CN108607103B

CN108607103B - Foxd1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用

Info

Publication number: CN108607103B
Application number: CN201810871204.0A
Authority: CN
Inventors: 曲静; 刘光慧; 付丽娜; 任若通
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2018-08-02
Filing date: 2018-08-02
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2038-08-02
Also published as: CN108607103A

Abstract

本发明公开了FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。本发明发现，FOXD1具有如下功能：治疗和/或预防动物骨关节炎；治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；延缓间充质干细胞的衰老；延缓间充质干细胞的复制性衰老。实验证明，在体外间充质干细胞中FOXD1的敲低加速了间充质干细胞的衰老，而FOXD1的过表达延缓了间充质干细胞的衰老；体内实验证实FOXD1基因可以降低关节软骨的退化和关节炎症反应，在骨关节炎疾病中具有很好的治疗效果。该发明为开发用于骨关节炎的基因治疗提供了新的思路，且扩大了临床基因治疗的可选择范围。

Description

FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域中，FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是最常见的慢性退行性关节病损，临床表现为慢性关节疼痛，僵硬，肥大及活动受限。骨关节炎的发病与年龄，肥胖，炎症，创伤，遗传等多种因素有关。该病多发生于中老年人，且患病率随年龄而增加，此外女性发病率要高于男性。由于极高的患病率和致残率，及疾病所致的工作能力和生活能力的丧失，骨关节炎已然成为了危害人类健康，影响社会发展的主要疾病之一。

目前，骨关节炎的治疗仍较多地采用药物疗法。与全身给药相比，关节腔给药可使药物直达部位，减少了其他途径的药物代谢，使得局部的药物浓度保持较高水平，起到良好的治疗作用，因而正迅速成为治疗骨关节炎的重要手段。但由于药物半衰期较短，需反复注射，增加了对关节部位的刺激和关节感染的风险。近年来，分子生物学和基因工程的发展为基因疗法在骨关节炎治疗方面的应用提供了可能性。利用基因疗法治疗骨关节炎就是将对骨关节炎有治疗作用的基因通过适当的载体导入关节腔中，使其在病变关节软骨细胞或滑膜细胞内长期、稳定、高效地表达从而起到治疗作用。

在基因治疗中，携带目的基因到靶细胞内进行复制和表达的病毒载体有多种。常用的有逆转录病毒，慢病毒，腺相关病毒，单纯疱疹病毒等。逆转录病毒表达时间长，感染效率高，但只能感染分裂细胞。腺相关病毒表达时间长，安全性高，但也存在携带外源基因容量小，制备较困难的缺陷。单纯疱疹病毒携带外源基因容量大，但具有细胞毒性且不能长期表达。因此，合理地选择载体是基因治疗成功的关键之一。

引发骨关节炎的最主要的因素是衰老。随着衰老，关节内的多种细胞如软骨细胞，滑膜细胞，间充质干细胞均发生细胞衰老和功能退化。因此，能够延缓或抵抗细胞衰老的基因可以为骨关节炎的治疗提供一种新的思路。2011年，科学家对来自101岁人类的细胞进行体外重新编程，将这些细胞的衰老相关表观遗传学修饰去除，使得这些细胞的代谢模式变得更符合年轻人的细胞。2016年，Cell文章报道细胞重编程可成功逆转早衰症小鼠的衰老。

发明内容

本发明的目的是提供FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用。

本发明首先提供了FOXD1的下述任一应用：

X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；

X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；

X3、制备治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；

X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；

X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；

X6、延缓间充质干细胞的衰老；

X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；

X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老。

上述应用中，所述FOXD1可为如下A1)或A2)或A3)或A4)或A5)：

A1)氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质；

A2)在氨基酸序列为序列3的第11-474位的蛋白质的N端添加甲硫氨酸残基得到的蛋白质；

A3)氨基酸序列为序列3的蛋白质；

A4)在序列3的第11-474位或序列3的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；

A5)在A1)或A2)或A3)或A4)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的FOXD1，为与序列3的第11-474位或序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的FOXD1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的FOXD1的编码基因可通过将序列2的第4694-6088位或序列2的第4664-6088位的所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2的第4664-6088位所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质。

本发明还提供了与所述FOXD1相关的生物材料的下述任一应用：

X1、制备治疗和/或预防动物骨关节炎的产品；

X2、治疗和/或预防动物骨关节炎；

X4、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；

X5、制备延缓间充质干细胞的衰老的产品；

X6、延缓间充质干细胞的衰老；

X7、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；

X8、延缓间充质干细胞的复制性衰老；

所述生物材料可为下述B1)至B12)中的任一种：

B1)编码所述FOXD1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

B11)降低所述FOXD1表达的核酸分子；

B12)含有B11)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列1的第169-1563位或序列1的第166-1563位或序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列1的第169-1563位或序列1的第166-1563位或序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述FOXD1的cDNA分子或DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述FOXD1的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述FOXD1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述FOXD1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述FOXD1且具有所述FOXD1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3的第11-474位或序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码所述FOXD1的核酸分子的表达盒(所述FOXD1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达所述FOXD1的DNA，该DNA不但可包括启动所述FOXD1基因转录的启动子，还可包括终止所述FOXD1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述FOXD1基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pLE4载体。

