ES2275879T3 - Metodo de obtencion de planta monocotiledonea conteniendo un gen de interes sin secuencia auxiliar foranea. - Google Patents
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Abstract
REIVINDICACIONES 1- Método de obtención de una planta monocotiledónea transgénica conteniendo un gen de interés (i) sin secuencia auxiliar foránea, comprendiendo las siguientes etapas: a) transformación de al menos una célula de planta que no posee ninguna transposasa activa, con un vector comprendiendo dos casetes de expresión, uno comprendiendo una secuencia nucleotídica de interés (i), el otro comprendiendo una secuencia nucleotídica codificadora de un marcador de selección (ii) enmarcada por las secuencias movibles de un transposón, dicho casete de expresión comprendiendo una secuencia nucleotídica de interés (i) que está fuera del elemento transposón; b) selección de las plantas transformadas con el marcador de selección (ii); c) cruzamiento de una planta transformada con otra planta perteneciente a una descendencia conteniendo en su genoma un gen, codificador de una transposasa activa endógena, y que se encuentra en medio de un marcador fenotípico de escisión (iii), para obtener una F1 o cualquier otro individuo de generación ulterior; d) selección de las células o los individuos portadores del gen de interés sin secuencia auxiliar foránea, a partir de la generación F1; e) regeneración de las plantas a partir de las células o de los individuos seleccionados en (d).
Description
Método de obtención de planta monocotiledónea
conteniendo un gen de interés sin secuencia auxiliar foránea.
La presente invención se refiere a un método de
obtención de planta monocotiledónea conteniendo un gen de interés
sin secuencia auxiliar foránea.
La transgénesis vegetal consiste en introducir
en una planta uno o varios genes provenientes de diferentes
organismos (bacterias, virus, insectos, plantas), con la finalidad
de aportarles nuevos caracteres y mejorar algunas cualidades
agronómicas o alimenticias. La gran diversidad de genes, asociada al
desarrollo de las técnicas clásicas de transformación genética, ha
llevado a la creación de nuevas variedades vegetales. En algunos
casos, gracias a la introducción de caracteres que confieren una
resistencia a un herbicida, a patógenos o a diversos estreses, las
prácticas de cultivo pueden ser facilitadas y los rendimientos
aumentados. En otros casos, el valor nutritivo de la planta y la
proporción de ciertos compuestos esenciales pueden ser mejorados.
Sin embargo, la integración de genes a un genoma durante un proceso
de transgénesis es realizada con muy poca frecuencia. Por esto, en
la mayoría de los casos, se vincula genéticamente con los genes de
interés ya sea un gen marcador de selección, que ofrece una ventaja
selectiva a las células transformadas, ya sea un marcador
fenotípico, que permite al especialista identificar las células
transformadas entre las otras.
Los genes marcadores de selección, tales como
los genes de resistencia a los antibióticos o a los herbicidas, son
esenciales para localizar los eventos de transformación. Sin
embargo, permanecen en la planta y en consecuencia pueden
igualmente ser detectados bajo la forma de ADN o de proteínas en
algunos productos derivados, aunque usualmente no aportan valor
añadido a la planta transformada obtenida. La presencia de estos
genes, y en particular los genes de resistencia a los antibióticos
y a los herbicidas, son centro actualmente de numerosos debates
sobre los organismos genéticamente modificados (Flavell y otros,
1992; Chesson y otros, 2000).
Por consiguiente, es necesario elaborar sistemas
que permitan la eliminación de estos genes de selección, una vez
que los transformantes hayan sido aislados por acción del agente
selectivo o/y por análisis moleculares. Numerosos métodos de
eliminación más o menos complejos han sido estudiados, tales
como:
- la co-transformación que
consiste en introducir dos ADN-T (ADN de
transferencia) en el organismo, el primero con el gen de interés y
el otro con el gen de selección. Este método es más bien utilizado
para las especies de ciclo de reproducción corto. Luego se
selecciona dentro de la descendencia los transformantes portando el
transgén de interés pero que hayan perdido el gen de selección por
segregación.
- los sistemas que explotan la recombinación en
sitios específicos tales como el sistema cre/lox del
bacteriófago P1 o el sistema FLP/FRT de la levadura (FliPase
recombinasa; Lyzrik y otros, 1997) utilizados por las especies de
ciclo de reproducción largo (maíz, arbustos). Pero estos sistemas
siguen siendo complejos y pesados.
- los sistemas de eliminación que explotan las
propiedades de genes movibles presentes en numerosos genomas como
los retroelementos y los transposones, y en particular el sistema
Ac/Ds del maíz, utilizados en numerosas especies.
Los elementos transponibles, en general, de
ellos en particular el sistema Ac/Ds, pueden ser extirpados y
reinsertados en el genoma durante el desarrollo celular. Estos
elementos pueden también no encontrar sitio receptor en el cual
insertarse y entonces son degradados por nucleasas. Principalmente
utilizados para la clonación y el etiquetaje de ciertos genes de
fenotipo de expresión visibles (Dellaporta y otros, 1988),
los transposones pueden igualmente servir para movilizar, extirpar
y eliminar genes (PCT/US91/04679).
