CN111690621A - 一种含有ires-s1-n基因的重组病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含有ires-s1-n基因的重组病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有IRES‑S1‑N基因的重组病毒及其制备方法和应用。该重组病毒包括插入有IRES和S1‑N基因的新城疫病毒弱毒株LaSota基因组；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用新城疫病毒LaSota株作为载体，能有效表达两种外源蛋白，增强免疫保护效果，同时，该重组疫苗可以在鸡胚内或细胞内大批量繁殖，经济实用，安全高效。

Description

一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒及其制备方法和应用。
背景技术
鸡新城疫病毒，是由新城疫病毒(Newcastle Disease，ND)引起的严重危害养禽业的高度接触性传染病。新城疫病毒属于副粘病毒科，禽腮腺炎病毒属的禽副粘病毒I型。血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒的两种主要保护性抗原。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，之后世界各国均有流行记载。有强毒株和弱毒株两类，病毒分为强毒力型、中毒力型和低毒力型。家禽最易感，雏禽比成年禽类易感性更强。死亡率高，对养鸡业危害严重。
鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性高度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征；患病的鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由Schalk等报道于美国，1936年由Beach和Hudson确定本病的病原为病毒。至今本病在世界范围内广泛流行，给养鸡业带来严重危害。
而目前对于上述两种传染病多用灭活疫苗进行免疫，但免疫效果差。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒及其制备方法和应用，利用新城疫病毒LaSota株作为载体，有效表达两种外源蛋白，增强免疫保护效果，同时，该重组疫苗可以在鸡胚或细胞内大批量繁殖，经济实用，安全高效。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒，该重组病毒包括插入有IRES和S1-N基因的新城疫病毒弱毒株LaSota基因组；其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时，S1-N基因中含有159bp的非编码序列，与M-F之间的非编码序列相同。
一种构建上述重组病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取新城疫病毒弱毒株LaSota全长基因组RNA；
(2)分别用三对特异性引物对步骤(1)提取得到的RNA进行RT-PCR，获得3个cDNA片段，然后再将3个cDNA片段连接到pBluescript载体上，构建得到pFLC-LaSota重组质粒；
(3)分别构建含有新城疫病毒NP、P和L的辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L；
(4)将pFLC-LaSota载体线性化，然后再在其上F和HN之间连接IRES基因和S1-N基因，然后将其与步骤(3)构建的辅助质粒共转染Hep-2细胞，并用MVA/T7感染(由B.Moss博士赠送)，转染72h后，在9日龄SPF鸡胚内增殖，即可获得含有IRES-S1-N的重组病毒。
进一步地，pBluescript载体中含有T7启动子，即cDNA 5’端插入T7启动子序列，3’末端插入HDVRz和T7转录终止子序列。
进一步地，三对特异性引物分别为LS-F1-F和LS-F1-R、LS-F2-F和LS-F2-R，以及LS-F3-F和LS-F3-R。
进一步地，步骤(2)中RT-PCR体系为：1μL RNA、12.5μL 2×Buffer、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、1μL RT-PCR酶，最后用DEPC水补足至25μL。
进一步地，步骤(2)中RT-PCR反应程序为：50℃，反转录30min；94℃，预变性2min；94℃，变性30s；50℃，退火30s；72℃，延伸5.5min；共35个循环，最后72℃终末延伸10min。
进一步地，利用引物IRES Fe和IRES R通过PCR从IRES-GFP质粒中获得IRES基因。
进一步地，利用引物Ls vec F-M up和Ls vec F down对pFLC-LaSota重组质粒线性化。
上述含有IRES-S1-N基因的重组病毒在制备新城疫和/或鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。
上述含有IRES-S1-N基因的重组病毒在制备抗新城疫和/或鸡传染性支气管炎药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明可以解决了活病毒载体只表达一种外源蛋白的难题，可以实现两种或多种外源蛋白的表达，能够用于临床多种疾病的共同预防提供技术，为临床疫苗的研发和应用提供参考依据。
2、本发明利用LaSota病毒作为载体，能表达两种外源蛋白，甚至三种及以上都是可能的，可以增强其外源蛋白的表达，增强免疫保护效果，同时，该重组疫苗可以在鸡胚内大批量繁殖，经济实用，安全高效。
附图说明
图1为BamHI酶切鉴定pFLC-LaSota质粒的结果图；
图2为PCR扩增pFLC-LaSota线性化载体片段结果图；
图3为酶切鉴定重组rLS/IBV-S1-N结果图；
图4为重组病毒rLS/IBV-S1-N在SPF鸡胚内生长曲线图；
图5为间接免疫荧光鉴定重组病毒中N蛋白和HN蛋白的表达结果图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1提取LaSota全长基因组RNA
1、利用Trizol试剂提取LaSota全长基因组RNA
(1)在EP管中加入250μL的NDV鸡胚尿囊液，再加750μL的TRizlo试剂，混匀后室温孵育5min；
(2)加入200μL氯仿，立即剧烈震荡15s，室温静置5min；
(3)4℃，12 000rpm，15min，吸取上清液于新的EP管中备用；
(4)然后将吸取的上清液加入500μL异丙醇，混匀后室温静置10min；
(5)4℃，12 000rpm，离心15min，弃上清液；
(6)加入DEPC灭菌水配制的75％乙醇1mL，洗涤沉淀；
(7)4℃，7500rpm，15min。弃上清，室温放置晾干；
(8)加入50μL DEPC水，混匀，待RNA充分溶解后，置于-80℃保存备用。
实施例2新城疫病毒LaSota株感染性全长cDNA克隆的构建
应用三对特异引物(LS-F1F和LS-F1R、LS-F2F和LS-F2R、LS-F3F和LS-F3R，见表1)通过One step RT-PCR(Takara)获得覆盖全长基因组的3个各约5kb的cDNA片段(反应条件及程序如表2、3所示)。随后，应用In-
Figure BDA0002567580730000041
PCR Cloning Kit(Clontech)将3个cDNA片段连接到含有T7启动子的pBluescript载体上。
然后根据说明书将其转化到Stbl2细胞内(北京华越洋有限公司)，最后得到LaSota株全长基因组的质粒，BamHI酶切鉴定，为6个片段，分别为8.8kb、4.3kb、2.1kb、1.1kb、1.2kb、0.68kb，如图1所示，并将重组质粒命名为pFLC-LaSota。
表1 引物序列
Figure BDA0002567580730000051
表2 One step RT-PCR反应体系(25μL)
Figure BDA0002567580730000052
表3 RT-PCR反应条件
Figure BDA0002567580730000053
Figure BDA0002567580730000061
实施例3重组新城疫病毒的构建
1、扩增IRES、S1-N
利用一对引物(IRES Fe，IRES R)通过PCR从IRES-GFP质粒中获得IRES，将合成的基因S1-N利用IRES-S1F，N-M41R引物扩增后获得S1-N片段。
2、构建含有IRES-S1-N的重组NDV克隆
利用引物(Ls vec F-M up，Ls vec F down)进行PCR扩增，将LaSota载体线性化(PCR结果参见图2)，然后将IRES，S1-N片段通过In-fusion PCR Cloning Kit连接到线性化的载体上，再将其转化到Stbl2细胞内(Invitrogen)，最后筛选得到含有IBV S1-N基因的重组NDV的质粒，命名pFLC-LaSota/IBV–S1-N。转化后获得的重组质粒，用Hind III酶切4个片段分别为8427bp、6317bp、4896bp、2280bp，初步鉴定，结果如图3所示，结果表明S1-N片段已经插入到LaSota载体中，已成功构建含有IBV–S1-N的重组病毒。
实施例4构建辅助质粒
将NP、P、L三个基因通过RT-PCR从病毒基因组中扩增获得，然后分别将三个基因克隆到蛋白表达质粒载体pTM1(由B.Moss博士赠送)，所构建的辅助质粒经DNA核苷酸序列分析鉴定，将阳性质粒分别命名为pTM-NP、pTM-P和pTM-L。
实施例5重组病毒拯救
