CN108823139B - 一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)‑pBENT‑H1，属于基因工程菌的构建的技术领域，保藏编号为CGMCC No.15819。本发明提供的生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够生产肝素酶，肝素酶的酶活为2540U/L，将得到的肝素酶酶解肝素，得到的超低分子量肝素的重均分子量为1419Da，低分子量肝素的Anti‑FXa/Anti‑FIIa效价比值为28.4。

Description

一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程菌的构建的技术领域，具体涉及一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用。

背景技术

肝素及其结构类似物硫酸乙酰肝素是一类由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸组成的长链多糖，属于粘多糖中的一种。从1935年以来，肝素和硫酸乙酰肝素正式用作临床抗凝药物，成为仅次于胰岛素的第二大类天然产物药物，全球年产值达100亿美元，广泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病。然而，临床应用表明，在肝素治疗中常伴随着很多不同的副作用，例如出血、肝素诱导性血小板减少症、过敏反应等。为了避免利用普通肝素带来的副作用，有学者提出了低分子量肝素的概念。低分子量肝素是由普通肝素(相对分子量在3000-30000)通过化学裂解法或肝素酶裂解法解聚得到的一类相对分子量在3000-8000的肝素的总称，包括伊诺肝素，达肝素钠，亭扎肝素等。因临床应用证明低分子量肝素在引起血小板减少、骨质疏松、出血等副作用方面优于普通肝素，当前低分子量肝素已取代大部分普通肝素的市场。而现阶段正在进行第三代创新型药物-超低分子量肝素的研发。超低分子量肝素的平均相对分子量小于2500，Anti-FXa/Anti-FIIa效价更高，抗凝血活性优于低分子量肝素，出血和血小板减少症等副作用更小，所以其研究与制备受到越来越多的关注。

目前已报道的几种超低分子肝素均为化学方法制备，该法处理效果过于激烈容易导致某些基团损坏从而失去生物活性，使得制备的肝素具有多分散性、微观非均相和结构变异大等缺点。相比之下，肝素酶裂解法的反应条件更加温和且环境友好，生成的不饱和糖醛酸的分子量与232nm处的紫外吸收有一定关系，便于检测，产物中不会引入有毒物质，产物硫酸化程度较高，不会作用于硫酸基团，且产物和肝素酶易于分离，生产中十分方便，易实现生产的连续化。同时，酶可反复使用，可极大的节约成本，是较理想的工业化生产途径。然而根据现状来看，虽然我国是肝素原料的出口大国，但是肝素类药物的生产技术一直缺乏系统的研究，目前我国肝素类药物还需要依靠进口或者来自合资企业生产，因此，肝素类药物的酶法生产研究具有重要的工业应用前景。

但是在过去的十年里报道了许多关于产肝素酶的微生物的研究，一般都是关于肝素黄杆菌产的肝素酶，经过NCBI数据库验证，目前为止，未见利用肝素酶基因构建的重组菌来生产肝素酶。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用，所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够使肝素酶的酶活得到提高，且利于后续肝素酶的分离纯化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，保藏编号为CGMCC No.15819。

本发明还提供了上述技术方案所述的生产肝素酶的大肠埃希菌的构建方法，包括以下步骤：

1)提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；

所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQIDNo.2所示的序列；

2)以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；

所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQID No.3所示的序列，所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列；

3)将所述步骤1)得到的肝素酶基因与所述步骤2)得到的质粒基因通过GibsonAssembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒pBENT-H1转化到大肠埃希氏菌中，得到生产肝素酶的大肠埃希氏菌；

所述步骤1)和2)没有时间顺序限定。

优选的，所述步骤1)PCR扩增的体系每50μL包括：100ng/μL的全基因组DNA 1μL、10μM的肝素酶基因上游引物0.5μL、10μM的肝素酶基因下游引物0.5μL、PCR Premix酶25μL和ddH 2O 8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃10s；72℃5min；4℃10min；35个循环。

