CN109811004A - 表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用，涉及棉花育种技术领域，将所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN中得到表达载体。Fbl2A‑GhPSY2转基因棉花在棉花的次生壁发育期特异性表达GhPSY2基因，使得成熟纤维呈现棕黄色，且成熟纤维中类胡萝卜素水平显著升高。这些结果表明，通过在棉花中导入Fbl2A‑GhPSY2转基因可以促进GhPSY2基因在纤维中表达，提高成熟纤维类胡萝卜素水平，使成熟纤维着色。

Description

表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕 黄色纤维中的应用

技术领域

本发明涉及棉花育种技术领域，具体涉及表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用。

背景技术

彩色棉又称有色棉，是能在纤维发育过程中合成和沉积天然色素，从而使成熟棉纤维带有天然色彩的棉花。与常规白色棉和化学纤维相比，彩色棉纤维本身具有天然色泽，在纺织加工过程中不需要漂白、印染等化学处理，可以避免染料、有机溶剂、重金属等有毒有害残留物对纺织品的污染和人体的危害，降低纺织业的能耗水耗，节约纺织加工的成本。彩色棉的发展具有巨大的社会效益与经济效益。

在天然棉花材料中，目前只有绿色和棕色棉可用于现代纺织。拓展成熟纤维的呈色色素和色彩范围，将有力促进彩色棉在纺织行业的推广应用，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达 GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用，将表达载体转化到棉花植株中，在棉花的次生壁发育期特异性表达GhPSY2基因，使得棉花成熟纤维呈现棕黄色，而且成熟纤维中类胡萝卜素含量显著提高。

本发明提供了表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用；

将所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN中得到表达载体。

优选的，所述GhPSY2基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述启动子Fbl2A具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选的，所述载体pLGN的构建方法包括：将植物表达载体pBI121的 T-DNA区段替换为了组成型的2×35S启动子控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，以及另一个由35S-P控制的表达盒。

优选的，所述载体pLGN具有SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

优选的，将所述载体pLGN经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切载体，将所述启动子Fbl2A的序列经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到酶切启动子，将所述GhPSY2基因的序列经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切序列，将所述酶切启动子和酶切序列插入到酶切载体中，得到表达载体。

本发明提供了表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用，将表达载体转化到棉花植株中，在棉花的次生壁发育期特异性表达GhPSY2基因，使得棉花成熟纤维呈现棕黄色，而且成熟纤维中类胡萝卜素含量显著提高。

附图说明

图1为Fbl2A-GhPSY2的表达载体T-DNA区的基因结构图，其中，2 ×35S-P，串联两个增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子；GhPSY2，棉花八氢番茄红素合成酶基因；GUS:NPTII，β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶融合基因；Nos-T，农杆菌冠瘿碱合成酶基因终止子；Fbl2A，棉花纤维次生壁合成期特异启动子；

图2为纤维特异表达载体Fbl2A-GhPSY2的构建流程；

图3为GhPSY2基因转录水平的检测，其中A，Fbl2A-PSY2转基因棉花开花后20天纤维中GhPSY2的表达量变化；B，Fbl2A-PSY2转基因棉花成熟纤维中类胡萝卜素含量的变化；C，Fbl2A-PSY2转基因棉花成熟纤维的颜色变化；#160～162为Fbl2A-PSY2转基因棉花的不同转化子，null为转基因棉花分离的非转基因后代株系。

具体实施方式

本发明提供了表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用；将所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN中得到表达载体。

在本发明中，所述GhPSY2基因优选具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

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在本发明中，所述GhPSY2基因的获取方法，优选包括：以陆地棉cDNA 为模版，用引物GhPSY2-U和GhPSY2-F进行PCR扩增，得到GhPSY2基因。本发明对所述PCR扩增使用的体系和程序没有特殊限定，采用常规即可。

在本发明中，所述引物GhPSY2-U具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：

GGATCCATGGCTGGTGTTCTTCTTTGGGTG；

所述引物GhPSY2-D具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下：

GAATTCACTAGTGATCTTCAGAACAATTTG。

在本发明中，所述GhPSY2基因编码的蛋白优选具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：

MAGVLLWVVCPKGNATALLSLIPRSGKHKRCRVHQKVKFSTGVSAI SSAVANPARSSEEKVYDVVLKQAALVKEQRGKKPLDLGTRTETDGFTDW DLLNEAYGRCGEVCAEYAKTFYLGTLLMTPERRRAVWAIYVWCRRTDEL VDGPNASHITPRALDRWEKRLDDLFEGRPYDMLDAALSDTVSKYPVDIQ PFKDMIE GMRLDLRKSRYMNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAP ESKASVESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQFGLSDDDIFRGQVTDKWRNFMKDQIKRARMFFDEAEKGVSELNAASRWPVW ASLLLYRQILDVIEENDYNNFSKRAYVGKVKKFASLPVAYGRALMGTSKL F

