CN112063590A

CN112063590A - 制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法及其所用的经改造的干细胞

Info

Publication number: CN112063590A
Application number: CN202011274614.0A
Authority: CN
Inventors: 李翔; 肖雄
Original assignee: Beijing Sima Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Sima Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开了制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法及其所用的经改造的干细胞。该方法包括将经改造的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞；所述经改造的干细胞为表达Nurr1或表达与所述Nurr1具有相同功能的蛋白质的离体干细胞。本发明将Nurr1基因导入人多能干细胞得到经改造的干细胞，用于诱导人多能干细胞向多巴胺能神经元亚型方向分化，最终获得多巴胺能神经前体细胞和多巴胺能神经元，和现有方法对比，能够显著增强诱导分化过程和获得多巴胺能神经元亚型细胞的效率。本发明可用于多巴胺能神经元退化和/或损伤所致疾病的治疗以及细胞技术应用、体外疾病模型的建立、药物的筛选和开发等。

Description

制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法及其所用的经改造的干细胞

技术领域

本发明涉及遗传工程与干细胞与再生医学领域中的制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法及其所用的经改造的干细胞。

背景技术

核受体相关因子1（nuclear receptor related factor 1，Nurr1）是一种转录因子,是核受体基因超家族孤儿受体亚家族的成员，转录因子Nurr1主要表达在大脑中脑区及嗅球区，作为基因转录调控蛋白而参与了中脑多巴胺能神经元的发育与存活，长时记忆，肝再生及炎症等多种生理和病理过程。

多能干细胞(Pluripotent Stem Cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。

人类干细胞具有在体外更新和增殖以及多向分化的潜能，可用于疾病发生发展机理的研究以及体外药物筛选，也为细胞替代性治疗人类重大疾病提供了新的可能。

由于人体中脑黑质区的多巴胺能神经元的退化和死亡导致的帕金森病，已批准上市的帕金森病药物十分有限、年销售额达20亿美元以上，但只能有限的改善疾病症状、且病人长期服药后会逐渐产生耐受、严重影响症状改善效果。体外制备的健康多巴胺能神经元，进行细胞替代性移植治疗，不仅能够显著改善疾病症状和运动功能，而且能够逆转病症的发生过程。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高效诱导干细胞（如人类多能干细胞）获得多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法。

本发明所提供的制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法包括将经改造的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞，所述经改造的干细胞为表达或可诱导表达Nurr1，或表达或可诱导表达与所述Nurr1具有相同功能的蛋白质的干细胞。

为了解决上述技术问题，本发明提供了经改造的干细胞（即基因异位表达的干细胞或重组干细胞）。

本发明所提供的经改造的干细胞为表达或可诱导表达Nurr1，或表达或可诱导表达与所述Nurr1具有相同功能的蛋白质的干细胞。

为了解决上述技术问题，本发明提供了上述经改造的干细胞的构建方法。

本发明所提供的经改造的干细胞的构建方法包括将外源Nurr1基因导入干细胞中，得到表达Nurr1的经改造的干细胞。

为了解决上述技术问题，本发明提供了A或B的应用：

A、所述经改造的干细胞在制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元中的应用；

B、所述经改造的干细胞在制备产生多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的产品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物。

本发明所述提供的用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物含有所述经改造的干细胞。

所述用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物还可含有能将干细胞诱导分化为神经元的物质，如神经基础培养基、神经营养因子、环腺苷单磷酸（cAMP）、TGFβ受体抑制剂、WNT/GSK3beta信号通路激活剂或抑制剂、FGF激活剂、SHH激活剂、糖原合成激酶抑制剂和/或BMP信号通路抑制剂和细胞因子等。所述能将干细胞诱导分化为神经元的物质中的这些物质可单独包装，也可混合在一起。所述用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物中，所述经改造的干细胞和所述能将干细胞诱导分化为神经元的物质可分别单独包装。

上述用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物中，所述多巴胺能神经元相关疾病可为多巴胺能神经元退化和/或损伤所致疾病。

为了解决上述技术问题，本发明提供了用于制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的组合物。

本发明所提供的用于制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的组合物含有调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞，所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

上述用于制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的组合物中，调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞可单独包装。

上述用于制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的组合物还含有能将干细胞诱导分化为神经元的物质，如神经基础培养基、神经营养因子、环腺苷单磷酸（cAMP）、TGFβ受体抑制剂、WNT/GSK3beta信号通路激活剂或抑制剂、FGF激活剂、SHH激活剂、糖原合成激酶抑制剂和/或BMP信号通路抑制剂和细胞因子等。所述能将干细胞诱导分化为神经元的物质中的这些物质可单独包装，也可混合在一起。

上述用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物和上述用于制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元的组合物中，所述神经营养因子可为胶质细胞源神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）和/或脑源性生长因子(BDNF)。BDNF的使用浓度可为0.5-100ng/ml、20-80ng/ml或40-60ng/ml。GDNF的使用浓度可为0.5-100ng/ml、20-80ng/ml或40-60ng/ml，所述细胞因子可为SHH（音猬因子）和/或FGF8（成纤维细胞生长因子8）。所述SHH的使用浓度可为10-1000ng/ml、200-800ng/ml、300-700ng/ml或300ng/ml。所述FGF8的使用浓度可为5-200ng/ml、30-180ng/ml或50-120ng/ml。

所述环腺苷单磷酸（cAMP）的使用浓度可为0.01-20µM、5-15µM或8-12µM。

所述TGFβ受体抑制剂包括但不限于（4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物）（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide，SB431542，S）；E-616452 [2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine]; A 83-01 [3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide]; SB 505124 [2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine];GW 788388 [4-[4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)-benzamide]; SB 525334 [6-[2-(1,1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline], 和dorsomorphine。SB431542的使用浓度可为2-10µM。

