WO2012064159A2 - 항암용 조성물 - Google Patents

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WO2012064159A2
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서성은
김선화
박유진
양혜영
김은지
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주식회사 노암
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    • A61K31/13—Amines
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • An anticancer composition comprising at least two compounds selected from the group consisting of salts as an active ingredient or a food composition for preventing or improving cancer, a method of preventing or treating cancer by administering the anticancer composition to a subject, and the It relates to the use of two or more compounds.
  • cancer treatment which accounts for most of the causes of death, includes surgery, radiation therapy, biotherapy and chemotherapy.
  • chemotherapy using anticancer agents is currently used for cancer treatment and is one of well-established treatment methods.
  • anticancer agents intervene in the metabolic pathways of cancer cells to block the replication, transcription, and translation processes of DNA, interfere with the synthesis of nucleic acid precursors, and inhibit cell division by direct interaction with DNA.
  • the anticancer agent causes fatal damage to normal cells, such as leukopenia, platelets, and red blood cells caused by bone marrow destruction; Hair loss due to hair follicle destruction; Side effects on the ovaries and testes, causing menstrual irregularities and male infertility; Side effects from the destruction of mucous membrane cells of the digestive system, including stomatitis, nausea and vomiting and digestive disorders; Diarrhea symptoms; Nephrotoxicity due to tubular necrosis; Peripheral neuritis and weakness caused by nervous system disorders; Vascular disorders such as vascular pain and rash; Various side effects occur, including skin and nail discoloration. Therefore, research to increase the therapeutic effect while minimizing the side effects caused by anticancer drugs is urgently needed.
  • the anti-cancer drug is effective initially, but gradually develops drug resistance, and the immunity is extremely deteriorated. Therefore, there is a need for a method for improving the efficacy of cancer treatment without increasing the toxicity of the drug.
  • the combination of anticancer drugs can be used in one way to enhance the efficacy of anticancer drugs.
  • combining anticancer drugs is not expected to be synergistic, and finding a combination of drugs that have a synergistic effect is very unlikely. It is difficult. Therefore, it is urgent to develop an anticancer combination agent that can maximize the anticancer effect while minimizing the side effects of the anticancer agent.
  • the present inventors have made diligent efforts to find anti-cancer substances that have no side effects on the human body by minimizing the concentration of the cancer while maximizing the therapeutic effect of cancer, and as a result, a combination formulation showing an anticancer synergistic effect through a combination of specific compounds.
  • the present invention was completed by confirming that the combination preparation inhibits cell cycle progression and effectively kills cancer cells even with a combination of low concentrations of the compound.
  • An object of the present invention is to provide an anticancer composition that can effectively treat cancer even in a small amount, and exhibits a specific toxic effect on cancer cells, thereby reducing side effects.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for the prevention or improvement of cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a use of a medicament for the treatment or prevention of cancer.
  • the present invention is 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid (Citric acid) or a pharmaceutically acceptable salt thereof provides an anticancer composition comprising as an active ingredient two or more compounds selected from the group consisting of.
  • the present invention provides 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutical thereof.
  • a food composition for preventing or ameliorating cancer comprising as an active ingredient two or more compounds selected from the group consisting of an acceptable salt.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer by administering the anticancer composition to a subject.
  • the present invention is 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, And Citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or its It relates to an anticancer composition comprising as an active ingredient two or more compounds selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts.
  • a combination formulation comprising two or more compounds selected from 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • Combination formulations of the present invention may use less amount of individual compounds included in the combination formulation than when treated with a single compound, thereby significantly reducing the risk and / or severity of side effects and significantly reducing the overall effect of the treatment. There is an advantage to increase.
  • 5-hydroxymethylfurfural is a food additive which is added as a flavoring agent in fruit juice, food, and liquor processing, and is a degradation product easily made from polysaccharides such as sugar in the food manufacturing process step. It is a substance commonly consumed through food.
  • 5-hydroxymethylfurfural has the structure of Formula 1.
  • 5-hydroxymethylfurfural is a very safe compound (National Technical Information Service). Vol. OTS0544683).
  • metformin is known as a diabetes treatment agent, which is represented by the following formula (2).
  • metformin exhibited a high anticancer effect even at low concentrations by combination with 5-hydroxymethylfurfural or / and citric acid.
  • LD 50 is 1,450 mg / kg, indicating that metformin is a very safe compound (Gekkan Yakuji.Pharmaceuticals Monthly.Vol. 9, Pg. 759, 1967). .).
  • citric acid (citric acid) can be used as an inhibitor of glycolysis, which has a structure represented by the formula (3).
  • 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid may be present in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • a "pharmaceutically acceptable salt” is a concentration that has a relatively nontoxic and harmless effect on a patient, and the side effects caused by this salt have the beneficial effect of 5-hydroxymethylfurfural, metformin or citric acid. It means any organic or inorganic addition salt that does not degrade.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid, and hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, and trifluoroacetic acid may be used as the organic acid.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • the lye metal salt or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving the compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid include salts of acidic or basic groups that may be present in 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, Hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts and the like, and are known in the art. It may be prepared through a method for preparing a salt.
  • Metformin salts of the present invention include pharmaceutically acceptable salts
  • metformin salt having an equivalent anticancer effect may be used, and preferably metformin hydrochloride, metformin succinate, metformin citrate, and the like, but is not limited thereto.
  • Citric acid salt of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt, equivalent to citric acid
  • citrate salt that exhibits an anticancer effect may be used, and preferably, but is not limited to sodium citrate, potassium citrate, calcium citrate, ammonium citrate, magnesium citrate, and the like.
  • the composition of the present invention is from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It may include two or more compounds selected as an active ingredient, preferably a combination formulation consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Combination formulations consisting of metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Combination preparation consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof; 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the combination molar ratio of each compound is not particularly limited.
  • two combination preparations comprising 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient are 5-hydroxymethylfur
  • the combination molar ratio of fural or a pharmaceutically acceptable salt thereof: metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof may range from 1: 1 to 1:60, and the combination molar ratio may vary depending on the type of cancer to be treated.
  • the combination molar ratio of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof: metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 1:20 to 1:40, preferably 1.7: 40, in gastric cancer cell lines in lung cancer cell lines 1:10 to 1:20, preferably 3:40, 1:10 to 1:15 in colorectal cancer cell lines, preferably 3.5: 40, 1:17 to 1:11 in cervical cancer cell lines, preferably 2.5 : 32, 1:10 to 1:20 in breast cancer cell lines, preferably 3:40, 1: 6 to 1:10 in pancreatic cancer cell lines, preferably 2.5: 20, 1: 6 to 1:10 in prostate cancer cell lines , Preferably 4:30, 1: 7 to 1:15 in bone cancer cell lines, preferably 3:30, 1: 7 to 1:15 in liver cancer cell lines, preferably 3:30, 1: in ovarian cancer cell lines 11 to 1:18, preferably 2.5: 35, 1:10 to 1:20 in bladder cancer cell lines, preferably 2:32, 1:17 to 1:35 in brain cancer cell lines, preferably 1.5:
  • the synergistic effect increases as the combined index molar ratio of metformin is larger than the 5-hydroxymethylfurfural concentration, but it is preferable to determine the combined index molar ratio in consideration of toxicity by high concentration of metformin.
  • the combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural and metformin at the combination molar ratio shows a combination index (CI) corresponding to a synergistic effect and a much lower drug reduction index compared to a single formulation (see Example 1).
  • two combination preparations comprising metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, may be metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the combination molar ratio of acceptable salts may range from 1: 1 to 15: 1, and the combination molar ratio may vary depending on the type of cancer being treated.
  • the combined molar ratio of metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be from 3: 1 to 5: 1, preferably 40:10, and 8: 1 in gastric cancer cell lines in lung cancer cell lines.
  • the synergistic effect increases as the combined index molar ratio of metformin is greater than citric acid concentration, but it is preferable to determine the combined index molar ratio in consideration of the toxicity caused by high concentration of metformin.
  • the combination formulation of metformin and citric acid in the combination molar ratio shows a combination index (CI) corresponding to a synergistic effect and a much lower drug reduction index compared to a single formulation (see Example 1).
  • the combined molar ratio of citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof can range from 1: 1 to 1:10, and the combination molar ratio can vary depending on the type of cancer being treated.
  • the combined molar ratio of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 1: 5 to 1: 7, preferably 1.7: 10, in lung cancer cell lines.
  • the synergistic effect is increased as the combined index molar ratio of citric acid is larger than the 5-hydroxymethylfurfural concentration, but it is preferable to determine the combined index molar ratio in consideration of the toxicity by high concentration of citric acid.
  • the combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural and citric acid in the combination molar ratio shows a combination index (CI) corresponding to a synergistic effect and a much lower drug reduction index compared to a single formulation (see Example 1).
  • the combined molar ratio of hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof: metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may range from 1: 1: 1 to 1:60:10.
  • the combination molar ratio may vary depending on the type of cancer being treated.
  • the combination molar ratio of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof: metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof: citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 1: 22: 5 in a lung cancer cell line.
  • the synergistic effect increases as the combined index ratio of metformin and citric acid is larger than the 5-hydroxymethylfurfural concentration, but it is preferable to determine the combined index molar ratio in consideration of the toxicity caused by high concentration of metformin and citric acid.
  • the combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid in the combination molar ratio shows a combination index (CI) corresponding to a synergistic effect and a much lower drug reduction index compared to a single formulation (see Example 1).
  • the invention is selected from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • Combination formulations of the present invention comprising two or more compounds as an active ingredient, reduce cell proliferation of cancer cell lines, inhibit the progression of the G1 / S phase cell cycle, and inhibit cell proliferation by inhibiting DNA synthesis of cancer cells.
  • the anticancer composition of the present invention is a combination formulation of two or more compounds selected from 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid as a combination formulation than when 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid are each used as a single formulation.
  • each of 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid should be used in excess due to insufficient anticancer effects when used as a single agent, but when used as a combination preparation combining the compounds, a small amount Can effectively kill cancer cells.
  • the combination preparation of the present invention can be used as an anticancer treatment without side effects by selectively killing only cancer cells without showing toxicity to normal cells and only toxicity to cancer cells (see Example 2-4).
  • the cytotoxicity in normal cells can be significantly reduced in the combination formulation than in the single formulation with the 50% cancer suppression concentration obtained by the single formulation and the combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate. (See Example 2-5).
  • cancer refers to a disease associated with cell death control, and refers to a disease caused by excessive proliferation of cells when a normal apoptotic balance is broken. These abnormally overproliferating cells sometimes invade surrounding tissues and organs to form masses and destroy or modify the normal structure of the body, which is called cancer.
  • tumor refers to a mass grown abnormally by autonomous overgrowth of body tissues, and may be classified into a benign tumor and a malignant tumor. Malignant tumors grow much faster than benign tumors, and metastasis occurs as they infiltrate surrounding tissues, thereby threatening life.
  • malignant tumors are commonly called 'cancer', and the types of cancers are cerebral spinal cord tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymic tumor, esophageal cancer, cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, kidney cancer and bladder cancer Prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma and skin cancer.
  • the anticancer composition of the present invention can be used without limitation to the type of cancer, lung cancer, gastric cancer, colon cancer, cervical cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bone cancer, liver cancer, ovarian cancer, bladder cancer and brain cancer It can be usefully used for prevention or treatment.
  • the term "prophylaxis or treatment” is used to inhibit the onset of cancer by using a composition for an anticancer agent comprising at least two substances selected from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural, metformin and citric acid as an active ingredient.
  • any action that delays the onset, and in particular, 'treatment' means any action that improves or beneficially alters the cancer using the composition.
  • the anticancer composition of the present invention by inhibiting the cell growth of lung cancer, stomach cancer, colon cancer, cervical cancer, breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bone cancer, liver cancer, ovarian cancer, bladder cancer and brain cancer, by promoting cell death Can effectively cure cancer.
  • the scope of the present invention includes administering the anticancer composition according to the present invention to a subject in need of preventing or treating cancer, and includes a method for preventing or treating cancer.
  • the anticancer composition of the present invention is at least two selected from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • it may further include a chemotherapeutic agent for treating cancer, if necessary.
  • chemotherapeutic agent refers to a chemical that inhibits the activity or reproduction of pathogenic microorganisms with little toxicity to the human body.
  • the chemotherapeutic agent should be harmless to the human body or have little effect on it, exert a powerful effect on the subject such as microorganisms, penetrate to the target site when administered by the proper route of administration, have sufficient time to act, It should be easy to obtain by culture or synthesis.
  • the anticancer composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external forms such as sterile injectable solutions, ointments, etc.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in such compositions may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, or the like. Mix and formulate. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquids, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • Bases for injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • composition of the present invention can be administered using a variety of methods such as oral, intravenous, subcutaneous, intradermal, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, the dosage may vary depending on the age, sex, and weight of the patient It can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to the present invention can be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc.
  • 5-hydroxymethylfurfural is used per day 1 to 100 mg / kg body weight, metformin 5 to 150 mg / kg body weight per day and citric acid 5 to 200 mg / kg body weight per day.
  • 5-hydroxymethylfurfural is 1 to 100 mg / kg body weight per day
  • metformin is 5 to 150 mg / kg body weight per day
  • citric acid is 5 per day To 200 mg / kg body weight.