本发明所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN 中得到表达载体。

在本发明中，所述载体pLGN是由传统的植物表达载体pBI121改造而来的一个双元植物表达载体，其T-DNA区段(RB和LB之间区域，如图2) 替换为了组成型的2×35S启动子(2×35S-P)控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，以及另一个由35S-P控制的表达盒。

在本发明中，所述启动子Fbl2A优选具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

CTGCAGACTTAGGATTGGATGGCGTTCAGGAGCTTGGATTGGTTTTCTC ACATCATATTTTATTAAATAATTATTAATTAAAATTTATGG ACTTTTGGAC TGTCTGACTAATTTTCAGAATTTTATTTTGGTTTTGGGTTTTGTTGAGTT TTTTAGATAA TTATTTTAAA TATTCTGCATAATTTTTCTG TTATTTGAAA AGGATGTTCGAATTTTTTTTCAAAATTGAAACGTTTAAGAATTTTTACTA CTGCAAATTCAGAATAAGTGAATTTGTTTTTTAGAAAGATTAAATAAGT TAGTATTACGATTTTTAGTTTGATTTGGTGGAAAGTAATGTATGTTTTTG AACATAATTATTTGACAATAATTAAGTTTTCTAGGAAATAAACGGAAATA TCTTCTTTTTTTTTTGTAAAATTACTAATGCAAGAACAAACAACGTTTT GGGAAGCAAATAATCTAGCTTTAAGTAGTCAGTGTAACTCTCAAAATCT GGTCATAACTTCTAGGCTGAGTTTGCTGTGCTACAGTAGTAAGTCTATA GAAACTTACCTGACAAAACGACATGACGTCAGGGTCGAATCTACAACT TTTCCTTTTTCTTCAATTAACATATGGTTGATTCAAGTTCCGATCTATAAT AATTTATTACGATTTATCAATTTCAATTACCTTATATCATCCTATTATAAAT ATAAGTCAGTTCAATTCAGTTTTCGAAAGTTCCCTAAAATTTTGAATTTT ATTAAATTTATTCCCTAAAACCGAAATAGTGATATCTTTCAAATTTAAGT TTCATTTTTCAATCCGATTTCAATTTCATCCTTTTATAACTCTCTATGATCT ATAATTACATAAATTTCAAACTAATTTTGAAATATATACACTTTAGTCCCT AAGTTCAAAACTATAAATTTTCACTTTAGAAATTAATCAT TTTTCACATC TAAGCATCAAATTTAACCAAATGACACAAATTTCATGATTAGTTAGATC AAGCTTTTGAGTCTTCAAAAACATAAAAATTACAAAAAAAAAAAAAC AAACTTAAAATCATTTATCAATTTGAACAACAAAGCTTGGCCGAATGCT AAGAGCTTAAAAATGGCTTCTTTTGTTTCTTTTTGTTGCAAACGGTGGA GAGAAGAGGGAAATGAAGATTGACCATATTTTTTTATTATGTTTTAACAT ATAATATTAATAATTTAATCATAATTATACTTTGGTGAATGTGACAGTGGG GAGATACGTAAAGTATATAACATTATACTTTTTGCAAGCAGTTGGCTGGT CTATCCAAGAGTGATCAAAGTTTGAGCTGCCTTCAATGAGCCAATTTTT GCCCATAATGGATAAAGGCAATTTGTTTAGTTCAACTGCTCACAGAATA ATGTTAAAATGAAATTAAAATAAGGTGGCCTGGTCACACACACACAAA AAAAAAACTAATGTTGGTTGGTTGAATTTTATATTACGGAATGTAATGTT ATATTTTAAAATAAAATTATGTTATTTAGATTCTTAATATTTTGAGCATTC CATACTATAATCTCGTATACATAATATT AAAATATAGT AATATAAAGT GTAATTAACT TTAAATTACAAGCATAATATTAAATTTTGA ATCAATTAAT TTTTATTTCTATTATTTTAA TTAATTTAGT CTATTTTTTCAAAATAAAAT TTAAATCTAA ATAAAAATAA TTTTTCCTTA ATATTATTAA TAAATTTATT TCAACATCATATATTTACTT ATTAATACAT AAATTATAAT AATTTATCAT AATTTTATGGAAATTGAGACCAAGAAACATTAAGAGAACAAATTCTATA ACAAAGACAATTTAGTAAAAATGTACTTTTAGGTAATTTTAAGTACTCTT AACCAAACACAAAAATTCAAATCAAATGAACCAAATAAGATAATATAA CATACAGAATATCCTACTTGTATTCTTACATTCCCGTAATCATATTATGAA AAGTAATATTATATTACCTGAGCCAAATGCTCTCACAAACTATTATCCAA AAAAAAAATGTTGAATATAATTTTTATAACATTTTTTCATATATTTGCAAG ATTATATTTTGTATATTTACGTAAAAATATTTGACATAGAT TGAACACCTT CTTAACATAATCCCACCATAAGTCAAGTATGTAGATGAGAAATTGGTAC AAACAACGTGGGGCCAAATCCCACCAAACCATCTCTCATCCTCTCCTAT AAAAGGCTAGTTACACATACACAACAATCCACACACAAATACACTCAA AATT CTTTGCTTTG TATTTCGGTT GGG。