B2)所述重组载体具体可为pLE4-FOXD1。所述pLE4-FOXD1为将序列1的第166-1563位所示的DNA分子通过同源重组的方式连接到经过Xho1和Mlu1酶切的pLE4载体上得到的重组载体。所述pLE4-FOXD1的序列可为序列表中序列2，所述pLE4-FOXD1能表达序列3所示的蛋白质。

上述应用中，所述微生物可为病毒、酵母、细菌、藻或真菌。所述病毒可为慢病毒。

B11)所述核酸分子可为编码靶向编码所述FOXD1的核酸分子的sgRNA或所述sgRNA的编码基因。所述sgRNA的靶序列具体可为序列1的327-349位。

B12)所述重组载体可为lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA，所述lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA为将序列1的327-349位所示的DNA分子与经过BsmB1酶切的lentiCRISPRv2载体进行连接得到的重组载体。

所述重组微生物可为重组慢病毒。所述重组慢病毒具体可为利用所述pLE4-FOXD1或所述lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA包装得到的慢病毒。

上述应用中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述动物可为c1)或c2)：

c1)哺乳动物；

c2)人或小鼠。

所述生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了具有如下Y1-Y5中任一功能的产品，所述产品含有所述FOXD1或所述生物材料：

Y1、治疗和/或预防动物骨关节炎；

Y2、治疗和/或预防动物前交叉韧带切断诱导的骨关节炎；

Y3、延缓间充质干细胞的衰老；

Y4、延缓间充质干细胞的复制性衰老；

Y5、延缓间充质干细胞的病理性衰老。

本发明中，所述治疗和/或预防动物骨关节炎具体可体现在如下任一方面：

C1)降低关节软骨的退化；

C2)促进关节细胞的增殖；

C3)延缓关节细胞的衰老；

C4)降低关节腔的炎症反应；

C5)降低关节细胞的凋亡。

所述间充质干细胞可为CD73、CD90和CD105均为阳性的间充质干细胞。

所述间充质干细胞的衰老可表现为间充质干细胞的生长阻滞。所述述间充质干细胞的衰老具体可表现为间充质干细胞中SA-β-gal活性的增加。

所述产品可为药物或疫苗。

本发明的实验证明，在体外间充质干细胞中FOXD1的敲低加速了间充质干细胞的衰老，而FOXD1的过表达延缓了间充质干细胞的衰老；体内实验证实FOXD1基因可以降低关节软骨的退化和关节炎症反应，在骨关节炎疾病中具有很好的治疗效果。该发明为开发用于骨关节炎的基因治疗提供了新的思路，且扩大了临床基因治疗的可选择范围。

附图说明

附图1为FOXD1在人间充质干细胞衰老中的作用。A：年轻(第2代)和衰老(第12代)的人间充质干细胞中FOXD1的表达情况；B：感染NTC-sgRNA慢病毒和感染FOXD1-sgRNA慢病毒的间充质干细胞中FOXD1的表达情况；C：感染NTC-sgRNA慢病毒和感染FOXD1-sgRNA慢病毒的间充质干细胞中P16和P21的表达情况；D：感染NTC-sgRNA慢病毒和感染FOXD1-sgRNA慢病毒的间充质干细胞中SA-β-gal活性检测；E：在第5代人间充质干细胞中分别感染Luc和FOXD1慢病毒后的细胞生长曲线；F：在第5代人间充质干细胞中分别感染Luc和FOXD1慢病毒后，继续培养至第10代的SA-β-gal活性检测。

附图2为FOXD1基因在前交叉韧带切断手术诱导的小鼠骨关节炎中的治疗效果。A：非手术组，手术组注射Luc慢病毒，手术组注射FOXD1慢病毒的小鼠关节微结构检测；B：非手术组，手术组注射Luc慢病毒，手术组注射FOXD1慢病毒的小鼠关节软骨染色结果；C：根据国际骨关节炎研究学会的标准，对非手术组，手术组注射Luc慢病毒，手术组注射FOXD1慢病毒的小鼠关节的评级打分；D：非手术组，手术组注射Luc慢病毒，手术组注射FOXD1慢病毒的小鼠关节的RT-qPCR分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37摄氏度，5％CO₂。本发明中使用的小鼠为北京华阜康生物科技股份有限公司产品，饲养于室温23℃，12小时昼夜周期并且可以自由摄食和饮水的生物物理研究所动物福利设施中。所有的动物实验均获得中国科学院生物物理研究所动物福利委员会的批准。

1.本发明用到的细胞系如下：

人胚胎干细胞H9细胞系是WiCell公司产品，货号：WA09(H9)-DL-7。

人胚胎肾细胞293T系为ATCC产品，货号CRL-3216。

2.本发明用到的细胞培养基如下：

(1)人胚胎干细胞H9细胞培养基CDF12：76.9％(v/v)DMEM/F12(ThermoFisher,11330-032)，20％(v/v)Knock-out血清替代物(Gibco,10828-028)，0.1％(v/v)β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)，1％(v/v)GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，1％(v/v)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(JPC，FGF2)。

(2)小鼠胚胎成纤维细胞培养基(MEF培养基)：87％(v/v)DMEM(Hyclone)，10％(v/v)胎牛血清(Gibco,10100-147)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，1％(v/v)GlutaMAX(Invitrogen，35050-061),1％(v/v)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)。

(3)胚胎肾细胞293T系培养基：87％(v/v)DMEM(Hyclone)，10％(v/v)胎牛血清(Gibco,10100-147)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，1％(v/v)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)。