  • the scope of the present invention is not limited by the above dosage.
  • the invention is selected from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • the invention is selected from the group consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a food composition for the improvement and prevention of cancer comprising two or more compounds.
  • the composition may include a food supplement acceptable food additives in addition to the active ingredient.
  • food supplement used in the present invention means a component that can be added to food supplements, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art as being added to prepare a health functional food of each formulation.
  • food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, Although pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like are included, the examples of the food additives of the present invention are not limited by the above examples.
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • a health functional food refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.
  • 'functional' means to obtain a useful effect for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food can also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in various forms of formulation, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and excellent portability, the present invention Dietary supplements are available as supplements to enhance the effectiveness of anticancer drugs.
  • the present invention provides a 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and citric acid or a salt thereof in the manufacture of a medicament for treating or preventing cancer. It relates to the use of two or more compounds selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts.
  • the anticancer composition of the present invention exhibits a synergistic anticancer effect through a combination of specific drugs that must be used in excess, thereby effectively treating cancer by inhibiting the death and cell cycle of cancer cells in a small amount.
  • the anticancer composition of the present invention may be useful as an anticancer agent because it exhibits a toxic effect specifically to cancer cells without showing toxicity to normal cells and can kill cancer cells without side effects.
  • FIG. 1 (A) shows MTT assay after 48 hours of treatment of single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate with indicated doses to A549 cell line, a cancer cell derived from human lung. Cell survival rate by percentage. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • Figure 1 (B) is analyzed by Fa-CI graph of A549 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in the ratio (mM) of 1.7: 40: 10.
  • a combination index value of less than 0.9 indicates a synergistic effect, more than 0.9 and less than 1.1 an additive effect, and a value of 1.1 or more indicates an antagonistic effect.
  • FIG. 2 (A) shows MTT assay after 48 hours of treatment of single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate with the indicated doses on AGS cell line, a cancer cell derived from human stomach Cell viability by percentage.
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • 2B is analyzed by Fa-CI graph of AGS cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 3: 40: 4.3 (mM).
  • FIG. 3A shows a single and combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride, and sodium citrate at the indicated doses for the DLD-1 cell line, a cancer cell derived from the human colon, at 48 hours after It is a graph showing the percentage of cell viability by the MTT assay. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • Figure 3 (B) is analyzed by Fa-CI graph of DLD-1 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in the ratio (mM) of 3.5: 40: 3.5 will be.
  • Figure 4 (A) is MTT 48 hours after treatment with the indicated doses of single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate against HeLa cell line, a cancer cell derived from human cervix It is a graph showing the percentage of cell viability by the assay. The vertical bar at each point represents the standard error. 4B is analyzed by Fa-CI graph of HeLa cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 2.5: 32: 8 (mM).
  • FIG. 5A shows single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at the indicated doses for the MDA-MB-231 cell line, which is a cancer cell derived from human breast. It is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after time. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • 5B is a Fa-CI graph of the MDA-MB-231 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 3: 40: 4.5 (mM). Analyzed.
  • FIG. 6 (A) shows that single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate were administered at the indicated doses to the PANC-1 cell line, a cancer cell derived from human pancreas, after 48 hours. It is a graph showing the percentage of cell viability by the MTT assay. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 6B is analyzed by Fa-CI graph of PANC-1 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 2.5: 20: 3 (mM). will be.
  • FIG. 7A shows a single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at the indicated doses for the PC-3 cell line, a cancer cell derived from the human prostate, after 48 hours. It is a graph showing the percentage of cell viability by the MTT assay. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 7B is analyzed by Fa-CI graph of PC-3 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 4: 30: 4.5 (mM). will be.
  • FIG. 8A shows a single and combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at 48 hours after treatment with Saos-2 cell line, a cancer cell derived from human bone, at the indicated doses. It is a graph showing the percentage of cell viability by the MTT assay. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 8B is analyzed by a Fa-CI graph of Saos-2 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 3: 30: 4.5 (mM). will be.
  • FIG. 9A shows single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride, and sodium citrate at the indicated doses for the SK-HEP-1 cell line, a cancer cell derived from human liver, using 48 indicated doses. It is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after time. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • (B) is a Fa-CI graph of the SK-HEP-1 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 3:30:13 (mM). Analyzed.
  • FIG. 10 shows single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at the indicated doses for SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary, at 48 doses. It is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after time. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • (B) is a Fa-CI graph of the SK-OV-3 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 2.5: 35: 8 (mM). Analyzed.
  • FIG. 11A shows MTT assay after 48 hours of treatment of single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate with the indicated doses on T24 cell line, a cancer cell derived from human bladder. Cell survival rate by percentage. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 11B is analyzed by a Fa-CI graph of T24 cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 2: 32: 7 (mM).
  • FIG. 12 shows 48 hours of treatment of single and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at the indicated doses for a U-87 MG cell line, a cancer cell derived from the human brain. It is a graph showing the percentage of cell viability by the MTT assay. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • (B) is analyzed by Fa-CI graph of U-87 MG cell line treated for 48 hours with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate in a ratio of 1.5: 35: 5 (mM). It is.
  • FIG. 13 is a graph showing the effect on the proliferation of A549 cells when 5-hydroxymethylfurfural, a combination preparation of metformin hydrochloride and sodium citrate were treated at a concentration of 1.7: 10: 10 mM for 24, 48 and 72 hours. to be.
  • FIG. 14 is a graph showing cell cycle distribution by flow cytometry after 24 hours of incubation of A549 cells with no combination of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate and control cells without addition.
  • FIG. 15 shows cell lysate after 8, 16, 24, and 40 hours of incubation of A549 cells and control cells without the combination of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate. It is shown which proteins affect the combination formulation.
  • Figure 16 shows the cell viability after treatment with a combination formulation of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate at a ratio of 1.7: 10: 10 mM for 48 hours to normal lung epithelial cell NL20 and lung cancer cell A549. It is.
  • FIG. 17 shows normal lung epithelial cell NL-20 for 48 hours after treatment with 50% cancer suppression concentration obtained by single and combination preparations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate of lung cancer cell A549. The survival rate is shown.
  • Human tumors such as lung cancer (A549), stomach cancer (AGS), colon cancer (DLD-1), cervical cancer (HeLa), breast cancer (MDA-MB-231), pancreatic cancer (PANC-1), prostate cancer (PC -3)
  • the cell lines were purchased from Korean cell line bank (Seoul, Korea).
  • Normal lung epithelial cell NL-20 was purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA).
  • RPMI-1640 medium Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% v / v fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 units / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin. All cells were fed at 37 ° C., 5% carbon and 95% oxygen using cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in RPMI-1640 medium. Were incubated in a wet incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • the monolayers of the cells were washed with phosphate buffer and then subcultured with 0.25% trypsin (trypsin-2.65 mM EDTA), and the medium was changed every three days.
  • Yellow tetrazolium MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was performed according to Carmichael et al.
  • the MTT assay is a method of measuring the growth of living cells, and utilizes the principle that the dehydrogenase in the mitochondria of living cells produces purple formazan by MTT, which is a yellow water-soluble substance.
  • the production of purple formazan is known to be nearly proportional to the number of living cells that are metabolically active and can be used very effectively to measure cell growth and differentiation.
  • Each cultured cancer cell was added to a 96 well plate at 200 ⁇ l of 2 ⁇ 10 4 cells / ml per well and incubated in a wet incubator fed with 37 ° C., 5% carbon and 95% oxygen for 24 hours, Each single formulation and combination formulation were each treated with cancer cells using a combination index indicating the fraction affected for the concentration of drug corresponding to IC50. After 48 hours of incubation, 15 ⁇ l of MTT (5 mg / ml) dissolved in phosphate buffered saline (PBS) was added to each well, followed by further incubation for 4 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Cells were seeded in 96 well plates at 2 ⁇ 10 4 cells / well and treated with 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate, respectively, as a single agent drug at the concentration of the drug corresponding to its IC50.
  • the combination formulation drug was treated at a concentration corresponding to the IC 50 of the combination formulation consisting of two or more compounds selected from 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride and sodium citrate. All cell lines were cultured for 48 hours at the concentration of single or combination preparations, and growth inhibition effect was measured by MTT assay.
  • fa is the fraction of cells affected by drug concentration D (eg 0.9 if cell growth is inhibited by 90%), fu is the fraction unaffected as (1- fa ), m Is the slope coefficient of the S-sigmodicity of the concentration-effect curve, based on the slope of the curve for each drug in the combination, whether the drugs have mutually non-exclusive effects (eg, independent of action or Interaction mode), where the combination Index (CI) was determined using the following equation.
  • (D x ) 1 is the concentration of Drug 1 required to produce the x% effect of Drug 1 alone, and (D) 1 is the amount of Drug 1 required to produce the same x% effect in combination with (D) 2 .
  • the CI value can be obtained by the above equation for various values of fa . In the above formula, when the CI value indicating cytotoxicity by the interaction of two drugs is less than 0.9, a synergistic effect is shown, and the value of 0.9 to 1.1 represents an additive effect. However, if the CI value is higher than 1.1, it shows less antagonistic effect than the additive effect.
  • the drug reduction index (DRI) is a measure of how much the concentration of each single drug decreases in the effect of a given drug by the interaction of two or more drugs.
  • (DRI) 1 (D x ) 1 / (D) 1 and
  • (DRI) 2 (D x ) 2 / (D) 2 .
  • cells were diluted with medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 24 Dispense into well plates. After 24 hours, the cells were cultured by replacing the medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) with a medium containing a combination of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride, and sodium citrate. After incubating the cells for 16 hours by adding a combination of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride, and sodium citrate, the cells were treated with trypsin-EDTA to collect the cells, followed by phosphate buffered saline.
  • FBS fetal bovine serum
  • Cells were rinsed with PBS) and fixed with 70% ethanol. After fixing the cells, the cells were stained by adding Guava cell cycle reagent containing propidium iodide. Cells stained with propidium iodide were measured by flow cytometry using a flow cytometer (Guava EasyCyte: Guava Technologies, Inc., Hayward, Calif., USA). Analyzes were performed using Guava CytoSoft version 2.5 software (Guava Technologies).
  • Cells were incubated for 8, 16, 24, 40 hours in a 100 mm dish by adding a combination of 5-hydroxymethylfurfural, metformin hydrochloride, and sodium citrate to the cell culture in the same manner as described above.
  • Cell lysate Rinse cells with cold phosphate buffered saline (PBS) to make cell lysates, lysis buffer (20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na 3 VO 4 ) were added and stirred at 4 ° C. for 40 minutes. The precipitate was removed by centrifugation at 13,000 xg for 10 minutes, and the supernatant was taken and used as a lysate.
  • PBS cold phosphate buffered saline
  • Protein concentration was measured using the BCA method (Pierce). 50 ⁇ g of total protein was loaded into SDS-polyacrylamide gel containing Tris-glycine elution buffer. These proteins were electrophoresed using a Mini-protein system (Bio-Rad) and a nitrocellulose membrane using a Mini Trans Blot electrophoresis transfer cell (Bio-Rad) for 1 hour at 100 V. : Bio-Rad). These nitrocellulose membranes were blocked for 30 minutes with Tween 20 TBS (TBST) containing 5% skimmed milk and 16 hours at 4 ° C. with the addition of the antibody to be measured in TBST containing 3% BSA. Or stirred at room temperature for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Dako horseradish peroxidase
  • Example 1-1 Effect of inhibiting survival rate of lung cancer cell line (A549)
  • A549 cell line which is a cancer cell derived from human lung
  • a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single preparation of HMF, MET and CT, respectively, were compared.
  • Table 1 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the A549 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 2.20 mM in HMF, 43.08 mM in MET and 15.78 mM in CT.
  • the 50% cancer suppression concentration was 0.79 to 0.90 mM in HMF and 18.50 to 21.08 mM in MET.
  • CT was 5.27 ⁇ 5.29 mM, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.38, 9.01, and 2.25 mM in HMF, MET, and CT, respectively, and 50% at the lowest concentration than a single formulation or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 2 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the combination index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in the A549 cell line showed synergistic effects at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. Indicated.
  • HMF / MET, MET / CT combination formulations HMF was 2.2 ⁇ 2.8 times, MET was 2.0 ⁇ 2.5 times, CT showed a drug reduction effect of 2.2 ⁇ 3.0 times.
  • HMF HMF / MET / CT
  • CT shows the highest drug reduction effect among the combination formulations. It was.
  • FIG. 1A shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in an A549 cell line, a cancer cell derived from human lung, for 48 hours. After providing, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • Figure 1 (B) shows the combination index (CI) according to the Fractional Effect (Fractional Effect, Fa) of the A549 cell line treated for 48 hours with a combination formulation containing HMF, MET and CT in a ratio of 1.7: 40: 10 It is shown.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • AGS cell line which is a cancer cell derived from the stomach of humans
  • a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single agent of HMF, MET and CT were compared.
  • Table 3 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination formulation and the compound of a single formulation in the AGS cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) of the compound of the single agent was 3.35 mM in HMF, 48.75 mM in MET and 3.61 mM in CT.
