more even at the highest concentration of 20 ⁇ M.
  • noranehydroikaritin is safe as a composition for preventing or treating cardiovascular and metabolic diseases because its cytotoxicity is low.
  • Example 3 Cell viability of HEK293T cells treated with noranehydroikaritin
  • HEK293T human embryonic kidneys were treated with noranehydroikaritin by concentration, and the viability of cells for each concentration of noranehydroikaritin was conducted through MTT screening. Results were calculated.
  • HEK293T cells were suspended in DMEM (Welgene Inc.) medium to which 10% Fetal bovine Serum was added at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/ml and inoculated into 96-well plates by 100 ⁇ l. After 4 hours, the noranehydroikaritin samples were treated in well plates at concentrations of 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ M, respectively. After incubation for 24 hours, MTT (5mg/ml) was added to the well plate by 5 ⁇ l and incubated for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, and DMSO was added to each well plate by 100 ⁇ l for reaction, and the absorbance was measured at 570 nm.
  • DMEM Fetal bovine Serum
  • noranehydroikaritin showed similar or higher cell viability at the same concentration compared to atorvastatin or rosuvastatin, which are controls, and a high cell viability of 90% or more even at the highest concentration of 20 ⁇ M.
  • noranehydroikaritin is safe as a composition for preventing or treating cardiovascular and metabolic diseases because its cytotoxicity is low.
  • PCSK9 Protein convertase subtilisin/kexin type 9
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • LDL low density lipoprotein
  • PCSK9 can alleviate lipid metabolism-related diseases by increasing LDLR and lowering extracellular LDL and cholesterol levels. Accordingly, in order to confirm the inhibitory effect of noranehydroikaritin on the production of PCSK9, the relative amount of PCSK9 mRAN was confirmed through RealTime-PCR after treatment with noranehydroikaritin in HepG2 cells by concentration.
  • HepG2 cells were suspended at a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 cells/ml, inoculated into a 23-well plate by 1 ml, and maintained for one day.
  • Chemferol and noranehydroikaritin were treated in a well plate of 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ M each, incubated for 24 hours, and then RNA was recovered and quantified and stored at -70°C. After that, RNA was synthesized with cDNA and the amount of PCSK9 mRNA was confirmed through Real time-PCR analysis. The group treated with DMSO alone was used as a negative control. The results are shown in FIG. 3.
  • noranehydroikaritin showed an excellent inhibitory effect on PCSK9 production at the same concentration compared to the control atorvastatin or rosuvastatin, and in particular, even at low concentrations of 2.5 and 5 ⁇ M, the inhibitory effect of PCSK9 production was significantly better than the control. Indicated. Through this, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the production of PCSK9, increasing LDLR and reducing blood cholesterol levels.
  • Example 5 Effect of LDLR production of noranehydroikaritin in HepG2 cells
  • LDLR is a protein that binds to LDL, which is a transporter of blood cholesterol. By binding to LDL and absorbing LDL into cells, LDLR can lower the level of blood cholesterol, thus alleviating cardiovascular metabolic diseases.
  • the relative amount of LDLR mRNA was confirmed through RealTime-PCR after treatment with noranehydroikaritin by concentration in HepG2 cells.
  • HepG2 cells were suspended at a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 cells/ml, inoculated into a 23-well plate by 1 ml, and maintained for one day.
  • Chemferol and noranehydroikaritin were treated in a well plate of 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ M each, incubated for 24 hours, and then RNA was recovered and quantified and stored at -70°C. After that, RNA was synthesized with cDNA and the amount of PCSK9 mRNA was confirmed through Real time-PCR analysis. The group treated with DMSO alone was used as a negative control. The results are shown in FIG. 4.
  • noranehydroikaritin exhibited a similar or higher LDLR production effect than that of the parent camperol at all concentrations, and exhibited a similar LDLR production effect at 10 ⁇ M compared to the control atorvastatin.
  • noranehydroikaritin has an effect of increasing LDLR production, so that it can lower the level of cholesterol in blood, and thus can be used for the prevention or treatment of cardiovascular and metabolic diseases.
  • Example 6 Inhibitory effect of PCSK9 gene expression by treatment with norehydroikaritin in HEK293T cells transfected with PCSK9 promoter-reporter construct
  • a primer was prepared to include the KpnI and XhoI restriction enzyme sites in the PCSK9 promoter gene site, followed by PCR (polymerase chain reaction), and electrophoresis was performed on an agarose gel to isolate the PCSK9 promoter site DNA. Agarose gel electrophoresis and gel extraction after treatment of the pGL4.14-[luc2/Hygro] vector containing firefly luminase as a reporter gene with the same restriction enzymes (KpnI and XhoI) Separated by performing.
  • the purely isolated PCSK9 promoter gene site and the pGL4.14-[luc2/Hygro] vector were reacted for 1 hour at 50 using In-fusion DNA ligase (Takara), and then transformed into E. coli to obtain the PCSK9 promoter.
  • An inserted promoter-reporter construct was prepared, and it was named pGL4.14-PCSK9.
  • HEK293T cells were transfected with pGL4.14-PCSK9, and then the luminase activity of the cell extract was measured.
  • the DNA-lipofectamine complex was prepared according to the manufacturer's protocol using 0.1 ⁇ g of promoter-reporter construct and lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen).
  • opti-MEM medium Invitrogen was used.
  • HEK293T cells were prepared in a 12-well plate at a concentration of 2.5 ⁇ 10 5 cells/ml by 1 ml by checking the number of cells immediately before the DNA was added.
  • the DNA-lipofectamine complex was carefully mixed with HEK 293T cells and then reacted in an incubator at 37°C for 6 hours. Subsequently, the medium was changed to find the transfected cells, and PCSK9-transfected HEK293T cells were found through the luciferase test.
  • the HEK293T cells after the reaction were treated with 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ M of noranehydroikaritin according to the experimental group, and then cultured for 18 hours.
  • the PCSK9 luminase activity was further reduced even at a lower concentration of noranehydroikaritin compared to the control, and the PCSK9 luminase activity decreased depending on the concentration of noranehydroikaritin. It was confirmed that the expression of the PCSK9 gene would also decrease in proportion to the concentration of anhydroikaritin. Through this, it was confirmed that noranehydroikaritin can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the expression of the gene of PCSK9, increasing LDLR and reducing blood cholesterol levels.
  • Roche protein elution solution
  • Protein extraction solution NP40
  • ELPIS BIOTECH Korea
  • the cells were mixed with RIPA lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 1). % NP-40, 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF], and a protein inhibitor cocktail [Roche Diagnostics, Heidelberg, Germany]). The protein concentration of the lysate was measured using a Bio-Rad dye-binding micro assay.
  • RIPA lysis buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 1). % NP-40, 0.1% sodium dodecyl sulfate [SDS], 1 mM
  • noranehydroikaritin can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by inhibiting the expression of PCSK9, increasing LDLR and reducing blood cholesterol levels.
  • RNA Using cDNA synthesized RNA by the method of Example 4, the amounts of PPAR ⁇ and ⁇ mRNA were confirmed through Realtime-PCR analysis. The group treated with DMSO alone was used as a negative control.
  • immunofluorescence staining immunohistochemistry
  • HepG2 cells were attached to a slide chamber and then cultured by treatment with 20 ⁇ M of noranehydroikaritin. After fixation with formalin, PPAR ⁇ and ⁇ were stained using antibodies targeting, and the nuclei were stained with DAPI, and the degree of fluorescence expression was confirmed using a confocal microscope.
  • noranehydroikaritin can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by increasing the expression of PPAR ⁇ and ⁇ to promote absorption and catabolism of fatty acids in the blood.
  • Example 9 SREBP promoter-reporter structure (promoter-reporter construct) transfected (transfected) HEK293T cells (transfected) the effect of suppressing the expression of SREBP gene according to the treatment of noranehydroikaritin
  • HEK293T cells were treated with noranehydroikaritin and camperol, and it was confirmed that the expression of SREBP was suppressed through luciferase assay.
  • SREBP1 and 2 promoter gene sites were prepared to contain KpnI and XhoI restriction enzyme sites, followed by PCR (polymerase chain reaction), and electrophoresis on agarose gel to isolate the SREBP promoter site DNA. Agarose gel electrophoresis and gel extraction after treatment of the pGL4.14-[luc2/Hygro] vector containing the firefly luminase enzyme with the reporter gene with the same restriction enzymes (KpnI and XhoI) Separated by performing. The purely isolated PCSK9 promoter gene site and pGL4.14-[luc2/Hygro] vector were reacted for 1 hour using In-fusion DNA ligase (Takara), and then transformed into E. coli and the SREBP promoter was inserted. A promoter-reporter construct was prepared, and it was named pGL4.14-SREBP.
  • HEK293T cells were transfected with pGL4.14-SREBP, and then the luminase activity of the cell extract was measured.
  • the DNA-lipofectamine complex was transfected into HEK293T cells in the same manner as in Example 6, and HEK293T cells transfected with SREBP were found through a luciferase test.
  • the HEK293T cells after the reaction were divided into a group treated with a sample and a group not treated according to the experimental group, treated with the sample, and cultured for 18 hours. Thereafter, by the method of Example 6, luminase activity was measured. All experiments were performed in duplicates three times, and promoter transcriptional activity was indicated by correcting the relative transcriptional activity with respect to the control group by transfection efficiency, and the student ⁇ s t-test was used for statistical processing.