Un sistema que utiliza Ac/Ds del maíz y que
permite la eliminación de genes marcadores de selección en el
tomate, especie que no posee elemento Ac o Ds en el estado natural,
fue descrito por Yoder y otros (1993).
Pero este sistema, que tuvo sus pruebas en
plantas heterólogas de tipo Dicotiledóneas (tomate, arabette,
tabaco), parecía hasta entonces difícilmente explotable en
monocotiledóneas en particular el maíz, especie en la cual el Ac/Ds
reside naturalmente. En efecto la presencia de elementos endógenos
hace difícil el dominio y explotación de este sistema.
En consecuencia, si bien WO 98/38323 sugiere que
este sistema podría ser utilizado en el maíz, no ejemplifica la
puesta en práctica más que en plantas dicotiledóneas.
En el marco de la presente solicitud, los
inventores lograron concluir un nuevo proceso original de
eliminación de genes marcadores en monocotiledóneas, en particular
en el maíz, utilizando un sistema de transposones endógeno, como
por ejemplo el sistema Ac/Ds.
La presente invención por consiguiente tiene por
objetivo un método de obtención de una planta monocotiledónea
transgénica conteniendo un gen de interés (i) sin secuencia auxiliar
foránea, que comprende las siguientes etapas:
\newpage
a) transformación de al menos una célula de
planta que no posee ninguna transposasa activa, con un vector
comprendiendo dos casetes de expresión, uno comprendiendo una
secuencia nucleotídica de interés (i), otro comprendiendo una
secuencia nucloetídica codificadora de un marcador de selección (ii)
encuadrado por las secuencias movibles de un transposón,
comprendiendo dicho casete de expresión una secuencia nucleotídica
de interés (i) estando fuera del elemento transposón;
b) selección de las plantas transformadas con el
marcador de selección (ii);
c) cruzamiento de una planta transformada con
otra planta perteneciente a una descendencia conteniendo en su
genoma un gen, codificador de una transposasa activa endógena, y que
se encuentra en medio de un marcador fenotípico de escisión (iii),
para obtener una F1 o cualquier otro individuo de generación
ulterior;
d) selección de las células o los individuos
portadores del gen de interés sin secuencia auxiliar foránea, a
partir de la generación F1;
e) regeneración de plantas a partir de las
células o de los individuos seleccionados en (d).
Por "secuencias auxiliares ajenas", se
entienden secuencias (ii) codificadoras para un marcador de
selección el cual puede ser igualmente un marcador fenotípico que
permite seleccionar una planta transformada de una planta que no
contiene el ADN ajeno transfectado. Como secuencia codificadora de
un marcador de selección, o gen marcador de selección, puede
citarse en particular un gen que confiere una resistencia a un
antibiótico (Herrera-Estrella y otros,
1983), o una resistencia a un herbicida (EP 242 246), o además:
- el gen sul confiriendo la resistencia al
herbicida sulfonamida Asulam (WO 98/49316),
- el gen nptII confiriendo la resistencia a la
kanamicina (Bevan y otros, 1983),
- el gen hph confiriendo la resistencia a la
higromicina (Herrera-Estrella y otros,
1983),
- el gen bar confiriendo la tolerancia al
bialafos (White y otros, 1990),
- el gen EPSPS confiriendo la tolerancia al
glifosato (US 5,188,642),
- el gen HPPD que confiere la tolerancia a los
isoxazolos (WO 96/38567),
- el gen del cloranfenicol acetil transferasa
(CAT) que desintoxica el cloranfenicol.
En el marco de la invención, se utilizará
preferiblemente el gen bar o el gen nptII.
Como secuencia codificadora de un marcador
fenotípico, o gen marcador fenotípico útil como marcador de
selección (ii) en el proceso según la invención, pueden citarse los
genes reporteros que permiten una selección según un criterio
fenotípico, colorimétrico o luminiscente y fácilmente detectable,
como por ejemplo:
- el gen codificador de la enzima
\beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson y
otros, 1987),
- el gen codificador de la proteína de
fluorescencia verde GFP que permite visualizar con UV, las células
transformadas (Chalfie y otros, 1994), así como todas las
otras proteínas fluorescentes derivadas de la GFP,
- el gen nptII que, utilizado en pequeña dosis,
inhibe la síntesis de cloroplastos,
o más usualmente cualquier gen que permita la
expresión de un pigmento como por ejemplo los genes que intervienen
en la síntesis de los flavonoides (antocianinas, flobafenos y
derivados), que pueden ser utilizados como genes reporteros en la
transformación de cereales. Este sistema reportero permite la
expresión de pigmentos yendo del rojo al violeta en ciertos tejidos
transformados. Puede citarse el ejemplo de genes reguladores Lc
(Ludwig y otros, 1990) B y C1 interviniendo en la síntesis de las
antocianinas y el gen P interviniendo en la síntesis de los
flobafenos (Grotewold y otros, 1998).