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.27 to 1.48 mM in HMF and 17.74 to 19.70 mM in MET. , 1.83 ⁇ 1.91 mM in the CT, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.85, 11.34, and 1.22 mM in HMF, MET, and CT, respectively, with 50% at the lowest concentration than a single formulation or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 4 shows the Combination Index (CI) at IC50, IC75, IC90 and Drug Reduction Index (DRI) of each compound in the Combination Formulation.
  • HMF / MET, MET / CT combination preparations HMF was 2.3 ⁇ 2.6 times, MET 2.3 ⁇ 2.8 times
  • CT showed a drug reduction effect of 1.9 ⁇ 2.4 times.
  • the compounds of HMF / MET / CT a combination product containing three compounds, HMF was 3.9 to 4.2 times, MET was 4.2 to 4.3 times and CT was 3.0 to 4.0 times. Indicated.
  • FIG. 2 (A) provides a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT for 48 hours to AGS cell lines, which are cancer cells derived from human stomach. After that, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 2B shows CI according to Fa of an AGS cell line treated with a combination formulation comprising HMF, MET and CT for 48 hours at a ratio of 3: 40: 4.3.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect.
  • the effect of inhibiting the cell proliferation of a combination formulation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single formulation of each of HMF, MET and CT was compared.
  • Table 5 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination formulation and the compound of a single formulation in the DLD-1 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of single agent was 4.90 mM in HMF, 42.61 mM in MET and 5.08 mM in CT.
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.68-1.75 mM in HMF and 15.67-19.21 mM in MET.
  • CT showed 1.37 ⁇ 1.75 mM, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.93, 10.67, and 0.93 mM in HMF, MET, and CT, respectively, with 50% at the lowest concentrations of either single or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 6 shows the combination index (CI) in the IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • HMF showed 2.2 ⁇ 2.9 times
  • MET showed 2.2 ⁇ 2.7 times
  • CT showed 2.3 ⁇ 3.7 times.
  • HMF is 4.1-5.2 times
  • MET is 4.0-4.2 times
  • CT is 4.0-5.4 times
  • CT has the highest drug reduction effect among the combination products. Indicated.
  • FIG. 3 (A) shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a DLD-1 cell line, which is a cancer cell derived from the human large intestine. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • 3B is a Fa-CI graph of a DLD-1 cell line treated for 48 hours with a combination preparation including HMF, MET and CT at a ratio of 3.5: 40: 3.5.
  • CI is shown according to Fa.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • HeLa cell line which is a cancer cell derived from the human cervix
  • a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single agent of HMF, MET and CT, respectively, were compared.
  • Table 7 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the HeLa cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) of the compound of the single agent was 3.27 mM in HMF, 38.09 mM in MET and 11.26 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation containing two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.22 to 1.34 mM in HMF and 15.59 to 15.78 in MET.
  • CT 3.94 to 4.30 mM was shown, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.76, 9.71, and 2.43 mM in HMF, MET, and CT, respectively, with 50% at the lowest concentration than a single formulation or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 8 shows the combination index (CI) in the IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the Combination Index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in the HeLa cell line had synergistic effects at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. Indicated.
  • HMF / / CT combination formulations HMF was 2.1 ⁇ 2.7 times, MET 2.0 ⁇ 2.4 times, the CT showed a drug reduction effect of 2.5 ⁇ 3.0 times.
  • the compounds of HMF / MET / CT a combination product containing three compounds, HMF was 4.2 to 4.3 times, MET was 3.1 to 3.9 times, and CT was 4.6 to 4.9 times. Indicated.
  • FIG. 4A shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a HeLa cell line, which is a cancer cell derived from human cervix, for 48 hours. After providing, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 4B shows CI according to Fa of a HeLa cell line treated with a combination formulation comprising HMF, MET and CT for 48 hours at a ratio of 2.5: 32: 8.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 1-5 Survival Inhibitory Effect of Breast Cancer Cell Line (MDA-MB-231)
  • MDA-MB-231 cell line which is a human breast-derived cancer cell
  • Table 9 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the MDA-MB-231 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 2.77 mM in HMF, 37.31 mM in MET and 5.22 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation containing two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.11-1.20 mM in HMF and 14.84-15.66 in MET.
  • CT 1.76 to 1.79 mM was shown, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.60, 8.02, and 0.90 mM in HMF, MET, and CT, respectively, and was 50% at the lowest concentration than a single formulation or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 10 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • HMF / MET, MET / CT HMF / CT combination formulations HMF was 2.3-2.5 times, MET 2.3-2.5 times, CT showed a drug reduction effect of 2.3-3.0 times.
  • a combination formulation containing three compounds HMF was 4.3 to 4.6 times
  • MET was 4.3 to 4.7 times
  • CT was 4.3 to 5.8 times. Indicated.
  • Figure 5 (A) is a single agent of HMF, MET, CT and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT MDA-MB-231 cell line which is a cancer cell derived from human breast After 48 hours, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown.
  • Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 5B shows CI according to Fa of the MDA-MB-231 cell line treated for 48 hours with a combination formulation comprising HMF, MET and CT at a ratio of 3: 40: 4.5.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 1-6 Survival Inhibitory Effect of Pancreatic Cancer Cell Line (PANC-1)
  • Table 11 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination formulation and the compound of a single formulation in the PANC-1 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 2.67 mM in HMF, 18.34 mM in MET and 3.37 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation comprising two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.01 to 1.10 mM in HMF and 7.95 to 8.09 in MET.
  • CT 1.19 to 1.31 mM was shown, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, exhibited 0.56, 4.49, and 0.67 mM in HMF, MET, and CT, respectively, with 50% at the lowest concentration than either the single or two combination formulations. Cancer inhibitory concentration was shown.
  • Table 12 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the combination index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in PANC-1 cell lines increased at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. The effect was shown.
  • HMF / MET, MET / CT HMF / CT combination preparations HMF was 2.4 ⁇ 2.8 times, MET 2.0 ⁇ 2.5 times, CT showed a drug reduction effect of 1.9 ⁇ 2.8 times.
  • a combination product containing three compounds HMF was 4.8 to 5.2 times
  • MET was 4.0 to 4.1 times
  • CT was 3.5 to 5.0 times. Indicated.
  • FIG. 6 (A) shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in PANC-1 cell line, which is a cancer cell derived from human pancreas. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 6B shows the CI according to Fa of the PANC-1 cell line treated for 48 hours with a combination formulation comprising HMF, MET and CT at a ratio of 2.5: 20: 3.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • PC-3 cell line which is a cancer cell derived from human prostate
  • a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single preparation of HMF, MET and CT, respectively, were compared.
  • Table 13 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the PC-3 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 5.43 mM in HMF, 34.75 mM in MET and 6.96 mM in CT.
  • 50% cancer suppression concentration was 2.12-2.18 mM in HMF and 15.84-15.90 in MET. 2.38 ⁇ 2.46 mM in the mM, CT, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, HMF, MET, and CT were 1.13, 8.50, and 1.28 mM, respectively, 50% cancer suppression at the lowest concentration than the single or two combination formulations. Concentration.
  • Table 14 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the combination index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT, rather than a single formulation of HMF, MET and CT, respectively, in PC-3 cell lines rose at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. The effect was shown.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT combination preparation HMF was 2.5 to 3.2 times
  • MET was 2.1 to 2.8 times
  • CT was 1.9 to 2.9 times.
  • the compounds of HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, HMF was 4.8 to 5.4 times, MET was 4.1 to 4.5 times, and CT was 3.2 to 5.5 times. Indicated.
  • FIG. 7A shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a PC-3 cell line which is a cancer cell derived from human prostate. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 7B shows CI according to Fa of a PC-3 cell line treated with a combination formulation comprising HMF, MET and CT for 48 hours at a ratio of 4: 30: 4.5.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 1-8 Survival Inhibitory Effect of Bone Cancer Cell Line (Saos-2)
  • a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single agent of HMF, MET and CT were compared.
  • Table 15 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the Saos-2 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 3.55 mM in HMF, 33.87 mM in MET and 6.58 mM in CT.
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.44 to 1.62 mM in HMF and 14.45 to 15.61 in MET. 2.34 ⁇ 2.43 mM in the mM, CT, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, showed 0.88, 8.79, and 1.32 mM in HMF, MET, and CT, respectively. Concentration.
  • Table 16 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the combination index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in the Saos-2 cell line increased at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. The effect was shown.
  • HMF / MET, MET / CT HMF / CT combination formulations HMF was 2.2 ⁇ 2.5 times, MET 2.1 ⁇ 2.3 times, CT showed a drug reduction effect of 2.2 ⁇ 2.8 times.
  • a combination formulation containing three compounds HMF was 4.0 to 4.2 times
  • MET was 3.6 to 3.9 times
  • CT was 3.9 to 5.0 times. Indicated.
  • FIG. 8 (A) shows a single preparation of HMF, MET, CT and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a Saos-2 cell line, which is a cancer cell derived from human bone. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 8B shows CI according to Fa of Saos-2 cell line treated for 48 hours with a combination formulation comprising HMF, MET and CT at a ratio of 3: 30: 4.5.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 1-9 Inhibitory Effect of Survival of Liver Cancer Cell Line (SK-HEP-1)
  • the cell proliferation inhibitory effect of a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single preparation of HMF, MET and CT, respectively, was compared. .
  • Table 17 shows the 50% cancer inhibitory concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the SK-HEP-1 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 3.05 mM in HMF, 31.32 mM in MET and 16.91 mM in CT.
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.27-1.33 mM in HMF and 12.67-14.09 in MET. 5.76 ⁇ 6.11 mM was shown in mM and CT, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, HMF, MET, and CT were 0.73, 7.25, and 3.14 mM, respectively, and 50% cancer suppression at the lowest concentration than the single or two combination formulations. Concentration.
  • Table 18 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • HMF / MET, MET / CT HMF / CT combination preparations HMF was 2.3 ⁇ 3.3 times, MET 1.8 ⁇ 2.5 times, CT showed 1.9 ⁇ 2.9 times the drug reduction effect.
  • a combination product containing three compounds HMF was 4.2 to 6.2 times
  • MET was 3.6 to 4.3 times
  • CT was 3.6 to 5.4 times. Indicated.
  • FIG. 9 (A) shows a single preparation of HMF, MET, CT and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a SK-HEP-1 cell line, which is a cancer cell derived from liver. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • Figure 9 (B) shows the CI according to Fa SK-HEP-1 cell line treated for 48 hours with a combination formulation containing HMF, MET and CT in the ratio of 3:30:13.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 1-10 Inhibitory Effect of Survival of Ovarian Cancer Cell Line (SK-OV-3)
  • Table 19 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the SK-OV-3 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 3.67 mM in HMF, 34.02 mM in MET and 10.30 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation containing two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 1.22-1.28 mM in HMF and 15.95-17.05 in MET.
  • CT 3.65 to 4.10 mM was shown, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, HMF, MET, and CT were 0.79, 11.01, and 2.52 mM, respectively, and 50% cancer suppression at the lowest concentration than the single or two combination formulations. Concentration.
  • Table 20 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • Combination indices in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT, rather than a single formulation of HMF, MET and CT, respectively, in the SK-OV-3 cell line were at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. All showed synergy.
  • HMF was 2.9-3.5 times
  • MET was 1.8-2.4 times
  • CT was 1.9-2.8 times.
  • the compounds of HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, HMF was 4.7 to 6.9 times, MET was 3.1 to 4.0 times, and CT was 3.7 to 4.1 times. Indicated.
  • FIG. 10A illustrates a single agent of HMF, MET, and CT, and a combination agent including two or more compounds selected from HMF, MET, and CT, which are cancer cells derived from human ovary, the SK-OV-3 cell line. After 48 hours, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • Figure 10 (B) shows the CI according to Fa SK-OV-3 cell line treated for 48 hours with a combination formulation containing HMF, MET and CT in a ratio of 2.5: 35: 8.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect.
  • Example 1-11 Inhibitory Effect of Survival Rate of Bladder Cancer Cell Line (T24)
  • T24 cell line which is a cancer cell derived from the human bladder
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a combination preparation including two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single preparation of each of HMF, MET and CT was compared.
  • Table 21 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the T24 cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of the single agent was 2.51 mM in HMF, 44.32 mM in MET and 8.11 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation containing two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 0.92 to 1.02 mM in HMF and 16.33 to 16.37 in MET.
  • CT 3.22 to 3.58 mM was shown, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • Table 22 shows the combination index (CI) of the IC 50, IC 75, IC 90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • the combination index in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in the T24 cell line all synergistically at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. Indicated.
  • HMF / CT combination formulations HMF was 2.5 to 3.1 times, MET 1.9 to 2.7 times, CT showed 1.9 to 2.5 times the drug reducing effect.
  • a combination formulation containing three compounds HMF was 5.0 to 7.0 times, MET was 4.3 to 5.5 times, and CT was 4.5 to 4.6 times. Indicated.
  • FIG. 11A shows a single preparation of HMF, MET, CT, and a combination preparation containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a T24 cell line, which is a cancer cell derived from human bladder, for 48 hours. After providing, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 11B shows CI according to Fa of a T24 cell line treated for 48 hours with a combination formulation comprising HMF, MET and CT at a ratio of 2: 32: 7.
