WO2013100270A1 - 삼나물 추출물 또는 아룬신 ｂ를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 에폽토시스 유도제 및 건강 기능 식품 - Google Patents

삼나물 추출물 또는 아룬신 ｂ를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 에폽토시스 유도제 및 건강 기능 식품 Download PDF

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WO2013100270A1
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cancer
cells
aruncin
carcinoma
extract
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김영호
한초롱
전도연
우현주
정수양
우미희
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대구한의대학교산학협력단
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention is a pharmaceutical for three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) preventing or treating cancer, containing an extract, or a acceptable salt Arun new B (aruncin B) or a pharmaceutically thereof agent represented by the general formula (1) as an active ingredient enemy A composition, an agent for inducing apoptosis of cancer cells, and a nutraceutical for preventing or improving cancer.
  • Chemotherapy to treat cancer may induce apoptosis of cancer cells (hereinafter also referred to as 'cell suicide') to allow cancer cells to be removed.
  • cancer cells once apoptosis occurs, the cancer cells are destroyed and converted into apoptotic bodies. Subsequently, the epoptic body is eliminated by the surrounding phagocytes and therefore does not carry side effects such as an inflammatory response.
  • induction of epoptosis of cancer cells is known as an effective mechanism for removing malignant tumor cells by treatment with chemotherapy drugs (Hannun, 1997; Kaufman and Earnshaw, 2000).
  • the apoptosis of cancer cells induced by anticancer agents is the signaling pathway delivered by the death receptor on the cell surface (Wallach et al., 1997), the mitochondrial-dependent signaling pathway inside the cell (Desagher and Martinou, 2000), and intracellular endoplasmic reticulum-dependent signaling pathways (Nakagawa et al., 2000).
  • anticancer agent further studies are needed to investigate the mechanism of inducing apoptosis of cancer cells by the anticancer agent in order to evaluate whether the apoptosis inducing activity does not act on normal cells but specifically on cancer cells.
  • apoptogenic substance apoptogenic substance
  • the inventors of the present invention have been trying to isolate a pharmacologically safe apoptotic substance (apoptogenic substance), as part of the cancer cell toxic substances derived from edible plants is relatively low toxicity to normal cells
  • the research is conducted on various edible plants.
  • MO15 The MO15 gene encodes the catalytic subunit of a protein kinase that activates cdc2 and other cyclin-dependent kinases (CDKs) through phosphorylation of Thr161 and its homologues, EMBO J. 12 (1993) 3111-3121.
  • CDKs cyclin-dependent kinases
  • the problem to be solved in the present invention include three herb extract (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus), or a pharmaceutical for the prevention and treatment of cancer containing acceptable salt Arun new B or a pharmaceutical represented by the general formula (1) as an active ingredient It is to provide a suitable composition.
  • Another object of the present invention is to provide an agent for inducing apoptosis having an action of inducing suicide on cancer cells containing the active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving cancer containing the active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the extract three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) as an active ingredient.
  • the three sprouts are the aerial part of the three sprouts.
  • the extract is preferably methylene chloride (methylene chloride) extract.
  • the cancer includes liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eye melanoma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anus Proximal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, renal or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma and pituitary adenoma It is preferable to select from the group which consists of
  • the present invention also provides a system popto (apoptosis) inducing agent containing the extract of three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) as an active ingredient.
  • the present invention also provides a three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) health for the prevention or amelioration of cancer, containing the extract as an active ingredient foods.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the compound represented by the following formula (Arunsin B) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compounds are preferably extracted and purified from ginseng herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus).
  • the cancer may include liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eye melanoma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anus Adjacent cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, renal or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma and pituitary adenoma It is preferable to select from the group which consists of.
  • the present invention also provides an apoptosis inducer containing the compound represented by Formula 1 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health functional food for preventing or improving cancer containing the compound represented by Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • Samnamul extract according to the present invention or a compound represented by the formula (Aunsin B) or a pharmaceutically acceptable salt thereof has an effect on the prevention, amelioration or treatment of various cancers, including acute leukemia, breast cancer, colon cancer Since these substances act as a mechanism for inducing apoptosis in cancer cells, they have an excellent effect of being usefully applied as apoptosis inducers.
  • Figure 2 shows the molecular structure of the Arunsin B compound.
  • FIG. 3 shows MTT results (A) and cell cycle distribution (B) and ⁇ m (C) flow cytometry results for investigation of cytotoxicity in JT / Neo and JT / Bcl-2 cells after treatment with Aruncin B compounds. Each is shown.
  • FIG. 4 shows mitochondrial cytochrome c release (A), caspase-9, -3, -8, Bid, PARP, pro into the cytoplasm in JT / Neo and JT / Bcl-2 cells after treatment with Aruncin B compounds.
  • -apoptotic Bcl-2 proteins Bad, Bak and Bax
  • anti-apoptotic Bcl-xL protein and ⁇ -actin B
  • phosphorylation of Bcl-2 at Thr-56 and Ser-70 Tyr-15 and Thr- Phosphorylation of CDK1 at 161, total phosphorylation of histone H3 at CDK1, cyclin B1, Ser-10
  • FIG. 5 shows microscopic images of flow cytometry of cell cycle distribution in JT / Neo cells after treatment with Aruncin B (A), cell morphology change (B) and morphology change of microtubule (C), respectively. It is shown.
  • Figure 7 shows the results of comparing the effects of CDK1 inhibitors, JNK inhibitors and p38 MAPK inhibitors on the cytotoxicity of Aursin B-induced Jurkat T cells.
  • FIG. 8 Western blot of caspase-8, FADD and ⁇ -actin in wild type Jurkat T cells (clone A3), FADD deficient Jurkat T cells (clone I2.1) and caspase-8 deficient Jurkat T cells (clone I9.2)
  • the analysis result (A) and the cytotoxicity measurement result of disin B (B) are shown.
  • Figure 9 shows the results of measurement of cytotoxicity in human peripheral blood resting T cells of Aruncin B, T cells activated with PHA (Phytohemagglutinin A) and Jurkat T cells.
  • PHA Phytohemagglutinin A
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the extract three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) as an active ingredient.
  • the three sprouts are the aerial part of the three sprouts.
  • the extract is preferably methylene chloride (methylene chloride) extract.
  • the cancer includes liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eye melanoma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anus Proximal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, renal or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma and pituitary adenoma It is preferable that it is selected from the group which
  • the present invention also provides a system popto (apoptosis) inducing agent containing the extract of three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) as an active ingredient.
  • the present invention also provides a three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) health for the prevention or amelioration of cancer, containing the extract as an active ingredient foods.
  • the inventors of the present invention after confirming the anti-cancer activity of the above-mentioned Samnamul extract, in order to purely separate the anti-cancer component (apoptogenic indgrdient) from the aerial part of the three, the serial solvent solvent extraction (serial solvent extraction) and As a result of silica gel column chromatography, a new monoterpenoid substance, 2- (8'-ethoxy-8'-methylpropylidene) -5-hydroxy-3,6- Dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid (2- (8'-ethoxy-8'-methylpropylidene) -5-hydroxy-3,6-dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid) was isolated and purified ( Aruncin B (aruncin B)).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, containing the arunsin B compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compounds are preferably extracted and purified from ginseng herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus).
  • the cancer may include liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or eye melanoma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anus Proximal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, renal or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma and pituitary adenoma It is preferable that it is selected from the group which
  • the present invention also provides an apoptosis inducer containing the compound represented by Formula 1 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a health functional food for preventing or improving cancer containing the compound represented by Chemical Formula 1 as an active ingredient.
  • Acid addition salts formed by free acid are useful.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equal molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equal molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid, and hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid.
  • Maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, Carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid and the like can be used.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salts, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the arunsin B compounds of the invention include acidic or basic salts which may be present in the compounds of the invention unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts, which are known in the art. It can be prepared through.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., a stearate, a stearate, a stearate, a stearate, a stearate, a stevia, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin
  • compositions of the present invention can be administered parenterally, with topical administration (dermal administration) or subcutaneous injection through the skin being preferred, with subcutaneous injection being most preferred.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Preferably, however, it is administered at 0.001 to 100 mg / kg body weight, more preferably 0.01 to 30 mg / kg body weight per day. Administration may be administered once a day or may be divided several times.
  • the compound of the present invention may be present at 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 1% by weight relative to the total weight of the total composition.
  • the health functional food containing the arunsin B compound of this invention contains various foods, a drink, a gum, tea, a vitamin complex, etc., for example. It may also be added to foods or beverages for the purpose of preventing cancer diseases. At this time, the amount of the extract or arunsin B compound in the food or beverage may be added to 0.01 to 15% by weight of the total weight of the food, the beverage is 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml Can be added in proportion.
  • the dietary supplement of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills, liquids and the like.
  • the health functional food of the present invention is not particularly limited to other ingredients containing the above-mentioned extracts or compounds in the desired ratios, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as conventional foods or drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the proportion of such natural carbohydrates is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the extract of the present invention or a compound isolated therefrom is used in various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and Salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the extracts or compounds of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is usually selected in the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the compound of the present invention.
  • the ECL Western kit was purchased from Amersham (Arlington Heights, IL, USA). Immobilon-P membrane was purchased from Millipore Corporation (Bedford, MA, USA). Anti-cytochrome c and anti-caspase-3 antibodies from Pharmingen (San Diego, CA, USA), anti-Bid, anti-PARP, anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-Bak, anti-phospho -histone H3 (serine 10), anti-histone H3, anti-cyclin B1 and anti- ⁇ -actin antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) and also anti-caspase-8, anti-caspase-9 , anti-phospho-Bcl-2 (threonine 56), anti-phospho-Bcl-2 (serine 70), anti-phospho-CDK1 (threonine 161), anti-phospho-CDK1 (tyrosine 15), anti-Bad and a -tubulin antibody was purchased from Cell Signaling (
  • PHA Phytohemagglutinin A
  • All caspase inhibitors and conformational specific anti-Bax and Bak were purchased from Calbiochem (San Diego, CA, USA).