所述糖原合成激酶抑制剂可为下述四种物质中的至少一种：6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈（6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile，CHIR99021，C）；CHIR99021三盐酸盐（CHIR 99021trihydrochloride） 3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮（3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione ，SB216763）；GSK 3I抑制剂XV（GSK 3I inhibitor XV）；GSK-3 抑制剂 IX [((2Z, 3E)-6’-bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3’-biindolinylidene]-2’-one]；GSK 3 IX [6-Bromoindirubin-3'-oxime]; GSK-3β Inhibitor XII [3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol]；GSK-3 抑制剂 XVI [6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-pyrimidin-2-ylamino)ethyl-amino)-nicotinonitrile]；SB-415286 [3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1 H-pyrrole-2,5-dione]; and Bio [(2'Z,3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime]和（2’Z,3’E)-6-溴靛玉红-3’-丙酮肟（ (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime ，Bio-acetoxime）。CHIR99021的使用浓度可为0.2-0.8µM、0.2-0.5µM或0.5µM。

所述BMP信号通路抑制剂包括但不限于LDN193189（4-[6-(4-(哌嗪-1-基)苯基]吡唑并[1,5-A]嘧啶-3-基)喹啉）。LDN193189的使用浓度可为1-1000nM、200-800nM、300-700nM或100-300nM。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞在制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞在制备多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺能神经元产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化为外胚层细胞中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化为外胚层细胞产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为提高Nurr1基因表达的物质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化的产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为提高Nurr1基因表达的物质。

上文中，所述干细胞可为S1或S2：

S1、胚胎干细胞、围产期干细胞或成体干细胞，

S2、多能干细胞、诱导性多能干细胞、全能干细胞、专能干细胞或单能干细胞。

其中，所述S1是干细胞按照发育阶段进行的分类，所述S2是干细胞按照分化潜能进行的分类。

上文中，所述干细胞可为哺乳动物干细胞，如人干细胞。

上文中，所述Nurr1可为天然的Nurr1，如来源于哺乳动物的Nurr1，也可为非天然的Nurr1，如重组Nurr1等，所述重组Nurr1只要具有天然的Nurr1的功能即可。所述Nurr1可为下述A1）或A2）的蛋白质：

A1）氨基酸序列如SEQ ID No.2或4所示的蛋白质；

A2）与A1）的蛋白质的氨基酸序列具有80%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

上述80%以上同一性可为85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或以上的同一性。

上文中，所述产品可为试剂、试剂盒、药物和/或药剂。

上文中，所述调控Nurr1基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1）在所述Nurr1基因转录水平上进行的调控；2）在所述Nurr1基因转录后进行的调控（也就是对所述Nurr1基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控）；3）对所述基因的RNA转运进行的调控（也就是对所述Nurr1基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控）；4）对所述Nurr1基因的翻译进行的调控；5）对所述Nurr1基因的mRNA降解进行的调控；6）对所述Nurr1基因的翻译后的调控（也就是对所述Nurr1基因翻译的蛋白质的活性进行调控）。

上文中，所述提高Nurr1基因表达的物质可为下述任一种物质：

B1）编码所述Nurr1的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。

所述提高Nurr1基因表达的物质中，所述重组载体可为慢病毒（Lentiviral）。

所述提高Nurr1基因表达的物质中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述核酸分子具体可为Nurr1基因。

上述提高Nurr1基因表达的物质中，B2）所述表达盒（Nurr1基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达Nurr1基因的DNA，该DNA不但可包括启动Nurr1基因转录的启动子，还可包括终止Nurr1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上文中，所述Nurr1基因可为天然的Nurr1基因，如来源于哺乳动物的Nurr1基因，也可为非天然的Nurr1基因，如重组Nurr1基因等。所述Nurr1基因可为编码链的编码序列是序列表中序列1的第5145位-6941位核苷酸所示的DNA分子，也可为编码链的编码序列是序列表中序列3的第211位-2040位核苷酸所示的DNA分子。

上文中，所述多能干细胞可为胚胎干细胞和/或诱导性多能干细胞。

上文中，所述多能干细胞可为哺乳动物的多能干细胞，如人多能干细胞。

上文中，所述应用的直接目的为非疾病诊断和/或治疗或细胞技术应用或疾病模型或药物筛选和开发目的。

由上述改造的干细胞产生的多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞也属于本发明的保护范围。

本发明将Nurr1基因导入人多能干细胞得到过表达Nurr1的经改造的干细胞，用于诱导人多能干细胞向多巴胺能神经元这种神经元亚型方向分化，最终获得多巴胺能神经前体细胞和多巴胺能神经元，和现有方法对比，能够显著增强诱导分化过程和获得多巴胺能神经元亚型细胞的效率。

本发明提供了快速和高效诱导人类多能干细胞获得多巴胺能神经前体细胞与多巴胺能神经元的方法。本发明采用增强或提高Nurr1基因表达的物质快速诱导人类干细胞高效率的获得多巴胺能神经前体细胞与多巴胺能神经元。本发明可用于多巴胺能神经元退化和/或损伤所致疾病的治疗。

附图说明

图1为改造前的人多能干细胞不表达Nurr1，转入Nurr1基因的经改造的干细胞表达Nurr1。左图为转入Nurr1基因的经改造的干细胞，右图为改造前的人多能干细胞。