  • CI according to Fa showed a high synergistic effect.
  • Example 1-12 Inhibitory Effect of Survival of Brain Cancer Cell Line (U-87 MG)
  • the cell proliferation inhibitory effect of a combination preparation comprising two or more compounds selected from HMF, MET and CT and a single preparation of HMF, MET and CT, respectively, was compared.
  • Table 23 shows the 50% cancer suppression concentration (Dm) of each compound in the combination and the compound of a single agent in the U-87 MG cell line.
  • the 50% cancer suppression concentration (Dm) for the compound of single agent was 2.29 mM in HMF, 43.96 mM in MET and 6.29 mM in CT.
  • HMF / MET, MET / CT, HMF / CT a combination formulation containing two compounds selected from HMF, MET and CT
  • the 50% cancer suppression concentration was 0.79 to 0.85 mM in HMF and 18.02 to 19.92 in MET.
  • 2.57 to 2.62 mM was shown in mM and CT, showing a cancer cell proliferation inhibitory effect at a lower concentration than a single agent.
  • HMF / MET / CT a combination formulation containing three compounds, showed 0.45, 10.42, and 1.49 mM in HMF, MET, and CT, respectively. Concentration.
  • Table 24 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, IC90 and the drug reduction index (DRI) of each compound in the combination formulation.
  • Combination indices in combination formulations containing two or more compounds selected from HMF, MET and CT rather than a single formulation of HMF, MET and CT in the U-87 MG cell line were all at 50%, 75% and 90% drug inhibition rates, respectively. It showed a synergistic effect.
  • HMF showed 2.7-3.8 times
  • CT showed 1.7-2.5 times the effect of reducing the drug.
  • the compounds of HMF / MET / CT a combination product containing three compounds, HMF was 5.1 to 7.5 times, MET was 3.1 to 4.2 times, and CT was 3.7 to 4.2 times. Indicated.
  • FIG. 12 (A) shows a single agent of HMF, MET, CT, and a combination agent containing two or more compounds selected from HMF, MET, and CT in a U-87 MG cell line which is a cancer cell derived from the human brain. After 48 hours, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Combination formulations containing two or more compounds rather than each single formulation of HMF, MET and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival. In addition, HMF / MET / CT, a combination formulation containing three compounds rather than HMF / MET, MET / CT and HMF / CT, containing two or more compounds showed the highest inhibitory effect on cancer cell survival. .
  • FIG. 12B shows CI according to Fa of a U-87 MG cell line treated for 48 hours with a combination formulation comprising HMF, MET and CT at a ratio of 1.5: 35: 5.
  • the CI according to Fa showed a high synergistic effect, and the increase was greater toward the left side of the data points.
  • Example 2-1 Effect of Combination Formulation of HMF, MET, and CT on Proliferation of A549 Cells
  • a combination formulation comprising HMF, MET and CT in a concentration ratio of 1.7: 10: 10 mM in cell culture medium was prepared. After the incubation of the experimental group and the control group without the addition of 24, 48, 72 hours, the living cell number was measured by MTT assay.
  • Retardation of cell cycle progression is one of the methods of inhibiting the proliferation of cancer cells.
  • the nuclei of the cells were propidium iodide (propidium). flow cytometry by staining with iodide).
  • the number of cells staying in G1 was significantly increased in the cells in which the combination preparation of HMF, MET, and CT was added to the cell culture compared to the control cells not added (FIG. 14).
  • the number of cells staying in the S and G2 / M phases was significantly decreased in the cells to which the combination preparation was added compared to the control cells to which the combination preparation was not added.
  • the combination preparation of HMF, MET, and CT inhibits G1 / S phase cell cycle and also inhibits DNA synthesis of A549 cells, thereby inhibiting cell proliferation.
  • CDK cyclin dependent kinase
  • the cells were treated with a combination formulation containing HMF, MET and CT in a concentration ratio of 1.7: 10: 10 mM, 8 After culturing the cells for 16, 24 and 40 hours, cell lysates were taken and Western blot analysis was performed.
  • the combination formulation of HMF, MET and CT significantly reduced the protein expression of CDK4, and a decrease in CDK4 protein expression appeared from 8 hours after treatment with the combination formulation.
  • Example 2-5 Effect of Single and Combination Formulations of HMF, MET and CT on Normal Cells at 50% Cancer Inhibitory Concentration
  • Example 17 shows the cell survival rate after treatment of lung cancer cell A549 of Example 2-1 with normal lung epithelial cell NL-20 for 48 hours at a 50% cancer suppression concentration obtained by a single preparation and a combination preparation of HMF, MET and CT. It is shown.
  • the anticancer composition of the present invention can effectively treat cancer even in a small amount, and since it exhibits specific toxic effects on cancer cells, it can be usefully used as an anticancer agent with reduced side effects.

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Abstract

본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 또는 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물, 상기 항암용 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법, 및 상기 2종 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항암용 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산의 상승적 조합 제제로서 각각의 단일제제보다 적은 양으로 암세포의 생존을 억제할 수 있으며, 정상세포에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포의 세포주기를 선택적으로 억제하여, 이의 사멸을 유도할 수 있으므로, 부작용 없는 항암제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항암용 조성물
본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 또는 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물, 상기 항암용 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법, 및 상기 2종 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다.
최근 전체 사망원인 중 암에 의한 사망은 4명 중 1명꼴로, 이는 계속 증가하는 추세에 있다. 이와 같이 사망원인의 대부분을 차지하는 암의 치료방법으로는 외과수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법 등이 있다. 이 중에서 항암제를 이용한 화학요법은 현재 암 치료를 위해 많이 사용되고 있으며, 잘 확립된 치료방법 중 하나이다. 이러한 항암제는 암세포의 대사경로에 개입하여 DNA와의 직접적인 상호 작용에 의해 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나, 핵산 전구체의 합성을 방해하고, 세포의 분열을 저해함으로써 세포에 대한 독성을 나타낸다. 즉, 항암제는 정상세포에도 치명적인 손상을 주어 골수 파괴로 인한 백혈구, 혈소판, 적혈구 등의 혈구 감소증; 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상; 난소와 고환에 대한 부작용으로 월경불순 및 남성불임의 원인; 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 부작용으로 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애와 소화 장애; 설사증상; 세뇨관 괴사에 의한 신장독성; 신경계 장애로 발생하는 말초 신경염과 쇠약감; 혈관통증 및 발진 등의 혈관장애; 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다. 따라서 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.
또한 항암 치료가 실패하는 주요 원인은 항암제가 초기에는 효과를 나타내지만 점차 약제 내성이 발현되고, 면역력이 극도로 악화되기 때문이다. 따라서 약제의 독성을 증가시키지 않으면서 암 치료 효능을 개선시키는 방법이 필요하다. 항암제의 효능을 향상시키는 한 방식으로 항암제를 조합하여 사용할 수 있는데, 불행하게도, 항암효과가 있는 약물을 조합한다고 해서 모두 상승효과를 나타낸다고 기대할 수 없으며, 상승효과를 갖는 약물의 조합을 발견하는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 항암제의 부작용을 최소화하면서, 항암효과가 최대로 발휘될 수 있는 항암 조합 제제의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암의 치료효과가 최대로 발휘될 수 있으면서, 사용 농도를 최소로 하여 인체에 부작용이 없는 항암물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 특정 화합물의 조합을 통해서 항암 상승효과를 보이는 조합 제제를 개발하였으며, 상기 조합 제제가 화합물의 저농도의 조합으로도 세포주기 진행을 억제하고, 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 소량으로도 암을 효과적으로 치료할 수 있으며, 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내어, 부작용이 감소된 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료 또는 예방용 의약의 제조 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항암용 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조를 위한 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제를 제조함으로써, 부작용이 적으면서, 소량으로도 암을 효과적으로 치료할 수 있는 항암제를 개발하였다.
본 발명의 조합 제제는 단일 화합물로 치료하는 경우보다 조합 제제에 포함되는 개별 화합물의 양을 더 적게 사용할 수 있으며, 이로 인해 부작용의 위험 및/또는 심각성은 상당 수준 낮추면서 치료의 전체적 효과는 유의미하게 높일 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄(HMF)은 과일즙, 식품, 술 가공 시 향료로서 첨가되는 식품 첨가제이며, 식품 제조공정 단계에서 설탕 등의 다당류로부터 쉽게 만들어지는 분해산물로서 일상생활에서 음식물을 통하여 흔히 섭취되는 물질이다. 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
화학식 1
Figure PCTKR2011008645-appb-C000001
본 발명에서는 5-하이드록시메틸푸르푸랄을 메트포민 또는/및 구연산과 조합하여 효과적으로 암세포의 사멸을 유도함을 확인하였다. 랫트(rat)에 5-하이드록시메틸푸르푸랄을 경구 투여 시, LD50이 2,500 mg/kg으로서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있다(National Technical Information Service. Vol. OTS0544683).
본 발명에서, 메트포민(Metformin)은 당뇨병 치료제로 알려져 있으며, 이는 하기 화학식 2로 표시된다.
화학식 2
Figure PCTKR2011008645-appb-C000002
본 발명에서는 메트포민이 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는/및 구연산과의 조합에 의해 낮은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다. 또한 랫트(rat)에 메트포민을 경구 투여 시, LD50이 1,450 mg/kg으로서, 메트포민은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있다(Gekkan Yakuji. Pharmaceuticals Monthly. Vol. 9, Pg. 759, 1967.).
본 발명에서, 구연산(Citric acid)은 해당작용의 억제제로 사용될 수 있으며, 이는 화학식 3으로 표시되는 구조를 갖는다.
화학식 3
Figure PCTKR2011008645-appb-C000003
본 발명에서는 구연산에 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는/및 메트포민을 조합함으로써 적은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다. 또한 랫트(rat)에 구연산을 경구 투여 시, LD50이 1,548 mg/kg으로서, 구연산은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있다(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol. 94, Pg. 65, 1948.).
본 발명에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민과 구연산은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재 할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 또는 구연산의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼
리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로 브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 메트포민 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 메트포민과
동등한 항암효과를 나타내는 메트포민 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 염산메트포민, 숙신산메트포민, 구연산메트포민 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구연산 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 구연산과 동등
한 항암효과를 나타내는 구연산 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 구연산나트륨, 구연산칼륨, 구연산칼슘, 구연산암모늄, 구연산마그네슘 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 조합 제제; 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 조합 제제; 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 조합 제제; 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 조합 제제이다.
본 발명에 따른 각 조합 제제에서, 각 화합물의 조합 몰비는 특별히 제한되지 않는다.
발명의 일 실시양태에서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 2종 조합 제제는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 1:60의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 몰비는 달라질 수 있다. 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비는, 폐암 세포주에서 1:20 내지 1: 40, 바람직하게는 1.7:40, 위암 세포주에서 1:10 내지 1:20, 바람직하게는 3:40, 대장암 세포주에서 1:10 내지 1:15, 바람직하게는 3.5:40, 자궁경부암 세포주에서 1:17 내지 1:11, 바람직하게는 2.5:32, 유방암 세포주에서 1:10 내지 1:20, 바람직하게는 3:40, 췌장암 세포주에서 1:6 내지 1:10, 바람직하게는 2.5:20, 전립선암 세포주에서 1:6 내지 1:10, 바람직하게는 4:30, 골암 세포주에서 1:7 내지 1:15, 바람직하게는 3:30, 간암 세포주에서 1:7 내지 1:15, 바람직하게는 3:30, 난소암 세포주에서 1:11 내지 1:18, 바람직하게는 2.5:35, 방광암 세포주에서 1:10 내지 1:20, 바람직하게는 2:32, 뇌암 세포주에서 1:17 내지 1:35, 바람직하게는 1.5:35 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 5-하이드록시메틸푸르푸랄 농도에 비해 메트포민의 조합지수 몰비가 클수록 상승효과가 커지나, 고농도의 메트포민에 의한 독성을 고려하여 조합지수 몰비를 정하는 것이 바람직하다. 상기 조합 몰비에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄 및 메트포민의 조합 제제는 상승효과에 해당하는 조합지수(CI)를 나타내며, 단일제제에 비해 훨씬 낮은 약물 감소지수를 나타낸다(실시예 1 참조).
그리고, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 2종 조합 제제는, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 15:1의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 몰비는 달라질 수 있다. 예를 들어, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비는 폐암 세포주에서 3:1 내지 5:1, 바람직하게는 40:10, 위암 세포주에서 8:1 내지 10:1, 바람직하게는 40:4.3, 대장암 세포주에서 10:1 내지 14:1, 바람직하게는 40:3.5, 자궁경부암 세포주에서 3:1 내지 5:1, 바람직하게는 32:8, 유방암 세포주에서 8:1 내지 10:1, 바람직하게는 40:4.5, 췌장암 세포주에서 5:1 내지 9:1, 바람직하게는 20:3, 전립선암 세포주에서 5:1 내지 8:1, 바람직하게는 30:4.5, 골암 세포주에서 5:1 내지 8:1, 바람직하게는 30:4.5, 간암 세포주에서 2:1 내지 4:1, 바람직하게는 30:13, 난소암 세포주에서 3:1 내지 5:1, 바람직하게는 35:8, 방광암 세포주에서 4:1 내지 6:1, 바람직하게는 32:7, 뇌암 세포주에서 6:1 내지 8:1, 바람직하게는 35:5 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 구연산 농도에 비해 메트포민의 조합지수 몰비가 클수록 상승효과가 커지나, 고농도의 메트포민에 의한 독성을 고려하여 조합지수 몰비를 정하는 것이 바람직하다. 상기 조합 몰비에서 메트포민 및 구연산의 조합 제제는 상승효과에 해당하는 조합지수(CI)를 나타내며, 단일제제에 비해 훨씬 낮은 약물 감소지수를 나타낸다(실시예 1 참조).