  • noranehydroikaritin in contrast to the increase in SREBP1 and 2 luminase activity compared to the control group at the same concentration of camperol, noranehydroikaritin significantly decreased SREBP1 and 2 luminase activity compared to the control group as well as camperol.
  • noranehydroikaritin can be used in the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by down-regulating the expression of the SREBP gene to inhibit the synthesis of fatty acids and cholesterol in the liver.
  • Example 10 Inhibitory Effect of Atherosclerosis-related Proteins in HepG2 Cells When Norane Hydroikaritin and Statin Combined Treatment
  • Proteins were extracted by treating cells dispensed by the method of Example 7 with noranehydroikaritin and statins (atorvastatin, rosuvastatin) alone or simultaneously. Each 30 ⁇ g of protein was electrophoresed on an SDS-polyacrylamide gel and attached to the membrane, and then the amount of protein expression was confirmed using the respective antibodies: phospho-AMPK, PCSK9, LDLR, and PPAR ⁇ .
  • noranehydroikaritin can be treated in combination with statin-based drugs to alleviate side effects that increase the expression of PCSK9 as well as LDLR when treated with statin drugs.
  • noranehydroikaritin alone can be treated.
  • the expression of pAMPK, LDLR and PPAR ⁇ exhibits a synergistic effect, and it can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by reducing fatty acids and cholesterol in the blood.
  • Example 11 Inhibitory effect of PCSK9 in HepG2 cells pretreated with PCSK9 when treated with a combination of noranehydroikaritin and statin
  • proteins were extracted by treatment with noranehydroikaritin and statin-based drugs (atorvastatin, rosuvastatin) alone or at the same time.
  • statin-based drugs atorvastatin, rosuvastatin
  • Each 30 ⁇ g of the extracted protein was electrophoresed on an SDS-polyacrylamide gel, attached to a membrane, and then protein expression levels were confirmed using each antibody: PCSK9 and LDLR.
  • RNA was extracted and realtime PCR was performed.
  • LDLR was reduced by PCSK9 pretreatment in HepG2 cells.
  • LDLR expression decreased in cells treated with each statin alone, but LDLR expression was significantly increased in cells treated with noranehydroikaritin and each statin.
  • the expression level of PCSK9 was rather increased when PCSK9 was pretreated and each statin was treated alone, but the expression of PCSK9 was significantly reduced in the cells treated with noranehydroikaritin.
  • noranehydroikaritin can be combined with statin drugs to alleviate side effects that increase the expression of PCSK9 as well as LDLR when treated with statin drugs.
  • the expression of LDLR is reduced while the expression of PCSK9 is rather reduced. Since it can be improved to a remarkable level compared to the case of treatment, it can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by reducing fatty acids and cholesterol in the blood.
  • Example 12 Expression of proteins related to arteriosclerosis in HepG2 cells in combination with yellow hydroikaritin and pitavastatin, pravastatin, simvastatin, or fluvastatin
  • Proteins were extracted by treating cells dispensed by the method of Example 7 with noranehydroikaritin and respective statins (pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, or simvastatin) alone or simultaneously. Each 30 ⁇ g of protein was subjected to electrophoresis on an SDS-polyacrylamide gel, attached to the membrane, and then the amount of protein expression was confirmed using each antibody: PCSK9 and LDLR.
  • statins pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, or simvastatin
  • noranehydroikaritin is a statin-based drug to alleviate side effects that increase the expression of PCSK9 as well as LDLR when treated with statin drugs such as atorvastatin, rosuvastatin, pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, or simvastatin.
  • statin drugs such as atorvastatin, rosuvastatin, pravastatin, pitavastatin, fluvastatin, or simvastatin.
  • PCSK9 expression can be reduced while LDLR expression can be improved to a remarkable level compared to the case of single treatment.By reducing fatty acids and cholesterol in blood, it can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases. .
  • Example 13 Inhibitory effect of noranehydroikaritin on arteriosclerosis in a mouse carotid-ligation model injected with PCSK9
  • the carotid artery ligation was performed on a rat on a high fat diet for one week, and ligation was performed on the left common carotid artery (LCA) after abdominal anesthesia. Partial ligation of the three branches of the LCA, the external carotid artery (ECA), the internal carotid artery (ICA), and the occipital artery (OA). Ligation and ECA ligation separately. In the mice subjected to ligation, the amount of blood flow to the heart was reduced and the direction was changed, so an atherosclerosis model was produced.
  • LCA left common carotid artery
  • ECA external carotid artery
  • ICA internal carotid artery
  • OA occipital artery
  • Carotid artery ligation was performed one week after injection of AAV-PCSK9 Virus (1x10 11 ifu/ml) and noranehydro icaritin ( 10 ug/g/day). After 3 weeks of ligation, it was confirmed whether the atherosclerosis model was completed, and gross plaque imaging (immunofluorescence) was performed to confirm the inhibitory effect of norannehydroikaritin on arteriosclerosis.
  • noranehydroikaritin inhibits the progression of inflammatory reactions in blood vessels and has an effect of alleviating arteriosclerosis, and it can be used for the prevention or treatment of cardiovascular metabolic diseases by increasing LDLR by reducing PCSK9 expression and reducing blood fatty acids and cholesterol. I can.

Abstract

본 발명은 노르안하이드로이카리틴(noranhydroicaritin) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 세포에 대한 독성이 없어 안전성을 확보하면서도, PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 생성을 억제하고, LDLR(Low density lipoprotein receptor)의 생성을 촉진하여 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 활용도가 높다. 또한, 본 발명의 노르안하이드로이카리틴은 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 노르안하이드로이카리틴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법으로 사용할 수 있다.

Description

노르안하이드로이카리틴을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 노르안하이드로이카리틴(noranhydroicaritin)을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 세포에 대한 독성이 없으면서, PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 생성을 억제하고, LDLR(Low density lipoprotein receptor)의 생성을 촉진하는 효과를 갖는 노르안하이드로이카리틴을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 노르안하이드로이카리틴을 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 노르안하이드로이카리틴을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
최근 풍부하고 다양한 식생활 및 생활양식의 변화로 영양섭취는 불균형 상태가 되기 쉬우며 기계화된 현대 생활은 운동 부족을 초래하게 되었다. 그 결과 질병의 형태도 선진국형으로 변화하고 그에 따라 심혈관 대사 질환의 이환율도 증가하고 있다. 심혈관 대사 질환이란, 생체내의 당질, 지질 등의 대사 불균형에 의해 발생하는 질환을 말하는 것으로, 심혈관 질환, 이상지질혈증, 비만 또는 당뇨병 등이 주요 질환에 해당한다.
심혈관 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 전세계적으로 가장 높은 사망의 원인이 되는 질환이다. 심혈관 질환에 속하는 주요 질병으로는 고혈압, 협십증, 심근경색증, 동맥경화증, 죽상경화증, 뇌졸중, 부정맥 등이 있다. 심혈관 질환과 관련된 위험인자는 연령, 성별, 흡연, 운동부족 및 비만 등이 있으나, 최근 서구화된 식생활 및 급격한 생활양식의 변화를 고려할 때, 특히 지단백(lipoprotein)에 의한 콜레스테롤의 축적이 대표적인 원인으로 꼽힐 수 있다.
동맥경화증은 동맥 내벽에 지방질 및 섬유조직이 쌓여 혈관벽이 좁아지거나 막히게 되는 것으로, 동맥경화증이 가벼울 경우 정상적인 활동에 지장은 없으나, 동맥경화증으로 관상조직의 50~70% 이상이 막히면 동맥경화성 심장병이 야기될 수 있다. 또한, 심할 경우 뇌동맥 또는 관상동맥이 파열될 수 있고 이 경우 뇌혈관 질환, 심장질환 등의 심혈관계로 발전하게 된다. 뇌동맥경화증의 경우 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화증의 경우 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발될 수 있다. 현재 동맥경화증의 치료제로 HMG-CoA reductase 저해제인 다양한 스타틴(statin) 계열 약물 등이 개발되어 있으나, 여전히 보다 효과적인 치료제의 개발의 필요성이 대두되고 있다.
이상지질혈증은 혈중에 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 또는 중성지방이 증가된 상태거나, HDL-콜레스테롤이 감소된 상태를 의미한다. 구체적인 예로, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증 등이 여기에 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유전적 요인, 비만, 당뇨 또는 음주 등의 원인에 의해 발생할 수 있으나, 특히 지방 함량이 높은 식생활에 의해 혈중 지질이 증가되어 이상지질혈증이 발생할 수 있다. 최근 한약재 및 식품 등의 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 또는 다양한 추출물의 제조방법으로, 고지혈증 치료용 사물활혈탕 조성물(한국공개특허 제2015-0064400호)등이 개발되고 있으나, 기존의 합성 약학적 조성물보다 치료 효과가 우수하며, 부작용이 적은 천연 약학적 조성물 또는 그 원료에 대한 개발은 아직까지 미비한 실정이다.