优选的，所述步骤2)PCR扩增的体系每50μL包括：浓度为47.5ng/μL的质粒DNA 1μL、浓度为10μM的质粒上游引物0.5μL、浓度为10μM的质粒下游引物0.5μL、PCRPremix酶25μL和ddH 2O8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃5min；72℃5min；4℃10min；35个循环。

优选的，所述步骤3)连接的体系每20μL包括：Gibson Mast Mix10μL、浓度为19.9ng/μL的肝素酶基因1μL、浓度为37.4ng/μL的质粒pBENT 6μL和ddH 2O 3μL；

所述连接的条件包括：50℃反应15min。

优选的，所述步骤4)转化的条件包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在0～4℃下静置40～50min，再37～45℃热激20～40s，然后在0～4℃下静置3～7min；

所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌的体积比为(1～3):(90～110)。

本发明还提供了上述技术方案所述的生产肝素酶的大肠埃希氏菌在生产肝素酶中的应用。

优选的，所述生产肝素酶的方法包括以下步骤：

1)将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于发酵培养基中，使得到的发酵初始混合物的OD 600值为0.2～0.3；

2)将所述步骤1)得到的发酵初始混合物在35～37℃下振荡培养2～3h，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物与异丙基硫代半乳糖苷混合，得到含有异丙基硫代半乳糖苷混合物，将所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物在15～18℃下振荡培养7～9h，得到肝素酶；所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为250～300μM。

优选的，所述步骤1)发酵培养基以水为溶剂，每升包括：10～15g胰蛋白胨、5～10g酵母提取物和10～15g氯化钠，所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌，能够生产高活性肝素酶，且利于后续分离纯化肝素酶。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够生产肝素酶，肝素酶的酶活为2540U/L，将得到的肝素酶酶解肝素，得到的超低分子量肝素的重均分子量为1419Da，低分子量肝素的Anti-FXa/Anti-FIIa效价比值为28.4。

生物保藏说明

生产肝素酶的大肠埃希氏菌命名为大肠埃希氏菌BLR(DE3)-pBENT-H1，拉丁文名称为Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，于2018年05月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.15819。

附图说明

图1为超低分子肝素Anti-FXa效价标准曲线；

图2为超低分子肝素Anti-FIIa效价标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，保藏编号为CGMCC No.15819。

在本发明中，所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够使肝素酶的酶活得到提高，且利于后续肝素酶的分离纯化。

本发明还提供了上述技术方案所述的生产肝素酶的大肠埃希菌的构建方法，包括以下步骤：

1)提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；

所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQIDNo.2所示的序列；

2)以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；

所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQID No.3所示的序列，所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列；

3)将所述步骤1)得到的肝素酶基因与所述步骤2)得到的质粒基因通过GibsonAssembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒pBENT-H1转化到大肠埃希氏菌中，得到生产肝素酶的大肠埃希氏菌；

所述步骤1)和2)没有时间顺序限定。

本发明提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQ ID No.2所示的序列。

本发明对所述含有肝素酶基因的微生物的种类没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的含肝素酶基因的微生物即可，在本发明实施例中，所述微生物优选为拉乌尔菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15，该菌株的保藏编号为CGMCC No.13723。

本发明对所述全基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用常规提取微生物全基因组DNA的方法即可，在本发明实施例中具体采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取。

在本发明中，所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，具体序列如下所示：

5’-aagaaggagatatacacatgatgcggatgaagcagtattt-3’；

所述肝素酶基因下游引物具有SEQ ID No.2所示的序列，具体序列如下所示：

5’-tctgcgatcgctcactattattatccatgactaacctttgctaatt-3’。

本发明用肝素酶基因引物对进行PCR扩增的体系优选每50μL包括：100ng/μL的全基因组DNA 1μL、10μM的肝素酶基因上游引物0.5μL、10μM的肝素酶基因下游引物0.5μL、PCRPremix酶25μL和ddH 2O 8μL。在本发明中，所述PCR Premix酶优选为PCR Premix(2×)酶。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

