WO2019221453A1 - 관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 화합물을 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 화합물을 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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cancer
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tussilagone
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류재하
이화
강석구
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숙명여자대학교산학협력단
연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prophylaxis and treatment of cancer diseases containing a tucilagone compound isolated from the Kantoin extract.
  • Glioblastoma multiforme is one of the most common and severe brain tumors ( J Neurooncol. 2012, 108, 11-27).
  • the current standard of care is to remove the tumor as much as possible from the first operation and then proceed with the combination of radiotherapy and temodal medication ( J Neuro oncol 2013, 112, 277-283).
  • 5-year survival after diagnosis is less than 3% ( J Clin Neurosci 2012, 19, 1530-1534).
  • Therapeutic mechanism of temozolomide (TMZ) is to induce apoptosis of cancer cells by alkylating DNA, and it is a drug used for standard brain tumor therapy, but certain brain tumor cells can recover DNA damage caused by temodal. The therapeutic effect is limited.
  • Temodal resistance to glioblastoma multiforme is known to be associated with the DNA repair gene O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) ( Mol ( Carcinogenesis 1995, 13, 70-80).
  • MGMT DNA repair gene
  • FoxM1 Forkhead box M1 Is a transcription factor that induces the expression of genes related to cell cycle and apoptosis ( Nat Cell Biol 2005, 7, 126-136; Mol Cell Biol 2013, 33, 227-236). Overexpressed in tumor cells and induces rapid cell proliferation ( J Transl Med 2013, 11, 204; PLoS One 2013, 8; Cancer Lett 2011, 306, 214-222; Cancer Res 2006, 66, 3593-3602).
  • Kanto Tussilago farfara L.
  • the buds of Kanto flowers have been used as drugs, and it is used for the treatment of bronchitis or asthma because it has the effect of strengthening the lungs and stopping cough and phlegm.
  • Kanto extracts have been reported to inhibit the metabolism of arachidonic acid ( Hinyokika Kiyo 1996, 42, 639-643) and to inhibit the platelet activating factor receptor ( Eur J Pharmacol 1987, 141, 269-281). It is also known to enhance cardiovascular and respiratory function ( Gen Pharmacol 1988, 19, 261-263).
  • Tussilagone is a type of sesquiterpene isolated from Kanto.
  • the present inventors have found that anti-inflammatory effects of nitric oxide synthesis were inhibited in lipopolysaccharide-stimulated microglial cells (BV2 cells) (Ar Pharm Res 2008, 31, 645-652) and Wnt / ⁇ - Inhibition of cateinin signaling pathway has been reported to prevent the proliferation of colorectal cancer cells ( Biochem and Biophys Res Commun 2014, 443, 132-137).
  • the invention of the use of Kanto extract or a tucilagone containing obesity or diabetes treatment (Korean Patent No. 10-0697235); (2) invented a composition for inhibiting maturation or activation of dendritic cells containing tociragon or a therapeutic agent for immunological diseases (Korean Patent Publication No. 10-2015-0033978); (3) the invention of use for the treatment of brain cancer containing brain cancer extract (Korean Patent Publication No. 10-2012-0094174); (4) The invention of the use of the Kantoin extract-containing lung cancer therapeutic agent (Korean Patent Publication No. 10-2012-0111764) and the like have been known.
  • Temozolomide which is currently used as a brain cancer treatment agent, has a problem of weak anticancer activity and induces resistance, and thus shows excellent anticancer activity against resistant cells. There is an urgent task to develop anti-cancer compounds with inhibitory mechanisms.
  • Tossilagone (tussilagone) compound was isolated through the fractionation and purification process, the effect on the viability of glioblastoma multiforme (tuliosiloma multiforme) of the target (Experimental Example 1); Effect on proliferation of human glioblastoma cell lines U87MG and T98G (Experimental Example 2); Evaluation of the inhibitory effect of ATP production, a cell energy source (Experimental Example 3); effect on the membrane potential of intracellular mitochondria (Experimental Example 4); Effect on tumor cell formation ability (Experimental Example 5); Effect on tumor sphere three-dimensional invasion (Experimental Example 6); Effect of Tucilagone on FoxM1 and MGMT Protein Expression (Experimental Example 7) In the experiment, the sample of the present invention solves the problem of temozo
  • the present invention aims to develop a natural product therapeutic agent which is more excellent for the prevention or treatment of cancer diseases.
  • the present invention contains the following formula (I) tusilagone (tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • formula (I) tusilagone tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • an isomer thereof an isomer thereof
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • an object of the present invention is the tussilagone of the formula (I) (14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), isomer thereof It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of cancer diseases containing a pharmaceutically acceptable salt as an active ingredient.
  • the present invention is a tussilagone of the formula (I) (14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient It provides a dietary supplement for the prevention and improvement of cancer diseases.
  • the compounds of the present invention can be prepared with pharmaceutically acceptable salts and solvates according to methods conventional in the art.
  • an acid addition salt formed by free acid is useful as a pharmaceutically acceptable salt.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equal molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethylether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equal molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethylether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, and trifluoroacetic acid may be used as the organic acid.
  • Citric acid maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid (gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid (glutaric acid), glucuronic acid (glucuronic acid), aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid and hydroiodic acid may be used.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the non-soluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the invention include salts of acidic or basic groups which may be present in the compounds of the invention, unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p -toluenesulfonate (tosylate) salts. It can be prepared through.
  • the compounds of the present invention have asymmetric centers and therefore may exist in different enantiomeric forms, and all optical isomers and R or S-type stereoisomers and mixtures thereof of the compounds of the present invention are also included within the scope of the present invention.
  • the present invention encompasses the use of racemates, one or more enantiomeric forms, one or more diastereomeric forms, or mixtures thereof, and includes methods or processes for the separation of isomers known in the art.
  • Compounds of the present invention can be prepared from commercially available methods, or chemically synthesized silica gel columns, which are separated from the separation and purification methods for carrying out the purification process using recrystallization and recrystallization.
  • the compounds of the present invention can be obtained by the preparation method as follows.
  • a solvent selected from water including purified water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol and butanol, or a mixed solvent thereof, preferably a mixed solvent of water and methanol More preferably, 10 to 100% methanol is mixed several times, and then 30 minutes to 72 hours, preferably 1 to 48 hours ultrasonic extraction, hydrothermal extraction, at a temperature of 10 to 150 °C, preferably 20 to 70 °C,
  • the crude extract of the present invention may be obtained by filtration, concentration under reduced pressure, and drying of the extract obtained by repeating the extraction at room temperature or reflux extraction, preferably cold extraction, about 1 to 20 times, preferably 2 to 10 times.
  • the compounds of the present invention is one of the crude extract obtained above, such as reverse phase chromatography, flash column chromatography, RP C18 column chromatography or silica gel open column chromatography, Diaion HP-20 column chromatography, Sephadex column chromatography, etc.
  • the above purification method may be optionally repeated several times to separate the compound of the present invention.
  • the present inventors have an effect on the viability of glioblastoma multiforme of tucilagone for the compounds obtained by the above production method (Experimental Example 1); Effect on proliferation of human glioblastoma cell lines U87MG and T98G (Experimental Example 2); Evaluation of the inhibitory effect of ATP production, a cell energy source (Experimental Example 3); effect on the membrane potential of intracellular mitochondria (Experimental Example 4); Effect on tumor cell formation ability (Experimental Example 5); Effect on tumor sphere three-dimensional invasion (Experimental Example 6); Effect of Tucilagone on FoxM1 and MGMT Protein Expression (Experimental Example 7)
  • the sample of the present invention solves the problem of temozolomide (TMZ,), which is currently the only brain cancer treatment agent, and has stronger anticancer activity.