비만은 지방간, 고혈압, 당뇨병, 심혈관계질환 등의 만성질환을 유발하는 것으로 널리 알려져 있으며, 최근 보건복지가족부의 2007년 국민건강ㆍ영양조사결과에 의하면 한국성인의 31.7%가 비만으로 나타났다. 또한, 전 세계인구의 약 25%에 해당하는 17억명이 현재 과체중(BMI> 25)이고, 미국, 유럽, 일본 등 주요 국가들의 1억 2천명을 포함한 서구지역 3억명 이상이 비만환자(BMI> 30)로 분류되고 있다. 국내외에서 판매되는 비만치료제로는 미 FDA에서 승인을 받은 orlistat을 주원료로 하는 '제니칼'이 있는데, 리파아제 작용을 억제하는 제니칼의 경우 지방변, 가스생성, 지용성 비타민 흡수 저하 등의 위장계 부작용이 있는 것으로 알려져 있다.
당뇨병은 인슐린 분비가 부족한 경우(I형), 또는 인슐린에 대한 감수성이 떨어져 당질 대사에 이상이 생기는 경우(Ⅱ형)의 두 가지 유형이 있고, 전체 당뇨병 환자 중 90%를 차지할 정도로 Ⅱ형이 훨씬 더 흔하다. Ⅱ형 당뇨병은 인슐린 비-의존성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes mellitus/NIDDM)으로, 종래 인슐린 비-의존성 당뇨병을 치료하기 위한 물질로서는 PPAR-γ 활성제, GLP-1 유도체, DPP-IV 저해제, PTP1B 저해제 등이 개발되어 있으나, 각각의 부작용으로서 간이나 신장, 근육, 심장에 대한 독성 및 체중증가 증상 등이 알려져 있다.
요컨대, 심혈관 대사 질환의 주요 원인을 해결하기 위해, 혈중 지질 농도를 저하시키는 것이 중요하다고 할 수 있고, 혈중 지질 농도를 저하시키는 방법으로는 고지방 식이를 억제하는 식이요법, 운동요법 및 약물요법 등이 권장되고 있다. 그러나, 식이요법이나 운동요법은 엄격한 관리 및 실시가 어려우며, 그 효과에 한계가 있는 경우가 많다. 또한 현재까지 개발된 지질 농도 감소제로는 담즙산 결합 수지, HMG-CoA 환원효소 억제제, 네오마이신 등과 같은 콜레스테롤 함량을 저하시키는 약제 및 피브린산 유도체, 니코틴산 및 어유 등 중성지방 함량을 낮추는 약제들이 치료제로 이용되고 있다. 그러나 이와 같은 약제들은 간 독성, 위장장해 및 암 발생 등과 같은 부작용이 있다.
한편, 본 발명에 사용한 노르안하이드로이카리틴(noranhydroicaritin)은 화학식 C20H18O6을 가지는 분자량 354.3629인 화합물(Komatsu et al. 1970)로서, 고삼(苦蔘, [Sophora flavescens] Aiton)에 함유된 플라보노이드(Flavonoid) 계열 화합물로 알려져 있다. 현재까지 노르안하이드로이카리틴이 특정 질병의 억제 활성이 있다고 알려진 바는 없고, 다만 노르안하이드로이카리틴의 모체가 되는 켐페롤(Kaempferol)은 알레르기성 천식의 억제, 항암, 항염, 항산화 등에 효과가 있다고 알려져 있을 뿐이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 천연물로부터 유래되어 안전성을 나타내면서도 심혈관 대사 질환에 대한 예방 또는 치료효과가 우수한 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 고삼으로부터 수득한 플라보노이드 계열 화합물인 노르안하이드로이카리틴이 세포독성이 없으면서도 PCSK9 생성을 억제하고 LDLR 생성을 촉진하여 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 고삼으로부터 추출한 성분인 노르안하이드로이카리틴은 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 효과가 우수하다. 구체적으로, 본 발명의 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 세포에 대한 독성이 없어 안전성을 확보하면서도, PCSK9의 생성을 억제하고, LDLR의 생성을 촉진하여 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 활용도가 높다. 또한, 본 발명의 노르안하이드로이카리틴은 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 개선용 식품 조성물, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 및 노르안하이드로이카리틴을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법으로 사용할 수 있다.
도 1은 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 각각 농도별로 처리한 HepG2 세포의 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 2는 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리한 HEK293T 세포의 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 3은 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 각각 농도별로 처리한 HepG2 세포에서 PCSK9 mRNA의 양을 나타낸 것이다.
도 4는 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 각각 농도별로 처리한 HepG2 세포에서 LDLR mRNA의 양을 나타낸 것이다.
도 5는 PCSK9 promoter-reporter construct를 transfection시킨 HEK293T 세포에서 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리하고, HEK293T 세포의 PCSK9 luciferase 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 PCSK9 및 LDLR을 표적으로 하는 면역블롯(immunoblotting)을 수행하여 그 발현 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리시 PPARα와 PPARγ의 mRNA량을 나타낸 것과, PPARα와 PPAR γ의 증가량을 면역형광염색법으로 나타낸 것이다.
도 8은 SREBP 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 형질주입(transfection)시킨 HEK293T세포에서 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 각각 농도별로 처리하여 SREBP luciferase 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴과 스타틴을 병용처리하였을 때 동맥경화에 관여하는 단백질의 발현변화를 나타낸 것이다.
도 10은 PCSK9으로 자극한 HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴과 스타틴을 병용처리하였을 때 동맥경화에 관여하는 단백질(LDLR)의 발현변화를 나타낸 것이다.
도 11은 HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴과 프라바스타틴(Pravastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 또는 심바스타틴(Simvastatin)을 병용처리하였을 때 동맥경화에 관여하는 단백질인 PCSK9의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 12는 HepG 세포에 노르안하이드로이카리틴과 아토바스타틴(Atorvastatin), 로수바스타틴 (Rosuvastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 플루바스타틴(Fluvastatin), 또는 심바스타틴(Simvastatin)을 병용처리하였을 때 동맥경화에 관여하는 단백질인 LDLR의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 PCSK9 과 노르안하이드로이카리틴을 처리한 마우스 동맥경화 모델을 나타낸 것이다.
도 14는 마우스 동맥경화 모델 확인을 위해, 웨스턴 블롯을 통해 간 조직에서의 PCSK9 발현 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 마우스 동맥경화 모델에서 carotid-ligation 후, 노르안하이드로이카리틴에 의한 회복 정도를 나타낸 것이다.
도 16는 마우스 동맥경화 모델에서 노르안하이드로이카리틴 처리시, 염증반응을 일으키는 대식세포의 마커 F/480, 염증반응이 일어날 때 분비되는 전염증성 싸이토카인인 TNF-a, IL-1B, MCP-1, 및 PCSK9의 수준을 면역형광법을 통해 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 상기와 같은 과제들을 해결하고, 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명의 "노르안하이드로이카리틴(noranhydroicaritin)"은 화학식 C20H18O6을 갖는 분자량 354.3629인 화합물로서, 고삼(苦蔘, [Sophora flavescens] Aiton) 중 특히 고삼 뿌리에 함유된 플라보노이드(Flavonoid) 계열 화합물이다. 상기 "플라보노이드"는 식물에 널리 함유되어 있는 노란색 계통의 색소로, 페닐기 2개가 C3사슬을 매개하여 결합한 탄소골격구조로 되어 있고, 생체 내에서 다양한 활성을 지니는 물질로 알려져있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 개체에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미하는 것으로, "약학적으로 허용가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다.
본 발명의 "켐페롤(kaempferol)"은 화학식 C15H10O6을 갖는 분자량 286.24인 화합물로서, 플라보노이드 계열 화합물에 속한다. 자연계에서는 퀘르세틴(quercetin)에 이어서 많이 존재하며, 브로콜리, 포도, 사과, 양파 등에 배당체 형태로 함유되어 있다. 켐페롤은 산화 스트레스를 줄임으로써 항산화제 역할을 하며, 섭취시 다양한 암의 위험을 줄일 수 있다고 알려져 있다(Kim and Choi, 2013).
본 발명의 "고삼(苦蔘, [Sophora flavescens] Aiton)"은 쌍떡잎 식물 장미목 콩과에 속하는 여러해살이풀이다. 도둑놈의 지팡이, 너삼, 뱀의 정자나무라고도 한다. 키는 80-120cm 정도로 전체에 노란색의 짧은 털이 있고, 뿌리는 비대하며 매우 쓴맛이 난다. 한방에서는 이 뿌리를 말린 것을 고삼이라고 하는데, 소화불량, 황달, 치질 등에 처방하는 것으로 알려져 있다. 민간에서는 줄기나 잎을 달여서 살충제로 쓰기도 한다.
본 발명의 용어 "심혈관 대사 질환"이란, 생체내의 당질, 지질 등의 대사 불균형에 의해 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 심혈관 질환 및 대사성 질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "심혈관 질환"은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환으로, 주요 질병으로는 고혈압, 협십증, 심근경색증, 동맥경화증, 죽상경화증, 뇌졸중, 부정맥 등이 있으며, 혈관 내 콜레스테롤의 축적(총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중성지방의 증가, HDL 콜레스테롤의 감소)이 대표적인 원인으로 꼽힐 수 있다.