图2为转入Nurr1基因的经改造的干细胞表达多能干细胞属性的标志性基因OCT4基因。

图3为转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的鉴定。上一行的照片从左至右依次为未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的共表达OTX2和FOXA2并表达定位在细胞核（通道叠加图）、多巴胺能神经前体细胞的代表性标志物OTX2抗体免疫荧光染色照片、多巴胺能神经前体细胞的代表性标志物FOXA2抗体免疫荧光染色照片、DAPI染色照片，下一行的照片从左至右依次为转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的共表达OTX2和FOXA2并表达定位在细胞核（通道叠加图）、多巴胺能神经前体细胞的代表性标志物OTX2抗体免疫荧光染色照片、多巴胺能神经前体细胞的代表性标志物FOXA2抗体免疫荧光染色照片、DAPI染色照片。

图4为转入Nurr1基因的经改造的干细胞的多巴胺能神经前体细胞诱导效率（+NURR1）和未进行基因编辑的改造前的人多能干细胞（受体细胞）的多巴胺能神经前体细胞诱导效率（-NURR1）比较。左图为OTX2阳性的多巴胺能神经前体细胞诱导效率，右图为FOXA2阳性的多巴胺能神经前体细胞诱导效率。检验方法为Student t检验，数据形式为平均值±标准差，*P<0.05；**P<0.01。

图5为转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞（右图）和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞（左图）在神经元诱导分化培养基诱导培养7天的多巴胺能神经元的代表性标志物TH抗体免疫荧光染色照片。

图6为转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率（+NURR1）和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率（-NURR1）比较。检验方法为Student t检验，数据形式为平均值±标准差，*P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的改造前的人多能干细胞为人胚胎干细胞系H9，为美国WiCellResearch Institute产品，货号为WA09。

下述实施例中的E8培养基为ThermoFisher公司的产品。下述实施例中的Nurr1基因表达载体为Addgene 公司货号为#35000的质粒，其含有编码链的编码序列是序列表中序列1的第5145位-6941位核苷酸所示的Nurr1基因，该Nurr1基因表达载体表达氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质Nurr1。

下述实施例中的多巴胺能神经前体细胞诱导培养基一为DF12+N2（1%）（神经基础培养基）+SB431542（2µM）+LDN193189（100nM）+CHIR99021（0.5µM）+SHH（300ng/ml）。多巴胺能神经前体细胞诱导培养基一由DF12+N2（1%）（神经基础培养基）、N2 Supplement（神经细胞培养血清替代品，以下简称N2）、SB431542、LDN193189、CHIR99021和SHH组成；多巴胺能神经前体细胞诱导培养基一中，N2的含量为1%（体积百分含量），SB431542的含量为2µM，LDN193189的含量为100nM，CHIR99021的含量为0.5µM，SHH的含量为300ng/ml。

多巴胺能神经前体细胞诱导培养基二为DF12+N2（1%）（神经基础培养基）+CHIR99021（0.5µM）+SHH（300ng/ml）+FGF8（100ng/ml）。多巴胺能神经前体细胞诱导培养基二中，N2的含量为1%（体积百分含量），CHIR99021的含量为0.5µM，SHH的含量为300ng/ml，FGF8的含量为100ng/ml。

多巴胺能神经前体细胞诱导培养基三为DF12+N2（1%）（神经基础培养基）+N2（1%）+SHH（300ng/ml）+FGF8（100ng/ml）。多巴胺能神经前体细胞诱导培养基三中，N2的含量为1%（体积百分含量），SHH的含量为300ng/ml，FGF8的含量为100ng/ml。

下述实施例中的神经元诱导分化培养基为DF12+N2（1%）（神经基础培养基）+BDNF（50ng/ml）+GDNF（50ng/ml）+cAMP（10µM）。神经元诱导分化培养基由DMEM/DF12、N2、BDNF、GDNF和cAMP组成；神经元诱导分化培养基中，N2的含量为1%（体积百分含量），BDNF的含量为50ng/ml，GDNF的含量为50ng/ml，cAMP的含量为10µM。

下述实施例中的DMEM/DF12为ThermoFisher公司的产品，N2 Supplement（神经细胞培养血清替代品）为ThermoFisher公司的产品，SB431542为Tocris Total公司的产品，LDN193189为Tocris Total公司的产品，CHIR99021为Tocris Total公司的产品，SHH为Peprotech公司的产品，BDNF为Peprotech公司的产品，GDNF为Peprotech公司的产品，cAMP为Tocris Total公司的产品。

实施例1、制备表达Nurr1的经改造的干细胞

1. 在人类多能干细胞上过表达Nurr1基因并鉴定证明在人多能干细胞过表达成功

1.1人类多能干细胞培养

将改造前的人多能干细胞（传代细胞数为20-60代）接种于E8培养基中，于37℃，5% CO₂的恒温培养箱中培养，汇合为60%-80%时，用Dispase（1mg/ml, Gibco）消化进行铺被到6孔培养板上，每次传代密度为1:6，约3-4天长起来至汇合密度时进行传代。

1.2在人多能干细胞上过表达Nurr1基因制备表达Nurr1的经改造的干细胞

293T细胞于培养基高糖DMEM+10%胎牛血清中培养，24 hr后，细胞完全贴壁，准备转染。准备2M的CaCl₂溶液，2×HBS溶液及实验室用水。将Nurr1基因表达载体5ug及包装质粒加入50ul CaCl₂溶液中，用水补足500ul，滴加入500ul 2×HBS溶液中，将1毫升混合物加入293T细胞，摇匀。12小时后换液，加入新鲜培养基10 ml。转染后48 小时后收上清液（含有表达Nurr1基因的重组慢病毒）于15 ml离心管内，将改造前的人多能干细胞传至6孔板，加polybrene （聚凝胺），加入500ul收集的上清液，用培养液（E8培养基）补足至1ml得到转染体系，转染体系中polybrene的含量为10 ug/ml，感染12小时后换为E8培养基继续在37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中培养得到转入Nurr1基因的经改造的干细胞，取出转入Nurr1基因的经改造的干细胞，PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化（0.2%Triton + PBS）10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液（PBST+3%驴血清）室温30分钟后加入Nurr1一抗（1:100; Santa Cruz），4度过夜后，PBS清洗3次，加入二抗（1:500；Jackson Lab），37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。同时以改造前的人多能干细胞作为对照。结果表明改造前的人多能干细胞不表达Nurr1，转入Nurr1基因的经改造的干细胞表达Nurr1。在人多能干细胞过表达Nurr1基因成功，能够检测到强表达的Nurr1蛋白并且定位在核里，Nurr1是核转录因子，证明过表达成功（图1）。