  • TMZ temozolomide
  • FoxM1 inhibition mechanism could be overcome as a central mechanism of overcoming resistance, and it was confirmed that the resistance problem could be overcome, and that the resistance could be overcome by co-administration with the existing anticancer agent as well as an anticancer agent replacing an anticancer agent such as temodal. .
  • the present invention provides an anticancer adjuvant containing an active ingredient containing tussilagone (14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • tussilagone 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • Kantoin is a medicinal herb that has been used for a long time as an edible or herbal medicine, and the Kantoon extract of the present invention and the compound separated therefrom also have no problems such as toxicity and side effects.
  • prevention means any action that inhibits or delays cancer disease by administration of a composition comprising the compound.
  • treatment used in the present invention means any action that improves or advantageously changes the condition of the disease by administration of the composition comprising the compound.
  • the tussilagone of formula (I) according to the present invention (14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof It provides a treatment method for treating a cancer disease comprising administering to a cancer disease patient.
  • tusilagone of formula (I) for preparing a therapeutic agent for treating a cancer disease patient (14) -Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, Provided are the use of pharmaceutically acceptable salts.
  • the present invention is an active ingredient comprising a combination of tussilagone (14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), an isomer thereof, a pharmaceutically acceptable salt and an existing anticancer agent
  • tussilagone 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • an isomer thereof a pharmaceutically acceptable salt
  • an existing anticancer agent Provided is a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer diseases, a supplement for anticancer treatment, or a dietary supplement.
  • temozolomide cyclophosphamide, methotrexate, 5-fluorouracil, doxorubicin, mustine Vincristine, procarbazine, prednisolone, prednisolone, bleomycin, vinblastine, dacarbazine, etoposide, cisplatin, cisplatin, Epirubicin, cisplatin, capecitabine, oxaliplatin, and the like.
  • TTZ temozolomide
  • the present invention is a tussilagone (tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone) obtained by the above method, an isomer thereof, and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • tussilagone tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • composition of the present invention comprises 0.01 to 99% by weight of the compound relative to the total weight of the composition.
  • composition as described above is not necessarily limited thereto, and may vary according to the condition of the patient and the type and extent of the disease.
  • compositions comprising a compound of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • compositions comprising the compounds according to the invention are each formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • the carriers, excipients and diluents that may be incorporated therein include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one or more excipients in the compound, at least cotton, starch, calcium carbonate, sucrose. Or lactose, gelatin or the like is mixed. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc are also used. Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. .
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Preferred dosages of the compounds of the present invention depend on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the compound is preferably administered at 0.01 mg / kg to 10 g / kg per day, preferably at 1 mg / kg to 1 g / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, live mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be anticipated, for example, by oral and rectal or intravenous methods.
  • the present invention is to prevent and improve the cancer disease (tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), its isomers, pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient
  • cancer disease tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • health functional food means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6767, and “functional” means It means ingestion for the purpose of obtaining useful effects on health use such as nutrient control or physiological action on structure and function.
  • the dietary supplement for the prevention and improvement of cancer diseases of the present invention comprises the compound in an amount of 0.01 to 95%, preferably 1 to 80% by weight, based on the total weight of the composition.
  • composition of the present invention may be a health food for the purpose of treating and ameliorating cancer diseases.
  • a pharmaceutical dosage form such as powders, granules, tablets, capsules, pills, suspensions, emulsions, syrups, or health functional foods in the form of tea bags, leach teas, and health drinks. And processing is possible.
  • the present invention is to prevent and improve the cancer disease (tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), its isomers, pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient Provide dietary supplements.
  • cancer disease tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • the health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the compound as an essential ingredient in the indicated ratios, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the present invention is to prevent and improve the cancer disease (tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone), its isomers, pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient Provide food or food additives.
  • cancer disease tussilagone; 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis- crotonoyloxy] -notonipetranone
  • the compound according to the present invention when used as a food additive, the compound may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., includes all of the health food in the conventional sense.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is generally selected from the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the compounds of the present invention may be added to foods or beverages for the purpose of the prophylactic effect.
  • the amount of the compound in the food or beverage may be added at 0.01 to 15% by weight of the total food weight
  • the health beverage composition is added in a ratio of 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml Can be.
  • the composition was found to be useful as a pharmaceutical composition for preventing and treating cancer diseases, health functional foods and health supplements.
  • the fractions were subjected to silica gel column chromatography using n-hexane (Hexane) / ethylacetate gradient conditions (gradient system, 70: 1 ⁇ 1: 1) to obtain 15 fractions ( F1 to F15), and further reverse phase column chromatography was performed on methanol F gradient conditions (50 to 90%), and the double fraction F-11- Silica gel column chromatography on 6 was carried out under n-hexane / ethylacetate (including 10% isopropanol) under gradient conditions (30: 1 ⁇ 1: 1).
  • F-11-6-2 was subjected to semi-preparative HPLC ( ⁇ -Bondapak C18 column, 20x300 cm, 90% methanol, 8 mL / min, 254 nm) to receive the following physical properties About 146 mg of ragon was obtained, and based on these properties, It was identified to T end (Arch. Pharm. Res. 31, 645-652, 2008)
  • Tussilagone 14-Acetoxy-7 ⁇ - [3'-ethyl- cis -crotonoyloxy] -notonipetranone
  • glioblastoma cell lines commonly used in the literature were selected in order to examine the effect on the viability of the glioblastoma multiforme isolated from the above Example.
  • the U87MG cell line (ATCC, HTB-14) is a conventional Temozolomide-sensitive cell line for treating brain tumors
  • the T98G cell line (ATCC, CRL-1690) is a cell line with temodal resistance ( J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495). The effects on the viability of tusilagon for these two cell lines were examined.
  • the U87MG cell line is Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's modified eagle's medium
  • MEM minimum essential medium
  • Tucilagone Glioblastoma Multiforme Cell Line Tucilagone concentration 0 20 40 Dead cells (%)
  • Temodal Temozolomide, TMZ, Sigma, T2577
  • TTL Tussilagone
  • Table 3 shows the results of prolonged administration of temodal and tucilagone on proliferation of glioblastoma cell lines U87MG and T98G. According to Experimental Example 1, it was found that the effect of 24 hours of tusilagon treatment on the cell activity was very weak. In this experiment, unlike the Experimental Example 1, the drug treatment time was extended to 6 days to evaluate the cell activity by the MTT method.
  • the treatment with temodal showed different trends in the two cell lines.
  • cell proliferation was reduced in a concentration-dependent manner up to 100 ⁇ M, whereas in the same concentration range, the cell proliferation inhibitory effect was less than 10% in the TmoG-resistant T98G cell line.
  • the cell proliferation inhibitory effect was less than 10% in the TmoG-resistant T98G cell line.
  • the cells treated with tusilagon decreased cell proliferation in a concentration-dependent manner, and this phenomenon was similar in both the T-modal sensitive cell line U87MG and the resistant cell line T98G.
  • Table 3 shows IC50 values for the proliferation of glioblastoma cell lines of temodal and tucilagon. Temodal activity on the two cell lines varied greatly, but the two IC50 values of tucilagone were comparable. Therefore, it was confirmed that Tucilagone effectively inhibited cell proliferation even in T98G, a resistant cell line that is difficult to treat.
  • a cell energy source a measurement kit (CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay kit, Cat # G7572, Promega) was used. Specifically, the cell lines cultured in Experimental Example 1-1 were inoculated with 5 ⁇ 10 4 and 3 ⁇ 10 4 cells at 60 mm Dish, respectively, and cultured for 24 hours, followed by treatment with 20 ⁇ M of tusilagon for 3 days. The recovered cells were washed with phosphate buffered saline (PBS), and then a constant cell count was taken to obtain 5 ⁇ L of cell lysate obtained by lysis of reporter lysis buffer (Cat # E1941, Promega).