상기 "대사성 질환"은 특별히 제한되지 않으나, 당질 대사 이상 또는 지질 대사 이상에 의한 대사성 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 용어 "당질 대사 이상에 의한 대사성 질환"이란 생체 내 당질의 대사과정에 있어서 발생한 불균형에 의한 질환을 말하는 것으로서, 특별히 이에 제한되지 않으나, 당뇨병, 당뇨병전증, 2형 당뇨병 등을 포함할 수 있다. 또한, 구체적으로, "지질 대사 이상에 의한 대사성 질환"이란 생체 내 지질의 대사과정에 있어서 발생한 불균형에 의한 질환을 말하는 것으로서, 특별히 이에 제한되지 않으나, 심혈관 질환과 이상지질혈증, 비만 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "독성"이란, "화학적, 물리적 또는 생물학적 작용물이 생명체와 생태계에 끼치는 악영향"을 의미한다.
본 발명의 용어 "LDL(Low density lipoprotein)"이란, 간에서 생산된 초저밀도 지단백질(VLDL; very low density lipoprotein)이 혈관 내에서 분해되어 만들어진 것으로서, 간이나 장의 콜레스테롤을 조직으로 운반하는 지단백질의 하나로 분류된다. apolipoprotein B-100과 Apo E, 비타민 E 및 카로티노이드와 같은 항산화 비타민을 포함하고 있으며, 조직세포에서 세포막, 호르몬을 합성 또는 저장한다. LDL은 세포막에 있는 수용체 LDLR(Low density lipoprotein receptor)와 결합하여 세포내로 운반되며 리소좀에서 가수분해 되는데, 수용체에 이상이 생기면 고 콜레스테롤 혈증을 유발하게 된다. LDL은 콜레스테롤을 많이 함유하고 있으므로 혈액 내에 증가하게 되면 관상동맥질환과 심장발작의 위험이 높아질 수 있다.
본 발명의 용어 "LDLR(Low density lipoprotein receptor)"이란, 혈중 주요콜레스테롤의 운반체인 LDL과 결합하는 단백질로서, 콜레스테롤이 풍부한 LDL의 엔도사이토시스(endocytosis)를 매개하여 LDL의 혈장 레벨을 유지하는 역할을 한다. LDLR은 LDL 입자의 외부 인지질 층에 삽입된 apoprotein B100을 인식하는 세포-표면 수용체로서, LDLR을 통한 LDL의 엔도사이토시스는 모든 유핵 세포에서 일어나지만, 주로 간에서 혈중 LDL의 약 70%를 제거한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 노르안하이드로이카리틴의 LDLR 생성 증가 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 LDLR mRNA 양을 확인하였다(도 4). 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 LDLR 생성 증가 효과가 있으므로, 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 따라서 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어 "PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)"이란, 인간의 1번 염색체 상의 PCSK9 유전자에 의해 암호화 되는 효소로서, 많은 조직과 세포 유형에 편재한다. PCSK9은 LDL의 수용체 LDLR에 결합하는데, 간 및 다른 세포막에서 LDLR-LDL 결합체가 세포 내로 흡수된 후 PCSK9이 LDLR에 결합할 경우, PCSK9이 LDLR을 분해하여 더 이상 LDLR이 LDL 입자와 결합하기 세포막 표면으로 재생되는 것을 막는다. 이에, PCSK9을 차단하거나 생성을 억제하면, 더 많은 LDLR이 재생되고 혈중 LDL 입자의 농도를 낮출 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 노르안하이드로이카리틴의 PCSK9 생성 억제 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 PCSK9 mRNA 양을 확인하였다(도 3). 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 생성을 억제하여 LDLR을 증가시키고, 혈중 콜레스테롤의 수치를 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 노르안하이드로이카리틴의 처리에 따른 PCSK9 유전자의 발현 억제 효과를 확인하기 위해, HEK293T 세포 추출물에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리하고, luciferase assay를 통해 PCSK9의 발현이 억제되는지 확인하였다(도 5). 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 유전자의 발현을 억제하여 LDLR을 증가시키고, 혈중 콜레스테롤 수치의 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어 "AMPK(AMP-activated protein kinase)"란, ATP 대 AMP의 비율을 모니터링 함으로써 낮은 에너지 상태를 감지하는 조절적 β/γ 서브유닛 및 촉매적 α 서브유닛을 포함하는 효소로서, 세포의 에너지 항상성을 유지하는 역할을 한다. AMPK는 근육 수축 및 운동 시 AMPK의 상위효소인 LKB1 및 CaMKK(Ca2+ /calmodulin-dependent kinase kinase)에 의한 트레오닌 172의 인산화에 의해 활성화된다(phospho-AMPK, pAMPK). AMPK의 활성화에 따라, 간 및 골격근에서의 지방산 산화, 글루코스 섭취의 촉진 및 콜레스테롤 합성의 억제 등의 효과가 나타난다. 구체적으로, 골격근 내에서의 글루코스의 섭취는 원형질막으로의 GLUT4의 이동(translocation)이 향상됨으로써 일어난다. 또한, AMPK는 지방 조직에서 유래된 2가지 호르몬인 렙틴(leptin)과 아디포넥틴(adiponectin)의 표적 분자이며, 상기 호르몬들은 에너지 대사 및 글루코스 항상성의 주요 조절인자이다(Ewart and Kennedy, 2012; Penumathsa et al. 2009; Samovski et al. 2012).
본 발명의 용어 “PPAR(Peroxisome proliferator activated receptor)”는 핵수용체(nuclear hormone receptor) superfamily 에 속하는 전사 인사로서, 지방대사 및 당대사를 조절하며 세포의 증식과 분화를 조절하는 역할을 한다. PPARs는 α, β, γ 세 가지의 형태가 알려져 있는데, 이들은 각각 서로 다른 세 유전자에 의해 발현된다. PPARα의 표적 유전자 대부분은 지방산의 세포 내 유입과 지방대사물의 산화를 조절하는 중요한 효소들인 반면, PPARγ은 지방 조직에서 다량으로 발현하여 지방세포의 분화와 잉여 에너지를 지방형태로 저장 및 인슐린과 당의 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 노르안하이드로이카리틴 처리에 따른 PPAR α와 γ 발현 증가 효과를 확인한 결과, 노르안하이드로이카리틴을 처리한 군에서 그 농도 의존적으로 PPARα 와 γ 의 발현이 증가함을 확인하였다(도 7). 이로부터, 노르안하이드로이카리틴은 PPARα 와 γ의 발현을 증가시켜 혈중 지방산의 흡수 및 이화 작용을 촉진함으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 “SREBP(sterolregulatory elementbinding protein)”는 지방산과 콜레스테롤의 생합성 경로에 관련되는 효소들을 활성화하여 간에서 지방산과 콜레스테롤 합성을 조절하는 중요한 전사활성인자이다. SREBP에는 1a, 1c 및 2의 세 가지 종류가 있으며, SREBP-1a와 SREBP-1c는 주로 지방산 및 중성지방의 합성에 관여하고 SREBP-2는 콜레스테롤 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 인슐린 저항성으로 인해 발생하는 고인슐린혈증은 간의 SREBP-1c의 발현을 증가시킴으로써 지방산의 생합성을 증가시키고 결과적으로 간조직에 중성지방의 축적을 유발한다. 또한, SREBP-1c는 지방합성 효소인 aceryl-CoA carboxylase(ACC)와 fatty acid synthase(FAS) 유전자의 발현을 증가시키는 전사인자로, ACC와 FAS의 발현을 증가시켜 간세포에서 지방산의 축적을 유발한다.
한편, SREBP-1c의 활성은 상기 “AMP-activated protein kinase(AMPK)”에 의해 억제되는데, AMPK는 serine/threonine kinase의 일종으로 세포 내 에너지(ATP)가 결핍될 때 활성화되어 세포 내 에너지 생산을 증가시키는 효소이다. 활성화된 AMPK는 지방산의 베타-산화(beta-oxidation)와 같은 ATP를 생성시키는 이화과정을 자극하고, 지방생성과 같은 ATP를 소비하는 과정을 억제한다. 그러므로 AMPK 활성화는 SREBP-1c 활성의 하향조절을 통해 지방합성 효소의 발현을 억제하여 지방합성을 억제한다.
본 발명의 일 실시예에서는, HEK293T 세포에 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 각각 처리하고, 발광효소 분석(luciferase assay)를 통해 SREBP의 발현이 억제되는지 여부를 확인한 결과, 동일 농도의 켐페롤에서 대조군 대비 SREBP1 및 2 발광효소 활성이 오히려 증가한 것과 달리, 노르안하이드로이카리틴은 켐페롤 뿐만 아니라 대조군 대비 SREBP1 및 2 발광효소 활성이 현저하게 감소하였음을 확인하였다(도 8). 이로부터, 노르안하이드로이카리틴은 SREBP 유전자의 발현을 하향 조절하여 간에서 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제함으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 스타틴 계열 약물을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 “스타틴(statins)”은 콜레스테롤 생합성의 초기 단계에 관여하는 HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A) 환원효소의 경쟁적 억제제로 작용하여 혈청 콜레스테롤 농도를 낮추는 약물로, 본 명세서 내에서 “스타틴 계열 약물”과 혼용된다. 상기 스타틴은 간세포에서 콜레스테롤 합성을 억제하고, 저밀도 지질단백질 수용체(Low density lipoprotein receptor, LDLR) 발현을 증가시켜 혈중 LDL-C(low density lipoprotein-cholesterol) 수치를 낮춘다. 이외에도 중성지방 수치의 감소와 HDL-C (high density lipoprotein-cholesterol) 수치를 증가시키는 효과가 있어, 이상지질혈증 환자에서 지질 조절을 위해 일반적으로 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 스타틴은 아토르바스타틴(Atorvastatin), 로수바스타틴(Rosuvastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 심바스타틴(Simvastatin), 또는 플루바스타틴(Fluvastatin)일 수 있으나, HMG-CoA 환원효소의 저해 활성을 갖는 한 특별히 이에 제한되지 않는다.