铺约1*106个HEp-2细胞至每孔细胞板中，预先用MVA/T7A感染。通过转染试剂，按说明书将pTM-NP、pTM-P、pTM-L和pFLC-LaSota/IBV–S1-N质粒共转染到HEp-2细胞上，转染后6小时，去掉转染培养基，并加入新鲜的2％FBS的DMEM培养基。72小时，通过将转染细胞反复冻融3次收获重组病毒，将重组病毒命名为rLS/IBV–S1-N。
实施例6
在9日龄SPF鸡胚内增殖，获得含有S1及N基因的重组病毒rLS/IBV-I-S1-N，间接免疫荧光鉴定重组蛋白表达(结果如图5所示)。并通过红细胞凝集实验(HA)、半数组织感染量(TCID50)、半数鸡胚感染量(EID50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)、体内外生长曲线(Growth curve)等方法鉴定重组病毒的滴度、毒力、体内外生长动力学等生物学特性(结果如表4、图4所示)。具体操作如下：
(1)HA：首先将1-12孔的V型微量反应板，每孔加入25μL PBS或生理盐水，再将25μL待检重组病毒加入第一孔,混匀后吸取25μL，加入第二孔，依次倍比稀释，至11孔，吸取25μL后弃去，第12孔为PBS对照。然后将每孔加入25μL 1％的鸡红细胞悬液。混匀后，室温放置30min,观察结果。如果红细胞凝集呈均匀分散，如果不凝集则红细胞沉于底部。以100％能出现病毒的红细胞凝集现象的病毒的最大稀释倍数者为该病毒的血凝价。
(2)TCID50：将DF-1细胞种植在96孔细胞培养板内，生长在含有抗生素和10％FBS的DMEM培养基中。接种前，将培养基更换为含有抗生素和2％FBS新鲜DMEM培养基，每孔180μL，将重组病毒rLS/IBV-S1-N 20μL接种于每排的第一孔，吹吸混匀以10倍梯度倍比稀释接种于DF-1细胞内，并与LaSota作对照。37℃5％CO2感染3d后，显微镜下观察病理变化，并应用Reed and Muenchmethod方法计算该病毒的TCID50。
(3)EID50：将重组病毒rLS/IBV-S1-N用PBS以10倍梯度倍比稀释，每个稀释度的病毒接种于5枚10日龄的SPF鸡胚，各100μL，37℃孵育4天后，通过HA检测每个稀释度感染的鸡胚数，根据Reed and Muench method方法计算该病毒的EID50。
(4)MDT：利用上述同样方法将倍比稀释的病毒通过尿囊腔接种于5枚10日龄的SPF鸡胚，各100μL，37℃孵育，每隔12h检查并记录每个稀释度接种鸡胚的死亡时间和死亡数，连续观察7天，计算鸡胚平均死亡时间，以病毒最高稀释倍数接种鸡胚全部死亡的平均时间为该病毒的MDT。
(5)ICPI：为了评估重组疫苗的安全性，1日龄SPF雏鸡，经脑内接种重组病毒rLS/IBV-S1-N每只雏鸡接种50μL，连续观察8d，记录雏鸡每天发病率和死亡率，并计算重组病毒的脑内致病指数ICPI。
(6)生长曲线：将重组病毒rLS/IBV-S1-N接种于9日龄SPF鸡胚，100μL/枚，分别在感染后0h、24h、48h、72h、96h后抽取尿囊液，每个时间点3枚鸡胚，2个重复。将各个时间点收取得尿囊液，用PBS以10倍梯度倍比稀释，每个稀释度的病毒接种于5枚9日龄的SPF鸡胚，100μL/枚，37℃孵育4d后，通过HA检测每个稀释度感染的鸡胚数，根据Reed and Muenchmethod方法计算该病毒感染后不同时间点的EID50，并以Log10的对数表示其效价,并与亲本病毒LaSota对比，其结果见图4。
(7)重组病毒rLS/IBV-S1-N蛋白表达的鉴定
为了确定重组病毒rLS/IBV-S1-N中S1和N蛋白及与NDV蛋白的表达，当用重组病毒rLS/IBV-S1-N感染DF-1细胞，利用双重染色，即用鼠抗IBV-N抗体和兔抗NDV HN抗体混合物孵育，随后用二者相应二抗鸡抗鼠IgG AF647和山羊抗兔IgGAF488混合物染色，通过荧光显微镜观察，可看到重组病毒感染的细胞既有绿色荧光NDV病毒HN蛋白的表达，又有红色荧光IBV N蛋白的表达。将绿色荧光和红色荧光合并后，可看到荧光表达在细胞的同一位置，结果表明，rLS/IBV-S1-N中N蛋白与NDV病毒HN蛋白在感染的细胞内共表达(参见图5)。
表4 重组病毒rLS/IBV-S1-N生物学特性鉴定
Figure BDA0002567580730000091
根据表4、图4和图5的检测结果可知，本申请已成功构建了表达IBV S1和N蛋白的重组NDV，其毒力在鸡胚内被致弱，并保持与亲本病毒相似的生长动力学。为抵抗新城疫和鸡传染性支气管炎病毒提供疫苗候选株，同时，能够为新城疫和其他病毒病的共同预防提供参考。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒及其制备方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21920
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgccggct gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacgcg 60
gccgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 120
caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 180
ggaggaacta tatccggatc ggccgatccg gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag 240
ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc 300
ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat ggccgccacc ggtgggcctt 360
gcagcacatc cccccttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 420
tcccaacagt tgcgtagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 480
gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 540
gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 600
ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 660
aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 720
cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 780
ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat 840
tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg 900
tttacaattt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 960
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 1020
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 1080
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 1140
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 1200
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg 1260
ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata 1320
cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat 1380
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataagca tgagtgataa cactgcggcc 1440
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt tcacaacatg 1500
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac 1560
gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact 1620
ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa 1680
gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct 1740
ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc 1800
tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggc agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga 1860
cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac 1920
tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag 1980
atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg 2040
tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc 2100
tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag 2160
ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc 2220
cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac 2280
ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc 2340
gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt 2400
tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt 2460
gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 2520
ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag gggggaacgc ctggtatctt 2580
tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 2640
ggggggccga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 2700
tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 2760
attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 2820
tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 2880
ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 2940
aacgcaatta atgtgagtta cctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt 3000
ccggctccta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat 3060
gaccatgatt acgccaagct cggaagcggc cgctaatacg actcactata gggaccaaac 3120
agagaatccg tgagttacga taaaaggcga aggagcaatt gaagtcgcac gggtagaagg 3180
tgtgaatctc gagtgcgagc ccgaagcaca aactcgagaa agccttctgc caacatgtct 3240
tccgtatttg atgagtacga acagctcctc gcggctcaga ctcgccccaa tggagctcat 3300
ggagggggag aaaaagggag taccttaaaa gtagacgtcc cggtattcac tcttaacagt 3360
gatgacccag aagatagatg gagctttgtg gtattctgcc tccggattgc tgttagcgaa 3420
gatgccaaca aaccactcag gcaaggtgct ctcatatctc ttttatgctc ccactcacag 3480
gtaatgagga accatgttgc cattgcaggg aaacagaatg aagccacatt ggccgtgctt 3540
gagattgatg gctttgccaa cggcacgccc cagttcaaca ataggagtgg agtgtctgaa 3600
gagagagcac agagatttgc gatgatagca ggatctctcc ctcgggcatg cagcaacgga 3660
accccgttcg tcacagccgg ggcagaagat gatgcaccag aagacatcac cgataccctg 3720
gagaggatcc tctctatcca ggctcaagta tgggtcacag tagcaaaagc catgactgcg 3780
tatgagactg cagatgagtc ggaaacaagg cgaatcaata agtatatgca gcaaggcagg 3840
gtccaaaaga aatacatcct ctaccccgta tgcaggagca caatccaact cacgatcaga 3900
cagtctcttg cagtccgcat ctttttggtt agcgagctca agagaggccg caacacggca 3960
ggtggtacct ctacttatta taacctggta ggggacgtag actcatacat caggaatacc 4020
gggcttactg cattcttctt gacactcaag tacggaatca acaccaagac atcagccctt 4080
gcacttagta gcctctcagg cgacatccag aagatgaagc agctcatgcg tttgtatcgg 4140
atgaaaggag ataatgcgcc gtacatgaca ttacttggtg atagtgacca gatgagcttt 4200
gcgcctgccg agtatgcaca actttactcc tttgccatgg gtatggcatc agtcctagat 4260
aaaggtactg ggaaatacca atttgccagg gactttatga gcacatcatt ctggagactt 4320
ggagtagagt acgctcaggc tcagggaagt agcattaacg aggatatggc tgccgagcta 4380
aagctaaccc cagcagcaat gaagggcctg gcagctgctg cccaacgggt ctccgacgat 4440
accagcagca tatacatgcc tactcaacaa gtcggagtcc tcactgggct tagcgagggg 4500
gggtcccaag ctctacaagg cggatcgaat agatcgcaag ggcaaccaga agccggggat 4560
ggggagaccc aattcctgga tctgatgaga gcggtagcaa atagcatgag ggaggcgcca 4620
aactctgcac agggcactcc ccaatcgggg cctcccccaa ctcctgggcc atcccaagat 4680
aacgacaccg actgggggta ttgatggaca aaacccagcc tgcttccaca aaaacatccc 4740
aatgccctca cccgtagtcg acccctcgat ttgcggctct atatgaccac accctcaaac 4800
aaacatcccc ctctttcctc cctccccctg ctgtacaact ccgcacgccc tagataccac 4860
aggcacaatg cggctcacta acaatcaaaa cagagccgag ggaattagaa aaaagtacgg 4920
gtagaagagg gatattcaga gatcagggca agtctcccga gtctctgctc tctcctctac 4980
ctgatagacc aggacaaaca tggccacctt tacagatgca gagatcgacg agctatttga 5040
gacaagtgga actgtcattg acaacataat tacagcccag ggtaaaccag cagagactgt 5100
tggaaggagt gcaatcccac aaggcaagac caaggtgctg agcgcagcat gggagaagca 5160
tgggagcatc cagccaccgg ccagtcaaga caaccccgat cgacaggaca gatctgacaa 5220
acaaccatcc acacccgagc aaacgacccc gcatgacagc ccgccggcca catccgccga 5280
ccagcccccc acccaggcca cagacgaagc cgtcgacaca cagttcagga ccggagcaag 5340
caactctctg ctgttgatgc ttgacaagct cagcaataaa tcgtccaatg ctaaaaaggg 5400
cccatggtcg agcccccaag aggggaatca ccaacgtccg actcaacagc aggggagtca 5460
acccagtcgc ggaaacagtc aggaaagacc gcagaaccaa gtcaaggccg cccctggaaa 5520
ccagggcaca gacgtgaaca cagcatatca tggacaatgg gaggagtcac aactatcagc 5580
tggtgcaacc cctcatgctc tccgatcaag gcagagccaa gacaataccc ttgtatctgc 5640
ggatcatgtc cagccacctg tagactttgt gcaagcgatg atgtctatga tggaggcgat 5700