  • PBS phosphate buffered saline
  • MMP intracellular mitochondrial membrane potential
  • the cultured cell lines of Experimental Example 1-1 were put in 2 ⁇ 10 5 in a 100 mm dish and incubated for 24 hours, treated with 20 ⁇ M of tusilagon and incubated for 24 hours.
  • the recovered cells were dispersed in 1 mL culture solution and added with a solution (JC-1 working solution, Cat # 551302, BD) for 15 minutes at 37 ° C., 5% CO 2 , and MMP was measured using FACS analysis.
  • JC-1 pigments penetrate the mitochondrial membrane and show red fluorescence (FL-2) in normal cells, and when the mitochondrial membrane potential decreases, JC-1 pigment remains in the cytoplasm and shows green fluorescence (FL-1). . Therefore, in this experiment, the extent of MMP decrease was evaluated by increasing the cell ratio in the FL-1 region.
  • the cell lines in Experimental Example 1-1 were B27 (1X; Invitrogen, San Diego, CA, USA), 20 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Sigma, St. Louis, MO, USA), 20 ng / 37 ° C. in complete medium (DMEM / F-12) mixed with mL epidermal growth factor (EGF; Sigma) and 50 U / mL penicillin, 50 mg / mL streptomycin (100x, Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, Korea) Incubated at 5% CO 2 . In the following experiments, GBM tumor cell cells thus obtained were used.
  • Tucilagon was incubated for 1 week by treatment (0, 1, 5, 20 ⁇ M) by concentration. Observe the shape and size of GBM tumor cells cultured using an inverted phase microscope (IX71 Inverted Microscope; Olympus, Tokyo, Japan), and photograph the cells using a DP70 Digital Microscope Camera; Olympus).
  • GBM tumor cells are lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid, phosphate inhibitor cocktail solution, protease After dissolving using an inhibitor cocktail solution), the resultant was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and the obtained supernatant was used as a cell extract for Western blot analysis.
  • lysis buffer 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid, phosphate inhibitor cocktail solution, protease After dissolving using an inhibitor cocktail solution
  • the resultant was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes, and the obtained supernatant was used as a cell extract for Western blot analysis.
  • stem cell marker expression levels such as Nestin, Sox-2 and Oct3 / 4 were measured.
  • the expression levels of Nestin, Sox-2 and Oct3 / 4 of U87MG tumor cells were confirmed to be significantly reduced by tucilagone. It was confirmed that the expression levels of Sox-2 and Oct3 / 4 in T98G neutrophils were also significantly reduced by tucilagone. This result is consistent with the results of Table 6 above.
  • tumor cells cultured in Experimental Example 5-1 were used. Tumor cells of U87MG cells and T98G cells were transferred from the culture plate to the collagen I matrices (collagen I matrices, BD bioscience, 354236).
  • the mixed matrix of metrigel and collagen I was composed of Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), NaHCO 3 , HEPES, 0.05N NaOH and B27 (1X), 20 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF), 20 ng / mL Prepared in complete medium (DMEM / F-12, Mediatech) mixed with epidermal growth factor (EGF) and 50 U / mL penicillin, 50 mg / mL streptomycin.
  • DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • the mixing matrix was mixed and maintained at 4 ° C. until use. After the tumor matrix-grafted mixed matrix was gelled, a culture medium mixed with tusilagone was added over the mixed matrix. At 72 hours, tumor infiltrate was observed by reversed phase contrast microscope (Nikon Ti-E, Tokyo, Japan). Invasiveness of tumor cells was also measured using the following formula (I). Image data analysis was performed using ToupView image analysis software (x64 v3.7.1460; Irvine, CA, USA ) .
  • EMT epithelial mesenchymal
  • T98G tumor cells As shown in Table 8, it was confirmed that the three-dimensional infiltration of the tumor cells was significantly inhibited by the treatment of tucilagon.
  • the inhibitory effect on T98G tumor cells was more pronounced than U87MG (U87MG tumor cells: 44.2% decrease; T98G tumor cells: 66.5% decrease).
  • Table 9 shows the results of measuring expression levels of epithelial mesenchymal (EMT) related markers such as ⁇ -catenin, N-cardherin and Zeb1.
  • EMT epithelial mesenchymal
  • tucilagone showed a similar brain tumor suppression effect not only in the general malignant glioblastoma cell line U87MG but also in the T-modal resistant cell line T98G.
  • protein expression levels of MGMT Neuro-Oncology. 2009 , 11, 281-291; J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495
  • FoxM1 which are important factors that cause temodal resistance
  • Rad51 a DNA repair gene, is known to induce temodal resistance by increasing expression as a FoxM1 target gene ( Clin Cancer Res. 18, 2012, 5961-5971).
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed with 20-40 ⁇ g of protein extract, and the separated protein was transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. After blocking with PBS / Twin containing 5% skim milk for 1 hour to prevent non-specific reaction. Subsequently, the primary mouse anti-FoxM1, MGMT, and Rad51 were bound to the blots at 4 ° C. for 12 hours, followed by a horseradish peroxidase-linked secondary antibody (goat anti-rabbit IgG-HRP, Cat # ADI-SAB-300-J, Enzo) was reacted at room temperature for 1 hour. This was washed three times with PBS / Twin for 10 minutes and checked for expression using chemiluminescent reagents. House-keeping gene ⁇ -actin (Sigma) was used as a loading control.
  • Table 10 shows the results of comparing the expression levels of FoxM1 and MGMT proteins in two cell lines, U87MG and T98G.
  • Table 10 shows the results of analyzing FoxM1 protein expression inhibitory activity of tucilagone. In both cell lines, the amount of FoxM1 protein expression was reduced in a dose dependent manner by the treatment of tucilagon.
  • Table 11 shows the results of analyzing the expression patterns of Rad51 and MGMT proteins, which are genes that induce temodal resistance expression, in T98G cell lines. Tucilage treatment significantly reduced the amount of protein expression of Rad51 and MGMT, which are important factors in temodal resistance.
  • the above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • composition ratio of the said vitamin and mineral mixture was mixed and comprised in the preferable embodiment the component suitable for a healthy food, you may change arbitrarily the compounding ratio considered that it does not deviate from the mind and range of this invention.
  • composition ratio is a composition that is relatively suitable for the preferred beverage in a preferred embodiment
  • the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and usage.
  • Example 1 Effect on the viability of glioblastoma multiforme of tucilagone against the compound of the present invention
  • Example 2 Effect on proliferation of human glioblastoma cell lines U87MG and T98G
  • Example 3 Effect on the membrane potential of intracellular mitochondria
  • Example 4 Effect on tumor cell formation ability
  • Example 5 Effect on tumor sphere three-dimensional invasion
  • Example 6 Effect of Tucilagone on FoxM1 and MGMT Protein Expression

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Abstract

본 발명은 관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 화합물을 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 대한 것이다. 본 발명에 따른 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향(실험예 1); 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향(실험예 2); 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가(실험예 3);세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향(실험예 4); 종양구 형성능에 미치는 영향(실험예 5); 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향(실험예 6); 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향(실험예 7) 실험에서 본 발명의 시료는 특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달(Temozolomide, TMZ,) 의 문제점을 해결하고 보다 강한 항암활성 및 내성 극복의 중심 기전으로 FoxM1 저해 기전을 발견하여 내성 문제를 극복할 수 있음을 확인하여 기존 테모달과 같은 항암제를 대체하는 항암제인 동시에 기존 항암제와 병용투여함으로서 내성을 극복할 수 있음을 확인함으로서, 상기 조성물을 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.