  • Annexin V-FITC apoptosis kit was purchased from Clontech (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).
  • RPMI 1640 medium and Fetal bovine serum (FBS) were purchased from Hyclone (Gaithersburg, MD, USA).
  • the ground part of Samnamul (6.9 kg) was extracted with 95% ethanol, and then concentrated to obtain an ethanol extract (3.03 kg). Subsequently, the ethanol extract was dissolved in 6.0 L of water, and then organic solvent extraction was performed sequentially to obtain n-hexane (5 L ⁇ 6, 308 g), methylene chloride (5 L ⁇ 6, 41.7 g), ethyl acetate (5 L ⁇ 5 , 121.3 g), n-buthanol (5 L ⁇ 6, 353.8 g), and aqueous layer (600 g) extract. The methylene chloride extract thus obtained was fractionated by flash column chromatography.
  • the silica gel was filled in the column, and 31.5 g of methylene chloride extract was adsorbed onto the silica gel and loaded into the column. Subsequently, eluting by elevating the polarity of the mobile phase in the order of hexane, methylene chloride, methanol, and water, and analyzed by thin layer chromatography (TLC) and based on the obtained TLC pattern 26 Divided into fractions (M1-M26).
  • TLC thin layer chromatography
  • the M14 fraction of the M1 to M26 fractions was subjected to reverse-phase column chromatography with a stepwise increase in the proportion of MeOH to 5-50%, resulting in a new monoterpenoid, 2- (8'-ethoxy- 29.2 mg of 8'-methylpropylidene) -5-hydroxy-3,6-dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid (aruncin B) was isolated as a single substance.
  • Jurkat T cell clones JT / Neo stable transfection with vector plasmid
  • JT / Bcl-2 transfection with Bcl-2 gene
  • human breast cancer cell lines MDA-MB-231, human normal breast epithelial cell lines MCF-10A, human blood cancer cell lines HL-60 and U937 were purchased from ATCC (http://www.atcc.org) Cancer cell lines, HCT-116 (p53 + / + ) and HCT-116 (p53 -/- ), are found at Dr. Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland. Was purchased from B. Volgelstein.
  • Jurkart T cell clones JT / Neo and JT / Bcl-2) are available from Dr. Gerontology Research Center, NIA / NIH, Baltimore, MD. D. received from Taub. These cell lines were incubated with the suggested culture conditions.
  • the immobilized cells were treated with 250 ⁇ l RNase solution (50 ⁇ g / ml RNase) for 30 minutes and then stained with 250 ⁇ l propidium iodide (PI) solution (50 ⁇ g / ml) for 20 minutes, which was flow cytometer (FACS Calibur). , BD Bioscience, San Jose, CA, USA) to investigate changes in cell cycle.
  • RNase solution 50 ⁇ g / ml RNase
  • PI propidium iodide
  • the supernatant containing nucleic acid was extracted and purified using phenol-chloroform after proteinase K and RNase treatment, and then recovered by ethanol precipitation.
  • the recovered DNA fragments were confirmed by performing electrophoresis on the precipitate in 1.2% agarose gel.
  • Jurkat T cells (5 x 10 6 ) were placed in 300 ⁇ l of lysis buffer (137 mM NaCl, 15 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 15 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 25 mM MOPS). , 2.5 ⁇ g / ml proteinase inhibitor E-64, pH 7.2), crushed with an ultrasonic crusher, extracted for 30 minutes at 4 °C, and the supernatant was secured by Winsim separation for 20 minutes at 14000 rpm.
  • lysis buffer 137 mM NaCl, 15 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 15 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 25 mM MOPS.
  • 2.5 ⁇ g / ml proteinase inhibitor E-64, pH 7.2 crushed with an ultrasonic crusher, extracted for 30 minutes at 4 °C, and the supernatant was secured by Wins
  • the cells were recovered by treating with Portin B for 36 hours at different concentrations and then lysis buffer (250 mM sucrose, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF). , 2.5 mg / ml E64, 20 mM HEPES, pH 7.2), reacted for 30 minutes at 4 ° C, crushed cells using a Dounce homogenizer, and the supernatant obtained after centrifugation at 3500 rpm for 10 minutes was again 15 at 13,700 rpm. Centrifugation was performed for a minute to ensure supernatant.
  • lysis buffer 250 mM sucrose, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF.
  • the protein-containing cytoplasm was electrophoresed using MOPS buffer under conditions of 4-12% SDS gradient polyacrylamide gel, and then the electrophoresed protein was electrotransmitted onto Immobilon-P membrane. Proteins located in Western blot were detected using ECL Western blotting kit.
  • the recovered cells were fixed in the 1% paraformaldehyde solution for 30 minutes, and then the primary antibody (conformation specific anti-Bak) was reacted in 500 ⁇ g / ml digitonin reaction solution for 1 hour, and the secondary antibody to which fluorescence was conjugated ( Alex Fluor 488-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was reacted for 30 minutes in 500 mg / ml digitonin reaction solution, washed twice with PBS and then flow cytometry (FACS Calibur, BD bioscience, San Jose, CA, USA) was used to measure the increase in FL1 fluorescence.
  • the primary antibody formation specific anti-Bak
  • the solution was washed twice in a solution containing 0.2% Triton X-100, and the reaction was performed overnight by adding a primary antibody (anti- ⁇ -tubulin). After completion of the primary antibody reaction, washing was performed five times in a solution containing 0.2% tween20, and a secondary antibody conjugated with FITC fluorescence (Alex Fluor 488-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) was reacted for 1 hour.
  • FITC fluorescence Alex Fluor 488-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
  • the solution was washed five times in a solution containing 0.2% Tween-20, and then reacted with DAPI solution of 1.5 mM for 10 minutes for nuclear staining, and then washed twice in cold PBS solution. Fade treatment was performed and changes in ⁇ -tubulin were observed in the confocal microscope (LSM 700, Carl Zeiss MicroImaging) FITC fluorescence wavelength.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • peripheral T cells were separated using a human T cell enrichment column (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). The separated resting T cells were activated for 60 hours by adding PHA (phytohemagglutinin A) at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml.
  • PHA phytohemagglutinin A
  • the 95% EtOH extract of the three herbs (Aruncus dioicus var. Kamtschaticus) was fractionated by dissolving the dried under reduced pressure, and then water and tried a continuous organic solvent extracted with n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, and the order of n-butanol .
  • the cytotoxicity of each fraction of human acute leukemia cell line, Jurkat T cells showed that methylene chloride extract showed the strongest cytotoxicity.
  • IC 50 value was 57 ⁇ g / ml, and other organic solvent extracts were not highly cytotoxic.
  • FIG. 1A methylene chloride extract showed cytotoxicity and apoptotic DNA fragmentation and mitochondrial membrane potential reduction effect.
  • the cancer cell toxicity of methyene chloride extracts was determined by MDA-MB-231, a human breast cancer cell line, MCF-10A, a normal human breast cancer cell line, HCT-116 (p53 + / + ) and HCT-116 (p53- /). -), etc. were surveyed, including several cancer cell lines.
  • methylene chloride extract extract showed cytotoxicity against all the cancer cell lines irradiated, wherein the IC 50 value for each cancer cell line was the case of Jurkat T cells (clone E6.1). Is 54 ⁇ g / ml, 57 ⁇ g / ml for Jurkat T cells (clone JT / Neo), 80 ⁇ g / ml for Jurkat T cells (clone JT / Bcl-2), 45 ⁇ g for HL-60 cells 50 ⁇ g / ml for / ml and U937 cells.
  • HCT-116 p53 + / +
  • HCT-116 p53 -/-
  • IC 50 value of MDA-MB-231 cells a human breast cancer cell line
  • MCF-10A cells a human breast breast epithelial cell line
  • a IC 50 value represents the concentration of methylene chloride extract with a 50% reduction in cell viability by the MTT assay. Cell lines were incubated for 36 hours and in the last 4 hours under MTT reagent.
  • the anticancer substance N9 (29.2 mg) was extracted, and the extract was analyzed as a novel substance, 2- (8'-ethoxy-8'-methylpropylidene) -5-hydroxy-3,6- It was identified as dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid (aruncin B, C 12 H 18 O 6 ) (FIG. 2).
  • 1 H-NMR and 13 C-NMR measurement results of the Arunsin B compound are as follows.
  • JT / Bcl-2 cells The conditions were 81.5%, 71.5%, and 61.2% for JT / Bcl-2 cells (FIG. 3A), and JT / Neo cells were cultured for 36 hours in the presence of reducin B (7.5-30 ⁇ g / ml).
  • JT / Neo cells were cultured for 36 hours in the presence of reducin B (7.5-30 ⁇ g / ml).
  • the proportion of sub-G 1 cells increased and also the ratio of G 2 / M cells increased depending on the concentration of structuriin B (FIG. 3B).
  • pro-caspase-3 (32) as well as activation of inactive pro-caspase-9 (47 kDa) to active caspase-9 (37/35 kDa)
  • the activation of kDa) to active caspase-3 (17 kDa) was also found to increase concentration-dependently (FIG. 4B).
  • Degradation of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) which is known to be degraded by active caspase-3 in the apoptosis signaling pathway, was also observed, and active caspase-8 (43) of pro-caspase-8 (57 kDa) / 41 kDa) was also confirmed.
  • PARP poly (ADP-ribose) polymerase
  • Bid 22 kDa
  • tBid 15 kDa
  • c release has been reported (Desagher et al., 1999; Li et al., 1998).
  • JT / Neo cells were treated with collin B, a decrease in Bid (20 kDa) protein levels and an increase in cytochrome C release were observed with caspase-8 activation.