그리고 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 2종 조합 제제는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 1:10의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 몰비는 달라질 수 있다. 예를 들어, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비는 폐암 세포주에서 1:5 내지 1:7, 바람직하게는 1.7:10, 위암 세포주에서 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 3:4.3, 대장암 세포주에서 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 3.5:3.5, 자궁경부암 세포주에서 1:2 내지 1:4, 바람직하게는 2.5:8, 유방암 세포주에서 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 3:4.5, 췌장암 세포주에서 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 2.5:3, 전립선암 세포주에서 1:1 내지 1:2,바람직하게는 4:4.5, 골암 세포주에서 1:1 내지 1:2, 바람직하게는 3:4.5, 간암 세포주에서 1:4 내지 1:6, 바람직하게는 3:13, 난소암 세포주에서 1:2 내지 1:4, 바람직하게는 2.5:8, 방광암 세포주에서 1:3 내지 1:4, 바람직하게는 2:7, 뇌암 세포주에서 1:3 내지 1:4, 바람직하게는 1.5:5 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 5-하이드록시메틸푸르푸랄 농도에 비해 구연산의 조합지수 몰비가 클수록 상승효과가 커지나, 고농도의 구연산에 의한 독성을 고려하여 조합지수 몰비를 정하는 것이 바람직하다. 상기 조합 몰비에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄 및 구연산의 조합 제제는 상승효과에 해당하는 조합지수(CI)를 나타내며, 단일제제에 비해 훨씬 낮은 약물 감소지수를 나타낸다(실시예 1 참조).
그리고 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 3종 조합 제제는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1:1 내지 1:60:10의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 몰비는 달라질 수 있다. 바람직하게는, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비는 폐암 세포주에서 1:22:5 내지 1:25:7, 바람직하게는 1.7:40:10, 위암 세포주에서 1:10:1 내지 1:16:2, 바람직하게는 3:40:4.3, 대장암 세포주에서 1:10:1 내지 1:13:1, 바람직하게는 3.5:40:3.5, 자궁경부암 세포주에서 1:10:2 내지 1:15:4, 바람직하게는 2.5:32:8, 유방암 세포주에서 1:12:1 내지 1:14:2, 바람직하게는 3:40:4.5, 췌장암 세포주에서 1:7:1 내지 1:9:1.5, 바람직하게는 2.5:20:3, 전립선암 세포주에서 1:7:1 내지 1:8:1.5, 바람직하게는 4:30:4.5, 골암 세포주에서 1:9:1 내지 1:11:2, 바람직하게는 3:30:4.5, 간암 세포주에서 1:9:4 내지 1:11:5, 바람직하게는 3:30:13, 난소암 세포주에서 1:13:3 내지 1:15:3.5, 바람직하게는 2.5:35:8, 방광암 세포주에서 1:15:3 내지 1:17:4, 바람직하게는 2:32:7, 뇌암 세포주에서 1:20:3 내지 1:26:4, 바람직하게는 1.5:35:5 이다. 이때 5-하이드록시메틸푸르푸랄 농도에 비해 메트포민 및 구연산의 조합지수 몰비가 클수록 상승효과가 커지나, 고농도의 메트포민 및 구연산에 의한 독성을 고려하여 조합지수 몰비를 정하는 것이 바람직하다. 상기 조합 몰비에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산의 조합 제제는 상승효과에 해당하는 조합지수(CI)를 나타내며, 단일제제에 비해 훨씬 낮은 약물 감소지수를 나타낸다(실시예 1 참조).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 본 발명의 조합 제제는 암세포주의 세포 증식을 감소시키며, G1/S기 세포주기의 진행을 억제하고, 암세포의 DNA 합성을 방해함으로써 세포 증식을 억제하는 것임을 확인하였다(실시예 2-1 및 2-2 참조). 본 발명의 항암용 조성물은, 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산 각각을 단일 제제로 사용한 경우보다 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산에서 선택된 2종 이상의 화합물을 조합하여 조합 제제로 사용한 경우, 화합물의 조합으로 인하여, 상승적 항암효과를 나타내었으며, 적은 양으로도 암세포의 사멸 및 세포주기를 억제함으로써 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산 각각은 단일 제제로 사용할 경우 항암 효과가 미비하여 과량으로 사용해야만 하나, 상기 화합물을 조합한 조합 제제로 사용하게 되면, 적은 양으로도 암세포를 효과적으로 사멸할 수 있다.
또한 본 발명의 조합 제제는 정상세포에는 독성을 나타내지 않으면서, 암세포에만 독성을 나타내어 암세포만을 선택적으로 사멸시킴으로써 부작용이 없는 항암 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 2-4 참조). 리고 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 제제와 조합 제제에 의해 얻어진 50% 암억제 농도로 정상세포에서의 세포독성이 단일 제제보다 조합 제제에서 현저히 감소될 수 있음을 확인하였다(실시예 2-5 참조).
본 발명에서 사용되는 용어 "암(cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암 등이 있다. 본 발명의 항암용 조성물은 암의 종류에 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명의 목적상 폐암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 골암, 간암, 난소암, 방광암 및 뇌암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방 또는 치료"란 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포민 및 구연산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 물질들을 유효성분으로 포함하는 항암제용 조성물을 이용함으로써 암의 발병을 억제하거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, 특히 '치료'란 상기 조성물을 사용하여 암을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 항암제용 조성물을 이용하여 폐암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 골암, 간암, 난소암, 방광암 및 뇌암의 세포성장을 억제시키고, 세포 사멸을 촉진시킴으로써 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 항암용 조성물을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 암을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다.
본 발명의 항암용 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 유효성분 이외에 필요에 따라 암치료용 화학요법제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료용 화학요법제"란 인체에 독성을 거의 나타내지 않으면서 병원 미생물의 활성이나 번식을 저지하는 화학약품을 일컫는다. 화학요법제는 인체에 무해하거나 거의 영향이 없어야 하고, 미생물과 같은 대상에 강력한 약효를 발휘해야 하며, 적절한 투여경로로 투여할 때 목적 부위까지 침투가 잘 되어야 하고, 작용시간이 충분해야 하며, 미생물 배양이나 합성으로 수득이 용이해야 한다.
또한 본 발명의 항암용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있는데, 바람직하게는 2종 화합물들의 조합 제제의 경우, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 1일당 1 내지 100 mg/kg(체중)이고, 메트포민은 1일당 5 내지 150mg/kg(체중)이며, 구연산은 1일당 5 내지 200 mg/kg(체중)이다. 3종 화합물들의 조합 제제의 경우, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 1일당 1 내지 100 mg/kg(체중)이고, 메트포민은 1일당 5 내지 150 mg/kg(체중)이며, 구연산은 1일당 5 내지 200mg/kg(체중)이다. 다만, 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 화합물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 암의 개선 및 예방을 위한 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물에는 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항암제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 2종 이상의 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 항암용 조성물은 과량으로 사용해야만 하는 특정 약물들의 조합을 통해 상승적 항암효과를 나타내어 소량으로도 암세포의 사멸 및 세포주기를 억제함으로써 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 정상세포에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내어, 부작용 없이 암세포를 사멸시킬 수 있으므로 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1의 (A)는 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 1의 (B)는 1.7:40:10의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 A549 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. Fa-CI 그래프에서 조합지수 값이 0.9 미만은 상승효과, 0.9 이상 1.1 미만은 상가효과, 1.1 이상의 값은 길항효과를 나타낸다.
도 2의 (A)는 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 2의 (B)는 3:40:4.3의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 AGS 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 3의 (A)는 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 3의 (B)는 3.5:40:3.5의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 DLD-1 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 4의 (A)는 인간의 자궁경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 4의 (B)는 2.5:32:8의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 HeLa 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 5의 (A)는 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MDA-MB-231 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 5의 (B)는 3:40:4.5의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 MDA-MB-231 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 6의 (A)는 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 PANC-1 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 6의 (B)는 2.5:20:3의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 PANC-1 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 7의 (A)는 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 7의 (B)는 4:30:4.5의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 PC-3 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 8의 (A)는 인간의 뼈에서 유래한 암세포인 Saos-2 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 8의 (B)는 3:30:4.5의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 Saos-2 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 9의 (A)는 인간의 간에서 유래한 암세포인 SK-HEP-1 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 9의 (B)는 3:30:13의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 SK-HEP-1 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 10의 (A)는 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 10의 (B)는 2.5:35:8의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 SK-OV-3 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 11의 (A)는 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 11의 (B)는 2:32:7의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 T24 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 12의 (A)는 인간의 뇌에서 유래한 암세포인 U-87 MG 세포주에 대해 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 및 조합 제제를 지시된 용량에 의해 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타내고 있다. 도 12의 (B)는 1.5:35:5의 비율(mM)의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에 의해 48시간 동안 처리된 U-87 MG 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다.
도 13은 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 조합 제제를 1.7:10:10 mM 비율의 농도로 24, 48, 72시간 처리한 경우, A549 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 조합 제제를 첨가한 A549 세포와 첨가하지 않은 대조군 세포를 24시간 배양한 후, 유세포 분석에 의한 세포주기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 15는 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 조합 제제를 첨가한 A549 세포와 첨가하지 않은 대조군 세포를 8, 16, 24, 40시간 배양한 후, 세포용해질(cell lysate)을 취해 상기 조합 제제가 어떤 단백질에 영향을 미치는지를 도시한 것이다.
도 16은 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 조합 제제를 1.7:10:10 mM 비율의 농도로 정상 폐상피세포 NL20과 폐암세포 A549에 48시간 처리한 후, 세포생존율을 도시한 것이다.
도 17은 폐암세포 A549의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨의 단일 제제와 조합 제제에 의해 얻어진 50% 암억제 농도로 정상 폐상피세포 NL-20에 48시간 처리한 후, 세포생존율을 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서는 구연산 및 메트포민의 약학적으로 허용가능한 여러 염의 형태 중에서 대표적으로 구연산나트륨, 염산메트포민을 사용하여 조합제제의 항암효과를 확인하였으며, 이들의 염의 형태는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
사용한 세포주
인간 종양, 예를 들어 폐암(A549), 위암(AGS), 대장암(DLD-1), 자궁경부암(HeLa), 유방암(MDA-MB-231), 췌장암(PANC-1), 전립선암(PC-3), 골암(Saos-2), 간암(SK-HEP-1), 난소암(SK-OV-3), 방광암(T24), 뇌암(U-87 MG)으로부터 유래된 세포주를 확립된 조건에 따라 배양하였으며, 모든 세포주는 한국세포주은행(Korean cell line bank, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 그리고 정상 폐상피세포 NL-20은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA)에서 구입하여 사용하였다.
세포는 10% v/v 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 단층으로 증식하였다. 모든 세포는 RPMI-1640 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 단위/ml 페니실린과 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 세포 배양액을 사용하여, 37 ℃, 탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 습윤한 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 80% 정도 차면 인산염 완충용액으로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% 트립신(trypsin-2.65 mM EDTA)으로 처리하여 계대배양을 하였고, 배지는 3일마다 교환하였다.
사용한 약물
5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural, HMF), 염산메트포민(Metformin HCl, MET), 구연산나트륨(Sodium Citrate, CT)은 시그마사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 본 발명에서 실험을 통하여 얻어진 결과를 정리한 표와 도면에서 사용한 모든 약물은 약어로서 표기하였다.
참조예 1: 시험관내 세포성장 억제 분석 방법
각 암세포의 증식억제 효과를 측정하기 위해 Carmichael 등의 방법에 따라 황색 테트라졸륨 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법을 실시하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 보라색 포마잔(formazan)을 생성하는 원리를 이용한다. 보라색 포마잔(formazan)의 생산량은 대사적으로 활성이 있는 살아있는 세포수와 거의 비례하는 것으로 알려져 세포의 생육과 분화를 측정하는데 아주 효과적으로 사용될 수 있다.
배양된 각각의 암세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2× 104 세포/ml가 되도록 200 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37 ℃, 탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 습윤한 인큐베이터에서 배양한 후, 각 단일 제제 및 조합 제제를 각각 IC50에 해당하는 약물의 농도에 대하여 영향을 받은 분율을 나타내는 조합 지수를 사용하여 암세포에 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, 각 웰에 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 녹인 MTT(5 mg/ml)용액을 15 ㎕씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다. 포마잔(formazan) 형성을 확인한 후 배지를 완전히 제거하고, 웰 바닥에 형성된 포마잔을 녹이기 위해 100 ㎕의 디메틸 설폭시드(DMSO)를 첨가하였다. 그런 후, 마이크로 플레이트리더(Powerwave XS, Biotek)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 증식 억제율을 산출하였다.