atcacagaga gtaagtaagg ttgactatca gctagatctt gtcttgaaac agacatcctc 5760
catccctatg atgcggtccg aaatccaaca gctgaaaaca tctgttgcag tcatggaagc 5820
caacttggga atgatgaaga ttctggatcc cggttgtgcc aacatttcat ctctgagtga 5880
tctacgggca gttgcccgat ctcacccggt tttagtttca ggccctggag acccctctcc 5940
ctatgtgaca caaggaggcg aaatggcact taataaactt tcgcaaccag tgccacatcc 6000
atctgaattg attaaacccg ccactgcatg cgggcctgat ataggagtgg aaaaggacac 6060
tgtccgtgca ttgatcatgt cacgcccaat gcacccgagt tcttcagcca agctcctaag 6120
caagttagat gcagccgggt cgatcgagga aatcaggaaa atcaagcgcc ttgctctaaa 6180
tggctaatta ctactgccac acgtagcggg tccctgtcca ctcggcatca cacggaatct 6240
gcaccgagtt cccccccgca gacccaaggt ccaactctcc aagcggcaat cctctctcgc 6300
ttcctcagcc ccactgaatg gtcgcgtaac cgtaattaat ctagctacat ttaagattaa 6360
gaaaaaatac gggtagaatt ggagtgcccc aattgtgcca agatggactc atctaggaca 6420
attgggctgt actttgattc tgcccattct tctagcaacc tgttagcatt tccgatcgtc 6480
ctacaaggca caggagatgg gaagaagcaa atcgccccgc aatataggat ccagcgcctt 6540
gacttgtgga ctgatagtaa ggaggactca gtattcatca ccacctatgg attcatcttt 6600
caagttggga atgaagaagc cactgtcggc atgatcgatg ataaacccaa gcgcgagtta 6660
ctttccgctg cgatgctctg cctaggaagc gtcccaaata ccggagacct tattgagctg 6720
gcaagggcct gtctcactat gatagtcaca tgcaagaaga gtgcaactaa tactgagaga 6780
atggttttct cagtagtgca ggcaccccaa gtgctgcaaa gctgtagggt tgtggcaaac 6840
aaatactcat cagtgaatgc agtcaagcac gtgaaagcgc cagagaagat tcccgggagt 6900
ggaaccctag aatacaaggt gaactttgtc tccttgactg tggtaccgaa gaaggatgtc 6960
tacaagatcc cagctgcagt attgaaggtt tctggctcga gtctgtacaa tcttgcgctc 7020
aatgtcacta ttaatgtgga ggtagacccg aggagtcctt tggttaaatc tttgtctaag 7080
tctgacagcg gatactatgc taacctcttc ttgcatattg gacttatgac caccgtagat 7140
aggaagggga agaaagtgac atttgacaag ctggaaaaga aaataaggag ccttgatcta 7200
tctgtcgggc tcagtgatgt gctcgggcct tccgtgttgg taaaagcaag aggtgcacgg 7260
actaagcttt tggcaccttt cttctctagc agtgggacag cctgctatcc catagcaaat 7320
gcttctcctc aggtggccaa gatactctgg agtcaaaccg cgtgcctgcg gagcgttaaa 7380
atcattatcc aagcaggtac ccaacgcgct gtcgcagtga ccgccgacca cgaggttacc 7440
tctactaagc tggagaaggg gcacaccctt gccaaataca atccttttaa gaaataagct 7500
gcgtctctga gattgcgctc cgcccactca cccagatcat catgacacaa aaaactaatc 7560
tgtcttgatt atttacagtt agttaacctg tctatcaagt tagaaaaaac acgggtagaa 7620
gattctggat cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg gctccagacc ttctaccaag 7680
aacccagcac ctatgatgct gactatccgg gttgcgctgg tactgagttg catctgtccg 7740
gcaaactcca ttgatggcag gcctcttgca gctgcaggaa ttgtggttac aggagacaaa 7800
gccgtcaaca tatacacctc atcccagaca ggatcaatca tagttaagct cctcccgaat 7860
ctgcccaagg ataaggaggc atgtgcgaaa gcccccttgg atgcatacaa caggacattg 7920
accactttgc tcacccccct tggtgactct atccgtagga tacaagagtc tgtgactaca 7980
tctggagggg ggagacaggg gcgccttata ggcgccatta ttggcggtgt ggctcttggg 8040
gttgcaactg ccgcacaaat aacagcggcc gcagctctga tacaagccaa acaaaatgct 8100
gccaacatcc tccgacttaa agagagcatt gccgcaacca atgaggctgt gcatgaggtc 8160
actgacggat tatcgcaact agcagtggca gttgggaaga tgcagcagtt tgttaatgac 8220
caatttaata aaacagctca ggaattagac tgcatcaaaa ttgcacagca agttggtgta 8280
gagctcaacc tgtacctaac cgaattgact acagtattcg gaccacaaat cacttcacct 8340
gctttaaaca agctgactat tcaggcactt tacaatctag ctggtggaaa tatggattac 8400
ttattgacta agttaggtgt agggaacaat caactcagct cattaatcgg tagcggctta 8460
atcaccggta accctattct atacgactca cagactcaac tcttgggtat acaggtaact 8520
ctaccttcag tcgggaacct aaataatatg cgtgccacct acttggaaac cttatccgta 8580
agcacaacca ggggatttgc ctcggcactt gtccccaaag tggtgacaca ggtcggttct 8640
gtgatagaag aacttgacac ctcatactgt atagaaactg acttagattt atattgtaca 8700
agaatagtaa cgttccctat gtcccctggt atttattcct gcttgagcgg caatacgtcg 8760
gcctgtatgt actcaaagac cgaaggcgca cttactacac catacatgac tatcaaaggt 8820
tcagtcatcg ccaactgcaa gatgacaaca tgtagatgtg taaacccccc gggtatcata 8880
tcgcaaaact atggagaagc cgtgtctcta atagataaac aatcatgcaa tgttttatcc 8940
ttaggcggga taactttaag gctcagtggg gaattcgatg taacttatca gaagaatatc 9000
tcaatacaag attctcaagt aataataaca ggcaatcttg atatctcaac tgagcttggg 9060
aatgtcaaca actcgatcag taatgctttg aataagttag aggaaagcaa cagaaaacta 9120
gacaaagtca atgtcaaact gactagcaca tctgctctca ttacctatat cgttttgact 9180
atcatatctc ttgtttttgg tatacttagc ctgattctag catgctacct aatgtacaag 9240
caaaaggcgc aacaaaagac cttattatgg cttgggaata atactctaga tcagatgaga 9300