本发明用肝素酶基因引物对进行PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃10s；72℃5min；4℃10min；35个循环。

在本发明中，所述肝素酶基因具有SEQ ID No.5所示的序列，具体序列如下：

5’-aagaaggagatatacacatgatgcggatgaagcagtatttgattgccccttcgattctgtcggctgattttgcccgcctgggcgaggataccgccaaagctctggctgcaggtgcggacgttgtgcactttgacgtgatggacaaccactacgtgccgaatctgaccatcggccctatggtgttgaaagcgctacgcaactatggcatcaccgccccgatcgacgtgcacctgatggtgaaaccggtcgaccgcatcattcctgatttcgccgcggcgggcgccagcatcatcaccttccacccggaagcctctgagcacgtcgatcgcagcctgcagctgatcaaagaacatggctgtaaagccggtctggtgtttaacccggccacgccgctgagctaccttgattatgtgatggataagctggacgttattctgctgatgtccgttaacccggggttcggcggtcagtccttcatcccccagactctggataaactgcgcgaagtgcgtcagcgcatcgatgcgtcgggttatgatattcgtctggaagtcgacggcggcgtgaaggtcagtaatattgcggatattgcggcggcaggcgcagatatgtttgttgccggttcggcgattttcgatcgtccggactacaaggaggttatcgatcaaatgcgtagtgaattagcaaaggttagtcatggataataatagtgagcgatcgcaga-3’。

本发明以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ ID No.3所示的序列，所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列。

在本发明中，所述质粒优选为质粒pBENT。本发明对所述质粒pBENT DNA的提取方法没有特殊限定。

本发明根据质粒的多克隆位点区设计质粒引物对，所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ ID No.3所示的序列，具体序列如下所示：

5’-taatagtgagcgatcgcaga-3’；

所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列，具体如下所示：

5’-catgtgtatatctccttcttaaagttaaac-3’。

本发明用质粒引物对进行PCR扩增的体系每50μL优选包括：浓度为47.5ng/μL的质粒DNA 1μL、浓度为10μM的质粒上游引物0.5μL、浓度为10μM的质粒下游引物0.5μL、PCRPremix酶25μL和ddH 2O 8μL。在本发明中，所述PCR Premix酶优选为PCR Premix(2×)酶。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

本发明用质粒引物对进行PCR扩增的条件优选包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃5min；72℃5min；4℃10min；35个循环。

在发明中，所述质粒基因具有SEQ ID No.6所示的序列：

5’-taatagtgagcgatcgcagatctgactgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagtttaaacactagctagtccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgc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本发明将得到的肝素酶基因与质粒基因通过Gibson Assembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1。

在本发明中，所述连接的体系每20μL优选包括：Gibson Mast Mix10μL、浓度为19.9ng/μL的肝素酶基因1μL、浓度为37.4ng/μL的质粒pBENT 6μL和ddH 2O 3μL。在本发明中，所述Gibson Mast Mix优选为Gibson Mast Mix(2x)。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。

在本发明中，所述连接的条件优选包括：50℃反应15min。

本发明将得到的重组质粒pBENT-H1转化到大肠埃希氏菌中，得到生产肝素酶的大肠埃希氏菌。

在本发明中，所述转化的条件优选包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在0～4℃下静置40～50min，再37～45℃热激20～40s，然后在0～4℃下静置3～7min；更优选包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在1～3℃下静置42～48min，再39～42℃热激25～35s，然后在1～3℃下静置4～6min；最优选包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在2℃下静置45min，再40℃热激30s，然后在2℃下静置5min。

本发明对所述转化后的阳性筛选和鉴定没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的阳性筛选和鉴定的方法即可。

本发明还提供了上述技术方案得到的生产肝素酶的大肠埃希氏菌在生产肝素酶中的应用。

在本发明中，所述生产肝素酶的方法优选包括以下步骤：

1)将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于发酵培养基中，使得到的发酵初始混合物的OD600值为0.2～0.3；

