이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1-a: 팥꽃나무 추출물의 제조
팥꽃나무(Daphne genkwa)의 건조된 꽃 4.47 kg을 40 L 80% 에탄올에 72시간 동안 침지하고, 여과하여 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 액상성분을 감압하에서 농축시킨 다음, 435 g의 팥꽃나무 꽃 추출물을 제조하였다.
실시예 1-b
팥꽃나무(Daphne genkwa)의 줄기와 뿌리 4.47 kg을 세절한 다음, 12 L 80% 에탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 고형분과 1차 액상성분을 분리하였다. 상기 분리된 고형분을 다시 12 L 80% 에탄올에 4시간 동안 침지하고, 여과하여 2차 액상성분을 수득하였다. 상기 수득한 1차 액상성분과 2차 액상성분을 혼합하고, 상기 혼합물을 감압하에서 농축시킨 다음, 잔사를 동결건조하여 255.1 g의 팥꽃나무 추출물을 제조하였다.
실시예 2: 팥꽃나무 추출물로부터 다양한 용매에 의한 활성성분의 분리
상기 실시예 1-a에서 수득한 팥꽃나무 꽃 추출물을 2 L의 증류수와 2 L의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 각각 순차적으로 용매 분획하였다. 이중 클로로포름층을 감압농축하여 클로로포름 분획물 (17.6 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 클로로포름과 메탄올 구배(gradient) 혼합용매(100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1)로 용리시켜 총 3개의 분획 (Fr. C1, C2, C3)을 얻었다. 이중 Fr. C2 (4.5 g)을 메탄올과 물 구배(gradient) 혼합용매(60:40, 80:20, 100:0)조건으로 역상 컬럼 크로마토그래피를 (ODS silica gel chromatography)를 실시하여 5개의 소 분획물(sub-fraction) (Fr. C21, C22, C23, C24, C25)을 얻었다. Fr. C23 (300 mg)을 다시 클로로포름과 아세톤의 구배 혼합용매(99:1 - 95:5)조건으로 실리카겔(40-63 μm; 4 g flash column) MPLC를 실시하여 3개의 소 분획물(sub-fraction) (Fr. C231, C232, C233)를 얻었다. Fr. C233 (140 mg)을 최종적으로 유속 5 mL/분의 55% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 yuanhuafine (25.5 mg, 화학식 1의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 1] yuanhuafine
[α]20
D +29.3 (c 0.5, CHCl3);
ESI-MS, m/z 573.9 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.68 (dd, J = 7.3, 1.8, 2H, H-3', H-7'), 7.57 (s, 1H, H-1'), 7.41 - 7.37 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.08 (br, 1H, H-12), 5.05 (s, 1H, H-16a), 5.02 (d, J = 2.4, 1H, H-16b), 4.98 (br, 1H, H-14), 4.14 (s, 1H, H-5), 4.05 (d, J = 12.3, 1H, H-20a), 3.96 (m, 1H, H-10), 3.65 (dd, J = 7.3, 4.9, 1H, H-20b), 3.59 (s, 1H, H-8), 2.54 (q, J = 7.3, 1H, H-11), 2.00 (s, 3H, H-2''), 1.86 (s, 3H, H-17), 1.76 (d, J = 1.1, 3H, H-19), 1.32 (d, J = 7.3, 3H, H-18);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 209.8 (C-3), 171.6 (C-1''), 160.0 (C-1), 145.0 (C-15), 138.3 (C-2), 137.2 (C-2'), 130.5 (C-5'), 128.9 (C-4', C-6'), 127.2 (C-3', C-7'), 119.1 (C-1'), 113.9 (C-16), 85.4 (C-13), 82.1 (C-14), 80.3 (C-9), 79.8 (C-12), 74.5 (C-4), 71.3 (C-5), 65.1 (C-20), 64.7 (C-7), 63.2 (C-6), 48.9 (C-10), 45.1 (C-11), 36.6 (C-8), 21.0 (C-2''), 19.1 (C-18), 18.7 (C-17), 10.0 (C-19).
Fr. C24 (210 mg)를 다시 클로로포름과 메탄올 (1:1) 혼합용매로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 최종적으로 유속 5 mL/분의 65% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 genkwadaphnine (25.0 mg, 화학식 2의 화합물) 을 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 2] genkwadaphnine
[α]20
D +56.7 (c 0.1, CHCl3);
ESI-MS, m/z 625.5 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz); δH 7.98 (d, J = 7.5, 2H, H-3'', H-7''), 7.72 (m, 2H, H-3', H-7'), 7.61 (m, 1H, H-5''), 7.59 (s, 1H, H-1), 7.48 (t, J = 7.7, 2H, H-4'', H-6''), 7.40 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.26 (br, 1H, H-12), 5.21 (d, J = 2.4, 1H, H-14), 5.13 (s, 1H, H-16a), 5.02 (s, 1H, H-16b), 4.13 (s, 1H, H-5), 4.06 (d, J = 12.3, 1H, H-20a), 3.99 (m, 1H, H-10), 3.76 (d, J = 2.3, 1H, H-8), 3.68 (s, 1H, H-7), 3.66 (d, J = 12.5, 1H, H-20b), 2.69 (q, J = 7.3, 1H, H-11), 1.90 (s, 3H, H-17), 1.75 (s, 3H, H-19), 1.42 (d, J = 7.3, 3H, H-18);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 209.8 (C-3), 166.9 (C-1''), 160.0 (C-1), 144.9 (C-15), 138.2 (C-2), 137.2 (C-2'), 134.5 (C-5''), 131.1 (C-2''), 130.7 (C-3'', C-7''), 130.5 (C-5'), 129.7 (C-4'', C-6''), 128.9 (C-4', C-6'), 127.2 (C-3', C-7'), 119.1 (C-1'), 114.1 (C-16), 85.7 (C-13), 82.0 (C-14), 80.4 (C-9), 80.2 (C-12), 74.4 (C-4), 71.4 (C-5), 65.2 (C-20), 64.8 (C-7), 63.2 (C-6), 49.9 (C-10), 45.3 (C-11), 37.0 (C-8), 19.1 (C-17), 18.9 (C-18), 10.0 (C-19).