  • the decrease of Bid protein level was easily confirmed by Western blot analysis, but the tBid (15 kDa) could not be identified because of the short half-life of tBid.
  • p34 cdc2 / cyclin B1 kinase which plays an important role as M-phase promoting factor (MPF) in the M phase of the cell cycle, can also act as a Bcl-2 kinase that phosphorylates Bcl-2 (Furukawa et al. , 2000; Terrano et al., 2010), and post-translational modifications such as changes in the phosphorylation status of p34 cdc2 have been reported to be very important in the regulation of p34 cdc2 kinase activity (Fesquet et al., 1993; Watanabe et al., 1995).
  • JT / Neo and JT / Bcl-2 cells were treated with radical-driven radicals to determine if they involved a change in p34 cdc2 phosphorylation.
  • a JT / Neo and the JT / Bcl-2 cells treated with the p34 cdc2 protein levels There was no difference phosphorylation at Tyr-15 of p34 cdc2 was reduced in p34 cdc2 of Thr-161 Phosphorylation was shown to increase.
  • the level of cyclin B1 protein was significantly increased (Fig. 4C).
  • the microtubule damage agent nocodazole and the DNA damage agent Genistein are used in JT / Neo and JT / Bcl-2 cells. And
  • Formationin B at a concentration of 30 mg / ml was incubated.
  • JT / Neo cells treated with nocodazole, genistein, and collapsein B commonly observed epoptosis with G2 / M arrest, whereas JT / Bcl-2 cells showed G.
  • the increase in 2 / M cells was more clearly confirmed than in the case of JT / Neo cells but no sub-G 1 cells.
  • JT / Neo and JT / Bcl-2 cells were treated with remainderin B, followed by fluorescence staining for microtubules (FIG. 5C).
  • JT / Neo cells decreased fluorescence for microtubule staining and fragmented nuclei for nuclear staining were observed, whereas in JT / Bcl-2 cells, reduction in fluorescence for microtubule staining was observed, but nuclei were observed. No segmented nuclei in staining were observed. Similar changes were observed in nocodazole-treated JT / Neo and JT / Bcl-2 cells, but not in genistein-treated JT / Neo and JT / Bcl-2 cells.
  • JT / Neo cells were pretreated with each caspase inhibitor at a concentration of 30 ⁇ M for 1 hour, and then snapshotin B was added at a concentration of 30 ⁇ g / ml and incubated for 28 hours.
  • each caspase inhibitor completely inhibited the sub-G 1 peak induced by collettivitin B, but did not inhibit the reduction of G 2 / M-arrest and mitochondrial membrane potential.
  • caspase-9 inhibitor z-LEHD-fmk or caspase-3 inhibitor z-DEVD-fmk the activation status of caspase-8 by collin B treatment was revealed more clearly because the z-LEHD-
  • caspase-9 activity is inhibited by fmk or caspase-3 activity is inhibited by z-DEVD-fmk, not only caspase-8 activation induced by collin B but also active caspase-3 (17 kDa) This is because the production was shown to be completely inhibited.
  • caspase-9, caspase-3 and caspase-8 are essential in strokein B-induced apoptosis, and phosphorylation of G 2 / M-arrest, Bcl-2 phosphorylation, and Histone H3 is impaired mitochondrial damage. And caspase cascade activation was identified as a higher level.
  • CDK1 Ibrado et al., 1998; Pathan et al., 2001
  • JNK Yamamoto et al., 1999
  • p38 MAPK p38 MAPK inhibitors
  • JT / Neo cells were pretreated with CDK1 inhibitors (5 ⁇ M), JNK inhibitors (5 ⁇ M), and p38 MAPK inhibitors (25 ⁇ M) for 2 hours at each concentration, followed by bluntin B at 30 ⁇ g / ml. After addition and incubation for 28 hours, cytotoxicity was examined.
  • CDK1 (roscovitine) inhibitors showed about 50% inhibitory effect on cytotoxicity induced by collin B, while JNK inhibitors and p38 MAPK inhibitors did not show inhibitory effects.
  • Bcl-2 phosphorylation induced by collin B changes in mitochondrial membrane potential, cytochrome c release, and caspase cascade activation are essential for apoptosis, and CDK1 kinase may be more involved than JNK or p38 MAPK kinase. .
  • Fas and / or FasL expression has been reported in the apoptosis of cancer cells induced by anticancer treatment (Friesen et al., 1996; Muller et al., 1997; Nagarkatti and Davis). , 2003).
  • Fas / FasL system is involved in the initiation of apoptosis induced by Aruncin B
  • wild-type Jurkat T cells expressing FADD and caspase-8 clone A3
  • Fas-mediated apoptosis Cells of restorationin B against FADD-deficient Jurkat T cells clone I2.1
  • caspase-8-deficient Jurkat T cells clone I9.2
  • human peripheral blood T cells or human peripheral blood T cells can be activated by activating 0.2 ⁇ g / ml of phytohemagglutinin (PHA) for 60 hours.
  • PHA phytohemagglutinin
  • the cytotoxicity of Portin B in human activated T cells and malignant Jurkat T cells (clone A3) was compared. Each cell was treated with Portin B concentration in a 96-well plate and incubated for 36 hours, and then cell viability was measured by MTT method.
  • the cytotoxicity of distyrene B against human T cells is mainly due to apoptosis induced by apoptosis, which is why resting T cells are much more resistant to malignant Jurkat T cells to cytotoxicity of constructin B. May be due to the low level of mitochondrial development in resting T cells and the low level of death signaling mediators.
  • the apoptotic activity induced by collettivosin B is not an extrinsic pathway initiated by Fas / FasL, and the apotogenic activity of sealin B is more effective in malignant Jurkat T cells than in human normal T cells. It was confirmed that. These findings may be useful for further evaluating the anticancer efficacy of Relationin B, a cytotoxic substance isolated from edible greens.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • each component is added and dissolved in purified water, lemon flavor is added thereto, then the above components are mixed, adjusted to 100 ml by adding purified water, and then filled into a brown bottle and sterilized. To prepare.
  • Vitamin B6 0.5 mg
  • composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method.
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization and refrigerated and stored Used in the manufacture of beverages.
  • composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.

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Abstract

본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물, 또는 하기 화학식 1로 표시되는 아룬신 B (aruncin B) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 암세포의 에폽토시스 (apoptosis) 유도제 및 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 삼나물 추출물, 또는 화학식 1로 표시되는 아룬신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 급성 백혈병, 유방암, 대장암을 비롯한 각종 암의 예방, 개선 또는 치료에 효과를 나타내며, 이러한 물질들은 암세포에서 세포 자살을 유도하는 기전으로 작용하므로 이를 아폽토시스 유도제로서 유용하게 적용할 수 있는 우수한 효과를 가진다.

Description

삼나물 추출물 또는 아룬신 Ｂ를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 에폽토시스 유도제 및 건강 기능 식품
본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물, 또는 하기 화학식 1로 표시되는 아룬신 B (aruncin B) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 암세포의 에폽토시스 (apoptosis) 유도제 및 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 화학요법 (chemotherapy)은 암세포의 에폽토시스 (apoptosis) (이하에서는 '세포 자살'이라고도 한다.)를 유도하여 암세포가 제거되도록 할 수 있다. 암세포에 있어서, 일단 에폽토시스가 야기되면, 암세포는 파괴되어 에폽틱 바디 (apoptotic bodies)로 전환되게 된다. 이어서, 에폽틱 바디는 주변의 식세포들에 의해 소거되므로 염증반응과 같은 부작용을 수반하지 않게 된다. 따라서, 암세포의 에폽토시스 유도는 항암제 (chemotherapeutic drugs) 처리에 의해 악성 종양세포를 제거하는데 있어서 효과적인 기전으로 알려져 있다 (Hannun, 1997; Kaufman and Earnshaw, 2000).
항암제에 의해 유도되는 암세포의 에폽토시스는 세포표면의 사망수용체 (death receptor)에 의해 전달되는 신호전달경로 (Wallach et al., 1997), 세포내부에서 미토콘드리아-의존적으로 일어나는 신호전달경로 (Desagher and Martinou, 2000), 그리고 세포내부의 소포체-의존적으로 일어나는 신호전달경로 (Nakagawa et al., 2000) 등과 같은 세가지 경로에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다. 이러한 항암제에 있어서, 에폽토시스 유도활성이 정상세포에 대해서는 작용하지 않고 암세포에만 특이적으로 작용하는지를 평가하기 위해서는 항암제에 의한 암세포의 에폽토시스 유도기전을 규명하는 연구가 한층 더 필요한 실정에 있다.
최근, 본 발명의 발명자들은 약학적으로 안전한 에폽토시스 유도 물질 (apoptogenic substance)을 분리하고자 하는 연구를 진행하고 있으며, 이의 일환으로서 식용식물 유래의 암세포 독성물질들은 정상세포들에 대해서 독성이 비교적 낮을 것이라는 단순한 개념에 근거하여 다양한 식용식물들 (edible plants)을 대상으로 조사·연구를 행하고 있다.
한편, 삼나물의 약학적인 활성에 대한 연구로서, 삼나물의 에탄올 추출물 (ethanol extract)의 항산화 활성과 항당뇨 효과가 있음이 보고된 바 있다 (Shin et al., 2008). 그러나 암세포에 대한 삼나물의 에폽토시스 유도활성 (apoptogenic activity)에 관한 연구는 수행된 바가 없는 실정이다.
선행기술문헌
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본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 삼나물 추출물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus), 또는 하기 화학식 1로 표시되는 아룬신 B 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 상기 유효성분을 함유하는 암세포에 대한 세포 자살 유도 작용을 갖는 에폽토시스 유도제를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 과제는 상기 유효성분을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 삼나물은 삼나물의 지상부 (aerial part)인 것이 바람직하다.