在本发明中，所述所述载体pLGN具有SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

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tgctgcgtgcgctcggacggccggcacttagcgtgtttgtgcttttgctcattttctctttacctcattaactcaaatgagtt ttgatttaatttcagcggccagcgcctggacctcgcgggcagcgtcgccctcgggttctgattcaagaacggttgtgc cggcggcggcagtgcctgggtagctcacgcgctgcgtgatacgggactcaagaatgggcagctcgtacccggcc agcgcctcggcaacctcaccgccgatgcgcgtgcctttgatcgcccgcgacacgacaaaggccgcttgtagccttc catccgtgacctcaatgcgctgcttaaccagctccaccaggtcggcggtggcccatatgtcgtaagggcttggctgc accggaatcagcacgaagtcggctgccttgatcgcggacacagccaagtccgccgcctggggcgctccgtcgatc actacgaagtcgcgccggccgatggccttcacgtcgcggtcaatcgtcgggcggtcgatgccgacaacggttagc ggttgatcttcccgcacggccgcccaatcgcgggcactgccctggggatcggaatcgactaacagaacatcggcc ccggcgagttgcagggcgcgggctagatgggttgcgatggtcgtcttgcctgacccgcctttctggttaagtacagc gataaccttcatgcgttccccttgcgtatttgtttatttactcatcgcatcatatacgcagcgaccgcatgacgcaagctg ttttactcaaatacacatcacctttttagacggcggcgctcggtttcttcagcggccaagctggccggccaggccgcc agcttggcatcagacaaaccggccaggatttcatgcagccgcacggttgagacgtgcgcgggcggctcgaacac gtacccggccgcgatcatctccgcctcgatctcttcggtaatgaaaaacggttcgtcctggccgtcctggtgcggtttc atgcttgttcctcttggcgttcattctcggcggccgccagggcgtcggcctcggtcaatgcgtcctcacggaaggca ccgcgccgcctggcctcggtgggcgtcacttcctcgctgcgctcaagtgcgcggtacagggtcgagcgatgcacg ccaagcagtgcagccgcctctttcacggtgcggccttcctggtcgatcagctcgcgggcgtgcgcgatctgtgccg gggtgagggtagggcgggggccaaacttcacgcctcgggccttggcggcctcgcgcccgctccgggtgcggtc gatgattagggaacgctcgaactcggcaatgccggcgaacacggtcaacaccatgcggccggccggcgtggtgg tgtcggcccacggctctgccaggctacgcaggcccgcgccggcctcctggatgcgctcggcaatgtccagtaggt cgcgggtgctgcgggccaggcggtctagcctggtcactgtcacaacgtcgccagggcgtaggtggtcaagcatcc tggccagctccgggcggtcgcgcctggtgccggtgatcttctcggaaaacagcttggtgcagccggccgcgtgca gttcggcccgttggttggtcaagtcctggtcgtcggtgctgacgcgggcatagcccagcaggccagcggcggcgc tcttgttcatggcgtaatgtctccggttctagtcgcaagtattctactttatgcgactaaaacacgcgacaagaaaacgc caggaaaagggcagggcggcagcctgtcgcgtaacttaggacttgtgcgacatgtcgttttcagaagacggctgca ctgaacgtcagaagccgactgcactatagcagcggaggggttggatcaaagtactttgatcccgaggggaaccctg tggttggcatgcacatacaaatggacgaacggataaaccttttcacgcccttttaaatatccgttattctaa。

本发明对所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明优选将所述载体 pLGN经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切载体，将所述启动子Fbl2A的序列经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到酶切启动子，将所述GhPSY2基因的序列经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切序列，将所述酶切启动子和酶切序列插入到酶切载体中，得到表达载体。本发明对所述酶切的条件没有特殊限定，采用常规使用的酶的酶切条件即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

棉花八氢番茄红素合成酶基因GhPSY2获得：

在Phytozome公共数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov)上，以拟南芥八氢番茄红素合成酶基因AtPSY(At5g17230)碱基序列为诱饵，通过BlastN搜索雷蒙德氏棉中的同源基因。结果显示雷蒙德氏棉中编号为Gorai.006G0094 00的基因与AtPSY具有高度同源性。以Gorai.006G009400的CDS序列为参考设计引物(GhPSY2-U(SEQ ID No.4)和GhPSY2-D(SEQ ID No.5))，以陆地棉cDNA为模板，扩增获得目标片段，并在片段两端加上BamHⅠ和EcoRⅠ位点。序列分析表明，该序列与来源于其它植物(如拟南芥、番茄、大豆等)的已知八氢番茄红素合成酶基因具有高度同源性，因此该序列被认为是棉花八氢番茄红素合成酶编码基因(GhPSY2)。