2)将所述步骤1)得到的发酵初始混合物在35～37℃下振荡培养2～3h，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物与异丙基硫代半乳糖苷混合，得到含有异丙基硫代半乳糖苷混合物，将所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物在15～18℃下振荡培养7～9h，得到肝素酶；所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为250～300μM。

本发明将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于发酵培养基中，使得到的发酵初始混合物的OD600值为0.2～0.3。

在本发明中，所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌优选以生产肝素酶的大肠埃希氏菌种子液的形式接种于发酵培养基中，所述种子液的接种量优选为5～15％，更优选为8～12％，最优选为10％。

在本发明中，所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌种子液的制备方法优选包括：将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于种子培养基进行振荡培养，至OD 600值为1～2。在本发明中，所述振荡培养的条件包括：所述振荡培养的温度优选为35～37℃，所述振荡培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm。

在本发明中，所述种子培养基优选以水为溶剂，每升优选包括：10～15g胰蛋白胨、5～10g酵母提取物和10～15g氯化钠；更优选为包括11～14g胰蛋白胨、6～9g酵母提取物和11～14g氯化钠；最优选包括12～13g胰蛋白胨、7～8g酵母提取物和12～13g氯化钠。在本发明中，所述种子培养基的pH值优选为7.0～7.2。

在本发明中，所述发酵培养基优选以水为溶剂，每升优选包括：10～15g胰蛋白胨、5～10g酵母提取物和10～15g氯化钠更优选为包括11～14g胰蛋白胨、6～9g酵母提取物和11～14g氯化钠；最优选包括12～13g胰蛋白胨、7～8g酵母提取物和12～13g氯化钠。在本发明中，所述发酵培养基的pH值优选为7.0～7.2。

本发明将得到的发酵初始混合物在35～37℃下振荡培养2～3h，得到振荡培养物。

在本发明中，所述振荡培养的时间优选为2.5h，所述振荡培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm。

本发明将得到的振荡培养物与异丙基硫代半乳糖苷混合，得到含有异丙基硫代半乳糖苷混合物，将所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物在15～18℃下振荡培养7～9h，得到肝素酶；所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为250～300μM。

在本发明中，所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度优选为250～300μM，更优选为260～290μM，最优选为270～280μM。在本发明中，所述异丙基硫代半乳糖苷能够诱导表达肝素酶目的蛋白。

在本发明中，所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物优选在16～17℃下振荡培养7.5～8.5h，得到肝素酶，更优选在16.5℃下振荡培养8h。在本发明中，所述振荡培养的转速优选为150～250rpm，更优选为180～220rpm，最优选为200rpm。

在本发明中，所述肝素酶具有SEQ ID No.7所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：

Met Arg Met Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp

Phe Ala Arg Leu Gly Glu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala

Asp Val Val His Phe Asp Val Met Asp Asn His Tyr Val Pro Asn Leu

Thr Ile Gly Pro Met Val Leu Lys Ala Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Thr

Ala Pro Ile Asp Val His Leu Met Val Lys Pro Val Asp Arg Ile Ile

Pro Asp Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Phe His Pro Glu

Ala Ser Glu His Val Asp Arg Ser Leu Gln Leu Ile Lys Glu His Gly

Cys Lys Ala Gly Leu Val Phe Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Leu

Asp Tyr Val Met Asp Lys Leu Asp Val Ile Leu Leu Met Ser Val Asn

Pro Gly Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Pro Gln Thr Leu Asp Lys Leu

Arg Glu Val Arg Gln Arg Ile Asp Ala Ser Gly Tyr Asp Ile Arg Leu

Glu Val Asp Gly Gly Val Lys Val Ser Asn Ile Ala Asp Ile Ala Ala

Ala Gly Ala Asp Met Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Arg Pro

Asp Tyr Lys Glu Val Ile Asp Gln Met Arg Ser Glu Leu Ala Lys Val

SerHis Gly

下面结合实施例对本发明提供的一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

工程菌的获得和保藏

一、工程菌的构建

1、采用保藏号为CGMCC No.13723的拉乌尔菌Raoultella sp.NX-TZ-3-15，以细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取该菌的全基因组DNA。