(4)间充质干细胞分化培养基：88％(v/v)α-MEM+GlutaMAX(Invitrogen，12571071)，10％(v/v)胎牛血清(Gibco,10100-147)，1％(v/v)非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050)，1％(v/v)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063)，10ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(JPC，FGF2)，5ng/mL TGFβ(Humanzyme，HZ1131)。

(5)间充质干细胞培养基：89％(v/v)α-MEM+GlutaMAX(Invitrogen，12571071),10％(v/v)胎牛血清(Gibco,10100-147),1％(v/v)青霉素/链霉素(Invitrogen，15070-063),1ng/mL重组人成纤维细胞生长因子(JPC，FGF2)。

3.本发明中慢病毒包装所用生物材料如下：

慢病毒包装载体是psPAX2(Addgene,#12260)和pMD2.G(Addgene,#12259)。

慢病毒载体为pLE4(由Dr Tomoaki Hishida馈赠)(Ren et al.,Visualizationof aging-associated chromatin alterations with an engineered TALE system,CellResearch(2017)27:483-504.)经Tomoaki Hishida同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

4.本发明涉及的细胞培养方法如下：

(1)人胚胎干细胞H9的培养方法：人胚胎干细胞系H9(WiCell Research)培养在经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，以CDF12作为培养基，每天更换新鲜培养基，一般5-7天传代一次。传代前一天，用MEF培养基在明胶(Sigma)包被的板子上铺MEF饲养层细胞，待细胞贴壁后，吸去MEF培养基，换成CDF12培养基。传代的方法包括机械法和消化法。机械法：使用毛细玻璃管对人胚胎干细胞克隆进行分块儿，挑取状态良好的克隆转移至铺好的MEF饲养层上。消化法：用消化酶胶原酶IV(Gibco)消化3-5分钟后吸走消化酶，用DMEM/F12基础培养基(ThermoFisher,11330-032)洗两次，再加入CDF12培养基，用玻璃移液管将克隆刮成小块接种到铺好的MEF饲养层上。

(2)间充质干细胞的分化和培养：将人胚胎干细胞进行拟胚体(EB)分化，分化3天，将EB接种于基质胶(matrigel)(Invitrogen公司)包被的6孔板中用上述的间充质干细胞分化培养基进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞类群，即为高纯度的人间充质干细胞。纯化的间充质干细胞的培养用上述的间充质干细胞培养基进行培养，4-5天传一次代。每次传代以1×10⁵细胞密度接种到6孔板中的一个孔中。

4.用于流式细胞术分选间充质干细胞的荧光标记抗体：

荧光素FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体(555595)，BD Biosciences。

荧光素PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体(550257)，BD Biosciences。

荧光素APC标记的抗人细胞表面识别分子CD105抗体(17-1057-42)，BDBiosciences。

荧光素APC标记同型对照抗体(555751)，BD Biosciences。

荧光素PE标记同型对照抗体(555749)，BD Biosciences。

荧光素FITC标记同型对照抗体(555742)，BD Biosciences。

5.用于免疫印迹抗体:

抗人FOXD1抗体(PA5-27142)，Thermo Fisher。

抗人P16抗体(550834)，BD Biosciences。

抗人P21抗体(2947)，Cell Signaling Technology。

抗人β-actin抗体(sc-69879)，Santa Cruz Biotechnology。

抗人GAPDH抗体(sc-25778)，Santa Cruz Biotechnology。

6.本发明中检测细胞衰老的SA-β-gal染色

SA-β-gal(senescence-associated beta-galactosidase)是溶酶体中的一种水解酶，在衰老细胞中活性增强，当添加底物X-Gal时，该酶可将其酶解并使细胞显现蓝色。SA-β-gal也因此成为一种快捷迅速检测细胞衰老的“金标准”。具体方法如下：

1)以1×10⁵/孔的密度将间充质干细胞接种到明胶(sigma)包被的6孔板的一个孔中，第2天进行染色。

2)步骤1)完成后用固定液(2％(v/v)甲醛+0.2％(v/v)戊二醛+98％(v/v)PBS)固定细胞4分钟(一定不要超过5分钟)，用PBS洗2遍。

3)步骤2)完成后每孔加入2mL染色液(40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液、5mM K₄[Fe(CN)₆]、5mM K₃[Fe(CN)₆]、150mM NaCl、2mM MgCl₂、1mg/mL X-gal)，在37℃细菌培养箱避光孵育过夜。

4)步骤3)完成后用PBS洗2遍后，倒置显微镜下观察，拍照。

7.本发明中的实验数据以平均值±标准差表示，用GraghPad Prism5统计软件分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

实施例1、FOXD1对间充质干细胞衰老的延缓作用

1.1伴随间充质干细胞的复制性衰老，FOXD1表达明显下调

利用体外定向分化技术，从人胚胎干细胞分化得到的人间充质干细胞可在体外培养条件下从第1代连续传代到第12代。第12代的间充质干细胞出现明显的生长阻滞，细胞体积变大，形态扁平等细胞衰老表型。以第2代和第12代的间充质干细胞作为供试细胞，其中第2代的细胞代表年轻的细胞，第12代的细胞代表衰老的细胞。提取两种细胞的总蛋白，使用RIPA细胞裂解液(碧云天，P0013B)裂解供试细胞，然后使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，P0010)测定细胞中蛋白浓度，最后分别取20μg蛋白进行免疫印迹实验。使用一抗为FOXD1抗体(Thermo Fisher，PA5-27142)，二抗为羊抗兔IgG/HRP(中杉金桥，ZDR-5306)，内参为β-tubulin(Santa Cruz,5274)，二抗为羊抗鼠IgG/HRP(中杉金桥，ZDR-5307)。结果如附图1中A所示，与第2代(年轻)间充质干细胞相比，FOXD1蛋白的表达在第12代(衰老)间充质干细胞中明显下调。