Description

관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 화합물을 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 화합물을 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
다형성아교모세포종 (glioblastoma multiforme, GBM)은 가장 일반적이고 심한 뇌종양 중 하나이다 (J Neurooncol. 2012, 108, 11-27). 현재의 표준치료법은 일차수술에서 최대한 종양을 제거한 후 방사선치료와 테모달을 이용한 약물치료를 병행진행 하는 것이다 (J Neuro oncol 2013, 112, 277-283). 하지만 진단 후 5년 생존율은 3% 미만이다 (J Clin Neurosci 2012, 19, 1530-1534). 테모달 (Temozolomide, TMZ)의 치료기전은 DNA를 알킬화하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것이고, 뇌종양 표준요법에 사용되고 있는 약물이지만 특정 뇌종양세포는 테모달에 의한 DNA손상을 회복할 수 있어 치료효과가 제한적이다.
다형성아교모세포종의 테모달에 대한 내성은 DNA복구유전자인 O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT)와 관련되어 있다고 알려져 있다 (Mol (Carcinogenesis 1995, 13, 70-80). 또한, forkhead box M1 (FoxM1)는 전사인자로써 세포주기 및 세포사멸 관련한 유전자들의 발현을 유도한다 (Nat Cell Biol 2005, 7, 126-136; Mol Cell Biol 2013, 33, 227-236). 이런 FoxM1은 다형성아교모세포종을 포함한 다양한 종양세포에서 과발현되며 빠른 세포증식을 유도한다 (J Transl Med 2013, 11, 204; PLoS One 2013, 8; Cancer Lett 2011, 306, 214-222; Cancer Res 2006, 66, 3593-3602). 따라서 FoxM1은 암예방 또는 치료에 새로운 타겟으로 주목 받고 있다. 선행연구결과에 의하면 FoxM1에 감소에 따라 신경교종세포의 성장도 억제되며 (Cancer Res 2006, 66, 3593-3602; Eur Rev Med Pharmacol Sci 2014, 18, 205-211), 재발한 다형성아교모세포종의 FoxM1을 넉아웃시킴으로써 암세포의 테모달내성을 감소시켰다는 보고가 있다. 또한 FoxM1은 DNA 복구 유전자인 Rad51 발현을 조절함으로써 테모달 내성을 유발하기도 한다 (Clin Cancer Res 2012, 18, 5961-5971). 이러한 알려진 기전에 근거하여 수종의 FoxM1 억제 물질들의 교모세포종에 대한 치료효과를 확인한 바 있다 (J Neurooncol 2015, 121, 469-477; Eur J Pharmacol 2015, 765, 346-354).
관동화 (Tussilago farfara L.)는 국화과에 속하는 다년생 초본이다. 한방에서는 관동화의 꽃봉오리를 약제로 사용해왔으며, 폐의 기능을 튼튼하게 하고 기침과 가래를 멎게 하는 효능이 있어 기관지염이나 천식의 치료를 위해 사용되었다. 관동화추출물은 아라키돈산의 대사를 억제하고(Hinyokika Kiyo 1996, 42, 639-643), 혈소판 활성인자 수용체 (platelet activating factor receptor)를 억제(Eur J Pharmacol 1987, 141, 269-281)한다고 보고되었다. 심혈관계 및 호흡기계의 기능을 증진시킨다고도 알려졌다(Gen Pharmacol 1988, 19, 261-263). 또한, 항미생물효과(J Ethnopharmacol 2002, 82, 51-53), 항산화 활성에 의한 신경보호효과(Biol Pharm Bull 2005, 28, 455-460) 등의 연구 결과도 있다. 투실라곤 (tussilagone)은 관동화에서 분리된 sesquiterpene의 일종이다. 본 발명자들은 투실라곤이 리포다당류 (lipopolysaccharide) 자극한 소교세포 (BV2세포)에서 일산화질소 (nitric oxide) 합성억제를 통한 항염증효과와(Arch Pharm Res 2008, 31, 645-652) Wnt/β-cateinin 신호전달 경로를 억제하여 대장암세포의 증식을 막을 수 있음을 보고한 바 있다(Biochem and Biophys Res Commun 2014, 443, 132-137).
선행발명으로는 관동화 추출물 또는 투실라곤 함유 비만 또는 당뇨치료제 용도 발명 (한국특허 제 10-0697235호); (2) 투실라곤 함유 수지상세포 성숙화 또는 활성화 억제용 조성물 또는 면역질환 치료제 용도 발명 (한국특허 공개 제 10-2015-0033978호); (3) 관동화 추출물 함유 뇌암 치료제 용도 발명 (한국특허 공개 제 10-2012-0094174호); (4) 관동화 추출물 함유 폐암 치료제 용도 발명 (한국특허 공개 제 10-2012-0111764호) 등이 알려진 바 있다.
그러나, 상기 문헌의 어디에도 관동화 추출물로부터 분리된 투실라곤 (tussilagone) 화합물을 함유하는 암 질환의 치료 효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.
특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달(Temozolomide, TMZ,) 의 경우, 항암활성이 약하고 내성을 유발한다는 문제점을 안고 있어 내성세포에 대해서도 우수한 항암 활성을 나타내고, 그 내성과 관여하는 지표들을 억제하는 기전을 가진 항암 화합물을 개발하여야 하는 시급한 과제를 안고 있다.
그러나, 본원 발명자들은 보다 항암 치료 효과면에서 보다 치료 활성이 강력한 천연물 신약 또는 건강기능식품 소재로서의 개발 가능성을 높이고자 기존에 알려진 관동화 추출물보다 강력한 치료효과를 나타내는 화합물을 분리하고자, 지속적으로 관동화 추출물을 대상으로 분획 및 정제과정을 통하여 투실라곤 (tussilagone) 화합물을 분리하였으며, 이를 대상으로 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향(실험예 1); 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향(실험예 2); 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가(실험예 3);세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향(실험예 4); 종양구 형성능에 미치는 영향(실험예 5); 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향(실험예 6); 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향(실험예 7) 실험에서 본 발명의 시료는 특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달(Temozolomide, TMZ,) 의 문제점을 해결하고 보다 강한 항암활성 및 내성 극복의 중심 기전으로 FoxM1 저해 기전을 발견하여 내성 문제를 극복할 수 있음을 확인하여 기존 테모달과 같은 항암제를 대체하는 항암제인 동시에 기존 항암제와 병용 투여함으로서 내성을 극복할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자는 암질환의 예방 또는 치료에 보다 탁월한 천연물 치료제 개발을 기술적 과제로 한다.
본 발명의 목적은 하기 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 하기 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명의 과제는 하기 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
Figure PCTKR2019005609-appb-C000001
또한 본 발명은 하기 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
본 발명의 염으로는 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.
본 발명의 화합물들은 당업계에 잘 알려진 실리카겔 컬럼, 및 재결정법을 이용한 정제과정을 반복수행하는 분리방법 및 정제방법으로부터 분리하는 방법 또는 화학적으로 합성하여 제조하거나, 상업적으로 구입가능하다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.
예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
건조된 관동화 (Tussilago farfara L.)를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 10~100% 메탄올을 수회 섞은 다음에 10 내지 150℃, 바람직하게는 20 내지 70℃ 의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 1시간 내지 48시간 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 냉침추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물들은 상기에서 얻은 조추출물을 역상크로마토그래피, 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피, Diaion HP-20 컬럼크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피 등의 하나 이상의 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물을 분리가능하다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 화합물들을 대상으로 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향(실험예 1); 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향(실험예 2); 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가(실험예 3);세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향(실험예 4); 종양구 형성능에 미치는 영향(실험예 5); 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향(실험예 6); 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향(실험예 7) 실험에서 본 발명의 시료는 특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달(Temozolomide, TMZ,) 의 문제점을 해결하고 보다 강한 항암활성 및 내성 극복의 중심 기전으로 FoxM1 저해 기전을 발견하여 내성 문제를 극복할 수 있음을 확인하여 기존 테모달과 같은 항암제를 대체하는 항암제인 동시에 기존 항암제와 병용 투여함으로서 내성을 극복할 수 있음을 확인하였다.