상기 추출물은 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride) 추출물인 것이 바람직하다.
상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스(apoptosis) 유도제를 제공한다.
또한, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 (아룬신 B) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012003224-appb-I000001
상기 화합물은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)로부터 추출 및 정제된 것이 바람직하다.
상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소 세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁 경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스 (apoptosis) 유도제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명에 따른 삼나물 추출물, 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 (아룬신 B) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 급성 백혈병, 유방암, 대장암을 비롯한 각종 암의 예방, 개선 또는 치료에 효과를 나타내며, 이러한 물질들은 암세포에서 세포 자살을 유도하는 기전으로 작용하므로 이를 아폽토시스 유도제로서 유용하게 적용할 수 있는 우수한 효과를 가진다.
도 1은 Jurkat T 세포 클론 JT/Neo에서 삼나물의 유기 용매 추출물들에 대한 세포 독성 효과 (A), 삼나물의 메틸렌 클로라이드 추출물의 에폽토시스 DNA 프래그멘테이션 (apoptosis DNA fragmentation) 현상 (B), 미토콘드리아 막 전위 감소 효과 (C), 및 세포 자살 효과(D)를 각각 나타낸 것이다.
도 2는 아룬신 B 화합물의 분자 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 아룬신 B 화합물로 처리된 후의 JT/Neo 및 JT/Bcl-2 세포에서의 세포 독성 조사를 위한 MTT 결과 (A)와 세포 주기 분포 (B) 및 ΔΨm (C)의 유세포 분석 결과를 각각 나타낸 것이다.
도 4는 아룬신 B 화합물로 처리된 후의 JT/Neo 및 JT/Bcl-2 세포에서의 세포질 내로의 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출 (A), caspase-9, -3, -8, Bid, PARP, pro-apoptotic Bcl-2 proteins (Bad, Bak 및 Bax), anti-apoptotic Bcl-xL protein 및 β-actin (B) 및 Thr-56 및 Ser-70에서의 Bcl-2의 인산화, Tyr-15 및 Thr-161에서의 CDK1의 인산화, 총 CDK1, cyclin B1, Ser-10에서의 histone H3의 인산화, 총 histone H3 및 β-actin (C)의 웨스턴 블랏 분석 결과와 Bak 활성의 유세포 분석 결과 (D)를 각각 나타낸 것이다.
도 5는 아룬신 B로 처리된 후의 JT/Neo 세포에서의 세포 주기 분포의 유세포 분석 결과 (A), 세포 형태 변화 (B) 및 마이크로튜블 (microtubule)의 형태 변화 (C)의 현미경 사진을 각각 나타낸 것이다.
도 6은 30 μM z-VAD-fmk, 30 μM z-DEVD-fmk 또는 30 μM z-LEHD-fmk의 존재 하에서 30 μg/ml의 아룬신 B를 처리한 후의 JT/Neo 세포에서의 세포 주기 분포 (A)와 ΔΨm (B)의 변화 및 Bcl-2의 인산화, 총 Bcl-2, Ser-10에서의 histone H3의 인산화, 총 histone H3, caspase-9, -3, -8, Bid 및 PARP의 절단의 웨스턴 블랏 분석 결과 (C)를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 아룬신 B에 의하여 유도된 Jurkat T 세포의 세포 독성에 CDK1 inhibitor, JNK inhibitor 및 p38 MAPK inhibitor의 영향을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 Jurkat T 세포 (클론 A3), FADD 결핍 Jurkat T 세포 (클론 I2.1) 및 caspase-8 결핍 Jurkat T 세포 (클론 I9.2)에서 caspase-8, FADD 및 β-actin의 웨스턴 블랏 분석 결과 (A) 및 아룬신 B의 세포 독성 측정 결과 (B)를 나타낸 것이다.
도 9는 아룬신 B의 인체 말초 혈액 resting T 세포, PHA (Phytohemagglutinin A)로 활성화된 T 세포 및 Jurkat T 세포에서의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 대한민국 울릉도 지역에서 어린 줄기와 잎이 식용으로 널리 이용되고 있는 삼나물 (goats beard, Aruncus dioicus var. kamtschaticus)이 인체 급성백혈병 세포주 (Jurkat T cells)에 대해 세포자살유도활성 (apoptogenic activity)을 나타내는지를 조사한 결과, 삼나물의 지상부 (aerial part)에 암세포에 대하여 세포 자살을 야기하는 항암 활성이 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 삼나물은 삼나물의 지상부 (aerial part)인 것이 바람직하다.
상기 추출물은 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride) 추출물인 것이 바람직하다.
상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 급성 백혈병, 유방암, 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스 (apoptosis) 유도제를 제공한다.
또한, 본 발명은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
한편, 본 발명의 발명자들은 위와 같은 삼나물 추출물의 항암 작용을 확인한 후, 삼나물의 지상부 (aerial part)로부터 항암 성분 (apoptogenic indgrdient)을 순수 분리하기 위하여, 연속유기용매추출 (serial solvent extraction)과 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography) 수행한 결과, 새로운 모노테르페노이드 (monoterpenoid) 물질인 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (2-(8'-ethoxy-8'-methylpropylidene)-5-hydroxy-3,6-dihydro-2H-pyran-4-carboxylic acid)을 분리·정제하였다 (아룬신 B (aruncin B)).
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아룬신 B 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012003224-appb-I000002
상기 화합물은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)로부터 추출 및 정제된 것이 바람직하다.
상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소 세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁 경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 급성 백혈병, 유방암, 또는 대장암인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스 (apoptosis) 유도제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 아룬신 B의 약제학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약제학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 아룬신 B 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트 (메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물에는 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수도 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피부를 통한 국소 투여 (경피 투여) 또는 피하 주입이 바람직하며, 피하주입이 가장 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%로 존재할 수 있다.
본 발명의 아룬신 B 화합물을 함유하는 건강 기능 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다. 또한, 암 질환의 예방 효과를 목적으로 식품류 또는 음료에 첨가될 수도 있다. 이 때, 식품류 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 아룬신 B 화합물의 양은 전체 식품류 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료는 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 바람직한 비율의 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품류 또는 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 유리하게 사용할 수도 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수도 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에서는 삼나물의 지상부에서 분리·정제한 단일물질인 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (아룬신 B)이 인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cells에 대한 에폽토시스 유도활성이 있음을 확인하였다. 아룬신 B가 Jurkat T cells에 대해 에폽토시스를 유도할 수 있으므로, 항암제로서의 활용가능성을 타진하기 위해 아룬신 B에 의한 세포 자살 유도기전을 조사하였다. 그 결과, 아룬신 B는 인체말초 혈액암 세포주에 대해 G2/M-arrest, Bcl-2 인산화, Bak 활성화, 그리고 미토콘드리아-의존적인 caspase cascade를 통해 에폽토시스를 유도함을 규명하였다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예이므로 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 축소 해석되지 않아야 한다.
실험 재료 및 방법
1. 실험재료
ECL Western kit는 Amersham (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. Immobilon-P membrane는 Millipore Corporation (Bedford, MA, USA)에서 구입하였다. Anti-cytochrome c와 anti-caspase-3 항체는 Pharmingen (San Diego, CA, USA)으로부터, anti-Bid, anti-PARP, anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-Bak, anti-phospho-histone H3 (serine 10), anti-histone H3, anti-cyclin B1 와 anti-β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터, 또한 anti-caspase-8, anti-caspase-9, anti-phospho-Bcl-2 (threonine 56), anti-phospho-Bcl-2 (serine 70), anti-phospho-CDK1 (threonine 161), anti-phospho-CDK1 (tyrosine 15), anti-Bad 와 a-tubulin 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. Phytohemagglutinin A (PHA)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 모든 caspase inhibitors와 conformational specific anti-Bax와 Bak는 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. Annexin V-FITC apoptosis kit는 Clontech (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)에서 구입하였다. RPMI 1640 배지와 Fetal bovine serum (FBS)은 Hyclone (Gaithersburg, MD, USA)로 부터 구입하였다.
2. 삼나물로부터 물질의 추출 및 분리
삼나물 지상부 (6.9 kg)를 95 % ethanol로 추출한 다음, 농축하여 ethanol 추출물 (3.03 kg)을 얻었다. 이어서 ethanol 추출물을 물 6.0 L에 녹인 후 연속적으로 유기용매 추출을 수행하여 n-hexane (5 L × 6, 308 g), methylene chloride (5 L × 6, 41.7 g), ethyl acetate (5 L × 5, 121.3 g), n-buthanol (5 L × 6, 353.8 g), 그리고 수층 (600 g) 추출물을 얻었다. 이때 얻은 methylene chloride 추출물을 Flash 컬럼 크로마토그래피 (Flash column chromatography)로 분획하였다. 즉, column에 silica gel을 채우고 methylene chloride 추출물 31.5 g을 silica gel에 흡착시켜 column에 loading하였다. 이어서 hexane, methylene chloride, methanol, 및 water 순서로 이동상 (mobile phase)의 극성을 높여서 용출 (elution) 시킨 후, 이를 박층 크로마토그래피 (Thin layer chromatography, TLC)로 분석하고 확보된 TLC pattern을 기준으로 26분획 (M1 ~ M26)으로 나누었다. M1 ~ M26 분획 중 M14 분획은 MeOH의 비율을 5 ~ 50 %로 단계적으로 높이면서 역상 컬럼 크로마토그래피 (reverse-phase column chromatography)를 실시하여 최종적으로 새로운 monoterpenoid 물질인 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B) 29.2 mg을 단일물질로서 분리하였다.