1.2 FOXD1的敲低加速了间充质干细胞的衰老

如上所述，FOXD1随细胞衰老表达量下降。那么如果在年轻的间充质干细胞中敲低FOXD1是否会加速衰老的进程呢？发明人利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术在间充质干细胞中对FOXD1进行敲低。然后检测FOXD1敲低对于间充质干细胞衰老的影响。

具体方法如下：

1.2.1构建FOXD1-sgRNA载体：

根据NCBI提供的FOXD1的基因组序列(GenBank：NC_000005.10的第73446256-73448527的方向序列，updated on 8-Apr-2018)，如序列表中序列1所示。FOXD1只有一个外显子，为序列1中的第1-2272位。在外显子1(exon 1)中的翻译起始位点ATG附近设计了sgRNA序列，记为FOXD1-sgRNA，其靶序列为：GCGGCGGCGCTCGTACGCCGGGG(序列1的327-349位)。同时，设计了对照sgRNA，该sgRNA不靶向人类基因组的任何位点，称为non-targetingcontrol，简称NTC。该sgRNA记为NTC-sgRNA，其靶序列为：TACTAACGCCGCTCCTACAGNGG。

首先合成sgRNA oligo，然后退火合成完整的sgRNA，再连接到sgRNA载体上。本发明中用的sgRNA载体为lentiCRISPRv2，Addgene产品，#52961。该载体可同时表达Cas9蛋白和sgRNA。因此可实现对目的基因的编辑。

sgRNA oligo序列如下：

FOXD1-sgRNA-F	CACCG<u>GCGGCGGCGCTCGTACGCCG</u>
		FOXD1-sgRNA-R	AAAC<u>CGGCGTACGAGCGCCGCCGC</u>C
NTC-sgRNA-F	CACCG<u>TACTAACGCCGCTCCTACAG</u>
		NTC-sgRNA-R	AAAC<u>CTGTAGGAGCGGCGTTAGTA</u>

退火体系如下：

sgRNA-F(100μM)	1μL
		sgRNA-R(100μM)	1μL
10×T4 ligation buffer	1μL
		T4 PNK(NEB M0201S)	0.5μL
水	补至10μL

退火条件如下：

退火完成后，将得到的DNA片段与经过BsmBl酶切的lentiCRISPRv2载体进行连接。即分别得到FOXD1-sgRNA和NTC-sgRNA的表达质粒，记为lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA和lentiCRISPRv2-NTC-sgRNA。

1.2.2制备FOXD1-sgRNA和NTC-sgRNA表达病毒：

上述构建好的lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA和lentiCRISPRv2-NTC-sgRNA属于慢病毒表达载体，需要包装成完整的慢病毒才能发挥功能。sgRNA慢病毒的包装方法具体如下：

1)将慢病毒质粒lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA或lentiCRISPRv2-NTC-sgRNA转染人胚胎肾细胞293T系。使用Lipo3000转染试剂盒(Thermo Fisher)。A液：600μL Opti-MEM(Gibco)和18μL Lipo3000，混匀；B液：600μL Opti-MEM、15μg lentiCRISPRv2-FOXD1-sgRNA或lentiCRISPRv2-NTC-sgRNA、10μg psPAX2和5μg pMD2.G，再加入30μL P3000，充分混匀。将B液逐滴加入A液中，边加边振荡，而后充分混匀。室温孵育20～30分钟。然后将混合液滴加到293T细胞中(10cm皿)，轻轻摇匀。

2)转染8小时后更换新鲜的293T细胞培养基(胚胎肾细胞293T系培养基)继续培养。

3)更换新鲜培养基后的第24，48，72小时收3次培养液于4℃。

4)病毒悬液收好后，使用0.45μm滤器过滤上清液于新的离心管中，4℃离心，转速为19400rpm/分钟，时间2.5小时。

5)离心后，将上清倒掉。使用100μL间充质干细胞培养基吹打重悬沉淀，分装冻存于-80℃。即得到编码FOXD1-sgRNA的慢病毒和编码NTC-sgRNA的慢病毒，分别记为FOXD1-sgRNA慢病毒和NTC-sgRNA慢病毒。

1.2.3利用FOXD1-sgRNA敲低间充质干细胞中的FOXD1蛋白：

以年轻的第4代间充质干细胞作为供试细胞，用上述制备好的编码FOXD1-sgRNA的慢病毒进行感染。具体方法为：2μL编码FOXD1-sgRNA的慢病毒和2μL Polybrene加到接种有第4代的间充质干细胞的培养孔(6孔板的一个孔)中。同时，也用相同条件在第4代的间充质干细胞中感染编码NTC-sgRNA的慢病毒作为对照处理。感染24小时后更换新鲜的培养基。72小时后加入Puromycin(1μg/mL)，连续处理3天。之后正常培养，传代。