2. 鉴定证明在人多能干细胞过表达基因成功后不影响干细胞属性

将改造前的人多能干细胞和1.2的转入Nurr1基因的经改造的干细胞分别用PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化（0.2%Triton + PBS）10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液（PBST+3%驴血清）室温30分钟后加入OCT4一抗（1:500;Abcam），4度过夜后，PBS清洗3次，加入二抗（1:500；Jackson Lab），37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。

结果表明转入Nurr1基因的经改造的干细胞维持了干性，强表达多能干细胞的标志物OCT4（图2）。证明转入Nurr1基因的经改造的干细胞表达多能干细胞属性的标志性OCT4。

3. 将未改造的人类多能干细胞及改造后的人类多能干细胞向多巴胺能神经前体细胞分化并进行鉴定，对比诱导效率

3.1转入Nurr1基因的经改造的干细胞诱导分化为多巴胺能神经前体细胞

将1.2的转入Nurr1基因的经改造的干细胞依照以下步骤进行诱导分化：将1.2的转入Nurr1基因的经改造的干细胞用E8培养基传代后，加入第一阶段诱导条件培养基—多巴胺能神经前体细胞诱导培养基一，于37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中诱导培养8天后，用消化酶（Accutase）消化细胞，转入悬浮状态培养，并更换为第二阶段培养基—多巴胺能神经前体细胞诱导培养基二，于37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中诱导14天后，转入多巴胺能神经前体细胞诱导培养基三于37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中培养14天得到多巴胺能神经前体细胞（以下称为转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞）。诱导后获得的多巴胺能神经前体细胞，弃上清，PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化（0.2%Triton + PBS）10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液（PBST+3%驴血清）室温30分钟后加入OTX2一抗（1:500; R&D），FOXA2一抗（1:500, Santa Cruz），4度过夜后，PBS清洗3次，加入二抗（1:500；Jackson Lab），37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。取三个随机视野统计OTX2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率和FOXA2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率。OTX2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率=OTX2阳性细胞个数/DAPI阳性细胞个数，FOXA2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率=FOXA2阳性细胞个数/DAPI阳性细胞个数，实验重复3次。

3.2改造前的人多能干细胞诱导分化为多巴胺能神经前体细胞

与3.1的区别仅在于将1.2的转入Nurr1基因的经改造的干细胞替换为改造前的人多能干细胞，其它操作均相同。具体如下：

将改造前的人多能干细胞依照以下步骤进行诱导分化：将改造前的人多能干细胞用E8培养基传代后，加入第一阶段诱导条件培养基—多巴胺能神经前体细胞诱导培养基一，于37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中诱导培养8天后，用消化酶（Accutase）消化细胞，转入悬浮状态培养，并更换为第二阶段培养基—多巴胺能神经前体细胞诱导培养基二，于37℃，5% CO₂的恒温培养箱中诱导14天后，转入多巴胺能神经前体细胞诱导培养基三，于37℃，5% CO₂的恒温培养箱中培养14天得到多巴胺能神经前体细胞（以下称为未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞）。诱导后获得的多巴胺能神经前体细胞，弃上清，PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化（0.2%Triton + PBS）10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液（PBST+3%驴血清）室温30分钟后加入OTX2一抗（1:500; R&D），FOXA2一抗（1:500, Santa Cruz），4度过夜后，PBS清洗3次，加入二抗（1:500；JacksonLab），37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。取三个随机视野统计诱导效率，OTX2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率=OTX2阳性细胞个数/DAPI阳性细胞个数， FOXA2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率=FOXA2阳性细胞个数/DAPI阳性细胞个数，实验重复3次。

3.3诱导效果比较

结果表明转入Nurr1基因的经改造的干细胞相对于未进行基因编辑干细胞，显著的提高了诱导分化为多巴胺神经前体细胞的效率（图3），证明转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞均表达多巴胺能神经元标志物叉头框蛋白A2（FOXA2）和OTX2 (orthodenticle homeobox 2)。转入Nurr1基因的经改造的干细胞的FOXA2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率极显著高于未进行基因编辑的改造前的人多能干细胞（受体细胞）（P<0.01）；转入Nurr1基因的经改造的干细胞的OTX2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率显著高于未进行基因编辑的改造前的人多能干细胞（受体细胞）（P<0.05）（图4）。说明增强或提高Nurr1基因表达可以显著提高干细胞的FOXA2阳性多巴胺能神经前体细胞和OTX2阳性多巴胺能神经前体细胞诱导效率。