Fr. C25 (130 mg)를 다시 클로로포름과 메탄올 (1:1) 혼합용매로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 최종적으로 유속 5 mL/분의 70% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 genkwanine H (4.0 mg, 화학식 3의 화합물) 및 genkwanine M (4.0 mg, 화학식 4의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 3] genkwanine H
[α]20
D +46.2 (c 1.5, CHCl3);
ESI-MS, m/z 631.6 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 8.09 (d, J = 7.4, 2H, H-3'', H-7''), 7.67 (d, J = 9.5, 2H, H-3', H-7'), 7.60 (t, J = 7.4, 1H, H-5''), 7.49 (t, J = 7.6, 2H, H-4'', H-6''), 7.36 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.07 (s, 1H, H-16a), 4.91 (s, 1H, H-16b), 4.78 (d, J = 11.0, 1H, H-20a), 4.62 (d, J = 2.5, 1H, H-14), 4.61 (s, 1H, H-7), 4.51 (d, J = 11.1, 1H, H-20b), 4.16 (d, J = 4.1, 1H, H-2), 3.41 (s, 1H, H-5), 2.74 (m, 2H, H-10, H-11), 2.67 (d, J = 2.3, 1H, H-8), 2.34 (dd, J = 14.1, 8.0, 1H, H-12a), 1.84 (s, 3H, H-17), 1.81 - 1.65 (m, 4H, H-1, H-2, H-12b), 1.31 (d, J = 6.9, 3H, H-18), 1.06 (d, J = 6.0, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 176 Hz): δC 168.4 (C-1''), 148.3 (C-15), 137.9 (C-2'), 134.4 (C-5''), 131.8 (C-2''), 130.8 (C-3'', C-7''), 130.5 (C-5'), 129.7 (C-3', C-7'), 129.1 (C-4'', C-6''), 127.2 (C-4', C-6'), 118.6 (C-1'), 111.5 (C-16), 86.9 (C-13), 86.6 (C-14), 85.6 (C-9), 82.7 (C-4), 78.9 (C-3), 77.6 (C-6), 77.2 (C-7), 74.8 (C-5), 68.9 (C-20), 52.9 (C-10), 38.4 (C-8), 37.5 (C-12), 37.4 (C-2), 36.5 (C-11), 36.1 (C-1), 21.5 (C-18), 19.6 (C-17), 13.8 (C-19).
[화학식 4] genkwanine M
[α]20
D -8.4 (c 0.05, MeOH);
ESI-MS, m/z 613.5 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 8.07 (d, J = 7.3, 2H, H-3'', H-7''), 7.69 (d, J = 9.5, 2H, H-3', H-7'), 7.61 (t, J = 7.4, 1H, H-5''), 7.49 (t, J = 7.7, 2H, H-4'', H-6''), 7.35 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.07 (s, 1H, H-16a), 5.06 (d, J = 12.0, 1H, H-20a), 4.91 (s, 1H, H-16b), 4.63 (d, J = 2.6, 1H, H-14), 4.05 (d, J = 11.8, 1H, H-20b), 3.83 (s, 1H, H-3), 3.78 (s, 1H, H-5), 3.53 (s, 1H, H-7), 3.18 (d, J = 2.6, 1H, H-8), 2.67 (t, J = 9.0, 1H, H-10), 2.48 (m, 1H, H-11), 2.31 (dd, J = 14.1, 8.0, 1H, H-12a), 1.84 (s, 3H, H-17), 1.79 - 1.55 (m, 4H, H-1, H-2, H-12b), 1.27 (d, J = 6.8, 3H, H-18), 1.04 (d, J = 5.2, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 176 Hz): δC 168.0 (C-1''), 148.5 (C-15), 138.2 (C-2'), 134.4 (C-5''), 131.6 (C-2''), 130.8 (C-3'', C-7''), 130.3 (C-5'), 129.74 (C-4'', C-6''), 128.9 (C-3', C-7'), 127.4 (C-4', C-6'), 118.8 (C-1'), 111.4 (C-16), 86.1 (C-13), 84.0 (C-14), 82.2 (C-4), 81.1 (C-9), 78.8 (C-3), 73.4 (C-5), 69.3 (C-20), 65.8 (C-7), 62.0 (C-6), 50.3 (C-10), 38.4 (C-2), 38.0 (C-8), 37.2 (C-12), 36.6 (C-11), 36.1 (C-1), 21.6 (C-18), 19.6 (C-17), 13.7 (C-19).