实施例2

纤维次生壁合成期特异表达GhPSY2的表达载体的构建

GhPSY2基因的编码序列构建入植物表达载体pLGN的流程见图2。 pLGN是由传统的植物表达载体pBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段(RB和LB之间区域，图2)替换为了组成型的2×35S启动子(2×35S-P)控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，以及另一个由35S-P控制的表达盒。按前述常规操作方法用引物Fbl2A-F(SEQ ID No.6：aagcttCTGCAGACTTAGGATTGGAT)和Fbl2A-R(SEQ ID No.7：ggatccCCCAACCGAAATACAAAGCAA)，从棉花基因组中扩增克隆启动子Fbl2A，并在启动子两端加上HindⅢ和BamHⅠ位点，并克隆测序。 pLGN载体用HindⅢ/EcoRⅠ酶切回收载体片段，启动子片段Fbl2A和目的基因片段分别用BamHⅠ/HindⅢ(部分酶切)和BamHⅠ/EcoRⅠ酶切从克隆载体上回收，3个回收片段一起连接后转化筛选，最终获得GhPSY2的特异表达载体pLGN-pFbl-GhPSY2(图2)。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

实施例3

棉花的遗传转化

通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表1。具体方法如下：对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量(约20～40颗)去壳后的种子置于灭菌后的100mL三角瓶中，先用75％酒精预洗种子1min，轻轻倒出酒精再加入0.1％HgCl₂灭菌约12min(不断摇动三角瓶进行灭菌)，轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床(30℃、 100rpm)上，每隔8小时换一次无菌水，待胚根长出1cm左右(约36～48h)，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30℃暗培养至下胚轴伸长到3cm左右(约 48h)。侵染约20h前，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50 mg/LKm和125mg/L Sm的液体YEB培养基中，置于28℃摇床(200rpm)，培养约20h后测量菌液的OD值(OD600)，OD600在0.8～1.0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离1min，弃上清后用含有共培养液体培养基(含100μmo1/LAS，乙酰丁香酮)的按1:1体积比重悬菌体后收集重悬液于100mL三角瓶，置于摇床(30℃、100rpm)培养约20min。将下胚轴切成长约1cm的小段，置于重悬液中并在摇床(30℃、100rpm)上侵染50min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养(30℃、16h光照/8h黑暗，下同)15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤转入液体悬浮培养基中并置于摇床(30℃、100rpm)上悬浮培养10d 左右，通过筛网过滤将细小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培养至长约1cm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作必须在严格的无菌条件下完成。

生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。收获T0代转基因棉花种子，继续种植T1代并收获种子，播种T1代种子后对萌发的T2代幼苗进行GUS组织染色(见常规操作方法)，筛选出纯合的转基因T2代株系(全部为GUS阳性或GUS阴性植株)，移栽 T2代纯合株系，并检测靶标基因GhPSY2的表达水平和比较纤维类胡萝卜素含量和颜色的变化。

表1根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986；Gelrite:Sigma,货号:G1910；SH:Schenk& Hildebrandt,1972。

实施例4

GhPSY2基因转录水平的检测

提取对照与转基因棉花开花后20天纤维的RNA，逆转录合成cDNA一链，以此为模板进行定量PCR检测。具体操作按常规方法进行。检测GhPS Y2的特异引物为GhPSY2-rtF和GhPSY2-rtR，GhACTIN基因为内标，引物为ACTIN4-rtF和GhACTIN4-rtR。