2、根据测序得到的该菌产的肝素酶和所用质粒pBENT的相关基因序列，按照无缝克隆原理，在质粒的多克隆位点区设计PCR引物，包括目的基因的上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2及质粒的上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4。

3、用步骤2设计的PCR引物进行PCR扩增：

(1)目的基因PCR扩增：模板目的基因DNA 100ng/μL 1μL、引物SEQ ID NO.1为10μM0.5μL、SEQ ID NO.2为10μM 0.5μL、PCR Premix(2x)酶25μL、ddH 2O 8μL，共50μL。

PCR程序：①98℃1min；②98℃15s；③55℃15s；④72℃10s；⑤72℃5min；⑥4℃10min；⑦Cycle*35从②到④)，得到PCR扩增产物，切胶回收并纯化处理得到大小为724bp的含40个overlap的目标基因SEQ ID NO.5。

(2)质粒PCR扩增：模板质粒DNA 47.5ng/μL 1μL、引物SEQ ID NO.3为10μM 0.5μL、SEQ ID NO.4为10μM 0.5μL、PCRPremix(2x)酶25μL、ddH 2O 8μL，共50μL。

PCR程序：①98℃1min；②98℃15s；③55℃15s；④72℃5min；⑤72℃5min；⑥4℃10min；⑦Cycle*35从②到④)，得到质粒PCR扩增产物，切胶回收并纯化处理得到大小为5374bp的线性化质粒片段SEQ ID NO.6。

4、将步骤3中的目标基因SEQ ID NO.5与线性化质粒片段SEQ ID NO.6通过GibsonAssembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1。

体系组成为：Gibson Mast Mix(2x)10μL，目标基因SEQ ID NO.519.9ng/μL 1μL，质粒pBENT 37.4ng/μL 6μL，ddH 2O 3μL，共20μL。

连接的反应条件为：50℃，15min。

5、加2μL重组质粒到100μL大肠杆菌感受态细胞BLR(DE3)中，冰上放置45min，42℃热击30s，然后冰上放置5min，转化大肠杆菌得到一株重组菌(工程菌)，该重组菌的生理生化性质与大肠杆菌一样，命名为Escherichia coliBLR(DE3)-pBENT-H1。

实施例2

应用工程菌生产肝素酶

一、培养基的制备

种子培养基(pH7.0)：取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠，用水溶解并定容至1L；121℃灭菌30min。

发酵培养基(pH7.0)：取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，用水溶解并定容至1L；121℃灭菌30min。

二、应用工程菌生产肝素酶

1、将大肠埃希氏菌BLR(DE3)-pBENT-H1接种至种子培养基，35℃振荡培养(200r/min)至OD 600nm＝1，即为种子液。

2、将步骤1的种子液用移液器按10％(v/v)的接种量接种至10mL发酵培养基(可以采用50mL摇瓶)，得到OD 600nm＝0.2的发酵初始体系；发酵过程如下：先37℃振荡培养(200r/min)2小时，然后加入IPTG至IPTG在所述述发酵初始体系中的终浓度为250μM继续15℃振荡培养(200r/min)8小时。

3、将完成步骤2的发酵体系离心(6000r/min，10min)收集菌体，获得的菌体用0.25M醋酸钠-0.0025M醋酸钙缓冲液(pH7.0)震荡悬浮，超声破碎5min，离心(4℃,12,000r/min离心15min)收集上清液，该上清液为肝素酶粗酶，以天青A法测得肝素酶的酶活为2540U/L，以SDS凝胶电泳确定24.7kDa处的目的蛋白条带，肝素酶的氨基酸序列为SEQIDNo.7，包含227个氨基酸。