다만, 효과와 비례하게 나타나는 스타틴 계열 약물의 부작용으로 간수치 상승과 횡문근 융해증 등이 있으며, 기전 연구를 통해 LDLR은 증가시키지만 그와 비례하게 PCSK9도 함께 증가시킨다는 결과가 나오고 있어 이를 보완할 수 있는 보조약물에 대한 연구가 중요하다. 구체적으로, 상기 부작용은 PCSK9의 동반 증가일 수 있다. 특히, 스타틴으로도 치료목표치의 LDL-C를 얻지 못할 경우 스타틴을 최대용량으로 증량시키기도 하지만, 다른 계열의 약물을 병용하는 병용요법이 권고되며, 고령자 및 중증 환자에서 고농도의 스타틴을 처리하여 약물의 효과를 기대할 수 있지만, 그만큼 부작용이 나타날 수 있기 때문에 이를 보완할 수 있는 보조 약물의 병용투여에 대한 연구가 각광받고 있으며, 병용투여시 LDLR 의 증가 및 PCSK9의 감소 활성을 통해 보다 우수한 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴과 스타틴 병용처리시 동맥경화 관련 단백질 억제 효과를 확인하였으며, PCSK9을 전처리한 HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴과 스타틴 병용처리시 PCSK9 억제 효과가 있음을 확인하였다(도 9 내지 도 12). 이로부터, 노르안하이드로이카리틴은 스타틴 계열 약물의 처리시 LDLR 뿐 아니라 PCSK9도 증가시키는 부작용을 완화하기 위해 스타틴 계열 약물과 병용처리될 수 있으며, 이 경우 노르안하이드로이카리틴을 단독으로 처리한 경우 대비 pAMPK, LDLR 및 PPARγ의 발현이 증가하는 상승작용을 나타내는바, 혈중 지방산 및 콜레스테롤을 감소시킴으로써 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "약학적 조성물"이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 외용제, 좌제, 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 제형화 할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 완충제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란, 생물체를 자극하지 않으면서 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occurring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 노르안하이드로이카리틴, 약학적으로 허용가능한 염 및 심혈관 대사 질환은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "식품"이란, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품, 발효차 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 용어 "건강 기능(성) 식품"(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없으며, 휴대성이 뛰어난 장점이 있다.
상기 "건강 식품"(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100ml 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ~ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 노르안하이드로이카리틴, 약학적으로 허용가능한 염 및 심혈관 대사 질환은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 심혈관 대사 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 예방은 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 심혈관 대사 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 행위를 의미하는 행위로 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "개선"이란, 심혈관 대사 질환의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 약학적 조성물의 투여에 의해 심혈관 대사 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 심혈관 대사 질환의 증세를 호전시키거나 병리증상을 경감시키는 행위를 의미하는 행위로 이해될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 “개체”는 심혈관 대사 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는, 인간을 포함한 모두 동물을 의미한다.
본 발명의 용어 “투여”란, 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입 또는 처리하는 것을 의미하며, 구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 노르안하이드로이카리틴 및 스타틴 계열 약물을 병용 투여하는 것일 수 있다. 상기 스타틴 계열 약물은 아토르바스타틴(Atorvastatin) 또는 로수바스타틴(Rosuvastatin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 노르안하이드로이카리틴 및 스타틴 계열 약물은 동시, 순차적, 또는 역순으로 개체에게 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 상기 약학적으로 유효한 양이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하는 것으로, 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 경로 및 방식은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 상기 조성물이 개체 내에 도달할 수 있는 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 상기 약학적 조성물은 세포에 대한 독성이 없으면서도 PCSK9 생성 및 PCSK9 유전자 발현을 억제하고, LDLR을 생성하는 효과가 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 LDLR mRNA 양을 확인하였다(도 4). 그 결과, 노르안하이드로이카리틴은 LDLR 생성 증가 효과가 있으므로, 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 따라서 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 PCSK9 mRNA 양을 확인하였다(도 3). 그 결과, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 생성을 억제하여 LDLR을 증가시키고, 혈중 콜레스테롤의 수치를 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, PCSK9 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 형질주입(transfection)한 HEK293T 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리하고, luciferase assay를 통해 PCSK9의 발현이 억제되는지 확인하였다(도 5). 그 결과, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 유전자의 발현을 억제하여 LDLR을 증가시키고, 혈중 콜레스테롤 수치의 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 혼합물의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 스타틴 계열 약물의 부작용 완화용 보조제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의, 스타틴 계열 약물의 부작용 완화용도를 제공한다.
상기 노르안하이드로이카리틴, 약학적으로 허용가능한 염 및 스타틴 계열 약물을 전술한 바와 같다.
상기 “보조제”는 스타틴 계열 약물과 병용 투여되어 그 부작용을 완화시켜 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 효과를 증진시킬 수 있는 물질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 스타틴 계열 약물은 LDLR의 발현 증가뿐만 아니라 그와 비례하게 PCSK9도 함께 증가시키는 부작용이 있는바, 이를 보완하기 위한 보조제로 노르안하이드이카리틴을 병용 투여하여 LDLR 증가 및 PCSK9을 감소 효과를 동시에 달성하고, 보다 우수한 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로, 노르하이드로이카리틴 및 스타틴 계열 약물을 병용 투여하는 단계를 포함하는, 스타틴 계열 약물의 부작용을 완화시키는 방법을 제공한다. 상기 노르안하이드로이카리틴, 약학적으로 허용가능한 염, 스타틴 계열 약물, 개체 및 투여는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 고삼 추출물로부터 노르안하이드로이카리틴 분리
음건한 고삼 203 g을 잘게 분쇄하여 100% methanol (MeOH, 1L×3)을 가하여 실온에서 24시간 3회 반복 추출한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하여 MeOH 추출물(13.9 g, 추출 수율 6.8%)을 얻었다. 얻은 추출물 1.0 g을 MPLC 기기에 250×20 mm에 YMC ODS AQ HG (220 g)을 충진한 칼럼관에 역상 조건(0-15min 35% MeOH, 15-65 min 35-100% MEOH, 65-90 min 100% MeOH)에서 UV 검출기(254 nm)를 사용하여 총 9개의 분획물(SF Fr. 1-9)을 얻었다. UPLC-QTof-MS분석으로 노르안하이드로이카리틴이 포함된 분획물 SF Fr. 7을 농축하여 PLC2020 prep-HPLC (YMC, Japan)에 역상칼럼 (YMC ODS AQ, 250×20 mm, 5 ㎛, Japan)를 사용하여 증류수(A), MeOH (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 0-5 min 30% (B), 5-35min 60% (B), 35-40 min 100% (B) 조건으로 column chromatography를 실시 하여 노르안하이드로이카리틴을 분리하였다. 분리한 노르안하이드로이카리틴은 UPLC 분석에서 retention time은 5.75분, UV 224 271, nm, high resolution electronspray ionization mass spectrometry (HRESIMS) 값은 353.1055 [M-H]- 분자식은 C20H18O6를 가졌다.
실시예 2: 노르안하이드로이카리틴 처리한 HepG2 세포의 세포생존율
노르안하이드로이카리틴의 세포에 대한 독성을 확인하기 위해, HepG2 세포 (human liver hepatocellular carcinoma)에 켐페롤 및 노르안하이드로이카리틴을 각각 농도별로 처리하고, MTT 검색법을 통해 각 농도에 대한 HepG2 세포의 생존율을 계산하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 소 태아 혈청(Fetal bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM (Welgene Inc.) 배지에 1×105개/ml의 농도로 현탁하여 96-웰 플레이트에 100㎕씩 접종하였다. 4시간 경과 후, 켐페롤 및 노르안하이드로이카리틴 시료를 2.5, 5, 10, 20μM의 농도로 웰 플레이트에 각각 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, MTT(5mg/ml)를 웰 플레이트에 5㎕씩 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고, DMSO를 웰 플레이트에 100㎕씩 첨가하여 반응시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 콜레스테롤 합성 저해제인 아토르바스타틴(Atorvastatin, Ato), 로수바스타틴(Rosuvastatin, Ros)을 사용하였고, 세포생존율은 DMSO만을 처리한 음성 대조군의 값을 100%로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값으로서, 하기 수학식에 따라 계산하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2020002773-appb-M000001
도 1에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴은 대조군인 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴에 비해 동일 농도에서 더 높은 세포생존율을 나타내었고, 특히, 20μM의 최고 농도에서도 90% 이상의 높은 세포생존율을 나타내었다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 세포독성이 낮으므로 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 안전성이 있음을 확인하였다.
실시예 3: 노르안하이드로이카리틴 처리한 HEK293T 세포의 세포생존율
노르안하이드로이카리틴의 세포에 대한 독성을 확인하기 위해, HEK293T (human embryonic kidneys에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리하고, MTT 검색법을 통해 노르안하이드로이카리틴의 각 농도에 대한 세포의 생존율을 계산하였다.