3. 세포배양
인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cell clone JT/Neo (stable transfection with vector plasmid)와 JT/Bcl-2 (transfection with Bcl-2 gene)은 Dr. Dennis Taub (Gerontology Research Center, NIA/NIH, MD, USA)로 부터 분양 받았으며, 이들 세포의 배양에는 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Gaithersburg, MD, USA)에 10 % FBS, 20 mM HEPES (pH 7.2), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol 및 100 μg/ml의 gentamycin을 첨가한 것을 사용하였고, 5.0 %의 CO2 농도 및 37 ℃의 조건에서 배양하였다.
또한, 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231, 인체 정상 유방상피세포주인 MCF-10A, 인체 혈액암 세포주 HL-60 및 U937은 ATCC (http://www.atcc.org)로부터 구입하였고, 인체 대장암세포주인 HCT-116 (p53+/+) 및 HCT-116 (p53-/-)은 미국 메릴랜드주 볼티모어시에 위치한 Johns Hopkins 대학교의 Dr. B. Volgelstein으로부터 분양받았다. Jurkart T cell clones (JT/Neo 및 JT/Bcl-2)는 미국 메릴랜드주 볼티모어시에 위치한 Gerontology Research Center, NIA/NIH의 Dr. D. Taub로부터 분양받았다. 이들 세포주들을 제안된 배양 조건으로 배양하였다.
4. 세포독성 측정
Jurkat T cells에 대한 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)의 세포독성을 조사하기 위해, 세포 생존율을 MTT assay 방법으로 측정하였다. 먼저, Jurkat T cells을 96-well plate에 well 당 5 x 104의 농도로 분주한 후, 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)을 다양한 농도별로 첨가하고 배양하였다. 배양 32 시간 후에, 각 well에 50 μl의 MTT 용액을 첨가하고 4 시간 더 배양하였다. 이때 생성된 formazan을 정량하기 위해 plate를 2300 rpm에서 15 분 원심분리하고 상등액을 제거한 다음, 150 μl의 DMSO를 첨가하여 형성된 formazan crystal을 용해시키고 용액의 OD 값을 540 nm에서 측정하였다.
5. 유세포 분석
Jurkat T cells의 세포주기에 미치는 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)의 영향을 분석하기 위해, aruncin B를 농도별로 첨가하고 36 시간 동안 배양한 후 세포를 회수하여 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 2 회 세척하고 66.7 % cold ethanol로 1 시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 250 μl RNase 용액 (50 μg/ml RNase)으로 30분 처리한 후 250 μl의 propidium iodide (PI) 용액 (50 μg/ml)으로 첨가하여 20 분간 염색하였으며, 이를 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 분석하여 세포주기의 변화를 조사하였다.
한편, Jurkat T cells에 있어서 aruncin B 처리에 의해 유도되는 apoptosis에 necrosis가 수반되는지를 조사하기 위해, aruncin B로 처리된 세포를 Annexin V-FITC 염색 후 유세포분석기로 분석하였다. 먼저, 처리된 세포를 1 X binding buffer 로 세척하고, Annexin V-FITC와 PI로 15 분 동안 반응시킨 다음 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD bioscience, San Jose, CA)로 분석하였다. Aruncin B의 처리에 의한 Jurkat T cells의 미토콘드리아 막전위의 변화의 유무를 조사하기 위해, 처리된 세포를 회수하고 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)로 2 회 세척하였으며, 이를 50 nM 3,3'dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6)로 15 분 동안 처리한 후 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD bioscience, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.
6. Apoptotic DNA fragmentation 분석
인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cell에 있어서 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)처리에 의한 apoptotic DNA fragmentation을 확인하기 위해, 세포를 aruncin B가 존재하는 조건으로 36 시간 동안 배양한 후 회수하여 cold PBS로 2 회 세척하였다. 회수한 세포를 세포용해 완충액 (0.5 % Tritox X-100, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4) 내에 4 ℃에서 20 분 동안 반응시키고 14000 rpm에서 15 분 동안 원심분리한 후 상등액을 확보하였다. Nucleic acid를 포함한 상등액은 proteinase K, RNase 처리 후 페놀-클로로포름을 이용하여 추출 정제한 다음, 에탄올 침전으로 회수하였다. 회수된 DNA 절편은 침전물을 1.2 % 아가로즈 젤에서 전기영동을 수행하여 확인하였다.
7. 세포 용해물 조제와 웨스턴블로팅 분석
세포 용해물을 얻기 위하여 Jurkat T cells (5 x 106)을 300 μl의 lysis buffer (137 mM NaCl, 15 mM EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 15 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 25 mM MOPS, 2.5 μg/ml proteinase inhibitor E-64, pH 7.2)로 현탁하고 초음파 파쇄기로 파쇄한 다음, 4 ℃에서 30분 동안 추출하였으며 이를 14000 rpm에서 20 분간 윈심분리하여 상등액을 확보하였다. 동일한 양의 단백질을 함유한 세포 용해물을 4 ~ 12 % SDS gradient polyacrylamide gel의 조건에서 MOPS buffer를 이용하여 전기영동한 다음, gel 속에서 전기영동된 단백질을 Immobilon-P 막에 전기전달 (electrotransfer)시켰다. Immobilon 막에 위치한 단백질의 확인에는 ECL 웨스턴 블로팅 킷 (western blotting kit)을 사용하였다.
8. 세포질 분리
세포 내의 미콘드리아를 제외한 세포질 부분의 분리를 위하여 aruncin B를 농도별로 36 시간 동안 처리한 후 세포를 회수하여 lysis buffer (250 mM sucrose, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 2.5 mg/ml E64, 20 mM HEPES, pH 7.2)로 현탁하고 30 분간 4 ℃에서 반응시킨 후 Dounce homogenizer를 사용하여 세포를 분쇄하고 3500 rpm에서 10 분간 원심분리 후 얻은 상등액은 다시 13,700 rpm에서 15 분간 원심분리를 수행하여 상등액을 확보하였다. 단백질을 함유한 세포질은 4 ~ 12 % SDS gradient polyacrylamide gel의 조건에서 MOPS buffer를 이용하여 전기영동 하였으며, 이어서 전기영동된 단백질을 Immobilon-P 막에 전기전달 (electortransfer)시켰다. 웨스턴 블롯에 위치한 단백질은 ECL 웨스턴 블로팅 킷 (Western blotting kit)을 사용하여 검출하였다.
9. Pro-apoptotic Bak 의 활성화 분석
인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cell에 있어서 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)처리에 의한 pro-apoptotic protein Bak의 활성화를 확인하기 위해, 세포를 aruncin B가 존재하는 조건으로 36 시간 동안 배양한 후 회수하여 cold PBS로 1 회 세척하였다. 회수한 세포를 1 % paraformaldehyde 용액에서 30 분 동안 세포를 고정한 후, 1 차 항체 (conformation specific anti-Bak)를 500 μg/ml digitonin 반응액에서 1 시간 동안 반응시키고, 형광이 접합되어진 2 차 항체 (Alex Fluor 488-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 500 mg/ml digitonin 반응액에서 30 분 동안 반응을 수행한 후, PBS로 2 회 세척한 후 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 FL1 형광의 증가현상을 측정하였다.
10. α-tubulin 변화 관찰
인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cell에 있어서 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)처리에 의한 세포의 microtubule의 변화를 관찰하기 위하여 형광염색을 수행하였다. 세포를 aruncin B가 존재하는 조건으로 36 시간 동안 배양한 후 cover slide에 세포를 부착하고 , PBS로 2 회 세척을 수행한 후, cold methanol 용액에서 세포를 고정, 0.5 % Triton X-100을 함유한 용액에서 5 회 세척을 수행 후 Goat serum이 포함된 0.2 % Tween20을 함유한 용액에서 1 시간 동안 Blocking을 수행하였다. Blocking 후, 0.2 % Triton X-100을 함유한 용액에서 2 회 세척을 한 후, 1 차 항체 (anti-α-tubulin)를 첨가하여 over night으로 반응을 수행하였다. 1 차 항체 반응이 끝난 후, 0.2 % tween20을 함유한 용액에서 5 회 세척을 수행하고, FITC 형광이 접합되어진 2 차 항체 (Alex Fluor 488-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 1 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.2 % Tween-20이 함유된 용액에서 5 회 세척을 수행한 후 핵 염색을 위해 1.5 mM 농도의 DAPI 용액을 10 분간 반응시킨 후 cold PBS 용액에서 2 번 세척 후 cover slide는 anti-fade 처리를 수행하고, confocal 현미경 (LSM 700, Carl Zeiss MicroImaging) FITC 형광파장에서 α-tubulin의 변화를 관찰하였다.
11. 말초혈액세포의 분리
혈액샘플을 RPMI 1640배지로 희석한 다음 Ficoll 용액을 cushion으로 하여 원심분리한 다음 상등액 속에 존재하는 PBMC (peripheral blood mononuclear cells) 층을 회수하였다. 회수된 PBMC를 cold PBS로 세척한 후 인체 T 세포분리 컬럼 (human T cell enrichment column, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 peripheral T cells를 분리하였다. 그리고, 분리된 resting T cells을 0.2 μg/ml 농도의 PHA (phytohemagglutinin A)를 첨가하여 60 시간 동안 활성화시켰다.
12. 통계처리
모든 실험은 독립적으로 3 회 이상 실시하여 통계처리 하였다.
결 과
1. 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)에 존재하는 세포자살 유도물질인 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B)의 정제 및 확인
삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)의 95 % EtOH 추출물을 감압 건조시킨 다음 물에 용해시키고 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, 및 n-butanol의 순서로 연속적인 유기용매추출을 시도하여 분획하였다. 각 분획의 인체 급성 백혈병 세포주인 Jurkat T cells에 대한 세포독성을 조사한 결과, methylene chloride 추출물이 가장 강한 세포독성을 나타내어 IC50값은 57 μg/ml이었으며, 그 외 유기용매추출물은 세포독성이 그다지 높지 않았다 (도 1A). 이때 methylene chloride 추출물은 세포독성을 나타냄과 동시에 apoptotic DNA fragmentation 현상과 미토콘드리아 막 전위 감소효과를 나타내었다 (도 1B 및 도 1C).