由肝素酶粗酶纯化得到纯酶的步骤：

(1)向粗酶液中加入硫酸铵，一边加一边搅拌使其溶解均匀，使得硫酸铵饱和度为70％，放于4℃下静置过夜，10000rpm离心20min，收集上清。

(2)将硫酸铵沉淀后得到的上清液置于截留分子量14000±2000Da的透析袋内，封密后置于装有超纯水的烧杯里，每2h置换超纯水，48h后收回透析好的溶液。

(3)SP-Sepharose FastFlow强阳离子交换层析：起始的buffer的浓度为25mMTris-HCl(含10mMCaCl 2，pH6.5)；洗脱液的浓度为25mM Tris-HCl(含10mMCaCl 2，pH6.5)+1mol/LNaCl；样品的加样量为5mL；样品的蛋白质浓度为1.43mg/mL；流动速度为2.5mL/min。加好样后，开始运行前把自动部分收集器打开，收集2ml/管，然后开始运行自动收集器和层析检测仪，继续用3～5倍的起始buffer洗柱子，洗至基线平稳。然后换洗脱液进行洗脱，按NaCl从0到1mol/L进行梯度洗脱。取图谱上峰值前后的那几管收集液，取样做SDS-PAGE电泳观察是否出现单一条带，没有出现单一条带则继续进行下一步的SephadexG-100凝胶过滤层析。

(4)Sephadex G-100凝胶过滤层析：起始缓冲溶液的浓度为25mM Tris-HCl(含10mMCaCl 2，Ph6.5)；洗脱溶液的浓度为25mM Tris-HCl(含10mMCaCl 2，pH6.5)+1mol/LNaCl；样品的加样量为10mL；样品的蛋白浓度为6.0mg/mL；流动速度为0.5mL/min。加好样后，开始运行前把自动部分收集器打开，收集2ml/管，然后开始运行自动收集器和层析检测仪，继续用3～5倍的起始buffer洗柱子，洗至基线平稳。然后换洗脱液进行洗脱，按NaCl从0到1mol/L进行梯度洗脱。取图谱上峰值前后的那几管收集液，取样做SDS-PAGE电泳观察是否出现单一条带。出现24.7kDa处单一条带条带的收集液即为肝素酶纯酶。

SDS-PAGE电泳的操作步骤：

1)选择15％的分离胶和5％的浓缩胶。

2)取40μL样品按1：5加入蛋白上样缓冲液令蛋白变性，在电泳之前煮沸5～10min。

3)在加入样品之后首先选用90V电泳，待样品跑进到分离胶以后，加压到120V，电泳1～2h，待溴酚蓝的前端跑到了电泳槽的底部后，作为电泳的终点。

4)在电泳完成之后，将凝胶回收，然后用适量的考马斯亮蓝染液进行3h的染色，结束染色后用足量的洗脱液脱色4h，脱色结束后，用凝胶成像系统将电泳胶显示成像，比较标准的蛋白带以确定样品蛋白的分子量大小。

由以上实施例可以得出，本发明提供的生产肝素酶的大肠埃希氏菌能够生产肝素酶，肝素酶的酶活为2540U/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌及其构建方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagaaggaga tatacacatg atgcggatga agcagtattt 40

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgcgatcg ctcactatta ttatccatga ctaacctttg ctaatt 46

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatagtgag cgatcgcaga 20

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catgtgtata tctccttctt aaagttaaac 30

<210> 5

<211> 724

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagaaggaga tatacacatg atgcggatga agcagtattt gattgcccct tcgattctgt 60