4. 将第3步获得的多巴胺能神经前体细胞分化到神经元并进行鉴定，对比诱导效率

将上一步获得的转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞进一步按以下步骤进行诱导分化：将悬浮的多巴胺能神经前体细胞小球进行包被过的培养板进行贴壁培养，加入神经元诱导分化培养基，于37℃，5% CO₂ 的恒温培养箱中诱导培养7天，得到多巴胺能神经元。转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞分化得到的多巴胺能神经元和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞分化得到的多巴胺能神经元能够明显见到神经突起的发出和成熟化。弃去上清液，PBS洗两遍，加入多聚甲醛室温固定15分钟，PBS清洗三次后，用PBST进行透化（0.2%Triton+ PBS）10分钟，PBS清洗一次后加入封闭液（PBST+3%驴血清）室温30分钟后加入TH一抗（1:5000; Sigma），4度过夜后，PBS清洗3次，加入二抗（1:500；Jackson Lab），37℃避光孵育1小时，PBS清洗3次后，加入DAPI染核5分钟，PBS清洗三次后进行荧光显微镜观察和避光拍照。取三个随机视野统计多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率。多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率=TH阳性细胞个数/DAPI阳性细胞个数。结果表明转入Nurr1基因的经改造的干细胞相对于未进行基因编辑干细胞，显著性的提高了诱导分化为多巴胺神经元的效率（图5），证明转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞分化的多巴胺能神经元和未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞分化的多巴胺能神经元均表达多巴胺能神经元标志物酪氨酸羟化酶（TH）。转入Nurr1基因的经改造的干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率显著高于未进行基因编辑干细胞来源的多巴胺能神经前体细胞的TH阳性神经元诱导效率（P<0.05）（图6）。说明增强或提高Nurr1基因表达可以显著提高干细胞的TH阳性神经元诱导效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，NURR1基因可以被其它功能类似基因所替代，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京士马生物科技有限公司

<120> 制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法及其所用的经改造的干细胞

<130> GNCSQ202668

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8838

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttggc 2220

cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca tgtccaacat 2280

taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat 2340

tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 2400

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa 2460

cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact 2520

tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta 2580

aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt 2640

acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg 2700

ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 2760

ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc 2820

cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt 2880

tagtgaaccg gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact 2940

agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc 3000

ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa 3060

aatctctagc agtggcgccc gaacagggac ctgaaagcga aagggaaacc agagctctct 3120

cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg gcgactggtg 3180

agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg cgagagcgtc 3240

agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag gccaggggga 3300

aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga acgattcgca 3360

gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg acagctacaa 3420

ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt agcaaccctc 3480

tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga caagatagag 3540

gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccgctgatct tcagacctgg 3600

aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 3660

tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 3720

agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 3780

cgcagcctca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 3840

gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 3900

gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 3960

gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 4020

tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 4080

ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 4140

ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 4200

ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 4260

cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 4320

atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggacccg acaggcccga 4380

aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg 4440

atctcgacgg tatcggttaa cttttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg 4500

ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat 4560

tacaaaaatt caaaatttta tcgatcacga gactagcctc gagaagcttg atatcgaatt 4620

cccacggggt tggggttgcg ccttttccaa ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc 4680

tgctctgggc gtggttccgg gaaacgcagc ggcgccgacc ctgggtctcg cacattcttc 4740

acgtccgttc gcagcgtcac ccggatcttc gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg 4800

cttcctgctc cgcccctaag tcgggaaggt tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga 4860

caaacggaag ccgcacgtct cactagtacc ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg 4920

gcagcgcgcc gaccgcgatg ggctgtggcc aatagcggct gctcagcggg gcgcgccgag 4980

agcagcggcc gggaaggggc ggtgcgggag gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg 5040

ttcctgcccg cgcggtgttc cgcattctgc aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc 5100