본원에서 정의되는 암질환는 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암, 혈액암 등, 바람직하게는, 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암(=결장암), 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 또는 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암), 보다 바람직하게는, 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 또는 폐암(비소세포성 폐암, 소세포성 폐암)을 포함한다.
또한 본 발명은 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암 보조 치료제를 제공한다.
또한, 관동화는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 관동화 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 상기 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 암 질환환자에게 투여함을 포함하는 암 질환을 치료하기 위한 치료방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 암 질환 환자를 치료하기 위한 치료제 제조를 위한 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 항암치료 보조제 또는 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 기존 항암제는 테모달((Temozolomide, TMZ,) 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 등을 포함한다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.
그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 마우스, 생마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 암 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.
더욱이, 본 발명의 조성물은 암 질환의 치료 및 개선을 목적으로 한 건강식품일 수 있다.
또한, 암 질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.
또한, 본 발명은 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.
또한, 본 발명은 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 개선용 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 화합물을 식품첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 화합물은 목적 질환이 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 화합물을 대상으로 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향(실험예 1); 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향(실험예 2); 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가(실험예 3);세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향(실험예 4); 종양구 형성능에 미치는 영향(실험예 5); 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향(실험예 6); 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향(실험예 7) 실험에서 본 발명의 시료는 특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달(Temozolomide, TMZ,) 의 문제점을 해결하고 보다 강한 항암활성 및 내성 극복의 중심 기전으로 FoxM1 저해 기전을 발견하여 내성 문제를 극복할 수 있음을 확인하여 기존 테모달과 같은 항암제를 대체하는 항암제인 동시에 기존 항암제와 병용 투여함으로서 내성을 극복할 수 있음을 확인함으로서, 상기 조성물을 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.
당업자라면 다양한 변형 및 변이가 본 발명의 정신 또는 범위를 이탈하지 않는 범위에서 본 발명의 조성물, 용도 및 제조에 사용 가능함이 자명할 것이다.
본 발명의 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 어떠한 방법으로도 하기 실시예로 제한하고자 하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 범위에서 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 관동화( Tussilago farfara ) 추출물 제조 및 투실라곤 (tussilagone) 분리
관동화는 서울경동한약시장(서울 한국, 숙명여자대학 약초표본실 보존 표본 SPH 1702) 에서 구입하였다. 건조된 관동화 6 kg에 메탄올 5 L 로 가열 환류 방식으로 2시간씩 3회 반복하여 추출후 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 투실라곤을 포함한 분획을 얻기 위하여 상기 추출물 1.25 Kg에 정제수 800 mL 를 가하여 현탁하고 이 현탁물에 에틸아세테이트(ethylacetate) 800 mL 을 가하여 분획하고 감압농축하여 에틸아세테이트가용 분획물 150g 을 얻었다. 투실라곤을 분리하기 위하여 상기 분획물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 n-헥산(Hexane)/에틸아세테이트(ethylacetate) 경사법 조건 (gradient system, 70:1 → 1:1)으로 수행하여 15개의 분획물을 (F1 ~ F15) 얻고, 이중 F-11을 대상으로 추가로 역상 컬럼크로마토그래피법(reverse phase column chromatography)을 메탄올 경사법 조건(gradient system, 50→90%)으로 수행하고, 이중 분획물 F-11-6을 대상으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피법을 n-헥산(Hexane)/에틸아세테이트(ethylacetate) (10% 이소프로파놀 포함) 경사법 조건 (gradient system, 30:1→1:1)으로 수행하고, 이중 F-11-6-2 대상으로 세미-프레파라티브(semi-preparative) HPLC (μ-Bondapak C18 컬럼, 20x300 cm, 90% 메탄올, 8 mL/min, 254 nm)을 수행하여 하기 물성치를 갖는 투실라곤을 약 146 mg을 수득하였고 이 물성치를 기초로 기존문헌에 기재된 물성치와 비교하여 최종동정하였다 (Arch. Pharm. Res. 31, 645-652, 2008)
투실라곤(tussilagone, I) 물성치
: 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone)
Figure PCTKR2019005609-appb-C000002
:성상: 무색의 오일상;
[a]D+55.81o(c 0.22, 31.8 ℃, CHCl3);
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 5.56 (1H, t, J=3.0, H-7α), 5.61 (1H, d, J=1.2, H-2'), 5.13 (1H, s, H-10), 5.09 (1H, q, J=3.2 H-14), 4.77 (1H, br s, H-10), 2.57 (1H, m, H-9β), 2.47 (1H, dd, J=3.2, 11.0, H-3β), 2.37 (1H, dd, J=4.8, 16.4, H-1β), 2.28 (1H, m, H-11), 2.16 (2H, m, H-4'), 2.13 (3H, d, J=1.2, H-6'), 2.08 (3H, s, 14-OCOCH 3), 2.08 (1H, m, H-6β), 2.04 (1H, m, H-1α), 1.96 (1H, m, H-5β), 1.45 (1H, m, H-6α), 1.44 (1H, m, H-4α), 1.21 (3H, d, J= 6.8, 15-CH 3), 1.06 (3H, t, J=7.5, 5'-CH 3), 0.97 (3H, d, J=6.8, 12-CH 3), 0.77 (3H, d, J=6.8, 13-CH 3);
13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 214.8 (C-2), 171.0 (14-OCOCH3), 166.0 (C-1'), 162.1 (C-3'), 146.2 (C-8), 114.8 (C-2'), 110.3 (C-10), 73.2 (C-7), 69.8 (C-14), 57.5 (C-3), 49.4 (C-4), 44.2 (C-5), 42.9 (C-1), 42.5 (C-9), 34.1 (C-4'), 31.5 (C-6), 27.9 (C-11), 21.9 (C-12), 21.7 (C-6'), 19.2 (14-OCOCH3), 15.7 (C-13), 15.5 (C-15), 12.2 (C-5');
EIMSm/z 390 [M]+
실험예 1. 세포배양 및 투실라곤의 세포 생존력에 미치는 영향
상기 실시예에서 분리한 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존 문헌에서 많이 사용하는 두 인간 교모세포종 세포주를 선정하였다. 그중 U87MG 세포주(ATCC, HTB-14)는 기존 뇌종양 치료제인 테모달 (Temozolomide) 민감성 세포주이고, T98G 세포주(ATCC, CRL-1690)는 테모달 내성을 가진 세포주이다 (J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495). 이 두 세포주에 대한 투실라곤의 세포생존력에 미치는 영향을 살펴보았다.
1-1. 실험과정
U87MG 세포주는 10% 우태아 혈청이 포함된 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)으로, T98G 세포주는 10% 우태아 혈청이 포함된 Minimum essential medium (MEM)으로 37℃, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 배양하였다.
세포의 생존력을 분석하기 위해서, 두 세포주를 5×103 cells/100 μL 로 96 well에 접종하고 투실라곤 (tussilagone, TSL)을 농도별(0, 5, 10, 20, 40 μM)로 24시간 동안 처리한 후 세포활성을 문헌에 기재된 MTT법으로 평가하였다 (Disease Models & Mechanisms. 2012, 5, 342-350). 또한, 투실라곤 20, 40 μM을 처리 24시간 후에 세포생존율을 프립판 블루(trypan blue) 염색법으로 확인하였다.
1-2. 실험 결과 (표 1 내지 표 2)
본 실험 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, U87MG 과 T98G에 투실라곤을 24시간 처리한 경우, 40 μM의 농도에서도 세포 활성이 70% 이상으로 확인하였다. 또한, 표 2에서 나타낸 바와 같이, 투실라곤 20 μM 과 40 μM 농도로 처리할 경우 대조군에 비해서 죽은 세포가 차지한 비율은 변하지 않았다. 따라서, 24시간 투실라곤 처리에 따른 세포활성이 미약하게 감소한 것은 독성에 의한 것이 아닌 것으로 예상하였다.