cggctgattt tgcccgcctg ggcgaggata ccgccaaagc tctggctgca ggtgcggacg 120

ttgtgcactt tgacgtgatg gacaaccact acgtgccgaa tctgaccatc ggccctatgg 180

tgttgaaagc gctacgcaac tatggcatca ccgccccgat cgacgtgcac ctgatggtga 240

aaccggtcga ccgcatcatt cctgatttcg ccgcggcggg cgccagcatc atcaccttcc 300

acccggaagc ctctgagcac gtcgatcgca gcctgcagct gatcaaagaa catggctgta 360

aagccggtct ggtgtttaac ccggccacgc cgctgagcta ccttgattat gtgatggata 420

agctggacgt tattctgctg atgtccgtta acccggggtt cggcggtcag tccttcatcc 480

cccagactct ggataaactg cgcgaagtgc gtcagcgcat cgatgcgtcg ggttatgata 540

ttcgtctgga agtcgacggc ggcgtgaagg tcagtaatat tgcggatatt gcggcggcag 600

gcgcagatat gtttgttgcc ggttcggcga ttttcgatcg tccggactac aaggaggtta 660

tcgatcaaat gcgtagtgaa ttagcaaagg ttagtcatgg ataataatag tgagcgatcg 720

caga 724

<210> 6

<211> 5374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatagtgag cgatcgcaga tctgactgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagt 60

ttaaacacta gctagtccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 120

gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga actatatccg gattggcgaa tgggacgcgc 180

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 240

ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 300

ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt 360

tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 420

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 480

tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga 540

ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga 600

attttaacaa aatattaacg tttacaattt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 660

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 720

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 780

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 840

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 900

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 960

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 1020

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 1080

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 1140

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 1200

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 1260

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa 1320

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 1380

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 1440

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 1500

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 1560

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 1620

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 1680

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 1740

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 1800

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 1860

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 1920

cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 1980

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 2040

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 2100

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 2160

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 2220

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2280

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2340

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 2400

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 2460

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 2520

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt 2580

ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatata tggtgcactc tcagtacaat 2640

ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc 2700

atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 2760

ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 2820

tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag ctgcggtaaa gctcatcagc gtggtcgtga 2880

agcgattcac agatgtctgc ctgttcatcc gcgtccagct cgttgagttt ctccagaagc 2940

gttaatgtct ggcttctgat aaagcgggcc atgttaaggg cggttttttc ctgtttggtc 3000

actgatgcct ccgtgtaagg gggatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga 3060

gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt 3120

gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa 3180

tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg 3240

atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa 3300

acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag 3360

tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc 3420

cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc gcacccgtgg ggccgccatg 3480

ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt gacgaaggct 3540

tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat cgtcgcgctc 3600

cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg tcctacgagt 3660

tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg cgcccaccgg 3720

aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga 3780

gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 3840

tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 3900

cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc 3960

ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc 4020

ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc 4080

cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc 4140

cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat 4200

ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg 4260

ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac 4320

agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc 4380

cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc 4440

agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc 4500

ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg 4560

caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc 4620

acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc 4680

cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac 4740

gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc 4800

agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata 4860

ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc 4920

cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc 4980

gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt 5040

tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg 5100

ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag 5160

cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc 5220

cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatctcgatc ccgcgaaatt 5280

aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag gatccaataa 5340

ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca catg 5374

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

Met Arg Met Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ser Ala Asp

1 5 10 15

Phe Ala Arg Leu Gly Glu Asp Thr Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala

20 25 30

Asp Val Val His Phe Asp Val Met Asp Asn His Tyr Val Pro Asn Leu

35 40 45

Thr Ile Gly Pro Met Val Leu Lys Ala Leu Arg Asn Tyr Gly Ile Thr

50 55 60

Ala Pro Ile Asp Val His Leu Met Val Lys Pro Val Asp Arg Ile Ile

65 70 75 80

Pro Asp Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ile Ile Thr Phe His Pro Glu

85 90 95

Ala Ser Glu His Val Asp Arg Ser Leu Gln Leu Ile Lys Glu His Gly

100 105 110

Cys Lys Ala Gly Leu Val Phe Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Leu

115 120 125

Asp Tyr Val Met Asp Lys Leu Asp Val Ile Leu Leu Met Ser Val Asn

130 135 140

Pro Gly Phe Gly Gly Gln Ser Phe Ile Pro Gln Thr Leu Asp Lys Leu

145 150 155 160

Arg Glu Val Arg Gln Arg Ile Asp Ala Ser Gly Tyr Asp Ile Arg Leu

165 170 175

Glu Val Asp Gly Gly Val Lys Val Ser Asn Ile Ala Asp Ile Ala Ala

180 185 190

Ala Gly Ala Asp Met Phe Val Ala Gly Ser Ala Ile Phe Asp Arg Pro

195 200 205

Asp Tyr Lys Glu Val Ile Asp Gln Met Arg Ser Glu Leu Ala Lys Val

210 215 220

Ser His Gly

225

Claims (9)