以第6代感染NTC-sgRNA的间充质干细胞和第6代感染FOXD1-sgRNA的间充质干细胞作为供试细胞，检测FOXD1在两者中的表达量。方法同1.1。使用一抗为FOXD1(ThermoFisher，PA5-27142)，内参为GAPDH(Santa Cruz,sc-25778)，二抗为羊抗兔IgG/HRP(中杉金桥，ZDR-5306)。免疫印迹结果(附图1中B)显示，感染FOXD1-sgRNA的间充质干细胞中的FOXD1的表达量明显低于感染NTC-sgRNA的间充质干细胞。

1.2.4FOXD1敲低的间充质干细胞表现出加速衰老的表型：

感染FOXD1-sgRNA的间充质干细胞在传代后体积变大，形态扁平，生长明显缓慢。以第6代感染NTC-sgRNA的间充质干细胞和第6代感染FOXD1-sgRNA的间充质干细胞作为供试细胞，检测两者中衰老相关蛋白P16和P21的表达量。方法同1.1。免疫印迹结果(附图1中C)显示，感染FOXD1-sgRNA慢病毒的间充质干细胞中的P16和P21的表达量明显高于感染NTC-sgRNA慢病毒的间充质干细胞。SA-β-gal染色结果(附图1中D)也表明，感染FOXD1-sgRNA慢病毒的间充质干细胞中SA-β-gal活性远远高于感染NTC-sgRNA慢病毒的间充质干细胞。这表明FOXD1蛋白的降低加速了间充质干细胞的衰老。

1.3过表达FOXD1可延缓间充质干细胞的复制性衰老

鉴于上述结果发现的FOXD1在间充质干细胞衰老中的重要作用，以正常第5代的间充质干细胞作为供试细胞，进行FOXD1的过表达，检测FOXD1是否可以延缓间充质干细胞的衰老。具体方法如下：

1.3.1构建表达FOXD1的慢病毒载体

根据NCBI提供的FOXD1的cDNA序列(GenBank：NM_004472.2→NP_004463.1，updated on 8-Apr-2018)，如序列表中序列1所示。其中，序列1的第1-165位为5’非编码区域；第166-1563位为YAP蛋白的编码框(coding sequence，CDS)；第1564-2272位为3’非编码区域。基于此序列，设计引物，以人间充质干细胞的总cDNA为模板，进行FOXD1的编码序列的PCR。

FOXD1-CDS-F：5′-TAGAGGATCCCTCGAGATGACCCTGAGCACTGAGATGTCCGATG-3′

FOXD1-CDS-R：5′-GATTGTCGACACGCGTTTAACAATTGGAAATCCTAGCAG-3′

将PCR得到的FOXD1编码序列(序列1的第166-1563位)通过同源重组的方式连接到经过Xho1和Mlu1酶切的pLE4载体上，将得到的序列正确的编码FOXD1的慢病毒质粒命名为pLE4-FOXD1。pLE4-FOXD1的序列为序列表中序列2，pLE4-FOXD1能表达序列3所示的蛋白质，其中，序列3的第11-474位为FOXD1的序列，序列3所示的蛋白质由序列2的第4664-6088位编码。

编码FOXD1的慢病毒包装，方法同步骤1.2.2，得到编码FOXD1的慢病毒，记为FOXD1慢病毒。

1.3.2编码FOXD1的慢病毒感染间充质干细胞

以第5代的间充质干细胞作为供试细胞，用上述制备好的编码FOXD1慢病毒进行感染。具体方法为：1μL编码FOXD1的慢病毒和2μL Polybrene加到接种有第5代的间充质干细胞的培养孔(6孔板的一个孔)中。次日换液，之后正常培养，传代。同时，利用相同条件在第5代的间充质干细胞中感染了表达萤火虫荧光素酶(luciferase，Luc)的慢病毒作为对照处理。该病毒为“SIRT6safeguards human mesenchymal stem cells from oxidativestress by coactivating NRF2.Pan et.al,.Cell research.(2016)26:190-205.”一文中的Flag-luciferase。

对于分别感染编码Luc或FOXD1慢病毒的间充质干细胞连续传代后，发现感染编码FOXD1慢病毒的间充质干细胞的增殖速率超过Luc组(附图1中E)。Luc组间充质干细胞最多可传代至第11代，即生长完全阻滞；而FOXD1组间充质干细胞在第15代还表现出较强的增殖能力。SA-β-gal染色结果(附图1中F)表明，同为第10代的间充质干细胞，FOXD1组SA-β-gal活性远远低于Luc组间充质干细胞。这表明FOXD1的表达延缓了间充质干细胞的复制性衰老进程。

实施例2.FOXD1基因对于前交叉韧带切断建立的骨关节炎小鼠的治疗作用

由于实施例1获得的编码FOXD1慢病毒在体外具有良好的延缓间充质干细胞衰老的特性，本实施例将实施例1获得的编码FOXD1慢病毒用于前交叉韧带切断诱导的骨关节炎小鼠的基因治疗。

2.1建立前交叉韧带切断诱导的骨关节炎小鼠模型

所用小鼠均为SPF级，雄性，10周，体重20±2g，北京华阜康生物科技股份有限公司。实验器械和材料包括：异氟烷气体麻醉仪，脱毛器，手术剪刀，手术刀，维纳斯剪刀，缝合线，青霉素，体式镜，20μL微量进样器。