Fr. C3 (4.0 g)을 메탄올과 물 구배(gradient) 혼합용매(60:40, 80:20, 100:0)조건으로 역상 컬럼 크로마토그래피 (ODS silica gel chromatography)를 실시하여 4개의 소 분획물(sub-fraction) (Fr. C31, C32, C33, C34)을 얻었다. Fr. C34 (1.06 g)를 메탄올을 용출용매로 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 3개의 소 분획물(sub-fraction) (Fr. C341, C342, C343)를 얻었다. Fr. C341 (120 mg), C342 (180 mg), C343 (119 mg)을 최종적으로 유속 4.5 mL/분의 50% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 각각 수행하여, Fr. C341으로부터 genkwanin K (9.6 mg, 화학식 5의 화합물)를 얻었고, Fr. C342로부터 yuanhuapine (79.5 mg, 화학식 6의 화합물)을 얻었고, Fr. C343으로부터 genkwanin A (4.7 mg, 화학식 7의 화합물), orthobenzoate 2 (85.6 mg, 화학식 8의 화합물), 1, 2α-dihydrodaphnetoxin (2.9 mg, 화학식 9의 화합물) 및 genkwanin I (2.4 mg, 화학식 10의 화합물)를 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 5] genkwanin K
[α]20
D +38.5 (c 0.1, CHCl3);
ESI-MS, m/z 627.6 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.98 (d, J = 7.5, 2H, H-3', H-7'), 7.90 (d, J = 7.5, 2H, H-3'', H-7''), 7.57 (m, 2H, H-5', H-5''), 7.44 (d, J = 7.7, 2H, H-4'', H-6''), 7.42 (d, J = 7.6, 2H, H-4', H-6'), 5.72 (d, J = 6.2, 1H, H-14), 5.06 (s, 1H, H-16a), 4.84 (s, 1H, H-16b), 4.62 (d, J = 13.4, 1H, H-20a), 4.42 (d, J = 3.0, 1H, H-3), 4.24 (d, J = 5.15, 1H, H-20b), 4.19, (d, J = 2.4, H-7), 3.33 (s, 1H, H-5), 3.15 (d, J = 6.2, 1H, H-8), 2.34 (m, 2H, H-10, H-11), 2.01 (m, 3H, H-2, H-1a, H-12a), 1.81 (s, 3H, H-17), 1.60 (m, 2H, H-1b, H-12b), 1.24 (d, J = 7.1, 3H, H-18), 1.08 (d, J = 6.5, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CDCl3, 101 Hz): δC 168.3 (C-1''), 166.7 (C-1'), 148.1 (C-15), 133.6 (C-5''), 133.5 (C-5''), 130.2 (C-3'', C-7''), 130.1 (C-3', C-7'), 129.9 (C-2''), 129.4 (C-2'), 128.7 (C-4'', C-6''), 128.6 (C-4', C-6'), 111.6 (C-16), 83.8 (C-4), 77.9 (C-9), 77.4 (C-6), 77.3 (C-14), 76.0 (C-7), 75.5 (C-3), 74.5 (C-13), 73.2 (C-5), 67.4 (C-20), 54.6 (C-10), 40.6 (C-8), 37.9 (C-12), 36.6 (C-2), 34.9 (C-1), 34.4 (C-11), 19.5 (C-18), 19.0 (C-17), 13.5 (C-19).
[화학식 6] yuanhuapine
[α]20
D +28.5 (c 0.05, CHCl3);
ESI-MS, m/z 565.5 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.67 (m, 2H, H-3', H-7'), 7.37 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.07 (s, 1H, H-16a), 5.07 (d, J = 2.9, 1H, H-12), 5.04 (s, 1H, H-16b), 4.95 (d, J = 2.7, 1H, H-14), 4.02 (s, 1H, H-5), 4.02 (d, J = 12.1, 1H, H-20a), 3.61 (d, J = 2.9, 1H, H-8), 3.60 (d, J = 10.6, 1H, H-20b), 3.54 (s, 1H, H-7), 3.18 (dd, J = 13.3, 5.8, 1H, H-10), 2.47 (q, J = 6.9, 1H, H-11), 2.38 (dt, J = 13.3, 6.8, 1H, H-1a), 2.25 (dt, J = 13.0, 6.6, 1H, H-1b), 2.01 (s, 3H, H-2''), 1.86 (s, 3H, H-17), 1.46 (d, J = 13.1, 1H, H-2), 1.37 (d, J = 7.0, 3H, H-18), 1.07 (d, J = 6.5, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 218.9 (C-3), 171.6 (C-1''), 145.0 (C-15), 137.4 (C-2'), 130.4 (C-5'), 128.8 (C-4', C-6'), 127.1 (C-3', C-5'), 119.3 (C-1'), 113.7 (C-16), 84.8 (C-13), 82.3 (C-14), 80.6 (C-9), 79.2 (C-12), 77.0 (C-4), 70.5 (C-5), 65.3 (C-20), 64.6 (C-7), 63.3 (C-6), 44.9 (C-11), 44.8 (C-10), 43.7 (C-1), 36.8 (C-8), 34.5 (C-2), 21.1 (C-2''), 19.1 (C-18), 19.0 (C-17), 12.8 (C-19).
[화학식 7] genkwanin A
[α]20
D +47.7 (c 0.1, CHCl3);
ESI-MS, m/z 505.6 [M+H]+ and m/z 527.4 [M+Na]+;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.66 (dd, J = 6.6, 3.0, 2H, H-3', H-7'), 7.38 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.07 (d, J = 6.5, 1H, H-16a), 4.91 (s, 1H, H-16b), 4.60 (d, J = 2.5, 1H, H-14), 4.42 (s, 1H, H-7), 4.13 (d, J = 4.6, 1H, H-3), 3.82 (q, J = 11.0, 2H, H-20), 3.38 (s, 1H, H-5), 2.71 (m, 2H, H-10, H-11), 2.62 (d, J = 2.4, 1H, H-8), 2.32 (dd, J = 14.1, 8.0, 1H, H-12a), 1.87 (m, 2H, H-1a, H-2), 1.83 (s, 3H, H-17), 1.69 (m, 1H, H-1b), 1.62 (m, 2H, H-12b), 1.30 (d, J = 6.9, 3H, H-18), 1.05 (d, J = 6.2, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 148.3 (C-15), 137.9 (C-15), 130.6 (C-5'), 129.1 (C-4', C-6'), 127.3 (C-3', C-5'), 118.6 (C-1'), 111.5 (C-16), 86.8 (C-13), 86.5 (C-14), 85.4 (C-9), 82.8 (C-4), 78.5 (C-7), 78.3 (C-6), 77.5 (C-3), 75.0 (C-5), 67.6 (C-20), 52.9 (C-10), 38.5 (C-2), 37.5 (C-8), 37.4 (C-12), 36.5 (C-11), 36.0 (C-1), 21.5 (C-17), 19.8 (C-18), 13.8 (C-19).