투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme) 세포주의 세포생존율(cell viability) 실험 결과
투실라곤 농도(μM) 0 5 10 20 40
세포생존율(%) U87MG 100 ± 3 99 ± 7 98 ± 3 92 ± 6 75 ± 7
T98G 100 ± 1 100 ± 3 101 ± 2 94 ± 2 74 ± 2
투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme) 세포주 사멸효과
투실라곤 농도(μM) 0 20 40
사멸세포(%) U87MG 12.3 ± 2.5 11.9 ± 2.7 11.7 ± 1.7
T98G 14.0 ± 2.4 14.2 ± 2.5 10.2 ± 1.6
실험예 2. 투실라곤의 세포증식에 미치는 영향
투실라곤의 장시간 투여가 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향을 문헌에 기재된 평가법을 참고하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495).
2-1. 실험 과정
상기 실험예 1-1의 배양한 세포주를 각각 500 cells/100 μL 과 1000 cells/100로 96 well plate에 접종한 후에, 테모달 (Temozolomide, TMZ, Sigma, T2577) (0, 10, 30, 50, 100 μM) 혹은 투실라곤 (tussilagone, TSL) (0, 10, 20, 40, 80 μM)를 6일 동안 처리한 후 세포활성을 MTT법으로 평가하여 IC50값을 구하였다.
2-2. 실험 결과 (표 3)
표 3은 테모달 와 투실라곤의 장시간 투여가 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G에 증식에 미치는 영향을 평가한 결과이다. 실험예 1 에 의하면 투실라곤 24시간 처리가 세포활성에 미치는 영향이 매우 약한 것을 알 수 있었으므로 본 실험에서는 실험예 1와 다르게 약물 처리시간을 6일로 연장하여 세포활성을 MTT법으로 평가하였다.
실험결과, 테모달을 처리한 결과, 두 세포주에서 다른 경향이 관찰되었다. U87MG 세포주에서는 100 μM 까지 농도 의존적으로 세포 증식을 감소시킨 반면에, 테모달 내성인 T98G 세포주에서는 같은 농도범위에서 세포증식억제 효과가 10% 미만으로 약했다. 이 결과는 문헌 (J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495)의 결과와 유사하여, T98G 세포주의 테모달에 대한 내성을 다시 확인할 수 있었다. 상기 결과와 다르게, 투실라곤을 처리한 세포는 농도의존적으로 세포증식이 감소하였으며, 이런 현상은 테모달 민감성세포주인 U87MG와 내성 세포주인 T98G에서 모두 비슷한 경향이었다.
표 3은 테모달과 투실라곤의 교모세포종 세포주 증식에 대한 IC50값이다. 두 세포주에 대한 테모달의 활성은 차이가 크게 나지만, 투실라곤의 두 IC50 값은 비슷하였다. 따라서 투실라곤은 테모달이 치료하기 어려운 내성세포주인 T98G에서도 세포증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
테모달과 투실라곤의 다형성아교모세포종 세포주 증식억제 효과
세포주 IC50 (μM)
TMZ TSL
U87MG 49.9 13.8
T98G > 100 15.3
실험예 3. 투실라곤의 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가
암세포는 지속적으로 변화하는 미세 환경 속에서 빠르게 증식하기 위해 많은 에너지가 필요하다. 상기 실험예 2중에서는 투실라곤이 세포 증식 억제 효과를 보였다. 따라서 본 실험에서는 세포 에너지원인 ATP 생성에 미치는 영향을 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Disease Models & Mechanisms. 2012, 5, 342-350).
3-1. 실험 과정
세포 에너지원인 ATP 생성을 평가하기 위해서 측정 키트(CellTiter-Glo　Luminescent Cell Viability Assay kit, Cat# G7572, Promega)를 사용하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1-1의 배양한 세포주들을 60 mm Dish에 각각 5 × 104 과 3 × 104세포를 접종하고 24시간 배양 후, 투실라곤 20 μM을 3일간 처리하였다. 회수한 세포를 인산완충식염수 (PBS)로 세척 후 일정한 세포수를 취하여 리포터 용해 버퍼(reporter lysis buffer, Cat# E1941, Promega) 용해하여 얻은 세포용해물 5 μL를 취하여 루시퍼라제 분석용 96-웰 플레이트 (Lucuferase analysis, Cat# 31196, SPL)에 분주하고 어세이 시약(CellTiter-Glo　Luminescent Cell Viability Assay, Cat# G7572, Promega) 시약을 50 μL를 더해 흡광도를 측정하였다.
3-2. 실험 결과 (표 4)
본 실험 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 투실라곤을 처리할 경우, ATP 생성이 현저히 감소하였다. 투실라곤의 ATP 생성저해 활성이 U87MG 세포주 (44.9% 감소)보다 테모달 내성 세포주인 T98G (61.8% 감소)에서 더 강하게 관찰되었다.
투실라곤(20μM)의 다형성아교모세포종 세포주의 ATP 생성 저해 효능 실험
세포주 ATP 생성저해 (%)
U87MG 44.9 ± 5.6
T98G 61.8 ± 2.2
실험예 4. 투실라곤의 세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향
인간 교모세포종 세포주인 U87MG 과 T98G에 투실라곤을 처리한 후 세포내 미토콘드리아 막전위 (mitochondrial membrane potential, MMP) 변화의 분석을 기존 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 12424-12435).
4-1. 실험 과정
상기 실험예 1-1의 배양한 세포주들을 100 mm Dish에 2 × 105 를 넣고 24 시간 배양 후, 투실라곤 20 μM 처리하고 24 시간 배양하였다. 회수한 세포를 1 mL 배양액에 분산하고 용액(JC-1 working solution, Cat# 551302, BD)를 첨가하여 37℃, 5% CO2에 15 분간 처리한 후 FACS 분석법을 이용하여 MMP를 측정하였다.
실험원리에 따르면 정상 세포내에서 JC-1색소는 미토콘드리아 막을 투과하여 빨간색 형광 (FL-2)을 나타내고, 미토콘드리아 막전위가 감소할 경우 JC-1색소는 세포질에 남아 녹색 형광(FL-1)을 나타난다. 따라서 본 실험에서는 FL-1 영역에 세포비율의 증가량으로 MMP 감소 정도를 평가한다.
4-2. 실험 결과 (표 5)
본 실험 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 투실라곤을 처리할 경우, MMP의 저하가 유도되었다. 또한, U87MG 세포주 비해 (12.15%→17.89%) 테모달 내성 세포주인 T98G (9.87%→ 22.96%)에서 투실라곤의 MMP 변화효과가 더 큰 것으로 확인되었다.
투실라곤(20μM)의 다형성아교모세포종 세포주의 세포내 미토콘드리아 막전위에 미치는 영향
세포주 대조군 투실라곤 처리군 MMP 변화(%)
U87MG 12.15 17.89 47.2
T98G 9.87 22.96 132.6
실험예 5. 투실라곤의 종양구 형성능에 미치는 영향
본 발명의 투실라곤 화합물이 종양구 형성능에 미치는 영향을 기존 문헌에 기재된 방법을 응응하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Oncotarget. 2016, 7, 65643-65659).
5-1. 실험 과정
상기 실험예 1-1 중에 세포주들을 B27(1X; Invitrogen, San Diego, CA, USA), 20 ng/mL의 염기성 섬유 모세포성장인자 (bFGF; Sigma, St. Louis, MO, USA), 20 ng/mL의 표피성장인자(EGF; Sigma) 및 50 U/mL 페니실린, 50 mg/mL 스트렙토마이신(100x, Gibco, Invitrogen Korea, Seoul, Korea)이 혼합된 완전 배지(DMEM/F-12)에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이하의 실험에서는 이렇게 얻어진 GBM 종양구 세포를 사용하였다.