구체적으로, HEK293T 세포를 소 태아 혈청(Fetal bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM (Welgene Inc.) 배지에 1×105개/ml의 농도로 현탁하여 96-웰 플레이트에 100㎕씩 접종하였다. 4시간 경과 후, 노르안하이드로이카리틴 시료를 2.5, 5, 10, 20μM의 농도로 웰 플레이트에 각각 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, MTT (5mg/ml)를 웰 플레이트에 5㎕씩 첨가하여 4시간 더 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고, DMSO를 웰 플레이트에 100㎕씩 첨가하여 반응시킨 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 콜레스테롤 합성 저해제인 아토르바스타틴(Atorvastatin), 로수바스타틴(Rosuvastatin)을 사용하였고, 세포생존율은 DMSO만을 처리한 음성 대조군의 값을 100%로 하였을 때 그에 대한 상대적인 값으로서, 상기 수학식 1에 따라 계산하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴은 대조군인 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴에 비해 동일 농도에서 비슷하거나 더 높은 세포생존율을 나타내었고, 20μM의 최고 농도에서도 90% 이상의 높은 세포생존율을 나타내었다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 세포독성이 낮으므로 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 안전성이 있음을 확인하였다.
실시예 4: HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴의 PCSK9 생성 억제 효과
PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)은 지질 대사에 관여하는 효소로서, 간 또는 다른 세포막에서 LDL(low density lipoprotein)과 결합된 LDLR(low density lipoprotein receptor)에 부착되어 LDLR을 분해함으로써, LDLR이 다시 세포막으로 재생되어 세포 밖의 LDL을 흡수할 수 없도록 한다. 따라서, PCSK9의 억제는 LDLR을 증가시키고 세포 밖의 LDL 및 콜레스테롤 수치를 낮춤으로써, 지질 대사 관련 질환을 완화할 수 있다. 이에, 노르안하이드로이카리틴의 PCSK9 생성 억제 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 PCSK9 mRAN의 상대적인 양을 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 2.5×105개/ml 농도로 현탁하여 23-웰 플레이트에 1ml씩 접종한 후, 하루 동안 유지하였다. 켐페롤 및 노르안하이드로이카리틴을 2.5, 5, 10, 20μM씩 웰 플레이트에 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 RNA를 회수 및 정량하여 -70℃에 보관하였다. 그 후 RNA를 cDNA로 합성하고 Real time-PCR 분석을 통해 PCSK9 mRNA의 양을 확인하였다. DMSO만을 처리한 군을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴은 대조군인 아토르바스타틴 또는 로수바스타틴에 비해 동일한 농도에서 우수한 PCSK9 생성 억제 효과를 보였고, 특히 2.5 및 5μM의 낮은 농도에서도 대조군보다 현저히 우수한 PCSK9 생성 억제 효과를 나타내었다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 생성을 억제하여 LDLR을 증가시키고 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴의 LDLR 생성 효과
LDLR은 혈중 콜레스테롤의 운반체인 LDL과 결합하는 단백질로서, LDL과 결합하여 세포 내로 LDL을 흡수함으로써 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 따라서 심혈관 대사 질환을 완화할 수 있다. 이에, 노르안하이드로이카리틴의 LDLR 생성 증가 효과를 확인하기 위해, HepG2 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리 후, RealTime-PCR을 통해 LDLR mRNA의 상대적인 양을 확인하였다.
구체적으로, HepG2 세포를 2.5×105개/ml 농도로 현탁하여 23-웰 플레이트에 1ml씩 접종한 후, 하루 동안 유지하였다. 켐페롤 및 노르안하이드로이카리틴을 2.5, 5, 10, 20μM씩 웰 플레이트에 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 RNA를 회수 및 정량하여 -70℃에 보관하였다. 그 후 RNA를 cDNA로 합성하고 Real time-PCR 분석을 통해 PCSK9 mRNA의 양을 확인하였다. DMSO만을 처리한 군을 음성 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴은 모든 농도에서 모체인 켐페롤과 비슷하거나 보다 높은 LDLR 생성 효과를 나타내고, 대조군인 아토르바스타틴과 비교하여 10μM에서 비슷한 LDLR 생성 효과를 나타내었다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 LDLR 생성 증가 효과가 있으므로, 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮출 수 있고, 따라서 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: PCSK9 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 형질주입(transfection)한 HEK293T 세포에서 노르안하이드로이카리틴의 처리에 따른 PCSK9 유전자의 발현 억제 효과
노르안하이드로이카리틴의 PCSK9 유전자의 발현 억제 효과를 확인하기 위해, HEK293T 세포에 노르안하이드로이카리틴을 농도별로 처리하고, 발광효소 분석(luciferase assay)를 통해 PCSK9의 발현이 억제되는지 확인하였다.
i) PCSK9 프로모터 유전자 부위에 KpnI 및 XhoI 제한효소 부위를 포함하도록 프라이머를 제작한 후 PCR(polymerase chain reaction)하고, 아가로스 젤에 전기영동을 시행하여 PCSK9 프로모터 부위 DNA를 분리하였다. 반딧불이 발광효소를 리포터(reporter) 유전자로 포함하는 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터(vector)를 동일한 제한효소(KpnI 및 XhoI)로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동 및 젤 추출(gel extraction)을 수행하여 분리하였다. 순수하게 분리된 PCSK9 프로모터 유전자 부위와 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터는 In-fusion DNA ligase(Takara)를 이용하여 50에서 1시간 동안 반응시킨 후, E. coli에 형질전환하여 PCSK9 프로모터가 삽입된 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 제조하였으며, 이를 pGL4.14-PCSK9 이라 명명하였다.
ii) PCSK9 프로모터 유전자의 전사 활성을 측정하기 위하여, HEK293T 세포에 pGL4.14-PCSK9를 형질주입시킨 후, 세포 추출물의 발광효소 활성을 측정하였다. DNA-lipofectamine complex는 0.1㎍의 promoter-reporter construct와 lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 제조하였다. DNA와 lipofectamine 2000이 complex를 제조하는 과정에서 opti-MEM 배지(Invitrogen)를 사용하였다. HEK293T 세포는 DNA를 가하기 직전 세포의 수를 확인하여 12-웰 플레이트에 2.5×105개/ml의 농도로 1ml씩 준비하였다. DNA-lipofectamine complex를 HEK 293T 세포에 조심스럽게 섞은 후 37℃ 인큐베이터에서 6시간 반응시켰다. 이후 배지를 갈아주면서 형질주입이 된 세포를 찾는 작업을 진행하였고, 발광효소 테스트(luciferase test)를 통해 PCSK9이 형질주입된 HEK293T세포를 찾을 수 있었다. 반응이 끝난 HEK293T 세포는 실험군에 따라 노르안하이드로이카리틴을 2.5, 5, 10, 20μM 농도로 처리한 후, 18시간 동안 배양하였다.
iii) 18시간의 배양이 끝난 후, PBS로 세포를 1회 세척한 후 발광효소 시약(luciferase reagent)을 각 웰에 적당량 가한 후 플레이트를 15분 진탕해준 후 상층액을 얻어내 전사 활성을 측정하였다. Passitive lysis buffer를 사용하였으며, 발광효소 활성은 microplate luminometer(Tecan)을 이용하여 측정하였다. 모든 실험은 duplicate로 3회 수행하였다. 프로모터 전사활성은 대조군에 대한 상대적인 전사 활성을 형질주입 효율로 보정하여 나타내었으며 통계처리는 student`s t-test를 사용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴은 대조군에 비하여 낮은 농도에서도 PCSK9 발광효소 활성이 보다 더 감소되었고, 노르안하이드로이카리틴의 농도에 의존적으로 PCSK9 발광효소 활성이 감소하는 것으로 보아, 노르안하이드로이카리틴의 농도에 비례하게 PCSK9 유전자의 발현도 감소할 것임을 확인하였다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 유전자의 발현을 억제하여 LDLR을 증가시키고 혈중 콜레스테롤 수치의 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 면역블롯 분석
노르안하이드로이카리틴의 PCSK9 발현 억제 및 LDLR 발현 증가 효과를 확인하기 위해, PCSK9 및 LDLR을 표적으로 하는 면역블롯(immunoblotting)을 수행하여 그 발현 정도를 비교하였다. β-actin을 대조군으로 사용하였다.
100mm 페트리디쉬에 1×106개의 HepG2 세포를 분주하고, 노르안하이드로이카리틴을 농도별 (5, 10, 20 μM)로 처리한 후 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제 (Protease inhibitor cocktail, Roche)를 함유한 단백질 용출용액(Protein extraction solution(NP40), ELPIS BIOTECH, Korea)을 사용하여 균질화 하였다.