GhPSY2-rtF(SEQ ID No.8)：ATGAATTTTGATGAGCTCTAT；

GhPSY2-rtR(SEQ ID No.9)：ATTAGCAATTCCGAGGGCTA；

ACTIN4-rtF(SEQ ID No.10)：TTGCAGACCGTATGAGCAAG；

GhACTIN4-rtR(SEQ ID No.11)：ATCCTCCGATCCAGACACTG。

基因表达分析发现，GhPSY2在转基因样品中转录水平显著高于野生型 样品，表明Fbl2A启动子可在纤维中特异启动GhPSY2的表达。

实施例5

棉花纤维色泽及类胡萝卜素水平的检测

棉花纤维色泽取成熟纤维进行观察照相。

用比色法检测成熟纤维的类胡萝卜素水平水平。具体操作方法如下。

1)用球磨机将干燥的成熟纤维研磨成粉，称取0.5～1g纤维装入10mL 离心管，加入3mL 0.5％NaOH，于60～75℃处理12～24h；

2)1000rpm/min离心，残渣中加入5mL提取液(己烷：丙酮：乙醇＝2:1:1)，避光萃取7天；

3)1000rpm/min离心10min收集上清于新的10mL离心管中，N₂吹干；

4)根据样品数量，取100μL～1mL 80％丙酮溶解检测浓度；

5)用80％丙酮配置不同浓度的β-胡萝卜素作为比色标准，用酶标仪检测447nm处吸光值。样品类胡萝卜素浓度用β-胡萝卜素的标准曲线标定。

结果显示，Fbl2A-GhPSY2转基因棉花在棉花的次生壁发育期特异性表达GhPSY2基因，使得成熟纤维呈现棕黄色，且成熟纤维中类胡萝卜素水平显著升高。这些结果表明，通过在棉花中导入Fbl2A-GhPSY2转基因可以促进GhPSY2基因在纤维中表达，提高成熟纤维类胡萝卜素水平，使成熟纤维着色。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctggtg ttcttctttg ggtggtatgt cccaaaggga atgccacagc tttacttagc 60

ttgataccaa ggagtgggaa gcataaaagg tgtagggtac atcaaaaggt gaagttttct 120

actggggttt cagctatttc aagtgcagtg gctaacccag cacgatcttc agaagagaag 180

gtttatgatg tggttttaaa gcaagctgct ttggttaaag aacaaagggg gaaaaaacct 240

ttggatttag gaacaagaac tgaaactgat ggattcactg attgggatct tttgaatgaa 300

gcttatggtc ggtgtggtga agtatgtgct gaatatgcta agactttcta tttgggtaca 360

ttacttatga caccagagcg tcggagagct gtgtgggcga tttacgtttg gtgtaggaga 420

acagatgagc ttgtggatgg acctaatgct tcacatatta caccaagggc acttgaccga 480

tgggagaaaa gattagatga tcttttcgaa ggtcgacctt atgatatgct cgatgccgct 540

ttatccgata ctgtctcaaa gtaccctgta gatatacagc cattcaagga catgatagaa 600

ggaatgagat tagatttaag gaagtccaga tatatgaatt ttgatgagct ctatctttac 660

tgctactacg ttgccgggac agttggacta atgagtgttc cggtaatggg gattgcacct 720

gaatcaaaag catcggtgga gagtgtctat aatgccgcat tagccctcgg aattgctaat 780

caacttacta atatacttag agatgttggt gaagatgcta ggagaggaag aatatatcta 840

ccccaagatg aactggcaca gttcggactg tcggacgatg acatatttcg tggacaagta 900

acggataagt ggaggaactt catgaaagat cagataaaac gagcgaggat gttcttcgac 960

gaggcagaaa agggtgtttc cgagctaaat gcggcaagca gatggccggt gtgggcatca 1020

ttgttgctgt atcgacagat attagacgtc attgaagaaa atgattataa caatttcagc 1080

aaaagagcgt atgtagggaa agtaaagaaa tttgcttcac tacctgtggc atatggaaga 1140

gcacttatgg gcacttccaa attgttctga 1170

<210> 2

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Gly Val Leu Leu Trp Val Val Cys Pro Lys Gly Asn Ala Thr

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ser Leu Ile Pro Arg Ser Gly Lys His Lys Arg Cys Arg

20 25 30

Val His Gln Lys Val Lys Phe Ser Thr Gly Val Ser Ala Ile Ser Ser

35 40 45

Ala Val Ala Asn Pro Ala Arg Ser Ser Glu Glu Lys Val Tyr Asp Val

50 55 60

Val Leu Lys Gln Ala Ala Leu Val Lys Glu Gln Arg Gly Lys Lys Pro

65 70 75 80

Leu Asp Leu Gly Thr Arg Thr Glu Thr Asp Gly Phe Thr Asp Trp Asp

85 90 95

Leu Leu Asn Glu Ala Tyr Gly Arg Cys Gly Glu Val Cys Ala Glu Tyr

100 105 110

Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Pro Glu Arg Arg

115 120 125

Arg Ala Val Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu

130 135 140

Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Arg Ala Leu Asp Arg

145 150 155 160

Trp Glu Lys Arg Leu Asp Asp Leu Phe Glu Gly Arg Pro Tyr Asp Met

165 170 175

Leu Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Lys Tyr Pro Val Asp Ile

180 185 190

Gln Pro Phe Lys Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Leu Asp Leu Arg Lys

195 200 205

Ser Arg Tyr Met Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val

210 215 220

Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ser Lys Ala Ser Val Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu

245 250 255

Gly Ile Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp

260 265 270

Ala Arg Arg Gly Arg Ile Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Phe

275 280 285

Gly Leu Ser Asp Asp Asp Ile Phe Arg Gly Gln Val Thr Asp Lys Trp

290 295 300

Arg Asn Phe Met Lys Asp Gln Ile Lys Arg Ala Arg Met Phe Phe Asp

305 310 315 320

Glu Ala Glu Lys Gly Val Ser Glu Leu Asn Ala Ala Ser Arg Trp Pro

325 330 335

Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Val Ile Glu

340 345 350

Glu Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Ser Lys Arg Ala Tyr Val Gly Lys Val