투실라곤의 종양구 형성능에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 상기 종양구들을 획득한 뒤, 투실라곤을 농도별로(0, 1, 5, 20 μM) 처리하여 1주간 배양하였다. 역위상차 현미경 (IX71 Inverted Microscope; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 배양된 GBM 종양구의 형상과 사이즈를 관찰하고, 세포의 사진은 디지털 카메라(DP70 Digital Microscope Camera; Olympus)를 이용하여 DP 컨트롤러 소프트웨어(Olympus)로 촬영하였다.
웨스턴 블롯 분석은 Nestin, Sox-2 및 Oct3/4 와 같은 줄기세포성 마커에 대해 수행하였고, 로딩대조군으로 하우스 키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다. 구체적으로, GBM 종양구세포를 용해버퍼 (lysis buffer) (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholic acid, phosphate inhibitor cocktail solution, protease inhibitor cocktail solution)를 이용하여 용해시킨 뒤, 14,000 rpm에서 15분간 원심 분리하고, 얻어진 상층액을 웨스턴블롯 분석을 위한 세포 추출물로 사용하였다. 단백질의 웨스턴블롯 분석을 위하여, 샘플을 SDS-polyacrylamide gel에 120 V로 전기영동시켜 분리한 뒤, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막은 3% 탈지유가 포함된 PBS/트윈 용액으로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹한 후, 1차 항체(1:1000 희석)를 3시간 동안 반응시킨 뒤, 2차 항체(1:2000 희석)을 1시간 동안 반응시켰다. Amersham Bioscience에 기재된 화학 발광법을 이용하여 자료를 획득하였다.
5-2. 실험 결과 (표 6 및 표 7)
표 6 및 7에서 보는 바와 같이, 5 μM 투실라곤 처리한 경우 U87MG 와 T98G 종양구 형성능이 유의적으로 감소하기 시작하고 20 μM 처리시 종양구 형성능이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
표 6에서는, Nestin, Sox-2 및 Oct3/4 와 같은 줄기세포성 마커발현 수준을 측정하였다. U87MG 종양구의 Nestin, Sox-2 및 Oct3/4에 발현양은 투실라곤에 의해 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. T98G 중양구의 Sox-2 및 Oct3/4 발현양도 투실라곤에 의해 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이결과는 상기 표 6 결과와 일치 하게 나왔다.
투실라곤의 다형성아교모세포종 종양구 형성능에 미치는 영향
처리군 (배)
U87MG 대조군 1.00
투실라곤(1μM) 0.85
투실라곤(5μM) 0.56
투실라곤(20μM) 0.22
T98G 대조군 1.00
투실라곤(1μM) 1.13
투실라곤(5μM) 0.77
투실라곤(20μM) 0.60
투실라곤(20μM)의 다형성아교모세포종 종양구에서 줄기세포성 발현 억제활성
처리군 (배)
U87MG Nestin 대조군 1.0
투실라곤 0.89
SOX2 대조군 1.0
투실라곤 0.92
Oct3/4 대조군 1.0
투실라곤 0.66
T98G Nestin 대조군 1.0
투실라곤 0.95
SOX2 대조군 1.0
투실라곤 0.61
Oct3/4 대조군 1.0
투실라곤 0.53
실험예 6. 투실라곤의 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향
본 발명의 투실라곤 화합물이 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향을 기존 문헌에 기재된 방법을 응응하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Oncotarget. 2016, 7, 65643-65659).
6-1. 실험 과정
본 실험에서는 상기 실험예 5-1에서 배양한 종양구를 사용하였다. U87MG세포와 T98G세포의 종양구를 배양 플레이트로부터 콜라겐 I 매트릭스(collagen I matrices, BD bioscience, 354236)에 이동시켰다. 메트리젤과 콜라겐 I의 혼합 매트릭스는 Dulbecco's 인산완충식염수 (DPBS), NaHCO3, HEPES, 0.05N NaOH와 B27(1X), 20 ng/mL의 염기성 섬유 모세포성장인자 (bFGF), 20 ng/mL의 표피성장인자(EGF) 및 50 U/mL 페니실린, 50 mg/mL 스트렙토마이신이 혼합된 완전 배지(DMEM/F-12, Mediatech)로 제조하였다. 혼합 매트릭스는 사용 전까지 4℃에서 혼합 및 유지시켰다. 종양구가 이식된 혼합 매트릭스가 겔화된 후, 투실라곤이 혼합된 배양 배지를 혼합 매트릭스 위에 첨가하였다. 72시간이 경과한 시점에서 종양구의 침윤을 역위상차 현미경 (Nikon Ti-E, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 또한, 종양구의 침윤능 (invasiveness)은 하기 수식 I 을 이용하여 측정하였다. 이미지 데이터 분석은 ToupView 이미지 분석 소프트웨어 (x64 v3.7.1460; Irvine, CA, USA)를 이용하여 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석은 β-catenin, N-cardherin 및 Zeb1과 같은 상피간엽이행 (EMT) 관련 마커를 이용하여 수행하였고, 방법은 상기 실험예 5-1 과 동일하였다.
Figure PCTKR2019005609-appb-M000001
6-2. 실험 결과 (표 8 및 표 9)
표 8에서 보는 바와 같이, 투실라곤 처리에 의해 종양구의 3차원 침윤이 현저하게 억제된 것을 확인하였다. T98G 종양구에 대한 억제효과가 U87MG 보다 더 현저하였다(U87MG 종양구: 44.2% 감소; T98G 종양구: 66.5% 감소).
표 9에서는, β-catenin, N-cardherin 및 Zeb1과 같은 상피간엽이행 (EMT) 관련 마커의 발현 수준을 측정한 결과이다. U87MG 과 T98G 종양구에 β-catenin, N-cardherin 및 Zeb1의 발현양이 투실라곤에 의해 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 상기 표 8 결과와 일치하였다.
투실라곤(20μM)의 다형성아교모세포종 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향 실험결과
처리군 (%)
U87MG 대조군 100
TSL 55.8
T98G 대조군 100
TSL 33.5
투실라곤(20μM)의 다형성아교모세포종 종양구에서 상피간엽이행 발현 억제활성 실험결과
처리군 (배)
U87MG β-catenin 대조군 1.0
TSL 0.65
N-cadherin 대조군 1.0
TSL 0.59
Zeb1 대조군 1.0
TSL 0.49
T98G β-catenin 대조군 1.0
TSL 0.21
N-cadherin 대조군 1.0
TSL 0.59
Zeb1 대조군 1.0
TSL 0.48
실험예 7. 투실라곤의 다형성아교모세포종 세포주에서 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향
상기 실험결과들을 의하면 투실라곤은 일반 악성 교모세포종 세포주 U87MG 뿐만 아니라, 테모달 내성 세포주인 T98G에서도 비슷한 뇌종양 억제효과를 보였다. 그 기전을 규명하기 위하여 테모달 내성을 일으키는 중요한 인자인 MGMT (Neuro-Oncology. 2009, 11, 281-291; J Biomed Biotechnol. 2012, 2012, 987495) 와 FoxM1의 단백질 발현양을 측정하였다. 또한, 문헌에 따르면 DNA 복구 유전자인 Rad51은 FoxM1 타겟유전자로써 발현 증가로 테모달 내성을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Clin Cancer Res. 18, 2012, 5961-5971).