전체 단백질을 준비하기 위해, 상기 세포를 RIPA 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM 소듐 플루오라이드, 2 mM 소듐 오르토바나데이트, 1% NP-40, 0.1% 소듐 도데실 설페이트[SDS], 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드[PMSF], 및 단백질 억제제 칵테일 [Roche Diagnostics, Heidelberg, Germany])에서 추출하였다. 상기 용해물의 단백질 농도는 Bio-Rad dye-binding micro assay를 사용하여 측정하였다. 면역블롯을 위해, 30 ㎍의 세포 용해물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하였다. 단백질들을 Hybond-ECL 니트로셀룰로오스 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) 위에 옮겼다. 상기 멤브레인은 0.1% Tween 20 및 5% 탈지분유를 함유하는 TBS(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl)로 블로킹하였으며, 블로킹 버퍼에 희석된 1차 항체; anti-PCSK9 (sc-515082, Santa cruz), anti-LDLR (sc-18823, Santa cruz), anti-β-actin (#4967, cell signaling)와 4에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 상기 멤브레인을 세척하고 적절한 2차 항체; goat-anti-rabbit IgG(H+L) (Jackson; 111-035-003), goat-anti-mouse IgG(H+L) (sc-2005, Santa cruz)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. HRP-컨쥬게이트된 2차 항체를 ECL 검출 시약을 사용하여 검출하였다.
도 6에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴을 처리한 세포는 농도 의존적으로 PCSK9 발현이 감소되었고, 농도 의존적으로 LDLR 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 노르안하이드로이카리틴은 PCSK9의 발현을 억제하여 LDLR을 증가시키고 혈중 콜레스테롤 수치의 감소시킴으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴의 PPAR 생성 효과
노르안하이드로이카리틴의 PPAR α와 γ 발현 증가 효과를 확인하기 위해, PPARα 프라이머를 이용한 PCR과, PPAR α 및 γ 를 표적으로 하는 면역형광염색법(immunohistochemistry)을 수행하여 그 발현 정도를 확인하였다.
실시예 4의 방법으로 RNA를 합성한 cDNA를 이용하여, Realtime-PCR 분석을 통해 PPARα 와 γ mRNA의 양을 확인하였다. DMSO만을 처리한 군을 음성 대조군으로 사용하였다. 또한, 면역형광염색법(immunohistochemistry)은 HepG2 세포를 슬라이드쳄버에 부착시킨 후, 노르안하이드로이카리틴을 20μM로 처리하여 배양하였다. 포르말린으로 고정시킨후, PPAR α 및 γ 를 표적으로 하는 항체를 이용하여 염색하고, DAPI를 처리하여 핵을 염색하였으며, 공초점현미경을 이용하여 형광발현정도를 확인하였다.
도 7에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴을 처리한 군에서 그 농도 의존적으로 PPARα 와 γ 의 발현이 증가함을 확인하였다. 즉, 이를 통해 노르안하이드로이카리틴은 PPARα 와 γ의 발현을 증가시켜 혈중 지방산의 흡수 및 이화 작용을 촉진함으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
실시예 9: SREBP 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 형질주입(transfection)한 HEK293T 세포에서 노르안하이드로이카리틴 처리에 따른 SREBP 유전자의 발현 억제 효과
노르안하이드로이카리틴의 SREBP 유전자의 발현 억제 효과를 확인하기 위해, HEK293T 세포에 노르안하이드로이카리틴과 켐페롤을 처리하고, 발광효소 분석(luciferase assay)를 통해 SREBP의 발현이 억제되는지 확인하였다.
i) SREBP1과 2 프로모터 유전자 부위에 KpnI 및 XhoI 제한효소 부위를 포함하도록 프라이머를 제작한 후 PCR(polymerase chain reaction)하고, 아가로스 젤에 전기영동을 시행하여 SREBP 프로모터 부위 DNA를 분리하였다. 반딧불이 발광효소를 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터(vector)를 동일한 제한효소(KpnI 및 XhoI)로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동 및 젤 추출(gel extraction)을 수행하여 분리하였다. 순수하게 분리된 PCSK9 프로모터 유전자 부위와 pGL4.14-[luc2/Hygro] 벡터는 In-fusion DNA ligase(Takara)를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 후, E. coli에 형질전환하여 SREBP 프로모터가 삽입된 프로모터-리포터 구조(promoter-reporter construct)를 제조하였으며, 이를 pGL4.14-SREBP 이라 명명하였다.
ii) SREBP 프로모터 유전자의 전사 활성을 측정하기 위하여, HEK293T 세포에 pGL4.14-SREBP를 형질주입시킨 후, 세포 추출물의 발광효소 활성을 측정하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 DNA-lipofectamine complex를 HEK293T세포에 형질주입하였고, 발광효소 테스트(luciferase test)를 통해 SREBP이 형질주입된 HEK293T세포를 찾을 수 있었다. 반응이 끝난 HEK293T 세포는 실험군에 따라 시료를 처리한 군과 그렇지 않은 군으로 나누고, 시료를 처리한 후, 18시간 동안 배양하였다. 이후 실시예 6의 방법으로, 발광효소 활성을 측정하였다. 모든 실험은 duplicate로 3회 수행하였으며, 프로모터 전사활성은 대조군에 대한 상대적인 전사 활성을 형질주입 효율로 보정하여 나타내었으며, 통계처리는 student`s t-test를 사용하였다.
도 8로부터 알 수 있듯이, 동일 농도의 켐페롤에서 대조군 대비 SREBP1 및 2 발광효소 활성이 오히려 증가한 것과 달리, 노르안하이드로이카리틴은 켐페롤 뿐만 아니라 대조군 대비 SREBP1 및 2 발광효소 활성이 현저하게 감소하였음을 확인하였다. 이로부터, 노르안하이드로이카리틴은 SREBP 유전자의 발현을 하향 조절하여 간에서 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제함으로써, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
실시예 10: HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴과 스타틴 병용처리시 동맥경화 관련 단백질 억제 효과
실시예 7의 방법으로 분주한 세포에 노르안하이드로이카리틴과 스타틴(아토르바스타틴, 로수바스타틴)을 단독 혹은 동시에 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 30 ㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 멤브레인에 부착한 후, 각각의 항체: phospho-AMPK, PCSK9, LDLR, PPARγ를 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 9에서 알 수 있듯이, 아토르바스타틴과 로수바스타틴 단독을 각각 처리하였을 때 증가한 PCSK9의 양이 노르안하이드로이카리틴을 병용처리한 세포에서는 감소한 것을 확인하였다. 반면, 아토르바스타틴과 로수바스타틴을 각각 단독으로 처리한 경우보다 노르안하이드로이카리틴과 스타틴을 병용처리한 경우 pAMPK, LDLR 및 PPARγ 단백질의 발현양이 증가한 것을 확인하였다.
즉, 노르안하이드로이카리틴은 스타틴 계열 약물의 처리시 LDLR 뿐 아니라 PCSK9의 발현도 증가시키는 부작용을 완화하기 위해 스타틴 계열 약물과 병용처리될 수 있으며, 이 경우 노르안하이드로이카리틴을 단독으로 처리한 경우 대비 pAMPK, LDLR 및 PPARγ의 발현이 증가하는 상승작용을 나타내는바, 혈중 지방산 및 콜레스테롤을 감소시킴으로써 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
실시예 11: PCSK9을 전처리한 HepG2 세포에서 노르안하이드로이카리틴과 스타틴 병용처리시 PCSK9 억제 효과
실시예 7의 방법으로 분주한 세포에 PCSK9을 2μg/ml씩 전처리한 후, 노르안하이드로이카리틴과 스타틴 계열 약물(아토르바스타틴, 로수바스타틴)을 단독 혹은 동시에 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출된 각 30㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 멤브레인에 부착한 후, 각각의 항체: PCSK9, LDLR를 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다. 그리고, LDLR mRNA 발현량을 확인하기 위하여 RNA를 추출하여 Realtime PCR을 진행하였다.
그 결과, 도 10에서 알 수 있듯이, HepG2 세포에서 PCSK9 전처리에 의해 LDLR이 감소함을 확인하였다. 또한, PCSK9을 전처리한 후 각각의 스타틴을 단독 처리한 세포에서는 LDLR 발현이 감소하였으나, 노르안하이드로이카리틴과 각각의 스타틴을 병용처리한 세포에서는 LDLR 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 아울러, PCSK9을 전처리하고 각각의 스타틴을 단독 처리한 경우 PCSK9의 발현양이 오히려 증가하였으나, 노르안하이드로이카리틴을 병용처리한 세포에서는 PCSK9 발현이 현저히 감소함을 확인하였다.
즉, 노르안하이드로이카리틴은 스타틴 계열 약물의 처리시 LDLR 뿐 아니라 PCSK9의 발현도 증가시키는 부작용을 완화하기 위해 스타틴 계열 약물과 병용처리될 수 있으며, 이 경우 PCSK9 발현은 오히려 감소시키면서 LDLR 발현은 단독 처리한 경우 대비 현저한 수준으로 향상시킬 수 있는바, 혈중 지방산 및 콜레스테롤을 감소시킴으로써 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
실시예 12: HepG2 세포에서 노란하이드로이카리틴과 피타바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 또는 플루바스타틴을 병용처리시 동맥경화 관련 단백질 발현
실시예 7의 방법으로 분주한 세포에 노르안하이드로이카리틴과 각각의 스타틴(프라바스타틴, 피타바스타틴, 플루바스타틴, 또는 심바스타틴)을 단독 혹은 동시에 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 30 ㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 멤브레인에 부착한 후, 각각의 항체: PCSK9, LDLR를 이용하여 단백질 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 알 수 있듯이, HepG2 세포에서 각각의 스타틴을 단독 처리한 세포에서보다 노르안하이드로이카리틴과 각각의 스타틴을 병용처리한 세포에서 PCSK9 발현이 현저히 감소함을 확인하였다. 이를 수치화한 값은 다음 표 1에 나타내었다 [표 1].