참조예 2: 단일제제 및 조합 제제 실험 방법
세포를 2× 104 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고, 단일제제 약물로서 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨 각각을 이의 IC50에 해당하는 약물의 농도로 처리하였다.
조합 제제 약물로서는 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민 및 구연산나트륨에서 선택된 2종 이상의 화합물로 구성된 조합 제제의 IC50에 해당하는 약물의 농도로 처리하였다. 모든 세포주는 단일 또는 조합 제제의 농도로 48시간 배양 후, 성장 억제 효과를 MTT 분석법으로 측정하였다.
동시 노출의 효과는 IC50에 해당하는 약물의 농도에 대하여 영향을 받은 분율을 나타내는 조합 지수를 사용하여 결정하였다. 0.9 미만의 조합 지수 계산치는 상승효과이며, 1.1 이상은 길항효과이고, 0.9 이상 1.1 미만의 조합지수는 상가효과에 해당한다.
참조예 3: 통계적 분석 및 상승 활성의 측정
약물 조합의 효과는 중간 효과 원리[(Chou and Talalay, Adv Enzyme Regul 22:27-55, 1984]에 기초하는 Chou 및 Talalay 방법을 사용하여 평가하였다. 이는 각각의 약물에 대하여, 그리고 다중 희석된 고정 비율의 조합에 대한 투여량-효과를 수학식 fa/fu = (D/Dm)m 을 사용하여 도시하였다. 상기 식에서 D 은 약물 농도이며, Dm 은 최대치의 절반 효과(즉, 세포 성장의 50% 억제)에 필요한 농도이며, fa 는 약물 농도 D 에 의하여 영향을 받는 세포 분율(예, 세포 성장이 90% 억제될 경우 0.9)이며, fu 는 (1 - fa) 로서 영향을 받지 않은 분율이며, m 은 농도-효과 곡선의 S-형 곡선(sigmodicity)의 기울기 계수이다. 조합에서의 각각의 약물에 대한 곡선의 기울기에 기초하여, 약물이 상호 비배타적 효과를 갖는지의 여부(예, 작용의 독립적 또는 상호작용 모드)를 결정할 수 있다. 여기서 조합 지수(CI)는 하기의 수학식을 사용하여 결정되었다.
[수학식 1]
CI = [(D)1/(Dx)1] + [(D)2/(Dx)2] + [α(D)1(D)2/(Dx)1(Dx)2]
상기 수학식에서, (Dx)1 은 약물 1 단독의 x % 효과를 생성하는데 필요한 약물 1의 농도이고, (D)1 은 (D)2 와 조합하여 동일한 x % 효과를 생성하는데 필요한 약물 1의 농도이다. α는 약물의 작용이 상호간에 유사성이 있는 경우는 α = 0, 그리고 없는 경우 α = 1로 가정하였다. CI 값은 fa 의 각종 값에 대하여 위의 수학식에 의해 구할 수 있다. 상기 식에서 두 약물의 상호작용에 의해 세포독성을 나타내는 CI 값이 0.9 미만일 때는 상승효과를 나타내며, 0.9 ~ 1.1의 값은 상가효과를 나타낸다. 그러나 CI 값이 1.1보다 큰 값은 길항효과를 나타내어 상가효과보다 효과가 적음을 나타낸다.
약물감소지수(DRI)는 두 약물 이상의 상호작용에 의해 주어진 약물의 효과에서 각각의 단독 약물의 농도가 어느 정도 감소하는지의 정도를 나타내는 것이다. (DRI)1 = (Dx)1/(D)1 이며, (DRI)2 = (Dx)2/(D)2 이다. 두 약물 사이의 DRI 와 CI 와의 관계는 CI = 1/(DRI)1 + 1/(DRI)2 로 표현될 수 있다.
데이터는 Calcusyn 소프트웨어(영국 케임브릿지에 소재하는 바이오소프트)에 대한 농도-효과 분석을 사용하여 분석하였다. 통계적 분석 및 그래프 Instat 및 Prism 소프트웨어(미국 샌디에고에 소재하는 그래프패드)를 사용하였다. 테스트한 약물 단독으로 또는 쌍을 이룬 조합에 대한 투여량-효과 관계를 중간-효과 플롯 분석으로 처리하여 각각의 세포주에서의 IC50, m 및 r 을 결정하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, IC50 및 m 값은 각각 CI 방정식에 기초한 상승효과 및 길항효과를 계산하는데 사용하였다. 결과는 3번 이상의 반복실험을 2중으로 실시한 평균±표준 편차로 나타내었다. 각각의 실험에서, 세포는 상기에서 설명한 바와 같이 쌍을 이룬 조합에 48시간 동안 노출시켰다. 평균 및 표준 편차를 스튜던트 t-테스트(2-측 p 값)를 사용하여 비교하였다.
참조예 4: 세포주기 측정
5-하이드록시메틸푸르푸랄, 염산메트포민, 및 구연산나트륨의 조합 제제가 A549 폐암세포의 세포 주기 진행에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 배지로 희석하여 24 웰 플레이트에 분주하였다. 24시간이 지난 후 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함되어 있는 배지에 5-하이드록시메틸푸르푸랄과 염산메트포민, 및 구연산나트륨의 조합 제제를 첨가한 배지로 교환하여 세포를 배양하였다. 5-하이드록시메틸푸르푸랄과 염산메트포민, 및 구연산나트륨의 조합 제제를 첨가하여 세포를 16시간 배양한 후 세포에 트립신(trypsin-EDTA)을 처리하여 세포를 수집한 후 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세포를 헹구고, 70% 에탄올로 세포를 고정하였다. 세포를 고정한 후 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 함유하고 있는 고바 세포주기 시약(Guava cell cycle reagent)을 첨가하여 세포를 염색하였다. 프로피디움 요오드화물에 의해 염색된 세포를 유속세포분석기(Guava EasyCyte: Guava Technologies, Inc., Hayward, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry) 방법에 의해 세포주기를 측정하였고, 얻은 결과는 Guava CytoSoft version 2.5 software(Guava Technologies)를 사용하여 분석하였다.
참조예 5: 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
세포를 100 mm 디쉬에서 위와 동일한 방법으로 세포 배양액에 5-하이드록시메틸푸르푸랄과 염산메트포민, 및 구연산나트륨의 조합 제제를 첨가하여 8, 16, 24, 40시간 배양한 후 세포 용해물(cell lysate)를 만들었다. 세포 용해물을 만들기 위해 세포를 차가운 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 헹구고, 용해 완충액(lysis buffer - 20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM 소디움 피로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1 mM Na3VO4)을 첨가하여 4 ℃에서 40분간 교반하였다. 13,000 xg에서 10분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 취해 용해물로 사용하였다.
단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)을 사용하여 측정하였다. 50 ㎍의 전체 단백질은 Tris-글리신 용리 완충액(elution buffer)을 포함하는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 내로 적하하였다. 이들 단백질은 Mini-단백질 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 전기영동 처리하고 100 V에서 1시간 동안 Mini Trans Blot 전기영동 이전 셀(electrophoresis transfer cell: Bio-Rad)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane: Bio-Rad)으로 이전하였다. 이들 니트로셀룰로오스 막은 5% 탈지 우유(skimmed milk)를 포함하는 Tween 20 TBS(TBST)로 30분 동안 차단하고, 3% BSA를 포함하는 TBST 내에서 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 양고추냉이 과산화효소(HRP, horseradish peroxidase, Dako)를 첨가하여 1시간 교반하였다. 그 다음, 이들 막은 실온에서 매 5분간 TBST로 4회 세척하고 ECL 웨스턴 블랏팅 화학발광 시스템(Western blotting chemiluminescence system: Amersham/ Pharmacia)으로 진전시키고, 이후 방사선사진촬영 필름(autoradiographic film: Hyperfilm ECL, Amersham)에 노출시켰다.
실시예 1: 5-하이드록시메틸푸르푸랄(HMF), 염산메트포민(MET) 및 구연산나트륨(CT)의 단일 제제 및 조합 제제 실험
12종의 암세포를 사용하여 HMF, MET 및 CT의 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
실시예 1-1: 폐암 세포주(A549)의 생존율 억제효과
인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 1
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.20 2.58 0.97
MET 43.08 1.84 1.00
CT 15.78 2.93 0.98
HMF/MET 0.79/18.50 1.98 1.00
MET/CT 21.08/5.27 2.07 1.00
HMF/CT 0.90/5.29 2.25 1.00
HMF/MET/CT 0.38/9.01/2.25 1.85 1.00
표 1은 A549 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 2.20 mM, MET에서 43.08 mM, CT에서 15.78 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우 50% 암억제농도는 HMF에서 0.79 ~ 0.90 mM, MET에서 18.50 ~ 21.08 mM, CT에서 5.27 ~ 5.29 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.38, 9.01, 2.25 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 2
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 1.7:40 50 0.79(상승효과) 2.80 2.33 -
75 0.82(상승효과) 2.50 2.43 -
90 0.86(상승효과) 2.16 2.53 -
MET/CT 40:10 50 0.82(상승효과) - 2.04 3.00
75 0.85(상승효과) - 2.18 2.56
90 0.88(상승효과) - 2.33 2.20
HMF/CT 1.7:10 50 0.74(상승효과) 2.45 - 2.98
75 0.81(상승효과) 2.30 - 2.66
90 0.88(상승효과) 2.16 - 2.38
HMF/MET/CT 1.7:40:10 50 0.53(상승효과) 5.74 4.78 7.01
75 0.59(상승효과) 4.85 4.79 5.63
90 0.67(상승효과) 4.10 4.80 4.52
상기 표 2는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. A549 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.2 ~ 2.8배, MET는 2.0 ~ 2.5배, CT는 2.2 ~ 3.0배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.1 ~ 5.7배, MET는 4.8배, CT는 4.5 ~ 7.0배로, 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 1의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 1의 (B)는 1.7:40:10의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 A549 세포주의 분획효과(Fractional Effect, Fa)에 따른 조합지수(CI)를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-2: 위암 세포주(AGS)의 생존율 억제효과
인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 3
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.35 2,02 1.00
MET 48.75 2.22 1.00
CT 3.61 1.67 0.99
HMF/MET 1.48/19.70 2.04 1.00
MET/CT 17.74/1.91 2.07 1.00
HMF/CT 1.27/1.83 1.86 1.00
HMF/MET/CT 0.85/11.34/1.22 2.15 1.00
표 3은 AGS 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 3.35 mM, MET에서 48.75 mM, CT에서 3.61 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우 50% 암억제농도는 HMF에서 1.27 ~ 1.48 mM, MET에서 17.74 ~ 19.70 mM, CT에서 1.83 ~ 1.91 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.85, 11.34, 1.22 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 4
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 3:40 50 0.84(상승효과) 2.27 2.48 -
75 0.86(상승효과) 2.28 2.37 -
90 0.88(상승효과) 2.29 2.26 -
MET/CT 40:4.3 50 0.89(상승효과) - 2.75 1.89
75 0.84(상승효과) - 2.65 2.15
90 0.80(상승효과) - 2.56 2.44
HMF/CT 3:4.3 50 0.89(상승효과) 2.63 - 1.98
75 0.87(상승효과) 2.51 - 2.11
90 0.86(상승효과) 2.39 - 2.25
HMF/MET/CT 3:40:4.3 50 0.82(상승효과) 3.94 4.30 2.96
75 0.77(상승효과) 4.07 4.23 3.42
90 0.73(상승효과) 4.20 4.16 3.95
표 4는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. AGS 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.3 ~ 2.6배, MET는 2.3 ~ 2.8배, CT는 1.9 ~ 2.4배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 3.9 ~ 4.2배, MET는 4.2 ~ 4.3배, CT는 3.0 ~ 4.0배로 조합 제제 중에서는 MET가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 2의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 2의 (B)는 3:40:4.3의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 AGS 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 우측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-3: 대장암 세포주(DLD-1)의 생존율 억제효과
인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 5
단일 및 조합 화 합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.90 2.99 0.97
MET 42.61 2.12 0.99
CT 5.08 3.23 0.91
HMF/MET 1.68/19.21 2.19 1.00
MET/CT 15.67/1.37 2.10 1.00
HMF/CT 1.75/1.75 2.40 1.00
HMF/MET/CT 0.93/10.67/0.93 2.24 1.00
표 5는 DLD-1 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 4.90 mM, MET에서 42.61 mM, CT에서 5.08 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우 50% 암억제농도는 HMF에서 1.68 ~ 1.75 mM, MET에서 15.67 ~ 19.21 mM, CT에서 1.37 ~ 1.75 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.93, 10.67, 0.93 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 6
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 3.5:40 50 0.79(상승효과) 2.91 2.22 -
75 0.84(상승효과) 2.54 2.26 -
90 0.89(상승효과) 2.22 2.29 -
MET/CT 40:3.5 50 0.64(상승효과) - 2.72 3.71
75 0.69(상승효과) - 2.71 3.09
90 0.76(상승효과) - 2.70 2.57
HMF/CT 3.5:3.5 50 0.70(상승효과) 2.80 - 2.91
75 0.78(상승효과) 2.56 - 2.58
90 0.86(상승효과) 2.34 - 2.30
HMF/MET/CT 3.5:40:3.5 50 0.62(상승효과) 5.24 3.99 5.44
75 0.67(상승효과) 4.64 4.11 4.68
90 0.73(상승효과) 4.10 4.23 4.03
상기 표 6은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. DLD-1 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.2 ~ 2.9배, MET는 2.2 ~ 2.7배, CT는 2.3 ~ 3.7배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.1 ~ 5.2배, MET는 4.0 ~ 4.2 배, CT는 4.0 ~ 5.4배로 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 3의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 3의 (B)는 3.5:40:3.5의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 DLD-1 세포주의 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-4: 자궁경부암 세포주(HeLa)의 생존율 억제효과
인간의 자궁경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 7
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.27 2.33 0.95
MET 38.09 2.93 0.97
CT 11.26 2.14 0.99
HMF/MET 1.22/15.59 2.27 1.00
MET/CT 15.78/3.94 2.28 1.00
HMF/CT 1.34/4.30 2.01 1.00
HMF/MET/CT 0.76/9.71/2.43 2.24 1.00
표 7은 HeLa 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50%암억제농도(Dm)는 HMF에서 3.27 mM, MET에서 38.09 mM, CT에서 11.26 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.22 ~ 1.34 mM, MET에서 15.59 ~ 15.78 mM, CT에서 3.94 ~ 4.30 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.76, 9.71, 2.43 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 8
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 2.5:32 50 0.78(상승효과) 2.69 2.44 -
75 0.83(상승효과) 2.66 2.19 -
90 0.89(상승효과) 2.62 1.96 -
MET/CT 32:8 50 0.76(상승효과) - 2.41 2.86
75 0.80(상승효과) - 2.17 2.95
90 0.84(상승효과) - 1.95 3.04
HMF/CT 2.5:8 50 0.79(상승효과) 2.44 - 2.62
75 0.84(상승효과) 2.27 - 2.54
90 0.88(상승효과) 2.11 - 2.46
HMF/MET/CT 2.5:32:8 50 0.70(상승효과) 4.31 3.92 4.64
75 0.73(상승효과) 4.24 3.50 4.75
90 0.77(상승효과) 4.17 3.12 4.86
상기 표 8은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. HeLa 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.1 ~ 2.7배, MET는 2.0 ~ 2.4배, CT는 2.5 ~ 3.0배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.2 ~ 4.3배, MET는 3.1 ~ 3.9 배, CT는 4.6 ~ 4.9배로 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 4의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 자궁경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 4의 (B)는 2.5:32:8의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 HeLa 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-5: 유방암 세포주(MDA-MB-231)의 생존율 억제효과
인간의 유방에서 유래한 암세포인 MDA-MB-231 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 9
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.77 1.81 0.99
MET 37.31 1.83 0.99
CT 5.22 2.22 1.00
HMF/MET 1.11/14.84 1.69 1.00