또한, Jurkat T cells을 methylene chloride 추출물로 처리하였을 때, Annexin-V-FITC에 의해서만 염색되는 초기 apoptotic cells과 Annexin-V-FITC 및 PI에 의해 동시에 염색되는 후기 apoptotic cells의 비율이 농도-의존적으로 증가되었다. 그러나, PI에 의해서만 염색되는 necrotic cells을 거의 확인되지 않았다 (도 1D).
이러한 결과를 바탕으로 삼나물의 methylene chloride 추출물에 의해 유도되어지는 인체 급성백혈병 세포주 (Jurkat T cells)에서의 세포독성을 세포 자살에 의해 나타남을 확인하였다.
또한, methyene chloride 추출물의 암세포 독성을 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231, 인체 정상 유방상피세포주인 MCF-10A, 인체 대장암세포주인 HCT-116 (p53+/+) 및 HCT-116 (p53-/-) 등을 비롯한 여러 암세포주들을 대상으로 조사하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 나타난 바와 같이, methylene chloride extract 추출물은 조사한 모든 암세포주들에 대해 세포독성을 나타내었으며, 이때 각 암세포주에 대한 IC50 값은 Jurkat T cells (clone E6.1)의 경우는 54 μg/ml, Jurkat T cells (clone JT/Neo)의 경우는 57 μg/ml, Jurkat T cells (clone JT/Bcl-2)에 대해서는 80 μg/ml, HL-60 cells의 경우는 45 μg/ml, U937 cells의 경우는 50 μg/ml으로 나타났다. 이때 인체 대장암 세포주인 HCT-116 (p53+/+) 및 HCT-116 (p53-/-)의 경우는 종양억제 유전자인 p53의 발현 유무와 상관없이 모두 46 μg/ml로 확인되었다. 한편, 인체 유방암세포주인 MDA-MB-231 cells의 경우는 IC50 값이 76 μg/ml인데 반해, 인체 정성 유방상피세포주인 MCF-10A cells의 IC50 값은 >200 μg/ml로 확인되었다.
이러한 결과는 삼나무의 methylene chloride 추출물속에 함유되어 있는 세포독성물질이 정상 상피세포에 비해 암세포에 대해 훨씬 더 강한 효과를 지니고 있으며, 이때의 암세포 독성은 암세포 내의 p53의 발현 유무에 의해서 영향을 받지 않음을 시사해 준다.
표 1 삼나물로부터의 메틸렌 클로라이드 추출물의 인체 암세포주의 저해 효과
세포주 IC50 (μg/ml)a
Human acute T cell leukemia Jurkat E6.1 54
Human acute T cell leukemia Jurkat (JT/Neo) 57
Human acute T cell leukemia Jurkat (JT/Bcl-2) 80
Human promyelocytic leukemia HL-60 45
Human monoblastoid U937 50
Human colorectal carcinoma HCT-116 (p53+/+) 46
Human colorectal carcinoma HCT-116 (p53-/-) 46
Human breast cancer MDA-MB-231 76
Human normal mammary epithelial MCF-10A > 200
a IC50 값은 MTT 검정법에 의한 세포의 생존율이 50 % 감소되는 메틸렌 클로라이드 추출물의 농도를 나타낸다. 세포주를 36 시간 동안 배양하고, 최종 4 시간 동안 MTT 시약하에서 배양하였다.
이어서 이러한 methylene chloride 추출물에서의 세포독성 효과를 나타내는 물질을 순수 분리하기 위해서 methylene chloride 추출물 (31.5 g)의 silica gel column chromatography를 수행하였고, gradient elution (hexane/methylene chloride/methanol/water)을 수행하여 26 분획 (M1 ~ M26)으로 분리하였다. 그 결과, M14 분획 (0.1167 g)은 gradient 5 - 50 % MeOH을 사용하여 reverse-phase column chromatography를 수행하였다. 그 결과 항암물질 N9 (29.2 mg)을 추출하였으며, 이 추출물은 기기분석결과를 통해 신규물질인 2-(8'-에톡시-8'-메틸프로필리덴)-5-히드록시-3,6-디히드로-2H-피란-4-카복실산 (aruncin B, C12H18O6)으로 확인되었다 (도 2). 아룬신 B 화합물의 1H-NMR 및 13C-NMR 측정 결과는 다음과 같다.
Colorless syrup; [α]D20:+27.0°C=0.1%, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε): 201.5 (0.96), 276.5 (1.34); IR (KBr) cm-1 : 3405, 1724, 1051; FAB-MSm/z 265 [M+Na]+; HR-FAB-MS m/z 265.1056 [M+Na]+ (calcd. 265.1052 for C12H18O5Na); 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ: 3.76 (2H, dd, J=12.0, 4.0 Hz, H-2), 3.65 (1H, dd, J=12.0, 4.0 Hz, H-3), 7.47 (1H, s, H-5), 5.57 (1H, s, H-1′), 1.50 (1H, s, H-3′), 1.50 (1H, s, H-4′), 3.57 (2H, dd, J=14.0, 7.2 Hz, H-5′), 1.22 (3H, t, J=7.2 Hz, H-1″);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ: 64.2 (C-2), 76.7 (C-3), 132.1 (C-4), 143.1 (C-5), 147.4 (C-6), 125.0 (C-1′), 71.2 (C-2′), 30.3 (C-3′), 30.3 (C-4′), 66.7 (C-5′), 15.8 (C-6′), 170.8 (C-1″)
2. Aruncin B에 의해 유도되는 에폽토시스에 관련된 G2/M-arrest, 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출 및 caspase cascade의 활성화
Aruncin B에 의해 유도되는 에폽토시스 기전을 이해하기 위해, Jurkat T cells에 empty vector plasmid를 stable transfection 시킨 clone JT/Neo와 Jurkat T cells에 Bcl-2 gene을 stable transfection시킨 clone JT/Bcl-2에 aruncin B를 처리한 후 세포주기의 변화와 미토콘드리아 막 전위 변화를 유세포 분석을 통해 조사하였다. Aruncin B (7.5 ~ 30 μg/ml)의 인체 급성 백혈병세포주인 Jurkat T cells에 대한 세포독성을 조사한 결과, JT/Neo 세포에 대한 cell viability는 82.0 %, 57.4 %, 및 44.9 %로 감소하였으며, 동일한 조건에서 JT/Bcl-2 세포의 경우는 81.5 %, 71.5 %, 및 61.2 %로 나타났으며 (도 3A), JT/Neo 세포를 aruncin B (7.5 ~ 30 μg/ml)의 존재하에서 36 시간 동안 배양하였을 때, aruncin B의 농도에 의존적으로 sub-G1 세포의 비율이 증가하였으며 또한 G2/M 세포의 비율도 증가하였다 (도 3B).
동일한 조건에서 JT/Bcl-2 세포의 경우는 G2/M 세포의 증가는 JT/Neo 세포의 경우보다 더 분명하게 확인되었으나 sub-G1 세포는 나타나지 않았다. 또한, aruncin B에 의한 미토콘드리아 막 전위 감소는 JT/Neo에서 쉽게 확인되었으나, JT/Bcl-2 세포에서는 확인되지 않았다 (도 3C). 에폽토시스에 대한 Bcl-2의 저해 효과는 미토콘드리아 존재하는 사이토크롬 c의 세포질로의 방출을 차단하는 작용을 통하여 사이토크롬 c-의존적인 caspase cascade의 활성화를 억제하기 때문으로 보고되었다 (Yang et al., 1997). 이러한 기존의 연구보고와 현재의 연구결과에 근거하면, Jurkat T cells에 있어서 Bcl-2에 의해 저해되는 미토콘드리아 막전위 감소 및 사이토크롬 c 방출이 aruncin B에 의해 유도되는 에폽토시스에 있어서 필수적임을 시사해준다. 이러한 가설을 규명하기 위해, aruncin B에 의해 유도되는 에폽토시스에 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출과 caspase cascade activation이 수반되는지를 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 그 결과 도 4A에서 나타난 바와 같이, JT/Neo 세포의 경우는 aruncin B (15 - 30 μg/ml) 처리에 의해 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출이 증가하였으나 Bcl-2가 과별현 되는 JT/Bcl-2 세포에서는 미토콘드리아 사이토크롬 c의 방출이 나타나지 않았다. JT/Neo 세포에서는 사이토크롬 c 방출과 함께, 비활성화 상태인 pro-caspase-9 (47 kDa)의 활성화 상태인 active caspase-9 (37/35 kDa)으로의 활성화 뿐만 아니라 pro-caspase-3 (32 kDa)의 active caspase-3 (17 kDa)로의 활성화도 농도-의존적으로 증가되는 것으로 확인되었다 (도 4B). 에폽토시스 신호전달경로에서 active caspase-3에 의해 분해되는 것으로 알려진 poly(ADP-ribose)polymerase (PARP)의 분해현상도 확인되었고, pro-caspase-8 (57 kDa)의 active caspase-8 (43/41 kDa)로의 전환도 확인되었다.
한편, pro-apoptotic Bcl-2 family proteins 중의 하나로 알려진 Bid (22 kDa)는 active caspase-8에 의해 분해되어 truncated Bid (tBid, 15 kDa)로 전환되며, 이 tBid는 미토콘드리아막에 손상을 일으켜 사이토크롬 c 방출을 일으키는 것으로 보고되었다 (Desagher et al., 1999; Li et al., 1998). JT/Neo 세포를 aruncin B로 처리하였을 때, caspase-8의 활성화와 함께 Bid (20 kDa) 단백질 수준의 감소 및 사이토크롬 C 방출의 증가가 확인되었다. 이때 웨스턴 블롯 분석을 통해 Bid 단백질 수준의 감소는 쉽게 확인되었으나 tBid (15 kDa)는 확인할 수 없었는데, 이는 tBid의 half-life가 짧기때문인 것으로 사료되었다.