[화학식 8] orthobenzoate 2
[α]20
D -16.6 (c 0.05, MeOH);
ESI-MS, m/z 509.2 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.69 (dd, J = 6.6, 2.9, 2H, H-3', H-7'), 7.35 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.06 (s, 1H, H-16a), 4.90 (s, 1H, H-16b), 4.56 (d, J = 2.6, 1H, H-14), 4.02 (d, J = 12.2, 1H, H-20a), 3.76 (d, J = 2.6, 1H, H-3), 3.70 (s, 1H, H-5), 3.59 (d, J = 12.3, 1H, H-20b), 3.42 (m, 1H, H-7), 3.07 (d, J = 2.6, 1H, H-8), 2.67 (dd, J = 12.6, 5.9, 1H, H-10), 2.47 (p, J = 6.9, 1H, H-11), 2.28 (dd, J = 13.9, 7.9, 1H, H-12a), 1.82 (s, 3H, H-17), 1.69 (d, J = 14.0, 1H, H-1a), 1.64 (dd, J = 9.5, 4.8, 1H, H-2), 1.58 (m, 2H, H-1b, H-12b), 1.27 (d, J = 6.8, 3H, H-18), 1.03 (d, J = 5.3, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 148.3 (C-15), 138.1 (C-2'), 130.1 (C-5'), 128.7 (C-4', C-6'), 127.2 (C-3', C-7'), 118.5 (C-1'), 111.2 (C-16), 85.8 (C-13), 84.0 (C-14), 82.1 (C-9), 81.0 (C-2), 78.6 (C-4), 73.7 (C-5), 65.7 (C-20), 64.9 (C-7), 63.2 (C-6), 50.0 (C-10), 38.2 (C-2), 37.8 (C-8), 37.0 (C-12), 36.5 (C-11), 35.9 (C-1), 21.4 (C-17), 19.5 (C-18), 13.6 (C-19).
[화학식 9] 1, 2α-dihydrodaphnetoxin
[α]20
D +6.2 (c 0.001, MeOH);
ESI-MS, m/z 507.3 [M+Na]+ ;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.72 (m, 2H, H-3', H-7'), 7.36 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.07 (s, 1H, H-16a), 4.91 (s, 1H, H-16b), 4.60 (d, J = 2.8, 1H, H-14), 4.01 (s, 1H, H-5), 3.99 (d, J = 12.2, 1H, H-20a), 3.57 (d, J = 12.2, 1H, H-20b), 3.44 (s, 1H, H-7), 3.16 (dd, J = 13.3, 5.8, 1H, H-10), 3.01 (d, J = 2.7, 1H, H-8), 2.55 (m, 1H, H-11), 2.38 (m, 1H, H-12a), 2.29 (m, 2H, H-1), 1.83 (s, 3H, H-17), 1.73 (d, J = 14.0, 1H, H-2), 1.53 (m, 1H, H-12b), 1.30 (d, J = 6.8, 3H, H-18), 1.08 (d, J = 6.6, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 219.3 (C-3), 148.3 (C-15), 138.1 (C-2'), 130.4 (C-5'), 128.9 (C-4', C-6'), 127.4 (C-3', C-5'), 118.8 (C-1'), 111.5 (C-16), 86.0 (C-13), 84.1 (C-14), 82.0 (C-9), 77.2 (C-4), 70.9 (C-5), 65.5 (C-20), 64.9 (C-7), 63.3 (C-6), 45.8 (C-10), 43.9 (C-8), 37.9 (C-1), 37.2 (C-2), 36.7 (C-12), 34.7 (C-11), 21.6 (C-17), 19.6 (C-18), 12.9 (C-19).
[화학식 10] genkwanin I
[α]20
D -22.8 (c 0.005, MeOH);
ESI-MS, m/z 513.3 [M+H]+ and m/z 535.3 [M+Na]+;
1H NMR values in ppm (CD3OD, 400 MHz): δH 7.69 (dd, J = 7.5, 1.9, 2H, H-3', H-7'), 7.36 (m, 3H, H-4', H-5', H-6'), 5.09 (s, 1H, H-16a), 4.93 (s, 1H, H-16b), 4.72 (d, J = 4.5, 1H, H-3), 4.64 (d, J = 2.8, 1H, H-14), 4.10 (s, 1H, H-5), 4.09 (d, J = 12.3, 1H, H-20a), 3.53 (d, J = 12.4, 1H, H-20b), 3.49 (s, 1H, H-7), 2.93 (dd, J = 13.3, 6.1, 1H, H-10), 2.78 (d, J = 2.8, 1H, H-8), 2.35 (dd, J = 14.1, 7.8, 1H, H-12a), 2.12 (m, 1H, H-11), 2.04 (dd, J = 11.7, 6.0, 1H, H-1a), 1.95 (dd, J = 12.0, 6.6, 1H, H-2), 1.84 (s, 3H, H-17), 1.82 (d, J = 14.9, 1H, H-12b), 1.58 (d, J = 12.6, 1H, H-1b), 1.31 (d, J = 6.7, 3H, H-18), 1.13 (d, J = 6.7, 3H, H-19);
13C NMR values in ppm (CD3OD, 101 Hz): δC 156.7 (C-21), 148.0 (C-15), 137.8 (C-2'), 130.5 (C-5'), 128.9 (C-4', C-6'), 127.4 (C-3', C-7'), 118.8 (C-1'), 111.8 (C-16), 94.1 (C-4), 90.4 (C-3), 85.8 (C-13), 84.2 (C-14), 81.4 (C-9), 71.1 (C-5), 65.0 (C-20), 64.7 (C-7), 62.8 (C-6), 50.7 (C-10), 37.9 (C-2), 37.4 (C-11), 37.3 (C-12), 37.1 (C-8), 36.2 (C-1), 21.6 (C-18), 19.5 (C-17), 12.9 (C-19).
실시예 2-b: 팥꽃나무 추출물로부터 다양한 용매에 의한 활성성분의 분리
상기 실시예 1에서 수득한 팥꽃나무 추출물을 200 mL의 증류수와 헥산의 1:1 혼합용매에 녹여 분획하여 헥산층을 얻었다. 같은 방법으로 2번 더 실시하여 얻은 헥산층을 감압농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 이렇게 얻은 헥산 분획물(20 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 에틸 아세테이트의 구배(gradient) 혼합용매(10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2)로 용리시켜 총 3개의 분획 (Fr. I, II, III)을 얻었다.