MET/CT 15.66/1.76 1.86 1.00
HMF/CT 1.20/1.79 1.79 1.00
HMF/MET/CT 0.60/8.02/0.90 1.70 1.00
상기 표 9는 MDA-MB-231 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 2.77 mM, MET에서 37.31 mM, CT에서 5.22 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.11 ~ 1.20 mM, MET에서 14.84 ~ 15.66 mM, CT에서 1.76 ~ 1.79 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.60, 8.02, 0.90 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 10
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 3:40 50 0.80(상승효과) 2.49 2.51 -
75 0.84(상승효과) 2.39 2.39 -
90 0.88(상승효과) 2.29 2.28 -
MET/CT 40:4.5 50 0.76(상승효과) - 2.38 2.96
75 0.79(상승효과) - 2.41 2.69
90 0.82(상승효과) - 2.43 2.45
HMF/CT 3:4.5 50 0.78(상승효과) 2.32 - 2.91
75 0.82(상승효과) 2.30 - 2.58
90 0.87(상승효과) 2.29 - 2.30
HMF/MET/CT 3:40:4.5 50 0.60(상승효과) 4.61 4.65 5.79
75 0.65(상승효과) 4.44 4.45 4.98
90 0.70(상승효과) 4.27 4.25 4.28
상기 표 10은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. MDA-MB-231 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.3 ~ 2.5배, MET는 2.3 ~ 2.5배, CT는 2.3 ~ 3.0배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.3 ~ 4.6배, MET는 4.3 ~ 4.7배, CT는 4.3 ~ 5.8배로 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 5의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MDA-MB-231 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 5의 (B)는 3:40:4.5의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 MDA-MB-231 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-6: 췌장암 세포주(PANC-1)의 생존율 억제효과
인간의 췌장에서 유래한 암세포인 PANC-1 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 11
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.67 1.44 0.99
MET 18.34 1.53 0.98
CT 3.37 2.01 0.99
HMF/MET 1.01/8.09 1.41 1.00
MET/CT 7.95/1.19 1.60 1.00
HMF/CT 1.10/1.31 1.57 1.00
HMF/MET/CT 0.56/4.49/0.67 1.52 1.00
상기 표 11은 PANC-1 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 2.67 mM, MET에서 18.34 mM, CT에서 3.37 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.01 ~ 1.10 mM, MET에서 7.95 ~ 8.09 mM, CT에서 1.19 ~ 1.31 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.56, 4.49, 0.67 mM을 나타내면서, 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 12
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 2.5:20 50 0.82(상승효과) 2.64 2.27 -
75 0.86(상승효과) 2.60 2.13 -
90 0.89(상승효과) 2.55 2.00 -
MET/CT 20:3 50 0.79(상승효과) - 2.31 2.83
75 0.83(상승효과) - 2.38 2.46
90 0.88(상승효과) - 2.45 2.14
HMF/CT 2.5:3 50 0.80(상승효과) 2.44 - 2.56
75 0.84(상승효과) 2.60 - 2.21
90 0.89(상승효과) 2.77 - 1.90
HMF/MET/CT 2.5:20:3 50 0.65(상승효과) 4.76 4.09 5.01
75 0.69(상승효과) 4.95 4.06 4.20
90 0.73(상승효과) 5.16 4.04 3.53
상기 표 12는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. PANC-1 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.4 ~ 2.8배, MET는 2.0 ~ 2.5배, CT는 1.9 ~ 2.8배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.8 ~ 5.2배, MET는 4.0 ~ 4.1배, CT는 3.5 ~ 5.0배로 조합 제제 중에서는 HMF가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 6의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 PANC-1 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 6의 (B)는 2.5:20:3의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 PANC-1 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-7: 전립선암 세포주(PC-3)의 생존율 억제효과
인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 13
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 5.43 1.56 0.99
MET 34.75 1.58 1.00
CT 6.96 2.91 0.93
HMF/MET 2.12/15.90 1.52 1.00
MET/CT 15.84/2.38 1.92 1.00
HMF/CT 2.18/2.46 1.90 1.00
HMF/MET/CT 1.13/8.50/1.28 1.71 1.00
상기 표 13은 PC-3 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 5.43 mM, MET에서 34.75 mM, CT에서 6.96 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 2.12 ~ 2.18 mM, MET에서 15.84 ~ 15.90 mM, CT에서 2.38 ~ 2.46 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 1.13, 8.50, 1.28 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 14
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 4:30 50 0.85(상승효과) 2.56 2.19 -
75 0.87(상승효과) 2.52 2.12 -
90 0.89(상승효과) 2.47 2.06 -
MET/CT 30:4.5 50 0.80(상승효과) - 2.19 2.93
75 0.82(상승효과) - 2.47 2.41
90 0.86(상승효과) - 2.79 1.98
HMF/CT 4:4.5 50 0.76(상승효과) 2.49 - 2.83
75 0.79(상승효과) 2.82 - 2.32
90 0.84(상승효과) 3.20 - 1.90
HMF/MET/CT 4:30:4.5 50 0.64(상승효과) 4.79 4.09 5.46
75 0.67(상승효과) 5.10 4.30 4.19
90 0.72(상승효과) 5.43 4.53 3.22
상기 표 14는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. PC-3 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.5 ~ 3.2배, MET는 2.1 ~ 2.8배, CT는 1.9 ~ 2.9배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.8 ~ 5.4배, MET는 4.1 ~ 4.5배, CT는 3.2 ~ 5.5배로 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 7의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 7의 (B)는 4:30:4.5의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 PC-3 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-8: 골암 세포주(Saos-2)의 생존율 억제효과
인간의 뼈에서 유래한 암세포인 Saos-2 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 15
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.55 2.05 0.98
MET 33.87 2.31 1.00
CT 6.58 2.81 0.94
HMF/MET 1.44/14.45 2.07 1.00
MET/CT 15.61/2.34 2.33 1.00
HMF/CT 1.62/2.43 2.20 1.00
HMF/MET/CT 0.88/8.79/1.32 2.13 1.00
상기 표 15는 Saos-2 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 3.55 mM, MET에서 33.87 mM, CT에서 6.58 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.44 ~ 1.62 mM, MET에서 14.45 ~ 15.61 mM, CT에서 2.34 ~ 2.43 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.88, 8.79, 1.32 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 16
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 3:30 50 0.83(상승효과) 2.46 2.34 -
75 0.86(상승효과) 2.47 2.22 -
90 0.88(상승효과) 2.48 2.10 -
MET/CT 30:4.5 50 0.82(상승효과) - 2.17 2.81
75 0.85(상승효과) - 2.18 2.59
90 0.88(상승효과) - 2.19 2.39
HMF/CT 3:4.5 50 0.85(상승효과) 2.19 - 2.71
75 2.85(상승효과) 2.27 - 2.43
90 0.88(상승효과) 2.36 - 2.18
HMF/MET/CT 3:30:4.5 50 0.71(상승효과) 4.04 3.85 5.00
75 0.74(상승효과) 4.12 3.71 4.41
90 0.77(상승효과) 4.21 3.57 3.90
상기 표 16은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. Saos-2 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.2 ~ 2.5배, MET는 2.1 ~ 2.3배, CT는 2.2 ~ 2.8배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.0 ~ 4.2배, MET는 3.6 ~ 3.9배, CT는 3.9 ~ 5.0배로 조합 제제 중에서는 CT가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 8의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 뼈에서 유래한 암세포인 Saos-2 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 8의 (B)는 3:30:4.5의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 Saos-2 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-9: 간암 세포주(SK-HEP-1)의 생존율 억제효과
인간의 간에서 유래한 암세포인 SK-HEP-1 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 17
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.05 1.37 0.99
MET 31.32 2.11 1.00
CT 16.91 2.74 0.99
HMF/MET 1.27/12.67 1.63 1.00
MET/CT 14.09/6.11 2.22 1.00
HMF/CT 1.33/5.76 1.79 1.00
HMF/MET/CT 0.73/7.25/3.14 1.81 1.00
상기 표 17은 SK-HEP-1 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 3.05 mM, MET에서 31.32 mM, CT에서 16.91 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.27 ~ 1.33 mM, MET에서 12.67 ~ 14.09 mM, CT에서 5.76 ~ 6.11 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.73, 7.25, 3.14 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 18
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 3:30 50 0.82(상승효과) 2.41 2.47 -
75 0.84(상승효과) 2.73 2.12 -
90 0.87(상승효과) 3.10 1.82 -
MET/CT 30:13 50 0.81(상승효과) - 2.22 2.77
75 0.84(상승효과) - 2.28 2.52
90 0.86(상승효과) - 2.34 2.29
HMF/CT 3:13 50 0.78(상승효과) 2.30 - 2.94
75 0.78(상승효과) 2.77 - 2.37
90 0.82(상승효과) 3.34 - 1.92
HMF/MET/CT 3:30:13 50 0.66(상승효과) 4.21 4.32 5.38
75 0.68(상승효과) 5.11 3.97 4.38
90 0.72(상승효과) 6.21 3.64 3.56
상기 표 18은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. SK-HEP-1 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.3 ~ 3.3배, MET는 1.8 ~ 2.5배, CT는 1.9 ~ 2.9배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.2 ~ 6.2배, MET는 3.6 ~ 4.3배, CT는 3.6 ~ 5.4배로 조합 제제 중에서는 HMF가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 9의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 간에서 유래한 암세포인 SK-HEP-1 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 9의 (B)는 3:30:13의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 SK-HEP-1 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-10: 난소암 세포주(SK-OV-3)의 생존율 억제효과
인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 19
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.67 1.53 0.99
MET 34.02 1.68 0.98
CT 10.30 2.34 0.99
HMF/MET 1.22/17.05 1.55 1.00
MET/CT 15.95/3.65 1.85 1.00
HMF/CT 1.28/4.10 1.77 1.00
HMF/MET/CT 0.79/11.01/2.52 2.08 1.00
상기 표 19는 SK-OV-3 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 3.67 mM, MET에서 34.02 mM, CT에서 10.30 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 1.22 ~ 1.28 mM, MET에서 15.95 ~ 17.05 mM, CT에서 3.65 ~ 4.10 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.79, 11.01, 2.52 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 20
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 2.5:35 50 0.83(상승효과) 3.02 2.00 -
75 0.86(상승효과) 3.05 1.89 -
90 0.88(상승효과) 3.09 1.79 -
MET/CT 35:8 50 0.82(상승효과) - 2.13 2.83
75 0.84(상승효과) - 2.27 2.50
90 0.87(상승효과) - 2.41 2.21
HMF/CT 2.5:8 50 0.75(상승효과) 2.87 - 2.51
75 0.78(상승효과) 3.16 - 2.16
90 0.83(상승효과) 3.48 - 1.85
HMF/MET/CT 2.5:35:8 50 0.78(상승효과) 4.67 3.09 4.09
75 0.72(상승효과) 5.66 3.51 3.87
90 0.67(상승효과) 6.85 3.98 3.65
상기 표 20은 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. SK-OV-3 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.9 ~ 3.5배, MET는 1.8 ~ 2.4배, CT는 1.9 ~ 2.8배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 4.7 ~ 6.9배, MET는 3.1 ~ 4.0배, CT는 3.7 ~ 4.1배로 조합 제제 중에서는 HMF가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 10의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 10의 (B)는 2.5:35:8의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 SK-OV-3 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 우측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
실시예 1-11: 방광암 세포주(T24)의 생존율 억제효과
인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 21
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.51 1.62 0.99
MET 44.32 2.86 0.95
CT 8.11 2.23 0.99
HMF/MET 1.02/16.33 1.92 1.00
MET/CT 16.37/3.58 2.29 1.00
HMF/CT 0.92/3.22 1.70 1.00
HMF/MET/CT 0.50/8.03/1.76 2.16 1.00
상기 표 21은 T24 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 2.51 mM, MET에서 44.32 mM, CT에서 8.11 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 0.92 ~ 1.02 mM, MET에서 16.33 ~ 16.37 mM, CT에서 3.22 ~ 3.58 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.50, 8.03, 1.76 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 22
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 2:32 50 0.78(상승효과) 2.46 2.71 -
75 0.81(상승효과) 2.74 2.25 -
90 0.86(상승효과) 3.05 1.87 -
MET/CT 32:7 50 0.81(상승효과) - 2.71 2.27
75 0.84(상승효과) - 2.46 2.30
90 0.88(상승효과) - 2.23 2.32
HMF/CT 2:7 50 0.76(상승효과) 2.73 - 2.52
75 0.82(상승효과) 2.81 - 2.16
90 0.89(상승효과) 2.90 - 1.85
HMF/MET/CT 2:32:7 50 0.60(상승효과) 5.00 5.52 4.62
75 0.59(상승효과) 5.93 4.88 4.55
90 0.60(상승효과) 7.03 4.31 4.48
상기 표 22는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. T24 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.5 ~ 3.1배, MET는 1.9 ~ 2.7배, CT는 1.9 ~ 2.5배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 5.0 ~ 7.0배, MET는 4.3 ~ 5.5배, CT는 4.5 ~ 4.6배로 조합 제제 중에서는 HMF가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 11의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 11의 (B)는 2:32:7의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 T24 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었다.