7-1. 실험 과정
세포용해물을 획득하여 웨스턴 블롯법(Western blot analysis)을 통해 FoxM1 및 MGMT 단백질 발현 수준을 평가하였고, 또 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향을 관찰하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1-1의 배양한 세포주를 60 mm Dish에 4 × 105세포를 접종하고 24 시간 배양 후 투실라곤 20 μM을 16 시간 또는 24 시간 처리한 후에 세포용해버퍼로 [lysis buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), protease inhibitor cocktail (Calbiochem, Darmstadt, Germany)] 단백질 추출물(Protein extracts)을 얻었다. 20-40 μg의 단백질 추출물로 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 실시하고, 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 맴브래인으로 이동시켰다. 이 후 5% 탈지유가 포함된 PBS/Twin 으로 1시간 동안 비특이적 반응을 막기 위해서 블로킹하였다. 이 후 블롯에 일차 마우스 항-FoxM1, MGMT, Rad51를 4℃에서 12 시간 동안 결합시키고, 이어서 Horseradish peroxidase가 연결된 2차 항체 (goat anti-rabbit IgG-HRP, Cat# ADI-SAB-300-J, Enzo)를 상온에서 1시간 반응시켰다. 이를 PBS/Twin 으로 10분씩 세번 세척하고 화학발광 시약을 이용해 발현을 확인하였다. 로딩 대조군으로 하우스 키핑 유전자인 β-actin (Sigma)를 사용하였다.
7-2. 실험 결과 (표 10 및 표 11)
투실라곤의 다형성아교모세포종 세포주에서 FoxM1 단백질 발현 억제활성 실험결과
처리군 (배)
U87MG 대조군 1.0
TSL-20μM 0.5
TSL-40μM 0.2
T98G 대조군 1.0
TSL-20μM 0.4
TSL-40μM 0.1
투실라곤의 T98G 다형성아교모세포종 세포주에서 Rad51 및 MGMT 단백질 발현 억제활성 실험결과
처리군 (배)
Rad51 대조군 1.0
TSL-20μM 0.3
TSL-40μM 0.4
MGMT 대조군 1.0
TSL-20μM 0.8
TSL-40μM 0.4
표 10은 U87MG 와 T98G 두 세포주에 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현양을 비교분석한 결과이다. 테모달 내성의 중요한 원인이 되는 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현양은 U87MG 세포주보다 테모달 내성 세포주인 T98G에서 현저히 높게 측정되었다.
표 10은 투실라곤의 FoxM1 단백질 발현 억제활성을 분석한 결과이다. 두 세포주 모두에서 투실라곤 처리에 의해 FoxM1 단백질 발현양은 농도 의존적으로 감소하였다. 표 11은 테모달 저항성 발현을 유도하는 유전자인 Rad51과 MGMT 단백질 발현양상을 T98G 세포주에서 분석한 결과이다. 투실라곤 처리에 의해 테모달내성의 중요인자인 Rad51과 MGMT의 단백질 발현양이 현저하게 감소하였다.
하기에 본 발명의 제형화 방법 및 담체의 종류를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 대표적인 제제예를 하기에 설명하고자 함이다.
하기에 본 발명의 시료 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
투실라곤 ------------------------------------------------ 20 mg
유당 --------------------------------------------------- 100 mg
탈크 ---------------------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
투실라곤------------------------------------------------ 10 mg
옥수수전분 -------------------------------------------- 100 mg
유당 -------------------------------------------------- 100 mg
스테아린산 마그네슘 ------------------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
투실라곤 ----------------------------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg
락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
투실라곤 ----------------------------------------------- 10 mg
만니톨 ------------------------------------------------ 180 mg
주사용 멸균 증류수 ----------------------------------- 2974 mg
Na2HPO4,12H2O ------------------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
투실라곤 ------------------------------------------------ 20 mg
이성화당 ------------------------------------------------- 10 g
만니톨 ---------------------------------------------------- 5 g
정제수 --------------------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
투실라곤 ---------------------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 -------------------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------------------- 70 ㎍
비타민 E ----------------------------------------------- 1.0 ㎎
비타민 B1 --------------------------------------------- 0.13 ㎎
비타민 B2 --------------------------------------------- 0.15 ㎎
비타민 B6 ---------------------------------------------- 0.5 ㎎
비타민 B12 --------------------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ------------------------------------------------ 10 ㎎
비오틴 -------------------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ----------------------------------------- 1.7 ㎎
엽산 ---------------------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ------------------------------------------ 0.5 ㎎
무기질 혼합물 -------------------------------------------- 적량
황산제1철 --------------------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 ---------------------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ------------------------------------------ 25.3 ㎎
제1인산칼륨 --------------------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 --------------------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 ---------------------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ----------------------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ------------------------------------------ 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는다고 간주되는 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
투실라곤------------------------------------------------- 1000㎎
구연산 ------------------------------------------------- 1000 ㎎
올리고당 ------------------------------------------------- 100 g
매실농축액 ------------------------------------------------- 2 g
타우린 ----------------------------------------------------- 1 g
정제수를 가하여 ------------------------------------ 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
상술한 바와 같이, 다양한 방법으로 본 발명은 변형가능하고, 이러한 변형은 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 것으로 간주되며, 이러한 모든 변형은 당업자에게는 하기한 본 발명의 청구범위 이내 포함되는 의도임이 자명할 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물을 대상으로 투실라곤의 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme)의 생존력에 미치는 영향(실험예 1); 인간 교모세포종 세포주인 U87MG 와 T98G 증식에 미치는 영향(실험예 2); 세포 에너지원인 ATP 생성 저해 효능 평가(실험예 3);세포내 미토콘드리아의 막전위에 미치는 영향(실험예 4); 종양구 형성능에 미치는 영향(실험예 5); 종양구 3차원 침윤에 미치는 영향(실험예 6); 투실라곤의 FoxM1 과 MGMT 단백질 발현에 미치는 영향(실험예 7) 실험에서 본 발명의 시료는 특히, 현재 유일하게 뇌암 치료제로 사용중인 테모달((Temozolomide, TMZ,) 의 문제점을 해결하고 보다 강한 항암활성 및 내성 극복의 중심 기전으로 FoxM1 저해 기전을 발견하여 내성 문제를 극복할 수 있음을 확인하여 기존 테모달과 같은 항암제를 대체하는 항암제인 동시에 기존 항암제와 병용투여함으로서 내성을 극복할 수 있음을 확인함으로서, 상기 조성물을 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 및 건강보조식품 등으로 유용함을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 하기 구조식(I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone, I), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물:
    Figure PCTKR2019005609-appb-I000001
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 암질환은 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암, 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암 또는 혈액암으로 구성된 군으로부터 선택된 암질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염과 기존 항암제와의 조합을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 기존 항암제는 테모달(Temozolomide, TMZ,) 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메토트랙세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신(Doxorubicin), 무스틴(Mustine), 비크리스틴(vincristine), 프로카바진(procarbazine), 프레드니솔론(prednisolone), 블레오마이신(bleomycin), 빈블라스틴(vinblastine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드 (etoposide), 시스플라틴(cisplatin), 에피루비신(Epirubicin), 시스풀라틴(cisplatin), 카페시타빈(capecitabine), 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)으로 구성된 군으로부터 선택된 항암제임을 특징으로 하는 약학조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 암질환는 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암, 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암 또는 혈액암으로 구성된 군으로부터 선택된 암질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
  6. 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 암질환는 다형성아교모세포종, 뇌암, 백혈병, 림프종, 골수종, 골수이형성증후군, 유방암, 두경부암, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 항문암, 간세포간암, 담관암, 담낭암, 췌장암, 폐암, 흉선암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 위장관 기질성 종양(GIST, 기스트), 원발부위불명암, 중피종, 흑색종, 신경내분비 종양, 피부암 또는 혈액암으로 구성된 군으로부터 선택된 암질환임을 특징으로 하는 약학조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 티백제, 침출차, 또는 건강 음료 형태인 건강기능식품.
  9. 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 암 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품.
  10. 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 항암 보조 치료제.
  11. 제1항의 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone, I), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염을 암 질환 환자에게 투여함을 포함하는 암 질환을 치료하기 위한 치료방법.
  12. 암 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 제1항의 구조식 (I)의 투실라곤 (tussilagone; 14-Acetoxy-7β-[3'-ethyl-cis-crotonoyloxy]-notonipetranone), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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