이중 Fr. I (577 mg)을 75% 아세토니트릴 조건으로 역상 실리카겔 프렙 TLC(reverse phase silica gel prep TLC)를 실시하여 활성밴드를 얻었다. 이 활성밴드를 유속 3 mL/분의 83% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 15.2 분과 18.5분에서 각각 acutilonine F (14.0 mg, 화학식 11의 화합물)와 wikstroemia factor M1 (7.0 mg, 화학식 12의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 11]
[α]20
D -32.1(c 1.3, MeOH);
ESI-MS, m/z 635.6 [M+H]+, 657.7 [M+Na]+;
1HNMR(CD3OD,500MHz): δH, 7.70(2H, dd, J=7.35, 2.22Hz, H-3', H-7'), 7.37(1H, m, H-5'), 7.36(2H, m, H-4', H-6'), 7.35(1H, m, H-3''), 6.64(1H, dd, J=14.82, 10.75Hz, H-5''), 6.34(1H, dd, J=14.79, 11.40Hz, H-4''), 6.22(1H, dd, J=15.16, 10.69Hz, H-6''), 6.01(1H, m, H-7''), 6.00(1H, m, H-2''), 5.06(1H, brs, H-16a), 5.03(1H, d, J=4.52Hz, H-3), 4.90(1H, brs, H-16b), 4.56(1H, d, J=2.66Hz, H-14), 3.98(1H, d, J=12.19Hz, H-20a), 3.92(1H, s, H-5), 3.59(1H, d, J=12.20Hz, H-20b), 3.41(1H, brs, H-7), 3.07(1H, d, J=2.69Hz, H-8), 2.83(1H, dd, J=13.03, 5.32Hz, H-10), 2.59(1H, m, H-11), 2.29(2H, m, H-12), 2.15(2H, m, H-8''), 1.82(3H, s, H-17), 1.78(1H, m, H-2), 1.71(2H, m, H-1), 1.47(2H, m, H-9''), 1.31(3H, d, J=6.89Hz, H-18), 0.99(3H, d, J=5.77Hz, H-19), 0.94(3H, t, J=7.39Hz, H-10'');
13CNMR values in ppm (CD3OD, 126Hz): δC169.4(C, C-1''), 148.5(C, C-15), 147.2(CH, C-3''), 143.3(CH, C-5''), 141.9(CH, C-7''), 138.2(C, C-2'), 131.6(CH, C-6''), 130.3(CH, C-5'), 129.2(CH, C-4''), 128.9(CH, C-4', C-6'), 127.4(CH, C-3', C-7'), 120.7(CH, C-2''), 118.7(C, C-1'), 111.4(CH2, C-16), 86.1(C, C-13), 84.0(CH, C-14), 82.9(C, C-4), 82.3(CH, C-3), 82.1(C, C-9), 74.1(CH, C-5), 66.1(CH2, C-20), 65.1(CH, C-7), 63.0(C, C-6), 37.9(CH, C-8), 37.7(CH, C-2), 37.3(CH2, C-1), 37.1(CH2, C-12), 36.5(CH, C-11), 36.2(CH2, C-8''), 23.4(CH2, C-9''), 21.6(CH3, C-18), 19.6(CH3, C-17), 14.1(CH3, C-10''), 13.8(CH3, C-19).
[화학식 12]
[α]20
D +18.9 (c 1.0, MeOH);
ESI-MS, m/z 637.6 [M+H]+, 659.4 [M+Na]+, 635.2 [M-H]-;
1HNMR(CDCl3, 500MHz): δH7.75(2H, m, H-3', H-7'), 7.36(3H, m, H-4', H-5', H-6'), 7.34(1H, dd, J=15.4 and 10.2, H-3''), 6.21(1H, dd, J=14.8 and 10.4, H-4''), 5.90(1H, d, J=15.2, H-2''), 5.05(1H, brs, H-16a), 4.92(1H, brs, H-16b), 4.69(1H, d, J=5.19, H-3), 4.51(1H, d, J=2.76, H-14), 4.06(1H, s, H-5), 3.88(1H, d, J=12.2, H-20a), 3.77(1H, d, J=12.2, H-20b), 3.44(1H, s, H-7), 2.96(1H, d, J=2.8, H-8), 2.82(1H, dd, J=13.2, 5.5, H-10), 2.48(1H, m, H-11), 2.20(2H, overlapped, H-6''), 2.20(1H, overlapped, H-12a), 1.93(1H, m, H-1a), 1.83(3H, s, H-17), 1.78(1H, m, H-12b), 1.73(1H, m, H-1b), 1.71(1H, m, H-2), 1.45(2H, m, H-7''), 1.33(3H, d, J=6.9, H-18), 1.32(2H, overlapped, H-9''), 1.31(2H, overlapped, H-8''), 1.06(3H, d, J=6.5, H-19), 0.91(3H, t, J=6.9, H-10'');
13CNMR(CDCl3, 126Hz): δC169.6(C, C-1''), 147.4(CH, C-3''), 146.8(CH, C-5''), 146.7(C, C-15), 136.4(C, C-2'), 129.4(CH, C-5'), 128.4(CH, C-4''), 128.2(CH, C-4', C-6'), 126.3(CH, C-3', C-7'), 118.0(CH, C-2''), 117.6(C, C-1'), 111.4(CH2, C-16), 84.5(C, C-13), 82.7(CH, C-14), 82.2(CH, C-3), 81.7(C, C-4), 80.5(C, C-9), 75.0(CH, C-5), 66.3(CH2, C-20), 64.2(CH, C-7), 60.6(C, C-6), 48.9(CH, C-10), 36.6(CH, C-8), 36.4(CH, C-2), 36.3(CH2, C-12), 36.0(CH2, C-1), 35.5(CH, C-11), 33.3(CH2, C-6''), 31.6(CH2, C-8''), 28.5(CH2, C-7''), 22.7(CH2, C-9''), 21.1(CH3, C-18), 19.4(CH3, C-17), 14.2(CH3, C-10''), 13.3(CH3, C-19).