심바스타틴 피타바스타틴 플루바스타틴 프라바스타틴 노르안하이드로이카리틴 PCSK9
5 μM 5 μM 5 μM 5 μM 20 μM
- - - - - 1±0.04
- - - - + 0.34±0.02
- - - + - 1.9±0.06
- - + - - 1.63±0.02
- + - - - 1.59±0.02
+ - - - - 1.85±0.11
- - - + + 0.3±0.02
- - + - + 0.29±0.02
- + - - + 0.28±0.03
+ - - - + 0.24±0.04
아울러, 도 12에서 알 수 있듯이, 각각의 스타틴(아토바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 플루바스타틴, 또는 심바스타틴)을 단독처리한 세포에서보다 노르안하이드로이카리틴과 각각의 스타틴을 병용처리한 세포에서 LDLR이 현저히 증가함을 확인하였다.
즉, 노르안하이드로이카리틴은 스타틴 계열 약물인 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 플루바스타틴, 또는 심바스타틴의 처리시 LDLR 뿐 아니라 PCSK9의 발현도 증가시키는 부작용을 완화하기 위해 스타틴 계열 약물과 병용처리 될 수 있으며, 이 경우 PCSK9 발현은 오히려 감소시키면서 LDLR 발현은 단독 처리한 경우 대비 현저한 수준으로 향상시킬 수 있는바, 혈중 지방산 및 콜레스테롤을 감소시킴으로써 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
실시예 13: PCSK9을 주입한 마우스 carotid-ligation 모델에서 노르안하이드로이카리틴의 동맥경화 저해효과
<실시예 13-1> 마우스 동맥경화 모델 제작
6-8주령 마우스의 경동맥(carotid artery)에 ligation을 하여 mechanic한 스트레스를 주어 염증, 혈전증(thrombosis), 산화적 스트레스 및 shear stress를 유발시키고, 외경동맥(external carotid, EC)의 기능과 구조를 변화시켜 죽상동맥경화증 모델(atherosclerosis model)을 제작하였다(도 13).
구체적으로, 고지방 식이를 1주일 한 쥐에게 경동맥 ligation을 하는 것으로, 복강 마취 후 LCA(Left common carotid artery)에 대해 ligation을 수행하였다. LCA에 있는 세 개의 branches, 외경동맥(External carotid artery, ECA), 내경동맥(internal carotid artery, ICA), 후두동맥(Occipital artery, OA) 이 세 곳의 branches를 partial ligation 해주고, 이 때 ICA와 OA를 ligation하고 ECA를 따로 ligation을 하였다. Ligation을 수행한 마우스는 심장으로 가는 혈액흐름의 양이 줄고 방향이 바뀌게 되어 죽상동맥경화증 모델을 제작하였다.
<실시예 13-2> 죽상동맥경화증 모델 마우스에서 노르안하이드로이카리틴 처리에 따른 효과 확인
AAV-PCSK9 Virus(1x1011 ifu/ml)와 노르안하이드로 이카리틴(10ug/g/day)을 주사한 후 1주일 뒤에 경동맥 ligation을 수행하였다. Ligation 3주 후 죽상동맥경화증 모델이 완성되었는지를 확인하고, 총 플라크 이미징(gross plaque imaging, 면역형광법(immunofluorescence)을 수행하여 노르안하이드로이카리틴의 동맥경화 저해 효과를 확인하였다.
먼저 동맥경화 모델이 제대로 만들어졌는지 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과, 도 14에서 알 수 있듯이, WT 마우스 보다 PCSK9 바이러스를 주입해준 Vehicle, 노르안하이드로이카리틴 처리군 마우스의 간 조직에서의 PCSK9의 발현이 증가하였음을 확인하였다.
또한, 총 플라크 이미징 결과, 도 15에서 알 수 있듯이 Vehicle 군(약 45%) 대비 노르안하이드로이카리틴 처리군(약 20%)에서 죽상 동맥경화 플라크(atherosclerotic plaque) 형성 부분이 현저히 감소한 것을 확인하였다.
나아가, 면역형광법을 이용하여 노르안하이드로이카리틴의 동맥경화 저해효과를 확인하였다. 구체적으로, 마우스 경동맥을 수득하여 4% PFA에 1일간 고정시킨 후 block을 제작하였다. 혈관 내 염증반응이 진행될수록 동맥경화가 더 악화되므로, 동맥경화 염증반응을 일으키는 대식세포의 마커 F/480 및 염증반응이 일어날 때 분비되는 전염증성 싸이토카인인 TNF-a, IL-1B, MCP-1을 염색하였다. CAP1(1:200), PCSK9(1:100), F4/80(1:100), TNF-a(1:100), IL-1B(1:100), MCP-1(1:100) 각각에 대한 항체를 이용하여 염색 후, 공초점 현미경을 이용하여 촬영, Bioluminescence를 평가하였다.
그 결과, 도 16에서 알 수 있듯이, 노르안하이드로이카리틴을 주입한 군에서 전염증성 마커인 TNF-a, IL-1B, MCP-1의 발현이 감소하였으며, 대식세포(macrophage)의 마커인 F/480의 발현도 감소함을 확인하였다. 또한, 노르안하이드로이카리틴을 주입한 군에서 PCSK9의 발현도 대조군 대비 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 이에 따라 노르안하이드로이카리틴은 혈관 내 염증반응의 진행을 억제하여 동맥경화의 완화 효과가 있으며, PCSK9 발현 감소 효과로 LDLR을 증가시키고 혈중 지방산 및 콜레스테롤을 감소시켜 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    Figure PCTKR2020002773-appb-C000001
  2. 제1항에 있어서, 상기 심혈관 대사 질환은 심혈관 질환 또는 지질 대사 이상에 의한 대사성 질환인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 협심증, 심근경색, 뇌경색, 뇌졸중, 및 부정맥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 지질 대사 이상에 의한 대사성 질환은 이상지질혈증, 고지혈증, 관상동맥경화증, 죽상동맥경화증 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 스타틴 계열 약물을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스타틴 계열 약물은 HMG-CoA 환원효소의 저해 활성을 갖는 것인, 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 스타틴 계열 약물은 아토르바스타틴(Atorvastatin), 로수바스타틴(Rosuvastatin), 피타바스타틴(Pitavastatin), 프라바스타틴(Pravastatin), 심바스타틴(Simvastatin), 또는 플루바스타틴(Fluvastatin)인, 약학적 조성물.
  8. 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제1 내지 제7항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 대사 질환의 예방 또는 치료방법.
  11. 노르안하이드로이카리틴 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 스타틴 계열 약물의 부작용 완화용 보조제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 스타틴 계열 약물은 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 또는 플루바스타틴인, 보조제.
  13. 제11항에 있어서, 상기 부작용은 스타틴 계열 약물 처리에 따른 PCSK9의 동반 증가인 것인, 보조제.
  14. 노르하이드로이카리틴 및 스타틴 계열 약물을 병용 투여하는 단계를 포함하는, 스타틴 계열 약물의 부작용을 완화시키는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116407531A (zh) * 2023-03-17 2023-07-11 哈尔滨医科大学 脱水淫羊藿素在制备抑制巨噬细胞铁死亡以治疗动脉粥样硬化药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080090710A (ko) * 2007-04-05 2008-10-09 한국과학기술연구원 고삼 추출물 또는 이로부터 분리한 5-메틸소포라플라바논ｂ를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 합병증 또는 비만의예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20090084439A (ko) * 2008-02-01 2009-08-05 부경대학교 산학협력단 고삼 추출물 또는 이로부터 분리한 프레닐레이티드플라보노이드 화합물을 함유한 당뇨성 합병증의 예방 또는치료용 조성물
US20150335685A1 (en) * 2014-05-20 2015-11-26 Emory University Engineered stem cell therapy for cardiac repair
KR20160083806A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 연세대학교 산학협력단 콜레스테롤 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20180041233A (ko) * 2015-08-27 2018-04-23 르 라보레또레 쎄르비에르 HMG-CoA 환원효소 억제제 및 ECA 억제제를 포함하는 약학적 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080090710A (ko) * 2007-04-05 2008-10-09 한국과학기술연구원 고삼 추출물 또는 이로부터 분리한 5-메틸소포라플라바논ｂ를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 합병증 또는 비만의예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20090084439A (ko) * 2008-02-01 2009-08-05 부경대학교 산학협력단 고삼 추출물 또는 이로부터 분리한 프레닐레이티드플라보노이드 화합물을 함유한 당뇨성 합병증의 예방 또는치료용 조성물
US20150335685A1 (en) * 2014-05-20 2015-11-26 Emory University Engineered stem cell therapy for cardiac repair
KR20160083806A (ko) * 2014-12-30 2016-07-12 연세대학교 산학협력단 콜레스테롤 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20180041233A (ko) * 2015-08-27 2018-04-23 르 라보레또레 쎄르비에르 HMG-CoA 환원효소 억제제 및 ECA 억제제를 포함하는 약학적 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MIHAYLOVA, B.: "The effects of lowering LDL cholesterol with statin therapy in people at low risk of vascular disease: meta-analysis of individual data from 27 randomised trials", LANCET, 2012, pages 581 - 590, XP055740989 *

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