小鼠分为非手术组(3只，不进行手术)和手术组(8只)。对手术组小鼠进行前交叉韧带切断术建立骨关节炎小鼠模型的具体实验步骤如下：

1)小鼠麻醉，用脱毛器将小鼠腿部进行脱毛。

2)在小鼠腿部膝盖处剪皮，露出关节部位。

3)将小鼠转移到体式镜下进行手术：经膝关节内侧髌旁切口.逐层分离打开关节腔.将髌骨向外侧脱位后屈膝下完全暴露前交叉韧带(较细的一条白带)，用维纳斯剪在韧带中段予以切断，并剪除2mm韧带组织防止粘连愈合。两条腿的关节部位均进行手术。

4)生理盐水冲洗关节腔.将髌骨复位，严密缝合关节腔及皮肤。

5)在手术部位施加青霉素，防感染，得到前交叉韧带切断诱导的骨关节炎小鼠模型。

2.2 FOXD1基因对于骨关节炎小鼠的治疗效果评价

利用上述方法，建立了8只前交叉韧带切断诱导的骨关节炎小鼠模型。在手术后的第7天，进行慢病毒介导的基因治疗。将实施例1得到的编码FOXD1基因的慢病毒用20μL间充质干细胞培养基吹打重悬，同时利用实施例1中的编码Luc的慢病毒作为对照处理。随机挑取手术组的4只骨关节炎小鼠，在其左右膝关节部位，利用微量进样器，向左右关节腔中分别注射10μL编码FOXD1的慢病毒，在手术组的其余4只骨关节炎小鼠的左右膝关节腔利用相同方法，分别注射10μL编码Luc的慢病毒。在注射病毒后的第7周，对FOXD1基因治疗骨关节炎的效果进行了评价。具体方法如下：

1)micro-CT检测小鼠关节微结构

在注射病毒后的第7周，对各组利用micro-CT(PE公司)检测观察了小鼠关节的微结构。结果显示，与非手术组相比，手术组手术后注射Luc慢病毒的小鼠关节处出现了一些损伤性空洞；而手术组注射了FOXD1慢病毒的小鼠关节则没有这种损伤空洞(附图2中A)。

2)小鼠关节的软骨组织染色

小鼠骨关节炎的表型之一是关节处软骨细胞的减少。因此，在注射病毒后的第7周处死小鼠，取下每只小鼠左腿膝关节进行软骨的石蜡切片染色。具体步骤如下：

a)取下小鼠左腿膝关节，将肌肉和脂肪剥离干净。

b)用4％多聚甲醛固定72小时。

c)用甲酸脱钙液(5％甲酸，5％甲醛，90％水)进行关节的脱钙处理，时间为7天。

d)脱钙完全后，进行脱水，石蜡包埋，切片。切片厚度为5μm。

e)对切片进行脱蜡，复水。

f)铁苏木素(中杉金桥，ZLI-9610)染色8分钟，流水冲洗2分钟。

g)0.02％快绿(Sigma，S2255)染色8分钟，1％醋酸快速漂洗15秒。

h)0.1％番红O(Sigma，F7252)染色5分钟。

i)脱水，封片，镜下观察。

结果显示，与非手术组相比，手术组注射Luc慢病毒的小鼠股骨和胫骨处的软骨细胞明显减少，而当注射FOXD1慢病毒后软骨细胞的比例又有所增加(附图2中B)。对于染色的切片，根据国际骨关节炎研究学会(The Osteoarthritis Research SocietyInternational)的骨关节炎病理评级标准(Osteoarthritis score)进行评级打分，手术组中与注射表达Luc的慢病毒相比，注射FOXD1慢病毒小鼠的关节炎程度有明显下降(附图2中C)。

3)小鼠关节的RNA测序和RT-qPCR分析

小鼠骨关节炎的表型还包括关节腔炎症的增加，细胞的衰老及细胞的凋亡。因此，在注射病毒后第7周处死小鼠，取下每只小鼠右腿膝关节进行了RNA的提取和分析。分别选了一些与细胞增殖，细胞衰老，细胞凋亡及炎症密切相关的基因进行了RT-qPCR的分析。结果(附图2中D)表明，与非手术组相比，手术组注射Luc慢病毒的小鼠关节细胞的增殖基因(Aspm，Ki67)明显下调，而手术组注射FOXD 1慢病毒可以提高这些增殖基因的表达；与非手术组相比，手术组注射Luc慢病毒的小鼠关节细胞的衰老基因(Irs2，Ngf)，凋亡基因(Casp-4，Dapk)和炎症基因(Mmp13，Il6)明显上调，而手术组注射FOXD 1慢病毒可以有效降低这些基因的表达。

<110> 中国科学院动物研究所

<120> FOXD1在制备治疗和/或预防动物骨关节炎产品中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2272