한편, JT/Neo 세포에 있어서 aruncin B에 의해 유도되는 여러 가지 caspases의 활성화, 그리고 PARP 분해현상은 BCl-2를 과발현하는 JT/Bcl-2 세포에서는 완전하게 차단되는 것으로 나타났다. 동일한 조건하에서의 Bcl-2 family 단백질의 발현변화를 조사한 결과, pro-apoptotic 단백질인 Bad 그리고 Bax의 경우는 aruncin B 처리에 의한 영양이 없었으나, Bak의 경우는 단백질 발현양이 증가되었다 (도 4B). Anti-apoptotic 단백질 Bcl-2와 Bcl-xL 단백질의 발현양을 조사한 결과, aruncin B 처리에 의한 단백질 발현의 차이는 없었다. 이러한 연구결과들은 Jurkat T 세포를 aruncin B 처리하였을 때 유도되는 에폽토시스에 있어서 미토콘드리아 막 전위 감소, 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출은 pro-apoptotic 단백질의 발현양의 증가에 의한 결과임을 나타내며, 그리고 이에 따른 caspase cascade의 활성화와 PARP의 분해현상이 필수적으로 요구되며, 이러한 에폽토시스 현상들은 Bcl-2에 의해 저해될 수 있음을 확인해 준다.
한편, aruncin B를 처리한 JT/Neo 및 JT/Bcl-2 세포에서 Bcl-2의 threonine 56과 serine 70 잔기의 인산화가 모두 확인되었다 (도 4C). 이와 동일한 조건하에, Bak 활성화 또한 관찰되었다 (도 4D). Bcl-2의 인산화는 Bcl-2 입체구조의 변화 (conformational change)를 일으켜 Bcl-2를 불활성화시키므로, 세포내 미토콘드리아의 사이토크롬 C 방출 및 caspase cascade의 활성화를 저해하지 못하는 것으로 보고된 바 있다 (Chiara et al., 2006). 이러한 연구결과는 aruncin B에 의해 유도되어지는 Bcl-2 인산화 그리고 Bak 활성화가 미토콘드리아 사이토크롬 c 방출 및 caspase cascade 활성화의 상위단계일 수도 있음을 시사해 준다. 세포주기의 M phase에서 M-phase promoting factor (MPF)로서 중요한 기능을 수행하는 p34cdc2/cyclin B1 kinase가 Bcl-2를 인산화시키는 Bcl-2 kinase로서의 작용도 할 수 있는 것으로 보고되었으며 (Furukawa et al., 2000; Terrano et al., 2010), 또한 p34cdc2 kinase 활성의 조절에는 p34cdc2의 인산화 상태의 변화와 같은 post-translational modification이 매우 중요하게 관여하는 것으로 보고된 바 있다 (Fesquet et al., 1993; Watanabe et al., 1995).
JT/Neo 및 JT/Bcl-2 세포를 aruncin B로 처리하였을 때 p34cdc2의 인산화의 변화가 수반되는지를 조사하였다. 그 결과, aruncin B를 처리한 JT/Neo와 JT/Bcl-2 세포 모두에서 p34cdc2 단백질 수준은 별 차이가 없었으나 p34cdc2의 Tyr-15에서의 인산화는 감소되었고 p34cdc2의 Thr-161에서의 인산화는 증가되는 것으로 나타났다. 아울러 cyclin B1 단백질의 수준이 현저히 증가되는 것으로 나타났다 (도 4C). 이러한 결과는 aruncin B의 처리에 의해 p34cdc2 kinase 활성이 증가될 수 있음을 시사한다.
이와 동시에, aruncin B에 의해 유도되는 세포주기의 G2/M phase에서 p34cdc2 kinase에 의해 일어나는 Histone H3의 Ser-10의 인산화 (Prigent and Dimitrov, 2003; Maton et al., 2003)가 aruncin B를 처리한 JT/Neo 및 JT/Bcl-2 세포 모두에서 확인되었다. 이러한 결과는 aruncin B에 의해 유도되어지는 Jurkat T 세포의 G2/M arrest 동안에 p34cdc2 kinase 활성이 계속 유지되며, 이때 유지되는 p34cdc2 kinase의 활성에 의해 Bcl-2 단백질이 인산화가 초래되는데, Bak 활성화에 의한 미토콘드리아-의존적인 세포자살의 현상에서 상위 신호로 작용함을 시사해 준다.
3. Aruncin B에 의해 유도되는 G2/M arrest에 대한 microtubule damage 의 영향
Aruncin B에 의해 유도되는 G2/M arrest 현상이 microtubule damage의 영향인지 DNA damage에 의한 영향인지 확인하기 위해, JT/Neo 와 JT/Bcl-2 세포에 microtubule damage agent인 nocodazole, DNA damage agent인 Genistein, 그리고 30 mg/ml 농도의 aruncin B를 첨가하여 배양하였다. 도 5A 에서 보는 바와 같이, nocodazole, genistein, 그리고 aruncin B가 처리된 JT/Neo 세포는 공통적으로 G2/M arrest 현상과 함께 에폽토시스 현상이 관찰되는 반면, JT/Bcl-2 세포의 경우는 G2/M 세포의 증가는 JT/Neo 세포의 경우보다 더 분명하게 확인되었으나 sub-G1 세포는 나타나지 않았다. 동일한 조건에서 JT/Neo 와 JT/Bcl-2 세포에 aruncin B를 처리한 경우, 부분적으로 JT/Neo 세포의 경우 돌기모양의 세포가 관찰되었으며, JT/Bcl-2 세포의 경우 돌기모양을 나타내는 세포가 더 분명하게 확인되었다. 이와 유사한 모양의 변화는 nocodazole을 처리한 JT/Neo 와 JT/Bcl-2 세포에서 관찰되었으나, genistein을 처리한 세포의 경우 관찰되지 않았다 (도 5B).
동일한 조건하에 JT/Neo와 JT/Bcl-2 세포에 aruncin B를 처리한 후, microtubule에 대한 형광염색을 수행하였다 (도 5C). JT/Neo 세포의 경우, microtubule 염색에 대한 형광발현의 감소와 핵 염색에 대한 분절화 되어진 핵이 관찰되는 반면, JT/Bcl-2 세포의 경우, microtubule 염색에 대한 형광발현의 감소는 보여지지만, 핵 염색에서의 분절화된 핵은 관찰되지 않았다. Nocodazole을 처리한 JT/Neo 와 JT/Bcl-2 세포에서 이와 유사한 변화가 관찰되었으나, genistein을 처리한 JT/Neo 와 JT/Bcl-2 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 aruncin B에 의해 유도되어지는 Jurkat T 세포의 에폽토시스 현상은 microtubule damage에 의한 G2/M arrest에 의한 Bcl-2 단백질이 인산화, Bak 활성화에 의한 미토콘드리아-의존적인 세포자살임을 시사해 준다.
4. Aruncin B에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 caspase inhibitors의 영향
Jurkat T cells을 aruncin B로 처리하였을 때 유도되는 caspase cascade activation 경로를 규명하고, 또한 aruncin B에 의한 Bcl-2 인산화, Histone H3의 인산화, 그리고 미토콘드리아 막 전위 감소 현상이 caspase cascade activation의 상위기전임을 확인하기 위해, aruncin B에 의한 Jurkat T 세포의 에폽토시스에 대한 pan-caspase inhibitor z-VAD-fmk, caspase-9 inhibitor z-LEHD-fmk 및 caspase-3 inhibitor z-DEVD-fmk의 영향을 조사하였다.
이를 위해 JT/Neo 세포를 각각의 caspase 저해제로 30 μM의 농도에서 1 시간 전처리한 후, aruncin B를 30 μg/ml의 농도로 첨가하여 28 시간 동안 배양하였다. 도 6A와 도 6B에서 보는 바와 같이, 각 caspase inhibitor는 aruncin B에 의해 유도되는 sub-G1 peak를 완전히 저해하였으나, G2/M-arrest 와 미토콘드리아 막 전위의 감소는 저해하지 못하는 것으로 나타났다. 또한, 웨스턴 블로팅 분석에서는, aruncin B에 의해 유도되는 caspase-3의 활성화, caspase-8의 활성화 및 PARP 분해 현상이 z-VAD-fmk에 의해 완전히 저해되었으나, pro-caspase-9 (47 kDa)의 active caspase-9 (37/35 kDa)로의 활성화는 완전히 저해하지는 못하고 부분적으로만 저해하는 것으로 나타났다. 이에 반해 aruncin B에 의해 유도되는 Bcl-2 단백질의 Thr-56 및 Ser-70 잔기의 인산화와 Histone H3의 Ser-10 잔기의 인산화는 z-VAD-fmk에 의해 저해되지 않았다 (도 6C).
이와 같은 연구결과는, aruncin B에 의한 Bcl-2의 인산화, Histone H3의 인산화 및 미토콘드리아 막 전위의 감소 현상이 caspase cascade activation의 상위기전이며, 아울러 이와 같은 미토콘드리아 막의 손상이 Bid로 부터 caspase-8에 의해 분해·생성되는 tBid에 의해 개시되는 것이 아님을 확인해 준다. 이미 보고된 바와 같이, active caspase-3 (17 kDa)에 의해 야기되는 pro-caspase-8의 활성화가 positive-feedback 기전으로서 tBid의 작용을 통해 미토콘드리아 사이토크롬 C 방출을 촉진시키는 역할을 수행한다는 개념이 caspase-9 inhibitor인 z-LEHD-fmk 혹은 caspase-3 inhibitor인 z-DEVD-fmk 존재하에서 aruncin B처리에 의한 caspase-8의 활성화 상태를 조사하였을 때 보다 명백하게 밝혀졌는데, 그 이유는 z-LEHD-fmk에 의해 caspase-9 활성이 저해될 경우나 z-DEVD-fmk에 의해 caspase-3 활성이 저해될 경우는, aruncin B에 의해 유도되는 caspase-8 활성화 뿐만 아니라 active caspase-3 (17 kDa)의 생성이 완전하게 저해되는 것으로 나타났기 때문이다.