1.一株生产肝素酶的大肠埃希氏菌Escherichia coli BLR(DE3)-pBENT-H1，保藏编号为CGMCC No.15819。

2.权利要求1所述的生产肝素酶的大肠埃希氏菌的构建方法，包括以下步骤：

1)提取含有肝素酶基因的微生物的全基因组DNA，以全基因组DNA为模版，用肝素酶基因引物对进行PCR扩增，得到肝素酶基因；

所述肝素酶基因引物对包括肝素酶基因上游引物和肝素酶基因下游引物，所述肝素酶基因上游引物具有SEQ ID No.1所示的序列，所述肝素酶基因下游引物具有SEQ ID No.2所示的序列；

2)以质粒pBENT DNA为模版，用质粒引物对进行PCR扩增，得到质粒基因；

所述质粒引物对包括质粒上游引物和质粒下游引物，所述质粒上游引物具有SEQ IDNo.3所示的序列，所述质粒下游引物具有SEQ ID No.4所示的序列；

3)将所述步骤1)得到的肝素酶基因与所述步骤2)得到的质粒基因通过GibsonAssembly体系连接，得到重组质粒pBENT-H1；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒pBENT-H1转化到大肠埃希氏菌中，得到生产肝素酶的大肠埃希氏菌；

所述步骤1)和2)没有时间顺序限定。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)PCR扩增的体系每50μL包括：100ng/μL的全基因组DNA 1μL、10μM的肝素酶基因上游引物0.5μL、10μM的肝素酶基因下游引物0.5μL、PCR Premix酶25μL和ddH₂O 8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃10s；72℃5min；4℃10min；35个循环。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)PCR扩增的体系每50μL包括：浓度为47.5ng/μL的质粒DNA 1μL、浓度为10μM的质粒上游引物0.5μL、浓度为10μM的质粒下游引物0.5μL、PCR Premix酶25μL和ddH₂O 8μL；

所述PCR扩增的条件包括：98℃1min；98℃15s；55℃15s；72℃5min；72℃5min；4℃10min；35个循环。

5.根据权利要求2～4任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)连接的体系每20μL包括：Gibson Mast Mix 10μL、浓度为19.9ng/μL的肝素酶基因1μL、浓度为37.4ng/μL的质粒pBENT 6μL和ddH₂O 3μL；

所述连接的条件包括：50℃反应15min。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)转化的条件包括：将所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌混合，在0～4℃下静置40～50min，再37～45℃热激20～40s，然后在0～4℃下静置3～7min；

所述重组质粒pBENT-H1与大肠埃希氏菌的体积比为(1～3):(90～110)。

7.权利要求1所述的生产肝素酶的大肠埃希氏菌或权利要求2～6任意一项构建方法构建得到的生产肝素酶的大肠埃希氏菌在生产肝素酶中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生产肝素酶的方法包括以下步骤：

1)将所述生产肝素酶的大肠埃希氏菌接种于发酵培养基中，使得到的发酵初始混合物的OD₆₀₀值为0.2～0.3；

2)将所述步骤1)得到的发酵初始混合物在35～37℃下振荡培养2～3h，得到振荡培养物；

3)将所述步骤2)得到的振荡培养物与异丙基硫代半乳糖苷混合，得到含有异丙基硫代半乳糖苷混合物，将所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物在15～18℃下振荡培养7～9h，得到肝素酶；所述含有异丙基硫代半乳糖苷混合物中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为250～300μM。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤1)发酵培养基以水为溶剂，每升包括：10～15g胰蛋白胨、5～10g酵母提取物和10～15g氯化钠，所述发酵培养基的pH值为7.0～7.2。

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