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

cgccgccacc cggcagcccc ggcgcagctc cggcagccgc agtcgcagcg cccccagcgt 60

ggcgcccccc ggccgggcct gccgcccggg acccgggctg gggcgcagag ggagcccgga 120

gcccggcgcc cccatgcgcc gccccgccgc cgccgcgcca cagctatgac cctgagcact 180

gagatgtccg atgcctctgg cctcgccgag gaaacagaca tcgacgtggt gggggagggc 240

gaggacgaag aagacgagga agaggaggac gacgacgagg gcggcggtgg cgggccccgg 300

ctggctgtcc ccgcgcagcg gcggcggcgg cggcgctcgt acgccgggga ggacgagctg 360

gaggatctgg aggaggagga ggacgacgat gacatcctgc tggccccgcc tgctgggggc 420

tccccggcgc ccccgggccc ggccccggcg gcgggggcag gagccggtgg gggcggcggc 480

ggcggcggcg cgggcggcgg cgggagcgcg ggtagcggcg ccaagaaccc gctggtgaag 540

ccgccctact cgtatatcgc gctcatcact atggccatcc tgcagagccc caagaagcgg 600

ctgacgctga gcgagatctg tgagttcatc agcggccgct tcccctacta ccgggagaag 660

ttccccgcct ggcagaacag catccgccac aacctctcgc tcaacgactg cttcgtcaag 720

atcccccgcg agcccggcaa cccgggcaag ggcaactact ggacgctgga cccggagtcc 780

gccgacatgt tcgacaacgg cagcttcctg cgccggagga agcgcttcaa gcggcagccg 840

ctgctcccac ccaacgccgc ggccgccgag tctctgctgc tgcgcggcgc gggagccgca 900

gggggcgcgg gcgacccggc agccgccgcc gcgctcttcc cgcccgcgcc cccgccgccc 960

ccgcatgcct acggctacgg cccctacggc tgcggctacg gcctgcagct gccgccttac 1020

gcgccgccct cggccctctt cgccgccgca gcggccgccg ccgccgccgc cgccttccac 1080

ccgcactcgc ccccgccgcc cccgccaccg cacggcgcgg ccgccgagct ggcccggacc 1140

gccttcggct accggccgca cccgctcggc gccgccctac ccggccccct gccggcctcc 1200

gcggccaagg cgggcggccc gggcgcctca gcgctggcgc gctcgccctt ctccatcgag 1260

agcatcatcg ggggcagctt gggcccggcc gccgctgccg ccgccgccgc gcaggccgcc 1320

gccgccgctc aggcctcgcc ctcgccctcg ccggtggcgg cgccgccagc tcccggatcc 1380

agcggaggag gctgcgcggc gcaggcggcc gtgggcccgg cggccgcgct cacccgatcc 1440

ctcgtggccg ccgcggccgc cgccgcctcc tcagtctcct cgtccgccgc cttggggact 1500

ctgcaccaag ggactgccct gtccagtgtc gagaacttta ctgctaggat ttccaattgt 1560

taataacgct atgttagcgc gctcgaggaa gaaggtagga atcccggctc cttttctcgt 1620

cttggtggtt cggtgttttg ttcgctcctc caggcgcggc ccctctcgac ctcgcgcgcc 1680

cattttcgcc gctgcgaatt ctcggacaaa actgtcaaca gcccgggcgc gccttttggc 1740

tctgcgggtc cctctattta tgcaaagccg acctatgcta cagcccccca acccccgacc 1800

tggggtaggg aggaagaggg tgccggggaa gggagtccgc cctgtccagg cactagaggc 1860

tcccttgacg tttggcagat gaaaaacaac taagcctttt tgaggtgtag agattctcag 1920

gtccaggcgt taaaaaataa tggtcaaaag aataatacaa aaatagtaaa ggtcttgaag 1980

aatgccagcg aagcaattct tttttatttg aggacacttg tctggtgtac tttttcatga 2040

aaaggaaaaa tggttaacat gtttacacaa gaaaaaaagt caaaattatc atttatttca 2100

acctgtgttt tgtatcataa cagacgtgtg gatttttttg tacttactgc gtattcttta 2160

caaggagtat tgtaaatttt actggcaatt attattgtac tattctaaat gtaagatttt 2220

tacacttttt cagaaataaa aatgcttaat tttcaaagaa aattcaccaa aa 2272

<210> 2

<211> 8035

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

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taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

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tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

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tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

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tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

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ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340

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gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640

cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700

agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760

cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag 2820

atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880

tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940

atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120

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ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240

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tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600

tggaacagat tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 3660

aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga 3720

attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct 3780

gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt 3840

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ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga 3960

gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatct cgacggttaa cttttaaaag 4020

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catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt caaaatttta tcgatggtac 4140

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gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa gcdggtaggc 4440

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cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct 4620

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cgacgacaag ggcaccctga gcactgagat gtccgatgcc tctggcctcg ccgaggaaac 4740

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cgagggcggc ggtggcgggc cccggctggc tgtccccgcg cagcggcggc ggcggcggcg 4860

ctcgtacgcc ggggaggacg agctggagga tctggaggag gaggaggacg acgatgacat 4920

cctgctggcc ccgcctgctg ggggctcccc ggcgcccccg ggcccggccc cggcggcggg 4980

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cggcgccaag aacccgctgg tgaagccgcc ctactcgtat atcgcgctca tcactatggc 5100