또한, Fr. III (400 mg)을 75% 아세토니트릴 조건으로 역상 실리카겔 프렙 TLC(reverse phase silica gel prep TLC)를 실시하여 활성밴드를 얻었다. 이 활성밴드를 CHCl3-MeOH(50:1) 조건으로 순상 실리카겔 프렙 TLC(silica gel prep TLC)를 실시하여 Rf 0.4 과 0.25 에서 두 개의 소 분획물(sub-fraction)로 각각 Fr.III-1 과 Fr.III-2 를 얻었다. Fr.III-1을 유속 3 mL/분의 65% 아세토니트릴 용출액으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 17.2 분과 23.4 분에서 각각 prostratin Q (2.1 mg, 화학식 13의 화합물) 와 yuanhuadine (4.0 mg, 화학식 14의 화합물)을 흰색 파우더 형태로 얻었다. Fr.III-2는 Fr.III-1과 같은 방법으로 ODS HPLC를 수행하여 머무름 시간(retention time) 19.0 분과 21.4 분에서 각각 yuanhuatine (4.4 mg, 화학식 15의 화합물) 과 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate (1.8 mg, 화학식 16의 화합물)를 흰색 파우더 형태로 얻었다. 상기 화합물의 구조는 아래와 같은 NMR, MS, [α]20
D 데이터를 근거로 구조를 동정하였다.
[화학식 13]
[α]20
D +14.1 (c 0.03, MeOH);
ESI-MS, m/z 579.5 [M+Na]+ ;
1HNM(CDCl3, 500MHz): δH7.60(1H, s, H-1), 7.24(1H, m, H-3''), 6.19(1H, m, H-4''), 6.15(1H, m, H-5''), 5.79(1H, d, J=15.41Hz, H-2''), 5.70(1H, d, J=4.71Hz, H-7), 5.47(1H, d, J=10.27Hz, H-12), 4.03(2H, q, J=13.04Hz, H-20), 3.26(2H, overlapped, H-8, H-10), 2.53(2H, m, H-5), 2.17(2H, overlapped, H-6''), 2.17(1H, overlapped, H-11), 2.11(3H, s, H-2'), 1.78(3H, s, H-19), 1.44(2H, m, H-7''), 1.32(2H, m, H-9''), 1.31(2H, m, H-8''), 1.27(3H, s, H-16), 1.22(3H, s, H-17), 1.10(1H, d, J=5.20Hz, H-14), 0.91(3H, d, J=6.93Hz, H-18), 0.90(3H, t, J=7.06Hz, H-10'');
13CNMR values in ppm(CDCl3, 126Hz):δC209.1(C, C-3), 174.1(C, C-1'), 167.3(C, C-1''), 161.0(CH, C-1), 145.8(CH, C-3''), 145.5(CH, C-5''), 140.7(C, C-6), 133.1(C, C-2), 129.5(CH, C-7), 128.5(CH, C-4''), 119.1(CH, C-2''), 78.4(C, C-9), 74.0(C, C-4), 68.2(CH2, C-20), 65.9(C, C-13), 56.4(CH, C-10), 43.4(CH, C-11), 39.3(CH, C-8), 38.9(CH2, C-5), 36.6(CH, C-14), 33.2(CH2, C-6''), 31.6(CH2, C-8''), 28.6(CH2, C-7''), 25.9(C, C-15), 24.0(CH3, C-17), 22.7(CH2, C-9''), 21.3(CH3, C-2'), 17.0(CH3, C-16), 14.2(CH3, C-10''), 10.3(CH3, C-19).
[화학식 14]
[α]20
D +7.5 (c 1.3, CH2Cl2);
ESI-MS, m/z 587.6 [M+H]+ and 609.5 [M+Na]+ ;
1H NMR (CDCl3, 500MHz): δH7.58(1H, s, H-1), 6.67(1H, dd, J=15.45, 10.66Hz, H-3'), 6.05(1H, dd ,J=15.14, 10.71Hz, H-4'), 5.86(1H, m, H-5'), 5.65(1H, d, J=15.46Hz, H-2'), 5.02(1H, brs, H-16a), 4.99(1H, brs, H-12), 4.96(1H, brs, H-16b), 4.76(1H, d, J=2.47Hz, H-14), 4.26(1H, brs, H-7), 3.94(1H, dd, J=12.34, 5.86Hz, H-20a), 3.82(1H, m, H-10), 3.80(1H, m, H-20b), 3.56(1H, s, H-5), 3.52(1H, d, J=2.45Hz, H-8), 2.38(1H, q, J=7.22Hz, H-11), 2.10(2H, q, J=7.20Hz, H-6'), 2.00(3H, s, H-2''), 1.84(3H, s, H-17), 1.80(3H, d, J=1.31Hz, H-19), 1.39(2H, dt, J=14.26, 7.28Hz, H-7'), 1.30(2H, m, H-9'), 1.27(2H, m, H-8'), 0.89(3H, t, J=6.93Hz, H-10');
13CNMR values in ppm(CDCl3, 126Hz): δC209.7(C, C-3), 169.9(C, C-1''), 160.6(CH, C-1), 143.3(C, C-15), 139.6(CH, C-5'), 137.1(C, C-2), 135.3(CH, C-3'), 128.8(CH, C-4'), 122.5(CH, C-2'), 117.2(C, C-1'), 113.5(CH2, C-16), 83.9(C, C-13), 80.7(CH, C-14), 78.5(CH, C-12), 78.3(C, C-9), 72.5(C, C-4), 72.2(CH, C-5), 65.3(CH2, C-20), 64.5(C-7), 60.7(C-6), 47.7(CH, C-10), 44.3(CH, C-11), 35.6(CH, C-8), 32.9(CH2, C-6'), 31.5(CH2, C-8'), 28.9(CH2, C-7'), 22.7(CH2, C-9'), 21.4(CH3, C-2''), 18.9(CH3, C-17), 18.5(CH3, C-18), 14.2(CH3, C-10'), 10.1(CH3, C-19).