gccactacaa aaatgtgagc ccctctccct cccccccccc taacgttact ggccgaagcc 9360
gcttggaata aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt 9420
ttggcaatgt gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc 9480
tttcccctct cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc 9540
tggaagcttc ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc 9600
cacctggcga caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg 9660
cggcacaacc ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct 9720
cctcaagcgt attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat 9780
ctgatctggg gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc 9840
taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatatggcc 9900
acaaccatgt tggtaacacc tcttttacta gtgactcttt tgtgtgtact atgtagtgct 9960
gctttgtatg acagtagttc ttacgtttac tactaccaaa gtgcctttag accacctaat 10020
ggttggcatt tacacggggg tgcttatgcg gtagttaata tttctagcga atctaataat 10080
gcaggctctt cacctgggtg tattgttggt actattcatg gtggtcgtgt tgttaatgct 10140
tcttctatag ctatgacggc accgtcatca ggtatggctt ggtctagcag tcagttttgt 10200
actgcacact gtaacttttc agatactaca gtgtttgtta cacattgtta taaatatgat 10260
gggtgtccta taactggcat gcttcaaaag aattttttac gtgtttctgc tatgaaaaat 10320
ggccagcttt tctataattt aacagttagt gtagctaagt accctacttt taaatcattt 10380
cagtgtgtta ataatttaac atccgtatat ttaaatggtg atcttgttta cacctctaat 10440
gagaccacag atgttacatc tgcaggtgtt tattttaaag ctggtggacc tataacttat 10500
aaagttatga gagaagttaa agccctggct tattttgtta atggtactgc acaagatgtt 10560
attttgtgtg atggatcacc tagaggcttg ttagcatgcc agtataatac tggcaatttt 10620
tcagatggct tttatccttt tattaatagt agtttagtta agcagaagtt tattgtctat 10680
cgtgaaaata gtgttaatac tacttttacg ttacacaatt tcacttttca taatgagact 10740
ggcgccaacc ctaatcctag tggtgttcag aatattcaaa cttaccaaac acaaacagct 10800
cagagtggtt attataattt taatttttcc tttctgagta gttttgttta taaggagtct 10860
aattttatgt atggatctta tcacccaagt tgtaatttta gactagaaac tattaataat 10920
ggcttgtggt ttaattcact ttcagtttca attgcttacg gtcctcttca aggtggttgc 10980
aagcaatctg tctttagtgg tagagcaact tgttgttatg cttattcata tggaggtcct 11040
tcgctgtgta aaggtgttta ttcaggtgag ttagatctta attttgaatg tggactgtta 11100
gtttatgtta ctaagagcgg tggctctcgt atacaaacag ccactgaacc gccagttata 11160
actcgacaca attataataa tattacttta aatacttgtg ttgattataa tatatatggc 11220
agaactggcc aaggttttat tactaatgta accgactcag ctgttagtta taattatcta 11280
gcagacgcag gtttggctat tttagataca tctggttcca tagacatctt tgttgtacaa 11340
ggtgaatatg gtcttactta ttataaggtt aacccttgcg aagatgtcaa ccagcagttt 11400
gtagtttctg gtggtaaatt agtaggtatt cttacttcac gtaatgagac tggttctcag 11460
cttcttgaga accagtttta cattaaaatc actaatggaa cacgtcgttt tagacgttaa 11520
gctgcgtctc tgagattgcg ctccgcccac tcacccagat catcatgaca caaaaaacta 11580
atctgtcttg attatttaca gttagtttac ctgtctatca agttagaaaa aacacgggta 11640
gaagattctg gatcccggtt ggcgccctcc aggtgcaaga tggcaagcgg taaggcaact 11700
ggaaagacag atgccccagc tccagtcatc aaactaggag gaccaaagcc acctaaagtt 11760
ggttcttctg gaaatgtatc ttggtttcaa gcaataaaag ccaagaagtt aaattcacct 11820
ccgcctaagt ttgaaggtag cggtgttcct gataatgaaa atctaaaacc aagtcagcag 11880
catggatatt ggagacgcca agctaggttt aagccaggta aaggtggaag aaaaccagtc 11940
ccagatgctt ggtattttta ctatactgga acaggaccag ccgctaacct gaattggggt 12000
gatagccaag atggtatagt gtgggttgct ggtaagggtg ctgatactaa atttagatct 12060
aatcagggta ctcgtgactc tgacaagttt gaccaatatc cgctacggtt ttcagacgga 12120
ggacctgatg gtaatttccg ttgggatttc attcctctga atcgtggcag gagtgggaga 12180
tcaacagcag cttcatcagc agcatctagt agagcaccat cacgtgaagt ttcgcgtggt 12240
cgcaggagtg gttctgaaga tgatcttatt gctcgtgcag caaggataat tcaggatcag 12300
cagaagaagg gttctcgcat tacaaaggct aaggctgatg aaatggctca ccgccggtat 12360
tgcaagcgca ctattccacc taattataag gttgatcaag tgtttggtcc ccgtactaaa 12420
ggtaaggagg gaaattttgg tgatgacaag atgaatgagg aaggtattaa ggatgggcgc 12480
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acgcccagac ttcaaccaga tgggctgcac ttgaaatttg aatttactac tgtggtccca 12600
cgtgatgatc cgcagtttga taattatgta aaaatttgtg atcagtgtgt tgatggtgta 12660
ggaacacgtc caaaagatga tgaaccaaga ccaaagtcac gctcaagttc aagacctgca 12720
acaagaggaa attctccagc gccaagacag cagcgcccta agaaggagaa aaagccaaag 12780
aagcaggatg atgaagtgga taaagcattg acctcagatg aggagaggaa caatgcacag 12840
ctggaatttg atgatgaacc caaggtaatt aactgggggg attcagccct aggagagaat 12900