tccctcgttg accgaatcac cgacctctct ccccaggggg atccatgcct tgtgttcagg 5160

cgcagtatgg gtcctcgcct caaggagcca gccccgcttc tcagagctac agttaccact 5220

cttcgggaga atacagctcc gatttcttaa ctccagagtt tgtcaagttt agcatggacc 5280

tcaccaacac tgaaattact gccaccactt ctctccccag cttcagtacc tttatggaca 5340

actacagcac aggctacgac gtcaagccac cttgcttgta ccaaatgccc ctgtccggac 5400

agcagtcctc cattaaggta gaagacattc agatgcacaa ctaccagcaa cacagccacc 5460

tgccccctca gtccgaggag atgatgccac acagcgggtc ggtttactac aagccctctt 5520

cgcccccgac acccagcacc ccgagcttcc aggtgcagca tagcccgatg tgggacgatc 5580

cgggctccct tcacaacttc caccagaact acgtggccac tacgcatatg atcgagcaga 5640

ggaagacacc tgtctcccgc ctgtcactct tctcctttaa gcagtcgccc ccgggcactc 5700

ctgtgtctag ctgccagatg cgcttcgacg ggcctctgca cgtccccatg aacccggagc 5760

ccgcgggcag ccaccacgta gtggatgggc agaccttcgc cgtgcccaac cccattcgca 5820

agccggcatc catgggcttc ccgggcctgc agatcggcca cgcatcgcag ttgcttgaca 5880

cgcaggtgcc ctcgccgccg tcccggggct ctccctccaa tgagggtctg tgcgctgttt 5940

gcggtgacaa cgcggcctgt cagcactacg gtgttcgcac ttgtgagggc tgcaaaggtt 6000

tctttaagcg cacggtgcaa aaaaacgcga aatatgtgtg tttagcaaat aaaaactgcc 6060

cagtggacaa gcgccgccga aatcgttgtc agtactgtcg gtttcagaag tgcctagctg 6120

ttgggatggt taaagaagtg gttcgcacgg acagtttaaa aggccggaga ggtcgtttac 6180

cctcgaagcc gaagagccca caggatccct ctcccccctc acctccggtg agtctgatca 6240

gtgccctcgt cagagcccac gtcgattcca atccggcaat gaccagcctg gactattcca 6300

ggttccaggc aaaccctgac tatcagatga gtggagatga tacccaacat atccagcagt 6360

tctacgatct cctgaccggc tctatggaga tcatcagagg gtgggcagag aagatccctg 6420

gctttgctga cctgcccaaa gccgaccagg acctgctttt tgaatcagct ttcttagaat 6480

tatttgttct gcgcttagca tacaggtcca acccagtgga gggtaaactc atcttttgca 6540

atggggtggt cttgcacagg ttgcaatgcg tgcgtggctt tggggaatgg attgattcca 6600

ttgttgaatt ctcctccaac ttgcagaata tgaacatcga catttctgcc ttctcctgca 6660

ttgctgccct ggctatggtc acagagagac acgggctcaa ggaacccaag agagtggaag 6720

agctacaaaa caaaattgta aattgtctta aagaccatgt gactttcaat aatgggggtt 6780

tgaaccgacc caactacctg tctaaactgt tggggaagct gccagaactc cgcacccttt 6840

gcacacaggg cctccagcgc attttctacc tgaaattgga agacttggta ccaccaccag 6900

caataattga caaacttttc ctggacacct tacctttcta agtcgacaat caacctctgg 6960

attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat 7020

gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt 7080

tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca 7140

ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg 7200

ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg 7260

aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca 7320

attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca 7380

cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc 7440

ttccttcccg cggcctgctg ccggctctag agcctcttcc gcgtcttcgc cttcccgggt 7500

cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt 7560

taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt 7620

ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac 7680

tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg 7740

cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga 7800

aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga 7860

aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 7920

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 7980

tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc 8040

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 8100

cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 8160

aggcttttgc gtcgagacgt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca 8220

ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 8280

cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 8340

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcg acgcgccctg tagcggcgca 8400

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 8460

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 8520

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 8580

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 8640

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 8700

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 8760

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 8820

ttaacgttta caatttcc 8838

<210> 2

<211> 598

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Gly Ala Ser

1 5 10 15

Pro Ala Ser Gln Ser Tyr Ser Tyr His Ser Ser Gly Glu Tyr Ser Ser

20 25 30

Asp Phe Leu Thr Pro Glu Phe Val Lys Phe Ser Met Asp Leu Thr Asn

35 40 45

Thr Glu Ile Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met

50 55 60

Asp Asn Tyr Ser Thr Gly Tyr Asp Val Lys Pro Pro Cys Leu Tyr Gln

65 70 75 80

Met Pro Leu Ser Gly Gln Gln Ser Ser Ile Lys Val Glu Asp Ile Gln

85 90 95

Met His Asn Tyr Gln Gln His Ser His Leu Pro Pro Gln Ser Glu Glu

100 105 110

Met Met Pro His Ser Gly Ser Val Tyr Tyr Lys Pro Ser Ser Pro Pro

115 120 125

Thr Pro Ser Thr Pro Ser Phe Gln Val Gln His Ser Pro Met Trp Asp

130 135 140

Asp Pro Gly Ser Leu His Asn Phe His Gln Asn Tyr Val Ala Thr Thr

145 150 155 160

His Met Ile Glu Gln Arg Lys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu Phe

165 170 175

Ser Phe Lys Gln Ser Pro Pro Gly Thr Pro Val Ser Ser Cys Gln Met

180 185 190

Arg Phe Asp Gly Pro Leu His Val Pro Met Asn Pro Glu Pro Ala Gly

195 200 205

Ser His His Val Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro Ile

210 215 220

Arg Lys Pro Ala Ser Met Gly Phe Pro Gly Leu Gln Ile Gly His Ala

225 230 235 240

Ser Gln Leu Leu Asp Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly Ser

245 250 255

Pro Ser Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys

260 265 270

Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys

275 280 285

Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn

290 295 300

Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe

305 310 315 320

Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp

325 330 335

Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro

340 345 350

Gln Asp Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Val Ser Leu Ile Ser Ala Leu

355 360 365

Val Arg Ala His Val Asp Ser Asn Pro Ala Met Thr Ser Leu Asp Tyr

370 375 380

Ser Arg Phe Gln Ala Asn Pro Asp Tyr Gln Met Ser Gly Asp Asp Thr

385 390 395 400

Gln His Ile Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Ser Met Glu Ile

405 410 415

Ile Arg Gly Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro Lys

420 425 430

Ala Asp Gln Asp Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val

435 440 445

Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Asn Pro Val Glu Gly Lys Leu Ile Phe