[화학식 15]
[α]20
D +52.8 (c 0.5, MeOH);
ESI-MS, m/z 605.5 [M+H]+, 627.4 [M+Na]+, 603.3 [M-H]-;
1HNMR(CDCl3, 500MHz): δH7.94(2H, m, H-3'', H-7''), 7.75(2H, m, H-3', H-7'), 7.60(1H, t, J=7.4, H-5''), 7.48(2H, m, H-4'', H-6''), 7.40(3H, m, H-4', H-5', H-6'), 5.42(1H, brs, H-12), 5.07(1H, brs, H-16a), 5.03(1H, brs, H-16b), 4.99(1H, d, J=2.8, H-14), 4.10(1H, s, H-5), 3.90(1H, d, J=12.4, H-20a), 3.85(1H, d, J=12.3, H-20b), 3.69(1H, d, J=2.8, H-8), 3.67(1H, brs, H-7), 3.06(1H, dd, J=13.3 and 5.9, H-10), 2.59(1H, q, J=6.9, H-11), 2.40(1H, m, H-1a), 2.28(1H, m, H-2), 1.92(3H, s, H-17), 1.63(1H, m, H-1b), 1.51(3H, d, J=6.9, H-18), 1.12(3H, d, J=6.6, H-19);
13CNMR(CDCl3, 126Hz): δC220.4(C, C-3), 165.8(C, C-1''), 143.2(C, C-15), 135.7(C, C-2'), 133.5(CH, C-5''), 130.0(CH, C-5'), 129.8(C, C-2''), 129.7(CH, C-3'', C-7''), 128.9(CH, C-4'', C-6''), 128.3(CH, C-4', C-6'), 126.2(CH, C-3', C-7'), 118.4(C, C-1'), 113.8(CH2, C-16), 83.9(C, C-13), 81.4(CH, C-14), 79.3(C, C-9), 78.7(CH, C-12), 75.2(C, C-4), 71.5(CH, C-5), 65.3(CH2, C-20), 64.5(CH, C-7), 61.0(C, C-6), 44.3(CH, C-11), 44.2(CH, C-10), 43.1(CH, C-2), 36.3(CH, C-8), 33.6(CH2, C-1), 19.0(CH3, C-17, C-18), 12.6(CH3, C-19).
[화학식 16]
[α]20
D -15.1 (c 0.2, CHCl3);
ESI-MS, m/z 577.5 [M+Na]+, 553.4 [M-H]-;
1HNMR (CDCl3, 500MHz): δH7.61(1H, s, H-1), 7.28(1H, dd, J=15.3 and 11.22, H-3''), 6.54(1H, dd, J=14.9 and 10.7, H-5''), 6.23(1H, dd, J=14.8 and 11.4, H-4''), 6.15(1H, dd, J=15.1 and 10.8, H-6''), 5.95(1H, m, H-7''), 5.84(1H, d, J=15.3, H-2''), 5.70(1H, d, J=4.8, H-7), 5.47(1H, d, J=10.3, H-12), 4.05(1H, d, J=12.9, H-20a), 4.00(1H, d, J=12.9, H-20b), 3.26(1H, overlapped, H-10), 3.26(1H, overlapped, H-8), 2.52(2H, m, H-5), 2.17(1H, m, H-11), 2.13(2H, overlapped, H-8''), 2.11(3H, s, H-2'), 1.78(3H, d, J=1.5, H-19), 1.45(2H, dq, J=14.6 and 7.3, H-9''), 1.27(3H, s, H-16), 1.22(3H, s, H-17), 1.10(1H, d, J=5.1, H-14), 0.93(3H, t, J=7.3, H-10''), 0.91(3H, d, J=6.4, H-18);
13CNMR(CDCl3, 126Hz): δC209.2(C, C-3), 174.1(C, C-1'), 167.2(C, C-1''), 161.0(CH, C-1), 145.6(CH, C-3''), 141.8(CH, C-5''), 141.0(CH, C-7''), 140.7(C, C-6), 133.1(C, C-2), 130.2(CH, C-6''), 129.5(CH, C-7), 127.9(CH, C-4''), 119.9(CH, C-2''), 78.5(C, C-9), 76.9(CH, C-12), 74.0(C, C-4), 68.2(CH2, C-20), 65.9(C, C-13), 56.4(CH, C-10), 43.4(CH, C-11), 39.3(CH, C-8), 38.8(CH2, C-5), 36.6(CH, C-14), 35.5(CH2, C-8''), 26.0(C, C-15), 24.0(CH3, C-17), 22.4(CH2, C-9''), 21.3(CH3, C-2'), 17.0(CH3, C-16), 14.6(CH3, C-18), 13.9(CH3, C-10''), 10.3(CH3, C-19).
실시예 3: Nurr1 단백질 활성에 대한 화합물의 효과
상기 실시예 2와 같이 팥꽃나무 추출물에서 분리한 다이터펜계 화합물의 농도에 따른 Nurr1 단백질 활성도를 루시퍼라제 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, GLA4 유전자가 결합할 수 있는 염기서열(5'-CTCGGAGGACAGTACTCCG-3', 서열번호 1)이 8회 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼라제에 결합시킨 벡터를 합성한 후, Nurr1-LBD를 포함한 DNA와 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)를 가진 DNA 등 3종의 플라스미드 DNA를 BE(2)C 세포에 주입(transfection)하였다. 6시간 후, 상기 실시예 2에서 분리한 화합물 1 내지 10을 하기 표 1의 농도별로 처리하였다. 이렇게 처리한 세포를 20시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양한 후, 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 대조군으로는 0.1% DMSO를 사용하였고, 이때의 활성에 배수로 활성도의 증가를 나타내었으며, 양성대조군으로 Amodiaquine을 사용하였다.
분석 결과, 하기 표 2 및 도 1과 같이, 화학식 1 내지 10의 모든 화합물이 Nurr1을 활성화시켰다. 구체적으로, 모든 화학식 1 내지 10의 화합물은 1 μM의 농도로 처리하는 경우 Nurr1을 활성화시켰고, 특히 화학식 2의 화합물은 0.01 μM의 저농도에서도 Nurr1의 활성화 효과가 우수함을 확인하였다. 이를 통해, 팥꽃나무 꽃 추출물에서 분리된 화합물들이 Nurr1을 활성화시킴과 동시에, 화합물의 구조에 따라 활성이 상이할 수 있음을 알 수 있었다.