gaactttgac gtacacagat gaggaacgaa ggtttcccta atagtaattt gtgtgaaagt 12960
tctggtagtc tgtcagttca gagagttaag aaaaaactac cggttgtaga tgaccaaagg 13020
acgatatacg ggtagaacgg taagagaggc gcgccctcaa ttgcgagcca ggcttcacaa 13080
cctccgttct accgcttcac cgacaacagt cctcaatcat ggaccgcgcc gttagccaag 13140
ttgcgttaga gaatgatgaa agagaggcaa aaaatacatg gcgcttgata ttccggattg 13200
caatcttatt cttaacagta gtgaccttgg ctatatctgt agcctccctt ttatatagca 13260
tgggggctag cacacctagc gatcttgtag gcataccgac taggatttcc agggcagaag 13320
aaaagattac atctacactt ggttccaatc aagatgtagt agataggata tataagcaag 13380
tggcccttga gtctccgttg gcattgttaa atactgagac cacaattatg aacgcaataa 13440
catctctctc ttatcagatt aatggagctg caaacaacag tgggtggggg gcacctatcc 13500
atgacccaga ttatataggg gggataggca aagaactcat tgtagatgat gctagtgatg 13560
tcacatcatt ctatccctct gcatttcaag aacatctgaa ttttatcccg gcgcctacta 13620
caggatcagg ttgcactcga ataccctcat ttgacatgag tgctacccat tactgctaca 13680
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ttggtgtgct ccggacatct gcaacaggga gggtattctt ttctactctg cgttccatca 13800
acctggacga cacccaaaat cggaagtctt gcagtgtgag tgcaactccc ctgggttgtg 13860
atatgctgtg ctcgaaagtc acggagacag aggaagaaga ttataactca gctgtcccta 13920
cgcggatggt acatgggagg ttagggttcg acggccagta ccacgaaaag gacctagatg 13980
tcacaacatt attcggggac tgggtggcca actacccagg agtagggggt ggatctttta 14040
ttgacagccg cgtatggttc tcagtctacg gagggttaaa acccaattca cccagtgaca 14100
ctgtacagga agggaaatat gtgatataca agcgatacaa tgacacatgc ccagatgagc 14160
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gcatacagca ggctatctta tctatcaagg tgtcaacatc cttaggcgaa gacccggtac 14280
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ctatgacagt cagcaacaaa acagccactc ttcatagtcc ttatacattc aatgccttca 14460
ctcggccagg tagtatccct tgccaggctt cagcaagatg ccccaactcg tgtgttactg 14520
gagtctatac agatccatat cccctaatct tctatagaaa ccacaccttg cgaggggtat 14580
tcgggacaat gcttgatggt gtacaagcaa gacttaaccc tgcgtctgca gtattcgata 14640
gcacatcccg cagtcgcatt actcgagtga gttcaagcag taccaaagca gcatacacaa 14700
catcaacttg ttttaaagtg gtcaagacta ataagaccta ttgtctcagc attgctgaaa 14760
tatctaatac tctcttcgga gaattcagaa tcgtcccgtt actagttgag atcctcaaag 14820
atgacggggt tagagaagcc aggtctggct agttgagtca attataaagg agttggaaag 14880
atggcattgt atcacctatc ttctgcgaca tcaagaatca aaccgaatgc cggcgcgtgc 14940
tcgaattcca tgttgccagt tgaccacaat cagccagtgc tcatgcgatc agattaagcc 15000
ttgtcattaa ttaattgatt aagaaaaaat gtaagtggca atgagataca aggcaaaaca 15060
gctcatggta aataatacgg gtaggacatg gcgagctccg gtcctgaaag ggcagagcat 15120
cagattatcc taccagagcc acacctgtct tcaccattgg tcaagcacaa actactctat 15180
tactggaaat taactgggct accgcttcct gatgaatgtg acttcgacca cctcattctc 15240
agccgacaat ggaaaaaaat acttgaatcg gcctctcctg atactgagag aatgataaaa 15300
ctcggaaggg cagtacacca aactcttaac cacaattcca gaataaccgg agtgctccac 15360
cccaggtgtt tagaacaact ggctaatatt gaggtcccag attcaaccaa caaatttcgg 15420
aagattgaga agaagatcca aattcacaac acgagatatg gagaactgtt cacaaggctg 15480
tgtacgcata tagagaagaa actgctgggg tcatcttggt ctaacaatgt cccccggtca 15540
gaggagttca gcagcattcg tacggatccg gcattctggt ttcactcaaa atggtccaca 15600
gccaagtttg catggctcca tataaaacag atccagaggc atctgatggt ggcagctaag 15660
acaaggtctg cggccaacaa attggtgatg ctaacccata aggtaggcca agtctttgtc 15720
actcctgaac ttgtcgttgt gacgcatacg aatgagaaca agttcacatg tcttacccag 15780
gaacttgtat tgatgtatgc agatatgatg gagggcagag atatggtcaa cataatatca 15840
accacggcgg tgcatctcag aagcttatca gagaaaattg atgacatttt gcggttaata 15900
gacgctctgg caaaagactt gggtaatcaa gtctacgatg ttgtatcact aatggaggga 15960
tttgcatacg gagctgtcca gctactcgag ccgtcaggta catttgcagg agatttcttc 16020
gcattcaacc tgcaggagct taaagacatt ctaattggcc tcctccccaa tgatatagca 16080
gaatccgtga ctcatgcaat cgctactgta ttctctggtt tagaacagaa tcaagcagct 16140
gagatgttgt gtctgttgcg tctgtggggt cacccactgc ttgagtcccg tattgcagca 16200
aaggcagtca ggagccaaat gtgcgcaccg aaaatggtag actttgatat gatccttcag 16260
gtactgtctt tcttcaaggg aacaatcatc aacgggtaca gaaagaagaa tgcaggtgtg 16320
tggccgcgag tcaaagtgga tacaatatat gggaaggtca ttgggcaact acatgcagat 16380
tcagcagaga tttcacacga tatcatgttg agagagtata agagtttatc tgcacttgaa 16440
tttgagccat gtatagaata tgaccctgtc accaacctga gcatgttcct aaaagacaag 16500
gcaatcgcac accccaacga taattggctt gcctcgttta ggcggaacct tctctccgaa 16560
gaccagaaga aacatgtaaa agaagcaact tcgactaatc gcctcttgat agagttttta 16620