450 455 460

Cys Asn Gly Val Val Leu His Arg Leu Gln Cys Val Arg Gly Phe Gly

465 470 475 480

Glu Trp Ile Asp Ser Ile Val Glu Phe Ser Ser Asn Leu Gln Asn Met

485 490 495

Asn Ile Asp Ile Ser Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met Val

500 505 510

Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Gln

515 520 525

Asn Lys Ile Val Asn Cys Leu Lys Asp His Val Thr Phe Asn Asn Gly

530 535 540

Gly Leu Asn Arg Pro Asn Tyr Leu Ser Lys Leu Leu Gly Lys Leu Pro

545 550 555 560

Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu

565 570 575

Lys Leu Glu Asp Leu Val Pro Pro Pro Ala Ile Ile Asp Lys Leu Phe

580 585 590

Leu Asp Thr Leu Pro Phe

595

<210> 3

<211> 3346

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

agccacataa acaaaggcac attggcggcc agggccagtc cgcccggcgg ctcgcgcacg 60

gctccgcggt cccttttgcc tgtccagccg gccgcctgtc cctgctccct ccctccgtga 120

ggtgtccggg ttcccttcgc ccagctctcc cacccctacc cgaccccggc gcccgggctc 180

ccagagggaa ctgcacttcg gcagagttga atgaatgaag acagacgcgg agaactccta 240

accatgcctt gtgttcaggc gcagtatggg tcctcgcctc aaggagccag ccccgcttct 300

cagagctaca gttaccactc ttcgggagaa tacagctccg atttcttaac tccagagttt 360

gtcaagttta gcatggacct caccaacact gaaatcactg ccaccacttc tctccccagc 420

ttcagtacct ttatggacaa ctacagcaca ggctacgacg tcaagccacc ttgcttgtac 480

caaatgcccc tgtccggaca gcagtcctcc attaaggtag aagacattca gatgcacaac 540

taccagcaac acagccacct gcccccccag tctgaggaga tgatgccgca ctccgggtcg 600

gtttactaca agccctcctc gcccccgacg cccaccaccc cgggcttcca ggtgcagcac 660

agccccatgt gggacgaccc gggatctctc cacaacttcc accagaacta cgtggccact 720

acgcacatga tcgagcagag gaaaacgcca gtctcccgcc tctccctctt ctcctttaag 780

caatcgcccc ctggcacccc ggtgtctagt tgccagatgc gcttcgacgg gcccctgcac 840

gtccccatga acccggagcc cgccggcagc caccacgtgg tggacgggca gaccttcgct 900

gtgcccaacc ccattcgcaa gcccgcgtcc atgggcttcc cgggcctgca gatcggccac 960

gcgtctcagc tgctcgacac gcaggtgccc tcaccgccgt cgcggggctc cccctccaac 1020

gaggggctgt gcgctgtgtg tggggacaac gcggcctgcc aacactacgg cgtgcgcacc 1080

tgtgagggct gcaaaggctt ctttaagcgc acagtgcaaa aaaatgcaaa atacgtgtgt 1140

ttagcaaata aaaactgccc agtggacaag cgtcgccgga atcgctgtca gtactgccga 1200

tttcagaagt gcctggctgt tgggatggtc aaagaagtgg ttcgcacaga cagtttaaaa 1260

ggccggagag gtcgtttgcc ctcgaaaccg aagagcccac aggagccctc tcccccttcg 1320

cccccggtga gtctgatcag tgccctcgtc agggcccatg tcgactccaa cccggctatg 1380

accagcctgg actattccag gttccaggcg aaccctgact atcaaatgag tggagatgac 1440

acccagcata tccagcaatt ctatgatctc ctgactggct ccatggagat catccggggc 1500

tgggcagaga agatccctgg cttcgcagac ctgcccaaag ccgaccaaga cctgcttttt 1560

gaatcagctt tcttagaact gtttgtcctt cgattagcat acaggtccaa cccagtggag 1620

ggtaaactca tcttttgcaa tggggtggtc ttgcacaggt tgcaatgcgt tcgtggcttt 1680

ggggaatgga ttgattccat tgttgaattc tcctccaact tgcagaatat gaacatcgac 1740

atttctgcct tctcctgcat tgctgccctg gctatggtca cagagagaca cgggctcaag 1800

gaacccaaga gagtggaaga actgcaaaac aagattgtaa attgtctcaa agaccacgtg 1860

actttcaaca atggggggtt gaaccgcccc aattatttgt ccaaactgtt ggggaagctc 1920

ccagaacttc gtaccctttg cacacagggg ctacagcgca ttttctacct gaaattggaa 1980

gacttggtgc caccgccagc aataattgac aaacttttcc tggacacttt acctttctaa 2040

gacctcctcc caagcacttc aaaggaactg gaatgataat ggaaactgtc aagagggggc 2100

aagtcacatg ggcagagata gccgtgtgag cagtctcagc tcaagctgcc ccccatttct 2160

gtaaccctcc tagccccctt gatccctaaa gaaaacaaac aaacaaacaa aaactgttgc 2220

tatttcctaa cctgcaggca gaacctgaaa gggcattttg gctccggggc atcctggatt 2280

tagaacatgg actacacaca atacagtggt ataaactttt tattctcagt ttaaaaatca 2340

gtttgttgtt cagaagaaag attgctataa tgtataatgg gaaatgtttg gccatgcttg 2400

gttgttgcag ttcagacaaa tgtaacacac acacacatac acacacacac acacacacag 2460

agacacatct taaggggacc cacaagtatt gccctttaac aagacttcaa agttttctgc 2520

tgtaaagaaa gctgtaatat atagtaaaac taaatgttgc gtgggtggca tgagttgaag 2580

aaggcaaagg cttgtaaatt tacccaatgc agtttggctt tttaaattat tttgtgccta 2640

tttatgaata aatattacaa attctaaaag ataagtgtgt ttgcaaaaaa aaagaaaata 2700

aatacataaa aaagggacaa gcatgttgat tctaggttga aaatgttata ggcacttgct 2760

acttcagtaa tgtctatatt atataaatag tatttcagac actatgtagt ctgttagatt 2820

ttataaagat tggtagttat ctgagcttaa acattttctc aattgtaaaa taggtgggca 2880

caagtattac acatcagaaa atcctgacaa aagggacaca tagtgtttgt aacaccgtcc 2940

aacattcctt gtttgtaagt gttgtatgta ccgttgatgt tgataaaaag aaagtttata 3000

tcttgattat tttgttgtct aaagctaaac aaaacttgca tgcagcagct tttgactgtt 3060

tccagagtgc ttataatata cataactccc tggaaataac tgagcacttt gaattttttt 3120

tatgtctaaa attgtcagtt aatttattat tttgtttgag taagaatttt aatattgcca 3180

tattctgtag tatttttctt tgtatatttc tagtatggca catgatatga gtcactgcct 3240

ttttttctat ggtgtatgac agttagagat gctgattttt tttctgataa attctttctt 3300

tgagaaagac aattttaatg tttacaacaa taaaccatgt aaatga 3346

<210> 4

<211> 609

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Met Asn Glu Asp Arg Arg Gly Glu Leu Leu Thr Met Pro Cys Val Gln