분석 결과, 하기 표 1과 같이, 화합물 13 및 14의 prostratin Q 및 yuanhuadine은 0.003 μM의 저농도에서도 Nurr1을 활성화시켰으며, 상기 화합물 13 및 14와 더불어 화합물 16의 12-O-n-deca-2,4,6-trienoyl-phorbol-(13)-acetate은 0.03 μM에서 유의적으로 Nurr1를 활성화함을 확인하였다. 또한, 화합물 11의 acutilonine F, 화합물 12의 wikstroemia factor M1 및 화합물 15의 yuanhuatine은 각각 1, 0.2 및 0.3 μM에서 유의적으로 Nurr1를 활성화시킴을 확인하였다. 이를 통해, 팥꽃나무 추출물에서 분리된 화합물들이 Nurr1을 활성화시킴과 동시에, 화합물의 구조에 따라 활성이 상이할 수 있음을 알 수 있었다.
농도(μM) |
양성대조군 |
화합물 11 |
화합물 12 |
화합물 13 |
화합물 14 |
화합물 15 |
화합물16 |
0.003 |
- |
- |
- |
1.23±0.09 |
1.03±0.15 |
- |
- |
0.01 |
- |
- |
- |
1.35±0.28 |
0.94±0.04 |
- |
- |
0.03 |
- |
1.28±0.18 |
1.4±0.18 |
*1.47±0.17 |
*1.63±0.18 |
1.17±0.22 |
*1.42±0.15 |
0.1 |
- |
1.16±0.16 |
**1.29±0.04 |
*1.42±0.14 |
**1.68±0.11 |
1.28±0.35 |
*1.68±0.43 |
0.3 |
- |
1.32±0.13 |
*1.33±0.06 |
*1.65±0.2 |
**1.62±0.11 |
**1.59±0.08 |
*1.82±0.51 |
1 |
0.8±0.03 |
*1.76±0.08 |
*1.62±0.21 |
**1.47±0.02 |
*1.67±0.32 |
*2.12±0.37 |
**1.53±0.07 |
5 |
1.1±0.15 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
10 |
**1.6±0.03 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
20 |
**2.7±0.37 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
(*P < 0.05, **P < 0.01 대조군 처리 대비)
실시예 4: 마이크로글리아 BV-2 세포에서 산화질소 생성 억제활성
마이크로글리아 세포(microglia cell)에서 염증반응에 의한 뇌신경세포의 사멸은 치매, 파킨슨 병과 같은 퇴행성 뇌질환의 주요한 원인중의 하나로 보고되어 있다(Sarkar S et al., Neurotoxicology, 44, 250-262 (2014); Bower JH et al., Neurology, 67, 494-496 (2006)). 따라서, 마이크로글리아에서 상기 실시예 2에서 분리한 화합물들을 대상으로 대표적인 염증인자인 산화 질소(nitric oxide, NO)의 생성억제 활성을 조사하였다. 구체적으로, 마이크로글리아 BV-2 세포를 96 웰 플레이트에 5 × 104 세포/웰로 넣고, 2일 배양한 다음, LPS (1 mg/mL)를 상기 실시예 2에서 분리한 화합물과 함께 24시간 배양하였다. 배양 상등액을 Griess 시약을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 아질산염(nitrite)를 정량함으로서 산화질소의 생성량을 조사하였다. 양성대조군으로는 Minocyline을 사용하였다.
조사 결과, 하기 표 3과 같이, 모든 화합물들이 낮은 농도에서 산화질소의 생성을 저해함을 확인하였다. 특히, 화합물 2의 genkwadaphnine은 0.06±0.02의 매우 낮은 농도에서 산화질소 생성의 저해 활성을 나타냄을 확인하였고 화합물 14의 yuanhuadine은 1.03 μM의 매우 낮은 농도에서 산화질소 생성의 저해 활성을 나타냄을 확인하였다.
|
양성대조군 |
화합물11 |
화합물12 |
화합물13 |
화합물14 |
화합물15 |
화합물16 |
IC50 (μM) |
29.9 |
3.49 |
2.3 |
1.8 |
1.03 |
3.73 |
1.78 |
실시예 5: 마이크로글리아 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인 생성 억제활성
마이크로글리아에서의 대표적인 염증인자인 IL-1b, IL-6 및 TNFa에 대한 화합물의 생성억제활성을 조사하였다. 마이크로글리아 BV-2 세포를 96 웰 플레이트에 1 × 105 세포/웰로 넣고, LPS (1 mg/mL)를 화합물과 함께 5시간 배양하였다. 각 웰에서 세포를 회수하여 웨스턴 블롯팅과 real-time PCR 을 실시하였다.
구체적으로, IL-1b 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅으로 조사하였다. 1차 항체로 rabbit anti-IL-1b [Cell Signaling (Danvers, MA, USA); 1:1000])를 사용하였고, control로 mouse anti-actin (Sigma 1:5000)을 사용하였다. 2차 항체로 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse 또는 anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) antibody (Amersham, Piscataway, NY, USA)를 사용하였고, enhanced-chemiluminescent substrate (Amersham)로 발색하여 관찰하였다.
또한, IL-1b, IL-6, TNF-a 의 mRNA 발현량을 Real-time quantatitive PCR 로 분석하였다. 모든 쥐의 사이토카인과 GAPDH의 프라이머는 Invitrogen에서 구입하였고, 사이토카인 mRNA 발현량을 GAPDH mRNA 발현량으로 정규화(normalized)하여 구하였다.
웨스턴 블롯팅 및 PCR 수행 결과, 도 1A 및 1B와 같이, 모든 화합물의 투여군에서 IL-1b의 발현량이 감소함을 확인하였다. 또한, PCR 수행 결과, 도 1C 및 1D와 같이, 모든 화합물의 투여군에서 IL-6 및 TNF-a의 발현량 역시 감소함을 확인하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.