gagtcaaatg attttgatcc atataaagag atggaatatc tgacgaccct tgagtacctt 16680
agagatgaca atgtggcagt atcatactcg ctcaaggaga aggaagtgaa agttaatgga 16740
cggatcttcg ctaagctgac aaagaagtta aggaactgtc aggtgatggc ggaagggatc 16800
ctagccgatc agattgcacc tttctttcag ggaaatggag tcattcagga tagcatatcc 16860
ttgaccaaga gtatgctagc gatgagtcaa ctgtctttta acagcaataa gaaacgtatc 16920
actgactgta aagaaagagt atcttcaaac cgcaatcatg atccgaaaag caagaaccgt 16980
cggagagttg caaccttcat aacaactgac ctgcaaaagt actgtcttaa ttggagatat 17040
cagacaatca aattgttcgc tcatgccatc aatcagttga tgggcctacc tcacttcttc 17100
gaatggattc acctaagact gatggacact acgatgttcg taggagaccc tttcaatcct 17160
ccaagtgacc ctactgactg tgacctctca agagtcccta atgatgacat atatattgtc 17220
agtgccagag ggggtatcga aggattatgc cagaagctat ggacaatgat ctcaattgct 17280
gcaatccaac ttgctgcagc tagatcgcat tgtcgtgttg cctgtatggt acagggtgat 17340
aatcaagtaa tagcagtaac gagagaggta agatcagacg actctccgga gatggtgttg 17400
acacagttgc atcaagccag tgataatttc ttcaaggaat taattcatgt caatcatttg 17460
attggccata atttgaagga tcgtgaaacc atcaggtcag acacattctt catatacagc 17520
aaacgaatct tcaaagatgg agcaatcctc agtcaagtcc tcaaaaattc atctaaatta 17580
gtgctagtgt caggtgatct cagtgaaaac accgtaatgt cctgtgccaa cattgcctct 17640
actgtagcac ggctatgcga gaacgggctt cccaaagact tctgttacta tttaaactat 17700
ataatgagtt gtgtgcagac atactttgac tctgagttct ccatcaccaa caattcgcac 17760
cccgatctta atcagtcgtg gattgaggac atctcttttg tgcactcata tgttctgact 17820
cctgcccaat tagggggact gagtaacctt caatactcaa ggctctacac tagaaatatc 17880
ggtgacccgg ggactactgc ttttgcagag atcaagcgac tagaagcagt gggattactg 17940
agtcctaaca ttatgactaa tatcttaact aggccgcctg ggaatggaga ttgggccagt 18000
ctgtgcaacg acccatactc tttcaatttt gagactgttg caagcccaaa tattgttctt 18060
aagaaacata cgcaaagagt cctatttgaa acttgttcaa atcccttatt gtctggagtg 18120
cacacagagg ataatgaggc agaagagaag gcattggctg aattcttgct taatcaagag 18180
gtgattcatc cccgcgttgc gcatgccatc atggaggcaa gctctgtagg taggagaaag 18240
caaattcaag ggcttgttga cacaacaaac accgtaatta agattgcgct tactaggagg 18300
ccattaggca tcaagaggct gatgcggata gtcaattatt ctagcatgca tgcaatgctg 18360
tttagagacg atgttttttc ctccagtaga tccaaccacc ccttagtctc ttctaatatg 18420
tgttctctga cactggcaga ctatgcacgg aatagaagct ggtcaccttt gacgggaggc 18480
aggaaaatac tgggtgtatc taatcctgat acgatagaac tcgtagaggg tgagattctt 18540
agtgtaagcg gagggtgtac aagatgtgac agcggagatg aacaatttac ttggttccat 18600
cttccaagca atatagaatt gaccgatgac accagcaaga atcctccgat gagggtacca 18660
tatctcgggt caaagacaca ggagaggaga gctgcctcac ttgcaaaaat agctcatatg 18720
tcgccacatg taaaggctgc cctaagggca tcatccgtgt tgatctgggc ttatggggat 18780
aatgaagtaa attggactgc tgctcttacg attgcaaaat ctcggtgtaa tgtaaactta 18840
gagtatcttc ggttactgtc ccctttaccc acggctggga atcttcaaca tagactagat 18900
gatggtataa ctcagatgac attcacccct gcatctctct acaggtgtca ccttacattc 18960
acatatccaa tgattctcaa aggctgttca ctgaagaagg agtcaaagag gggaatgtgg 19020
tttaccaaca gagtcatgct cttgggttta tctctaatcg aatcgatctt tccaatgaca 19080
acaaccagga catatgatga gatcacactg cacctacata gtaaatttag ttgctgtatc 19140
agagaagcac ctgttgcggt tcctttcgag ctacttgggg tggtaccgga actgaggaca 19200
gtgacctcaa ataagtttat gtatgatcct agccctgtat cggagggaga ctttgcgaga 19260
cttgacttag ctatcttcaa gagttatgag cttaatctgg agtcatatcc cacgatagag 19320
ctaatgaaca ttctttcaat atccagcggg aagttgattg gccagtctgt ggtttcttat 19380
gatgaagata cctccataaa gaatgacgcc ataatagtgt atgacaatac ccgaaattgg 19440
atcagtgaag ctcagaattc agatgtggtc cgcctatttg aatatgcagc acttgaagtg 19500
ctcctcgact gttcttacca actctattac ctgagagtaa gaggcctaga caatattgtc 19560
ttatatatgg gtgatttata caagaatatg ccaggaattc tactttccaa cattgcagct 19620
acaatatctc atcccgtcat tcattcaagg ttacatgcag tgggcctggt caaccatgac 19680
ggatcacacc aacttgcaga tacggatttt atcgaaatgt ctgcaaaact attagtatct 19740
tgcacccgac gtgtgatctc cggcttatat tcaggaaata agtatgatct gctgttccca 19800
tctgtcttag atgataacct gaatgagaag atgcttcagc tgatatcccg gttatgctgt 19860
ctgtacacgg tactctttgc tacaacaaga gaaatcccga aaataagagg cttaactgca 19920
gaagagaaat gttcaatact cactgagtat ttactgtcgg atgctgtgaa accattactt 19980
agccccgatc aagtgagctc tatcatgtct cctaacataa ttacattccc agctaatctg 20040
tactacatgt ctcggaagag cctcaatttg atcagggaaa gggaggacag ggatactatc 20100
ctggcgttgt tgttccccca agagccatta ttagagttcc cttctgtgca agatattggt 20160
gctcgagtga aagatccatt cacccgacaa cctgcggcat ttttgcaaga gttagatttg 20220