실시예 1-12: 뇌암 세포주(U-87 MG)의 생존율 억제효과
인간의 뇌에서 유래한 암세포인 U-87 MG 세포주에서, HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제와 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
표 23
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.29 1.42 0.99
MET 43.96 2.54 0.98
CT 6.29 2.15 1.00
HMF/MET 0.85/19.92 1.84 1.00
MET/CT 18.02/2.57 2.16 1.00
HMF/CT 0.79/2.62 1.63 1.00
HMF/MET/CT 0.45/10.42/1.49 1.88 1.00
상기 표 23은 U-87 MG 세포주에서 단일 제제의 화합물과 조합 제제에서의 각 화합물의 50% 암억제농도(Dm)를 나타낸 것이다. 단일 제제의 화합물의 경우 50% 암억제농도(Dm)는 HMF에서 2.29 mM, MET에서 43.96 mM, CT에서 6.29 mM를 나타내었다. 그리고 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT의 경우, 50% 암억제농도는 HMF에서 0.79 ~ 0.85 mM, MET에서 18.02 ~ 19.92 mM, CT에서 2.57 ~ 2.62 mM을 나타내면서, 단일 제제보다 낮은 농도에서 암세포 증식 억제효과를 나타내었다. 또한, 3종의 화합물을 포함하는 조합 제제인 HMF/MET/CT의 경우, HMF, MET, CT에서 각각 0.45, 10.42, 1.49 mM로 단일 제제나 2종 조합 제제보다 가장 낮은 농도에서 50% 암억제농도를 나타내었다.
표 24
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET CT
HMF/MET 1.5:35 50 0.83(상승효과) 2.69 2.21 -
75 0.85(상승효과) 3.21 1.87 -
90 0.89(상승효과) 3.83 1.59 -
MET/CT 35:5 50 0.82(상승효과) - 2.44 2.44
75 0.85(상승효과) - 2.26 2.45
90 0.88(상승효과) - 2.10 2.46
HMF/CT 1.5:5 50 0.76(상승효과) 2.91 - 2.40
75 0.80(상승효과) 3.23 - 2.04
90 0.86(상승효과) 3.57 - 1.74
HMF/MET/CT 1.5:35:5 50 0.67(상승효과) 5.13 4.22 4.23
75 0.69(상승효과) 6.21 3.63 3.93
90 0.73(상승효과) 7.52 3.12 3.65
상기 표 24는 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 조합 제제에서 각 화합물의 약물감소지수(DRI)를 나타낸 것이다. U-87 MG 세포주에서 HMF, MET 및 CT 각각의 단일 제제보다 HMF, MET 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서의 조합지수는 각 50%, 75%, 90% 약물 억제율에서 모두 상승효과를 나타내었다. 또한, HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 조합 제제의 화합물 중 HMF는 2.7 ~ 3.8배, MET는 1.6 ~ 2.4배, CT는 1.7 ~ 2.5배의 약물감소 효과를 나타내었다. 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT의 화합물 중 HMF는 5.1 ~ 7.5배, MET는 3.1 ~ 4.2배, CT는 3.7 ~ 4.2배로 조합 제제 중에서는 HMF가 가장 높은 약물감소 효과를 나타내었다.
도 12의 (A)는 HMF, MET, CT의 각각의 단일 제제 및 HMF, MET, 및 CT에서 선택된 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제를 인간의 뇌에서 유래한 암세포인 U-87 MG 세포주에 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET 및 CT의 각각의 단일 제제보다는 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다. 그리고 2종 이상의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET, MET/CT, HMF/CT 보다는 3종의 화합물이 포함된 조합 제제인 HMF/MET/CT 제제에서 가장 높은 암세포 생존을 억제하는 효과가 나타났다.
도 12의 (B)는 1.5:35:5의 비율로 HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제를 48시간 동안 처리한 U-87 MG 세포주의 Fa에 따른 CI를 나타낸 것이다. Fa에 따른 CI는 높은 상승효과를 나타내었는데, 데이터의 점 좌측으로 갈수록 상승이 보다 크게 나타났다.
<실시예 2> 5-하이드록시메틸푸르푸랄(HMF), 염산메트포민(MET) 및 구연산나트륨(CT)의 조합 제제가 세포주기 진행 및 세포사멸에 미치는 영향
인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에서, HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 세포주기 진행과 세포사멸에 미치는 영향을 알아보았다. 이때 사용된 각 약물은 최대 40 mM을 초과하지 않는 범위 내에서 사용하였다.
이를 위해, A549 세포의 증식에 미치는 영향과 세포주기 측정, 그리고 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)를 실시하였다.
실시예 2-1: HMF, MET 및 CT의 조합 제제의 A549 세포의 증식에 미치는 영향
HMF, MET 및 CT를 포함하는 조합 제제가 인간의 폐암 A549 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해, 세포 배양액에 HMF, MET 및 CT를 1.7:10:10 mM의 농도 비율로 포함하는 조합 제제를 첨가한 실험군과, 이를 첨가하지 않은 대조군을 24, 48, 72시간 배양한 후 MTT 분석법을 실시하여 살아있는 세포수를 측정하였다.
그 결과, HMF, MET 및 CT를 1.7:10:10 mM의 농도 비율로 조합한 후, 이를 24, 48, 72시간 처리한 경우, 처리 농도에 따라 유의적으로 세포 증식의 감소 효과가 나타났다(도 13). 조합 제제로 처리하여 24, 48, 72시간 배양한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 39 %, 85 %, 93 % 세포 증식이 감소하였다.
실시예 2-2: HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 A549 세포의 세포주기 진행과 세포사멸에 미치는 영향
세포주기의 진행의 지연은 암세포의 증식을 억제하는 방법 중의 하나이다. HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 폐암세포인 A549 세포의 세포주기 진행에 미치는 영향을 조사하였다.
세포 배양액에 HMF, MET 및 CT를 1.7:10:10 mM의 농도 비율로 포함하는 조합 제제를 첨가한 실험군과 첨가하지 않은 대조군을 24시간 배양한 후, 세포의 핵을 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색하여 유세포 분석을 실시하였다.
그 결과, 세포 배양액에 HMF, MET 및 CT의 조합 제제를 첨가한 세포에서는 첨가하지 않은 대조군 세포에 비해 G1에 머물고 있는 세포수가 현저히 증가하였다(도 14). 그리고 S기와 G2/M기에 머물고 있는 세포수는, 조합 제제를 첨가한 세포가 조합 제제를 첨가하지 않은 대조군 세포에 비해 유의적으로 감소하였다. 이와 같은 결과에 의해, HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 G1/S기 세포주기를 억제하여 A549 세포의 DNA 합성도 방해함으로써, 세포증식을 억제하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 2-3: HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 A549 세포의 단백질 발현에 미치는 영향
세포주기의 진행은 세포질에 있는 단백질에 의해 조절된다. 이러한 세포 주기 조절을 위해서는 많은 인자들이 필요하며, 그 중에 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 사이클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinase: CDK)이다.
A549 세포의 세포주기 진행을 억제한 조합 제제가 어떤 단백질에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, HMF, MET 및 CT를 1.7:10:10 mM의 농도 비율로 포함하는 조합 제제를 세포에 처리하고, 8, 16, 24, 40시간 동안 세포를 배양한 후 세포용해질(cell lysate)을 취해 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 실시하였다. 그 결과, HMF, MET 및 CT의 조합 제제는 CDK4의 단백질 발현을 현저히 감소시켰으며, CDK4 단백질 발현 감소는 조합 제제를 처리하고 8시간부터 나타났다. 또한 HMF, MET 및 CT의 조합 제제는 세포주기를 조절하는 주요한 전사인자인 E2F1의 단백질 발현을 유의적으로 억제하였고, 전사인자인 E2F 단백질에 결합하여 세포주기를 G1기에서 멈추는 역할을 하는 Rb의 인산화를 현격히 감소시켰다. 그리고 p21의 단백질 발현도 조합 제제에 의해 감소하는 경향을 나타내었다(도 15).
실시예 2-4: HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 정상세포에 미치는 영향
HMF, MET 및 CT의 조합 제제가 정상세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 정상 폐상피세포 NL-20과 폐암세포 A549에 상기 조합 제제를 처리하고 48시간 후에 MTT 분석법으로 세포독성을 조사하였다. 조합 제제의 폐암세포에 대한 세포사멸을 정상 폐상피세포와 비교한 결과, 조합 제제의 HMF, MET 및 CT가 0.425:2.5:2.5 mM 농도인 경우 A549가 정상세포보다 2.64배, 0.85:5:5 mM 농도인 경우 A549가 정상세포보다 3.59배, 0.425:2.5:2.5 mM 농도인 경우 A549가 정상세포보다 5.60배 세포 독성이 증가되는 것으로 관찰되어, 정상 폐상피세포에 비해 폐암세포에서 조합 제제의 독성이 더 강하게 나타났다. HMF, MET 및 CT의 조합 제제는 정상 폐상피세포보다 암세포에 훨씬 민감하게 작용하는 것으로 나타났다(도 16).
실시예 2-5: HMF, MET 및 CT의 단일 제제와 조합 제제가 50% 암억제 농도에서 정상세포에 미치는 영향
도 17은 실시예 2-1의 폐암세포 A549에 HMF, MET 및 CT의 단일 제제와 조합 제제에 의해 얻어진 50% 암억제 농도로 정상 폐상피세포 NL-20에 48시간 처리한 후, 세포생존율을 도시한 것이다.
정상 폐상피세포 NL-20에서 단일 제제로서 HMF, MET 및 CT의 50% 암억제 농도에 의한 세포 생존율은 63.4%, 44.2%, 7.1%인 반면에, 조합 제제로서의 HMF, MET 및 CT의 50% 암억제 농도에 의한 세포 생존율은 109%, 98.7%, 91.2%로 세포독성이 현저히 감소되었다. 48시간 후 세포 독성의 감소 정도는 단일 제제보다 조합제제가 HMF에서는 1.7배, MET은 2.2배, 그리고 CT은 12.8배로 나타났으며, 특히 조합 제제로서 적용한 HMF은 오히려 정상 세포를 활성화시키는 것으로 나타났다.
본 발명의 항암용 조성물은 소량으로도 암을 효과적으로 치료할 수 있으며, 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내므로, 부작용이 감소된 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 1:60의 범위인 항암용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 15:1의 범위인 항암용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1 내지 1:10의 범위인 항암용 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:1:1 내지 1:60:10의 범위인 항암용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 골암, 간암, 난소암, 방광암 및 뇌암에서 선택되는 것인 항암용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 항암용 조성물.
  12. 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
  13. 제1항의 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  14. 암의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물의 용도.
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