catcctgcag agccccaaga agcggctgac gctgagcgag atctgtgagt tcatcagcgg 5160

ccgcttcccc tactaccggg agaagttccc cgcctggcag aacagcatcc gccacaacct 5220

ctcgctcaac gactgcttcg tcaagatccc ccgcgagccc ggcaacccgg gcaagggcaa 5280

ctactggacg ctggacccgg agtccgccga catgttcgac aacggcagct tcctgcgccg 5340

gaggaagcgc ttcaagcggc agccgctgct cccacccaac gccgcggccg ccgagtctct 5400

gctgctgcgc ggcgcgggag ccgcaggggg cgcgggcgac ccggcagccg ccgccgcgct 5460

cttcccgccc gcgcccccgc cgcccccgca tgcctacggc tacggcccct acggctgcgg 5520

ctacggcctg cagctgccgc cttacgcgcc gccctcggcc ctcttcgccg ccgcagcggc 5580

cgccgccgcc gccgccgcct tccacccgca ctcgcccccg ccgcccccgc caccgcacgg 5640

cgcggccgcc gagctggccc ggaccgcctt cggctaccgg ccgcacccgc tcggcgccgc 5700

cctacccggc cccctgccgg cctccgcggc caaggcgggc ggcccgggcg cctcagcgct 5760

ggcgcgctcg cccttctcca tcgagagcat catcgggggc agcttgggcc cggccgccgc 5820

tgccgccgcc gccgcgcagg ccgccgccgc cgctcaggcc tcgccctcgc cctcgccggt 5880

ggcggcgccg ccagctcccg gatccagcgg aggaggctgc gcggcgcagg cggccgtggg 5940

cccggcggcc gcgctcaccc gatccctcgt ggccgccgcg gccgccgccg cctcctcagt 6000

ctcctcgtcc gccgccttgg ggactctgca ccaagggact gccctgtcca gtgtcgagaa 6060

ctttactgct aggatttcca attgttaaac gcgtgtcgac aatcaacctc tggattacaa 6120

aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 6180

cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 6240

cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 6300

tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 6360

ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 6420

cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 6480

ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 6540

tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 6600

ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 6660

tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca 6720

atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 6780

gggctaattc actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg 6840

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 6900

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 6960

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca 7020

tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg 7080

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 7140

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 7200

tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 7260

cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 7320

tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc 7380

caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 7440

tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 7500

cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 7560

gaatggcgaa tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 7620

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 7680

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 7740

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 7800

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 7860

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 7920

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 7980

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcc 8035

<210> 3

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Thr Leu Ser Thr Glu Met

1 5 10 15

Ser Asp Ala Ser Gly Leu Ala Glu Glu Thr Asp Ile Asp Val Val Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Glu Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Gly Pro Arg Leu Ala Val Pro Ala Gln Arg Arg Arg Arg

50 55 60

Arg Arg Ser Tyr Ala Gly Glu Asp Glu Leu Glu Asp Leu Glu Glu Glu

65 70 75 80

Glu Asp Asp Asp Asp Ile Leu Leu Ala Pro Pro Ala Gly Gly Ser Pro

85 90 95

Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ser Gly Ala

115 120 125

Lys Asn Pro Leu Val Lys Pro Pro Tyr Ser Tyr Ile Ala Leu Ile Thr

130 135 140

Met Ala Ile Leu Gln Ser Pro Lys Lys Arg Leu Thr Leu Ser Glu Ile

145 150 155 160

Cys Glu Phe Ile Ser Gly Arg Phe Pro Tyr Tyr Arg Glu Lys Phe Pro

165 170 175

Ala Trp Gln Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu Asn Asp Cys Phe

180 185 190

Val Lys Ile Pro Arg Glu Pro Gly Asn Pro Gly Lys Gly Asn Tyr Trp

195 200 205

Thr Leu Asp Pro Glu Ser Ala Asp Met Phe Asp Asn Gly Ser Phe Leu

210 215 220

Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Arg Gln Pro Leu Leu Pro Pro Asn Ala

225 230 235 240

Ala Ala Ala Glu Ser Leu Leu Leu Arg Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly

245 250 255

Ala Gly Asp Pro Ala Ala Ala Ala Ala Leu Phe Pro Pro Ala Pro Pro

260 265 270

Pro Pro Pro His Ala Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Gly Cys Gly Tyr Gly

275 280 285

Leu Gln Leu Pro Pro Tyr Ala Pro Pro Ser Ala Leu Phe Ala Ala Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe His Pro His Ser Pro Pro Pro

305 310 315 320

Pro Pro Pro Pro His Gly Ala Ala Ala Glu Leu Ala Arg Thr Ala Phe

325 330 335

Gly Tyr Arg Pro His Pro Leu Gly Ala Ala Leu Pro Gly Pro Leu Pro

340 345 350

Ala Ser Ala Ala Lys Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ser Ala Leu Ala Arg

355 360 365

Ser Pro Phe Ser Ile Glu Ser Ile Ile Gly Gly Ser Leu Gly Pro Ala

370 375 380

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ala Ser

385 390 395 400

Pro Ser Pro Ser Pro Val Ala Ala Pro Pro Ala Pro Gly Ser Ser Gly

405 410 415

Gly Gly Cys Ala Ala Gln Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Ala Leu Thr

420 425 430

Arg Ser Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Val Ser Ser

435 440 445

Ser Ala Ala Leu Gly Thr Leu His Gln Gly Thr Ala Leu Ser Ser Val

450 455 460

Glu Asn Phe Thr Ala Arg Ile Ser Asn Cys

465 470

Claims

1.FOXD1的下述任一应用：

X1、制备治疗和/或预防小鼠前交叉韧带切断诱导的骨关节炎的产品；

X2、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；

所述FOXD1为氨基酸序列为序列3的蛋白质。

2.与权利要求1中所述FOXD1相关的生物材料的下述任一应用：

X2、制备延缓间充质干细胞的复制性衰老的产品；

所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述FOXD1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)：

b1)编码序列是序列表中序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2的第4664-6088位的cDNA分子或DNA分子。