1 5 10 15

Ala Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Gly Ala Ser Pro Ala Ser Gln Ser

20 25 30

Tyr Ser Tyr His Ser Ser Gly Glu Tyr Ser Ser Asp Phe Leu Thr Pro

35 40 45

Glu Phe Val Lys Phe Ser Met Asp Leu Thr Asn Thr Glu Ile Thr Ala

50 55 60

Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Asn Tyr Ser Thr

65 70 75 80

Gly Tyr Asp Val Lys Pro Pro Cys Leu Tyr Gln Met Pro Leu Ser Gly

85 90 95

Gln Gln Ser Ser Ile Lys Val Glu Asp Ile Gln Met His Asn Tyr Gln

100 105 110

Gln His Ser His Leu Pro Pro Gln Ser Glu Glu Met Met Pro His Ser

115 120 125

Gly Ser Val Tyr Tyr Lys Pro Ser Ser Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro

130 135 140

Gly Phe Gln Val Gln His Ser Pro Met Trp Asp Asp Pro Gly Ser Leu

145 150 155 160

His Asn Phe His Gln Asn Tyr Val Ala Thr Thr His Met Ile Glu Gln

165 170 175

Arg Lys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Phe Lys Gln Ser

180 185 190

Pro Pro Gly Thr Pro Val Ser Ser Cys Gln Met Arg Phe Asp Gly Pro

195 200 205

Leu His Val Pro Met Asn Pro Glu Pro Ala Gly Ser His His Val Val

210 215 220

Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro Ile Arg Lys Pro Ala Ser

225 230 235 240

Met Gly Phe Pro Gly Leu Gln Ile Gly His Ala Ser Gln Leu Leu Asp

245 250 255

Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly Ser Pro Ser Asn Glu Gly

260 265 270

Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His Tyr Gly Val

275 280 285

Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Gln Lys

290 295 300

Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val Asp Lys

305 310 315 320

Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala

325 330 335

Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys Gly Arg

340 345 350

Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Gln Glu Pro Ser Pro

355 360 365

Pro Ser Pro Pro Val Ser Leu Ile Ser Ala Leu Val Arg Ala His Val

370 375 380

Asp Ser Asn Pro Ala Met Thr Ser Leu Asp Tyr Ser Arg Phe Gln Ala

385 390 395 400

Asn Pro Asp Tyr Gln Met Ser Gly Asp Asp Thr Gln His Ile Gln Gln

405 410 415

Phe Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Ser Met Glu Ile Ile Arg Gly Trp Ala

420 425 430

Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro Lys Ala Asp Gln Asp Leu

435 440 445

Leu Phe Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val Leu Arg Leu Ala Tyr

450 455 460

Arg Ser Asn Pro Val Glu Gly Lys Leu Ile Phe Cys Asn Gly Val Val

465 470 475 480

Leu His Arg Leu Gln Cys Val Arg Gly Phe Gly Glu Trp Ile Asp Ser

485 490 495

Ile Val Glu Phe Ser Ser Asn Leu Gln Asn Met Asn Ile Asp Ile Ser

500 505 510

Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met Val Thr Glu Arg His Gly

515 520 525

Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Gln Asn Lys Ile Val Asn

530 535 540

Cys Leu Lys Asp His Val Thr Phe Asn Asn Gly Gly Leu Asn Arg Pro

545 550 555 560

Asn Tyr Leu Ser Lys Leu Leu Gly Lys Leu Pro Glu Leu Arg Thr Leu

565 570 575

Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu Lys Leu Glu Asp Leu

580 585 590

Val Pro Pro Pro Ala Ile Ile Asp Lys Leu Phe Leu Asp Thr Leu Pro

595 600 605

Phe

Claims

1.一种制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的方法，包括将经改造的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞；所述经改造的干细胞为表达或可诱导表达Nurr1，或表达或可诱导表达与所述Nurr1具有相同功能的蛋白质的干细胞。

2.经改造的干细胞，其特征在于：所述经改造的干细胞为表达或可诱导表达Nurr1，或表达或可诱导表达与所述Nurr1具有相同功能的蛋白质的干细胞。

3.权利要求2所述的经改造的干细胞的构建方法，所述构建方法包括将外源Nurr1基因导入干细胞中，得到表达Nurr1的经改造的干细胞。

4.权利要求2所述的经改造的干细胞在制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞中的应用。

5.用于制备治疗多巴胺能神经元相关疾病药物的组合物，其特征在于：所述组合物含有权利要求2所述的经改造的干细胞。

6.用于制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞的组合物，其特征在于：所述组合物含有调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞，所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

7.调控Nurr1基因表达的物质和多能干细胞在制备多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

8.由权利要求2所述的经改造的干细胞产生的多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞。

9.调控Nurr1基因表达的物质的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

P1、调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化为多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质；

P2、调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化为多巴胺能神经元和/或多巴胺能神经前体细胞产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质；

P3、调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化为外胚层细胞中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质；

P4、调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化为外胚层细胞产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为增强或提高Nurr1基因表达的物质。

10.调控Nurr1基因表达的物质的应用，其特征在于：所述应用为P5或P6：

P5、调控Nurr1基因表达的物质在促进和/或增强多能干细胞分化中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为提高Nurr1基因表达的物质；

P6、调控Nurr1基因表达的物质在制备促进和/或增强多能干细胞分化的产品中的应用；所述调控Nurr1基因表达的物质为提高Nurr1基因表达的物质。