agtgctccag caaggtatga cgcattcaca cttagtcaga ttcatcctga actcacatct 20280
ccaaatccgg aggaagacta cttagtacga tacttgttca gagggatagg gactgcatct 20340
tcctcttggt ataaggcatc tcatctcctt tctgtacccg aggtaagatg tgcaagacac 20400
gggaactcct tatacttagc tgaagggagc ggagccatca tgagtcttct cgaactgcat 20460
gtaccacatg aaactatcta ttacaatacg ctcttttcaa atgagatgaa ccccccgcaa 20520
cgacatttcg ggccgacccc aactcagttt ttgaattcgg ttgtttatag gaatctacag 20580
gcggaggtaa catgcaaaga tggatttgtc caagagttcc gtccattatg gagagaaaat 20640
acagaggaaa gtgacctgac ctcagataaa gcagtggggt atattacatc tgcagtgccc 20700
tacagatctg tatcattgct gcattgtgac attgaaattc ctccagggtc caatcaaagc 20760
ttactagatc aactagctat caatttatct ctgattgcca tgcattctgt aagggagggc 20820
ggggtagtaa tcatcaaagt gttgtatgca atgggatact actttcatct actcatgaac 20880
ttgtttgctc cgtgttccac aaaaggatat attctctcta atggttatgc atgtcgagga 20940
gatatggagt gttacctggt atttgtcatg ggttacctgg gcgggcctac atttgtacat 21000
gaggtggtga ggatggcaaa aactctggtg cagcggcacg gtacgctctt gtctaaatca 21060
gatgagatca cactgaccag gttattcacc tcacagcggc agcgtgtgac agacatccta 21120
tccagtcctt taccaagatt aataaagtac ttgaggaaga atattgacac tgcgctgatt 21180
gaagccgggg gacagcccgt ccgtccattc tgtgcggaga gtctggtgag cacgctagcg 21240
aacataactc agataaccca gattatcgct agtcacattg acacagttat ccggtctgtg 21300
atatatatgg aagctgaggg tgatctcgct gacacagtat ttctatttac cccttacaat 21360
ctctctactg acgggaaaaa gaggacatca cttatacagt gcacgagaca gatcctagag 21420
gttacaatac taggtcttag agtcgaaaat ctcaataaaa taggcgatat aatcagccta 21480
gtgcttaaag gcatgatctc catggaggac cttatcccac taaggacata cttgaagcat 21540
agtacctgcc ctaaatattt gaaggctgtc ctaggtatta ccaaactcaa agaaatgttt 21600
acagacactt ctgtattgta cttgactcgt gctcaacaaa aattctacat gaaaactata 21660
ggcaatgcag tcaaaggata ttacagtaac tgtgactctt aacgaaaatc acatattaat 21720
aggctccttt tttggccaat tgtattcttg ttgatttaat catattatgt tagaaaaaag 21780
ttgaaccctg actccttagg actcgaattc gaactcaaat aaatgtctta aaaaaaggtt 21840
gcgcacaatt attcttgagt gtagtctcgt cattcaccaa atctttgttt ggtggccggc 21900
atggtcccag cctcctcgct 21920
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgactcacta tagggaccaa acagagaatc cgtgag 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaccatgc cggccaaatc ccctggttgt gcttac 36
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaccaggg gatttgcctc ggca 24
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaccatgc cggccggcta ggatcccttc cgccat 36
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagggatcc tagccgatca gattgcacct ttct 34
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggaccatgc cggccaccaa acaaagattt ggtgaa 36
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcacattttt gtagtggctc tcatc 25
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acacagatga ggaacgaagg tttccctaat ag 32
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccactacaa aaatgtgagc ccctctccct ccc 33
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgtggccata ttatcatcgt g 21
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgatgataat atggccacaa ccatgttggt aacacc 36
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gttcctcatc tgtgtacgtc aaagttcatt ctc 33

Claims (8)

1.一种含有IRES-S1-N基因的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒包括插入有IRES和S1-N基因的新城疫病毒弱毒株LaSota基因组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种构建权利要求1所述重组病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取新城疫病毒弱毒株LaSota全长基因组RNA；
(2)分别用三对特异性引物对步骤(1)提取得到的RNA进行RT-PCR，获得3个cDNA片段，然后再将3个cDNA片段连接到pBluescript载体上，构建得到pFLC-LaSota重组质粒；
(3)分别构建含有新城疫病毒NP、P和L的辅助质粒pTM-NP、pTM-P和pTM-L；
(4)将pFLC-LaSota载体线性化，然后再在其上连接IRES基因和S1-N基因，然后将其与步骤(3)构建的辅助质粒共转染细胞，即可获得含有IRES-S1-N的重组病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pBluescript载体中含有T7启动子。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三对特异性引物分别为LS-F1-F和LS-F1-R、LS-F2-F和LS-F2-R，以及LS-F3-F和LS-F3-R。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RT-PCR体系为：1μL RNA、12.5μL 2×Buffer、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、1μL RT-PCR酶，最后用DEPC水补足至25μL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RT-PCR反应程序为：50℃，反转录30min；94℃，预变性2min；94℃，变性30s；50℃，退火30s；72℃，延伸5.5min；共35个循环，最后72℃终末延伸10min。
7.权利要求1所述的含有IRES-S1-N基因的重组病毒在制备新城疫和/或鸡传染性支气管炎疫苗中的应用。
8.权利要求1所述的含有IRES-S1-N基因的重组病毒在制备抗新城疫和/或鸡传染性支气管炎药物中的应用。
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