355 360 365

Lys Lys Phe Ala Ser Leu Pro Val Ala Tyr Gly Arg Ala Leu Met Gly

370 375 380

Thr Ser Lys Leu Phe

385

<210> 3

<211> 2313

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcagactt aggattggat ggcgttcagg agcttggatt ggttttctca catcatattt 60

tattaaataa ttattaatta aaatttatgg acttttggac tgtctgacta attttcagaa 120

ttttattttg gttttgggtt ttgttgagtt ttttagataa ttattttaaa tattctgcat 180

aatttttctg ttatttgaaa aggatgttcg aatttttttt caaaattgaa acgtttaaga 240

atttttacta ctgcaaattc agaataagtg aatttgtttt ttagaaagat taaataagtt 300

agtattacga tttttagttt gatttggtgg aaagtaatgt atgtttttga acataattat 360

ttgacaataa ttaagttttc taggaaataa acggaaatat cttctttttt ttttgtaaaa 420

ttactaatgc aagaacaaac aacgttttgg gaagcaaata atctagcttt aagtagtcag 480

tgtaactctc aaaatctggt cataacttct aggctgagtt tgctgtgcta cagtagtaag 540

tctatagaaa cttacctgac aaaacgacat gacgtcaggg tcgaatctac aacttttcct 600

ttttcttcaa ttaacatatg gttgattcaa gttccgatct ataataattt attacgattt 660

atcaatttca attaccttat atcatcctat tataaatata agtcagttca attcagtttt 720

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aagttcaaaa ctataaattt tcactttaga aattaatcat ttttcacatc taagcatcaa 960

atttaaccaa atgacacaaa tttcatgatt agttagatca agcttttgag tcttcaaaaa 1020

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gcttggccga atgctaagag cttaaaaatg gcttcttttg tttctttttg ttgcaaacgg 1140

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tataacatta tactttttgc aagcagttgg ctggtctatc caagagtgat caaagtttga 1320

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tcaacatcat atatttactt attaatacat aaattataat aatttatcat aattttatgg 1800

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tgtactttta ggtaatttta agtactctta accaaacaca aaaattcaaa tcaaatgaac 1920

caaataagat aatataacat acagaatatc ctacttgtat tcttacattc ccgtaatcat 1980

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aaaaaatgtt gaatataatt tttataacat tttttcatat atttgcaaga ttatattttg 2100

tatatttacg taaaaatatt tgacatagat tgaacacctt cttaacataa tcccaccata 2160

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actcaaaatt ctttgctttg tatttcggtt ggg 2313

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatccatgg ctggtgttct tctttgggtg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcacta gtgatcttca gaacaatttg 30

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttctgc agacttagga ttggat 26

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 12260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120

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cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctctagtacg acggccagtc aattcataac 300

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cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 660

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 720

caagtggatt gatgtgaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa 780

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg 840

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa 900

ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc 960

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 1020

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 1080

ggatggcgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 1140

tcatttggag aggacacgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctgctaga 1200

ggatcgatcc atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg 1260

cctgtgggca ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag 1320

cgcgttacaa gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga 1380

tgcagatatt cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa 1440

aggttgggca ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt 1500

gtgggtcaat aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga 1560

tgtcacgccg tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga 1620

actgaactgg cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa 1680

gcagtcttac ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta 1740

caccacgccg aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg 1800

taaccacgcg tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg 1860

tgatgcggat caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt 1920

gaatccgcac ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa 1980

aagccagaca gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa 2040

gggcgaacag ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga 2100

agatgcggac ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt 2160

aatggactgg attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat 2220

gctcgactgg gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt 2280

taacctctct ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga 2340

agaggcagtc aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc 2400

gcgtgacaaa aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg 2460

tccgcaaggt gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc 2520

gacgcgtccg atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag 2580

cgatctcttt gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga 2640

tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca 2700

tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta 2760

caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt 2820

tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc 2880

gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc 2940

gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc 3000

gcagcaggga ggcaaacatg aatcaacaac tctcctggcg caccatcgtc ggctacagcc 3060

tcgggaattg ctaccgagct cgagcttgga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 3120

ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 3180

cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 3240

tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 3300

tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 3360

cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 3420

catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 3480

ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 3540

ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 3600

ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 3660

tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 3720

ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 3780

atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 3840

cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agaattaatt cggtacgctg aaatcaccag 3900

tctctctcta caaatctatc tctctctatt ttctccataa ataatgtgtg agtagtttcc 3960

cgataaggga aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc 4020

cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 4080

caaaatccag tctagtacga cggccagtca attcataact tcgtatagca tacattatac 4140

gaagttatga ccgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc 4200

gctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc tggacatgca attgttttat ttactatcac 4260

aagattagta gatgtcgttg gcgaaaagtc attagtttta ttcgatgaac cagaggttca 4320

tctgcatcca cctttgctct ctgctttttt acgaacatta agcgacttac tcgatgcacg 4380

caatggtgta gcaataattg caactcattc cccagtagta ctgcaagagg ttccaaaatc 4440

ctgcatgtgg aaagtcctac ggtcaagaga agcaataaat attatccgtc cggatattga 4500

gacattcggt gagaacttag gtgttttaac tcgtgaggtg tttttacttg aagtgacaaa 4560

ttctggatac caccacttat tatcgcagtc cgttgattca gagctttctt atgaaaccat 4620

tctaaaaaat tataatggtc agataggatt agaaggtcga accgttttaa aagcgatgat 4680

aatgaacaga gatgaaggta aagtacaatg aaaaaactac ctcttccagc gagaacttat 4740

agcgaaatgc ttaataaatg ctcggaaggt atgatgcaga taaatgttag aaataatttc 4800

attactcact tccccacttt tttgcagaaa gaacaacaat atagaatatt aagctcgaca 4860

ggtcagttat ttacctacga caggacacac cctcttgagc ctacaacctt agtagttggt 4920

aacctgacaa aggttaaatt agaaaagctt ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc 4980

taacagaact cgccgtaaag actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg 5040

acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac gcttgtctac tccaaaaata 5100

tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat 5160

ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 5220

aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 5280

atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 5340

aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 5400

taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 5460

catttcattt ggagaggaca gggtacggat ccgtactagt cccgggcccg tcgacatggt 5520

accagaattc cctgctttaa tgagatatgc gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt 5580

tcaattctgt tgtgcacgtt gtaaaaaacc tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc 5640

ggtttcggtt cattctaatg aatatatcac ccgttactat cgtattttta tgaataatat 5700

tctccgttca atttactgat tgtccagtac gtaactggag atccctcgag tttctccata 5760

ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt tcgctcatgt 5820

gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa 5880

aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg aattaattcg 5940

gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat 6000

ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga ccggcagctc 6060

ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt cagcgggaga 6120

gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag aacggcaact 6180

aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct cgcggagggt agcatgttga ttgtaacgat 6240

gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc gatactatgt 6300

tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta aggttttaga 6360

atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg ggtatcttta 6420

aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat caccggaatt 6480

gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt ctcctgctaa 6540

ggtatataag ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg acagccggta 6600

taaagggacc acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc tggaaggaaa 6660

gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca atctgctcat 6720

gagtgaggcc gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa gccctgaaaa 6780

gattatcgag ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca tatcggattg 6840

tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac tgaataacga 6900

tctggccgat gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag atccgcgcga 6960

gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt cccacggcga 7020

cctgggagac agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta ttgatcttgg 7080

gagaagcggc agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt cgatcaggga 7140

ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga tcaagcctga 7200

ttgggagaaa ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc tagaatgcat 7260

gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 7320

caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 7380

accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 7440

ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 7500

aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 7560

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 7620

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 7680

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 7740

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 7800

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 7860

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 7920

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 7980

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 8040

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 8100

agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 8160

gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 8220

tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 8280

tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 8340

tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg tgccttgatg 8400

tgggcgccgg cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta gattgcctgg 8460

ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg aagcggcggg 8520

gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg ctgtgcgctg 8580

gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt ttaaagagtt 8640

ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt gtgaccggtt 8700

cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt acggctttgg 8760

gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt cccctgctag 8820

ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt cgccctcgat 8880

caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct ccttcaaatc 8940

gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga acttcttgaa 9000

ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg cttctgcctt 9060

gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat cgatcaaaaa 9120

gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct cgcggtacat 9180

ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct ttacgatctt 9240

gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt tcttggcctt 9300

cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt ctaccaggtc 9360

gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg caacgtgtgg 9420

acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca tggattcggt 9480

tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca tgccggccgg 9540

ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct cgccagctcg 9600

tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac tatcgcgggt 9660

gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct tgggcggctt 9720

cctaatcgac ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga ttcgatcagc 9780

ggccgcttgc cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc gctgggcggc 9840

ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga tttgtaccgg 9900

gccggatggt ttgcgaccgt cacgccgatt cctcgggctt gggggttcca gtgccattgc 9960

agggccggca gacaacccag ccgcttacgc ctggccaacc gcccgttcct ccacacatgg 10020

ggcattccac ggcgtcggtg cctggttgtt cttgattttc catgccgcct cctttagccg 10080

ctaaaattca tctactcatt tattcatttg ctcatttact ctggtagctg cgcgatgtat 10140

tcagatagca gctcggtaat ggtcttgcct tggcgtaccg cgtacatctt cagcttggtg 10200

tgatcctccg ccggcaactg aaagttgacc cgcttcatgg ctggcgtgtc tgccaggctg 10260

gccaacgttg cagccttgct gctgcgtgcg ctcggacggc cggcacttag cgtgtttgtg 10320

cttttgctca ttttctcttt acctcattaa ctcaaatgag ttttgattta atttcagcgg 10380

ccagcgcctg gacctcgcgg gcagcgtcgc cctcgggttc tgattcaaga acggttgtgc 10440

cggcggcggc agtgcctggg tagctcacgc gctgcgtgat acgggactca agaatgggca 10500

gctcgtaccc ggccagcgcc tcggcaacct caccgccgat gcgcgtgcct ttgatcgccc 10560

gcgacacgac aaaggccgct tgtagccttc catccgtgac ctcaatgcgc tgcttaacca 10620

gctccaccag gtcggcggtg gcccatatgt cgtaagggct tggctgcacc ggaatcagca 10680

cgaagtcggc tgccttgatc gcggacacag ccaagtccgc cgcctggggc gctccgtcga 10740

tcactacgaa gtcgcgccgg ccgatggcct tcacgtcgcg gtcaatcgtc gggcggtcga 10800

tgccgacaac ggttagcggt tgatcttccc gcacggccgc ccaatcgcgg gcactgccct 10860

ggggatcgga atcgactaac agaacatcgg ccccggcgag ttgcagggcg cgggctagat 10920

gggttgcgat ggtcgtcttg cctgacccgc ctttctggtt aagtacagcg ataaccttca 10980

tgcgttcccc ttgcgtattt gtttatttac tcatcgcatc atatacgcag cgaccgcatg 11040

acgcaagctg ttttactcaa atacacatca cctttttaga cggcggcgct cggtttcttc 11100

agcggccaag ctggccggcc aggccgccag cttggcatca gacaaaccgg ccaggatttc 11160

atgcagccgc acggttgaga cgtgcgcggg cggctcgaac acgtacccgg ccgcgatcat 11220

ctccgcctcg atctcttcgg taatgaaaaa cggttcgtcc tggccgtcct ggtgcggttt 11280

catgcttgtt cctcttggcg ttcattctcg gcggccgcca gggcgtcggc ctcggtcaat 11340

gcgtcctcac ggaaggcacc gcgccgcctg gcctcggtgg gcgtcacttc ctcgctgcgc 11400

tcaagtgcgc ggtacagggt cgagcgatgc acgccaagca gtgcagccgc ctctttcacg 11460

gtgcggcctt cctggtcgat cagctcgcgg gcgtgcgcga tctgtgccgg ggtgagggta 11520

gggcgggggc caaacttcac gcctcgggcc ttggcggcct cgcgcccgct ccgggtgcgg 11580

tcgatgatta gggaacgctc gaactcggca atgccggcga acacggtcaa caccatgcgg 11640

ccggccggcg tggtggtgtc ggcccacggc tctgccaggc tacgcaggcc cgcgccggcc 11700

tcctggatgc gctcggcaat gtccagtagg tcgcgggtgc tgcgggccag gcggtctagc 11760

ctggtcactg tcacaacgtc gccagggcgt aggtggtcaa gcatcctggc cagctccggg 11820

cggtcgcgcc tggtgccggt gatcttctcg gaaaacagct tggtgcagcc ggccgcgtgc 11880

agttcggccc gttggttggt caagtcctgg tcgtcggtgc tgacgcgggc atagcccagc 11940

aggccagcgg cggcgctctt gttcatggcg taatgtctcc ggttctagtc gcaagtattc 12000

tactttatgc gactaaaaca cgcgacaaga aaacgccagg aaaagggcag ggcggcagcc 12060

tgtcgcgtaa cttaggactt gtgcgacatg tcgttttcag aagacggctg cactgaacgt 12120

cagaagccga ctgcactata gcagcggagg ggttggatca aagtactttg atcccgaggg 12180

gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg ataaaccttt tcacgccctt 12240

ttaaatatcc gttattctaa 12260

Claims (6)

1.表达载体在棉花的次生壁发育期特异表达GhPSY2基因生产棕黄色纤维中的应用；

将所述GhPSY2基因的序列和启动子Fbl2A的序列插入载体pLGN中得到表达载体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GhPSY2基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子Fbl2A具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述载体pLGN的构建方法包括：将植物表达载体pBI121的T-DNA区段替换为了组成型的2×35S启动子控制的报告基因GUS和标记基因NPTII的融合基因表达盒，以及另一个由35S-P控制的表达盒。

5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述载体pLGN具有SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述载体pLGN经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切载体，将所述启动子Fbl2A的序列经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到酶切启动子，将所述GhPSY2基因的序列经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，得到酶切序列，将所述酶切启动子和酶切序列插入到酶切载体中，得到表达载体。