Caspase-9 inhibitor 또는 caspase-3 inhibitor 처리 시, aruncin B에 의한 apoptotic sub-G1 peak, caspase-8 활성화, PARP 분해가 완벽하게 저해되었고 active caspase-9 (p37/35 kDa)의 유도는 현저하게 감소되었으며 active caspase-3 (17 kDa)은 확인되지 않았다. 이에 반해 active caspase-3 (p19 kDa)의 생성은 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은, aruncin B에 의한 caspase-9 및 caspase-3 간의 상호왕복적 활성화가 미토콘드리아의 사이토크롬 c 방출의 하위 단계로서, 이를 통해 active caspase-9 (37/35 kDa) 및 active caspase-3 (17 kDa)의 생성과 뒤이은 pro-caspase-8의 활성화가 야기되어 aruncin B에 의한 Jurkat T 세포의 에폽토시스에 중요하게 관련됨을 시사한다.
결과적으로, aruncin B에 의한 유도되는 세포자살에서 caspase-9, caspase-3 및 caspase-8의 활성화가 필수적으로 요구되며, G2/M-arrest, Bcl-2 인산화, Histone H3의 인산화는 미토콘드리아 손상과 caspase cascade activation의 상위 단계임을 규명하였다.
5. Aruncin B에 의해 유도되는 세포사멸에 관여하는 protein kinase 조사
Microtubule-targeting drug에 의해 유도되어지는 mitotic arrest동안의 Bcl-2 인산화의 경우 CDK1 (Ibrado et al., 1998; Pathan et al., 2001), JNK (Yamamoto et al., 1999), 그리고 p38 MAPK (Chiara et al., 2006)가 관여함이 보고 되었다. Jurkat T cells을 aruncin B로 처리하였을 때 유도되는 에폽토시스 현상에 CDK1, JNK, 그리고 p38 MAPK 가 관여하는지 확인하기 위하여, CDK1 저해제 (roscovitine), JNK 저해제 (SP600125), 또는 p38 MAPK 저해제 (SB203580)의 영향을 조사하였다.
이를 위해 JT/Neo 세포를 CDK1 저해제 (5 μM), JNK 저해제 (5 μM), 그리고 p38 MAPK 저해제 (25 μM)는 각각의 농도에서 2 시간 전처리한 후, aruncin B를 30 μg/ml의 농도로 첨가하여 28 시간 동안 배양한 후 세포독성을 조사하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, CDK1 (roscovitine)저해제는 aruncin B에 의해 유도되는 세포독성을 약 50 % 정도 저해효과를 나타낸 반면, JNK 저해제 와 p38 MAPK 저해제의 경우는 저해효과를 나타내지 못하였다. 결과적으로, aruncin B에 의해 유도되는 Bcl-2 인산화, 미토콘드리아 막 전위 변화, cytochrome c 방출, caspase cascade activation은 세포자살과정에 필수적이며, JNK 또는 p38 MAPK kinase 보다는 CDK1 kinase가 더 많이 관여할 것이라 사료된다.
6. Wild-type Jurkat T cell clone A3, FADD-dificient Jurkat T cell clone I2.1, 그리고 caspase-8-deficient Jurkat T cell clone I9.2에 대한 aruncin B의 세포독성 비교
항암제 처리에 의해 유도되는 암세포의 에폽토시스에 있어서, Fas 및/혹은 FasL 발현의 증가 현상이 관련되어 있음이 보고된 바 있다 (Friesen et al., 1996; Muller et al., 1997; Nagarkatti and Davis, 2003). Aruncin B에 의해 유도되어지는 에폽토시스의 개시에 Fas/FasL 시스템이 관련되는지를 조사하기 위해, FADD와 caspase-8를 발현하는 wild-type Jurkat T cells (clone A3), Fas-매개 에폽토시스에 대해 저항성을 나타내는 것으로 보고 (Juo et al, 1999)된 바 있는 FADD-deficient Jurkat T cells (clone I2.1) 및 caspase-8-deficient Jurkat T cells (clone I9.2)에 대한 aruncin B의 세포독성을 비교 분석하였다.
도 8A 및 도 8B에 나타난 바와 같이, aruncin B의 세포독성에 대한 Jurkat T cells의 감수성은 FADD의 발현 유무와 상관없이 유사한 것으로 확인되었다. 또한, caspase-8-결손 I9.2-clone의 경우도 wild-type A3 clone이나 FADD-결손 I2.1 clone에 비교해서는 aruncin B의 세포독성에 대해 감수성이 약간 낮았으나, 전반적으로 aruncin B의 세포독성으로부터 보호되지 않는 것으로 확인되었다.
이와 같은 연구결과는 Jurkat T 세포에 대한 aruncin B의 세포독성과 관련된 에폽토시스 유도활성이 Fas/Fas system에 의해 개시되는 기전이 아님을 확인해 준다.
7. 인체 말초혈액 T cells에 대한 독성효과
Aruncin B의 세포독성이 암세포에 비해 정상세포에 대해서는 더 낮게 작용하는지를 규명하기 위해, 인체 말초혈액 T cells 또는 인체 말초혈액 T cells을 0.2 μg/ml의 phytohemagglutinin (PHA)로 60 시간 동안 활성화 시켜 확보할 수 있는 activated T cells, 그리고 malignant Jurkat T cells (clone A3)를 대상으로 aruncin B의 세포독성을 비교하였다. 각각의 세포를 96-well plate에서 aruncin B를 농도별로 처리하고 36 시간 동안 배양한 후, MTT 법으로 cell viability를 측정하였다.
그 결과, resting 상태의 인체 말초혈액 T cells의 경우는 30 μg/ml 농도까지는 cell viability가 별로 영향을 받지 않았으며 60 μg/ml 농도의 aruncin B의 존재하에서는 63.8 %의 cell viability를 나타내었다. 이에 반해 activated T cells의 경우는 15 μg/ml, 30 μg/ml, 60 μg/ml 농도의 aruncin B의 존재하에서 각각 85.9 %, 68.5 %, 25.0 %의 cell viability를 나타내어 resting 상태의 T cells에 비해서는 aruncin B의 세포독성에 대한 감수성이 다소 높게 나타났다 (도 9).
한편, Jurkat T cells (clone A3)의 cell viability는 7.5 μg/ml 농도의 aruncin B의 존재하에서 67.7 %였으며, 15 μg/ml, 30 μg/ml, 60 μg/ml 농도에서는 각각 67.7 %, 36.1 %, 24.5 %였다. 이러한 결과는 aruncin B의 resting human T cells, activated T cells 및 Jurkat T cells (A3)에 대한 IC50 값이 60 μg/ml, 49 μg/ml, 그리고 22 μg/ml임을 보여주며, 또한 malignant Jurkat T cells의 경우는 aruncin B의 세포독성에 대한 감수성이 인체 말초혈액 T cells 보다 더 높은 것임을 확인해 준다. 인체 T cells에 대한 aruncin B의 세포독성은 주로 에폽토시스 유도에 의한 세포자살이 그 요인이므로, aruncin B의 세포독성에 대해 resting 상태의 T cells이 malignant Jurkat T cells에 비해 저항성이 훨씬 더 높은 이유는 아마도 resting T cells에서의 미토콘드리아의 낮은 수준의 발달과 death signaling mediators의 낮은 수준의 발현 때문일 것으로 사료된다.
결론적으로, 삼나물 (A. dioicus)로부터 추출되어진 새로운 monoterpenoid 물질인 aruncin B는 Jurkat T cells의 apoptotic DNA fragmentation, microtubule damage, G2/M-arrest, Bcl-2 의 threonine 56 과 serine 70 잔기의 인산화, Bak 활성화, 미토콘드리아 막 전위 감소, 미토콘드리아 사이토크롬 C의 세포질로의 방출, caspase-9 및 caspase-3의 활성화, 그리고 PARP 분해를 유도하여 에폽토시스를 일으킬 수 있음을 규명하였다. Aruncin B에 의해 유도되어진 에폽토시스 활성은 Fas/FasL에 의해 시작되어지는 extrinsic pathway가 아니며, 이러한 aruncin B의 에폽토시스 유도활성 (apotogenic activity)은 인체 정상 T cells 보다 malignant Jurkat T cells에서 더 효과적임을 확인하였다. 이러한 발견은 식용식물인 삼나물로부터 분리된 세포독성물질인 aruncin B의 항암효능을 추가적으로 평가하는데 유용하게 활용될 것이다.
이하에서는 본 발명의 삼나물 지상부의 메틸렌 클로라이드 추출물 또는 아룬신 B를 포함하는 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 제제예를 구체적으로 설명한다. 이러한 제제예들은 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니라 단지 제제예를 구체적으로 설명하고자 하는 것일 뿐이다.
제제예
제제예 1. 산제의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 2 g
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 100 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 100 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 100 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음, 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강식품의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 1 g
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강음료의 제조
삼나물 추출물 또는 아룬신 B 1 g
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강음료의 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

  1. 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 삼나물은 삼나물의 지상부 (aerial part)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride) 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스 (apoptosis) 유도제.
  6. 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003224-appb-I000003
  8. 제 7항에 있어서, 상기 화합물은 삼나물 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)로부터 추출 및 정제된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 암은 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소 세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁 경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부감상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 종양, 1 차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 에폽토시스 (apoptosis) 유도제:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003224-appb-I000004
  11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012003224-appb-I000005
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