Según un modo preferido, se puede integrar en el
casete de expresión comprendiendo una secuencia nucleotídica
codificadora de un marcador de selección (ii) otro gen marcador
fenotípico de tipo gen reportero de selección no destructivo, para
facilitar las etapas de selección por simple observación visual, no
destructiva. A modo de ejemplo, puede citarse la GFP descrita por
Nielsen y otros (1999) y cualquiera otra variante de la GFP
utilizable en las plantas, como por ejemplo las descritas por Seth
J. Davis (1998).
Para la secuencia codificadora de un marcador de
selección (ii) antes mencionado, se utilizará ventajosamente un
promotor específico de un tejido o de un órgano para diferenciar la
expresión de ese gen marcador fenotípico (ii) en relación con la
expresión del marcador fenotípico de escisión (iii) de la planta
utilizada en la etapa (c) para cruzar la planta transformada.
La presente invención se refiere, por
consiguiente, a un sistema de dos componentes, que están
representados en la figura nº 1:
- una primera planta que no posee ninguna
transposasa activa aunque presenta un sistema transposón endógeno,
en la cual un construido, comprendiendo el casete de expresión del
gen de interés (i) y el del gen marcador de selección (ii), puede
ser integrado a ella.
- una segunda planta conteniendo en su genoma un
gen codificador de una transposasa activa endógena y que es
insertado en un marcador fenotípico de escisión (iii).
De manera preferencial, la planta
monocotiledónea transformada según la invención no contiene ninguna
transposasa activa aunque tenga un sistema transposón endógeno. De
manera preferida, la planta monocotiledónea transformada puede ser
una planta de maíz, y puede pertenecer a:
- la descendencia A188 que no contiene ninguna
transposasa activa
- una descendencia M1 sin ninguna transposasa
activa, resultado del cruzamiento de las descendencias A188 y B73,
y favorable a la formación de callos de tipo II muy regenerantes
- o más usualmente cualquier otro descendiente
que no contiene ninguna transposasa activa.
Entre los elementos transponibles según la
invención, pueden utilizarse por ejemplo familias de transposones
puestas en evidencia en las monocotiledóneas, tales como:
- el elemento Dotted (Dt), puesto en
evidencia en el maíz
- la familia de elementos Mutator like
(Mu), puesta en evidencia en el maíz y el arroz
- la familia Activator/Dissociation like
(Ac/Ds), puesta en evidencia en el maíz
(Müller-Neumann y otros, 1984), la cebada
(Chernyshev y otros, 1988), y el mijo (MacRae y otros,
1994)
- la familia CACTA like, puesta en evidencia en
el maíz (Pereira y otros, 1986), el sorgo (Chopral y otros, 1999),
la cebada (Chernyshev y otros, 1988), y el arroz (Mototashi R. y
otros, 1996)
- la familia copia like, puesta en evidencia en
la cebada (Mannimem y otros, 1993)
Según un modo preferido de la invención, el
sistema de eliminación, de genes marcadores es el sistema Ac/Ds de
maíz.
Los elementos de la familia
Activator/Dissociation (Ac/Ds) forman parte de los elementos
transponibles de tipo II, y están compuestos así principalmente de
dos dominios:
- un gen que codifica la proteína necesaria a la
movilidad de las copias, la transposasa.
- dos extremidades terminales invertidas y
repetidas llamadas ITR (Inverted Terminal Repeat). Las ITR y ciertas
secuencias flanqueantes parecen servir de referencia para dirigir
la acción de la transposasa.
El elemento Ds es un elemento Ac que ha
sufrido significativas mutaciones o supresiones en la secuencia
codificadora de la transposasa. No puede extirparse de su sitio de
inserción más que en presencia de una fuente de transposasa activa
Ac. Por consiguiente, es Ac-dependiente.
Por extensión puede llamarse un elemento Ds todo
elemento compuesto por dos ITR rodeando cualquier secuencia interna
cuya tamaño sea inferior a la del elemento autónomo.
Según la presente invención, el construido del
ADN utilizado en la etapa (a) comprende un casete de expresión del
gen de interés (i) y un casete de expresión del gen marcador de
selección (ii).
El gen marcador a eliminar (ii) está integrado
entre dos bordes provenientes de las extremidades de un elemento Ac
y contiene las secuencias necesarias para la transposición. Todo es
insertado al ADN-T que porta así un elemento
transposón defectivo de tipo Ds conteniendo el gen de selección.
Este elemento es llamado Ds::M (M por Marcador de selección o
Marcador fenotípico).
El gen de interés está en cuanto a él en el
ADN-T y fuera del elemento transponible Ds::M.
Según la presente invención, las secuencias
nucleotídicas de interés (i) pueden ser todas las secuencias de
ácidos nucleicos que permiten dar o mejorar un rasgo de carácter
interesante en la planta transgénica resultante. Por ejemplo, la
secuencia de ácido nucleico puede codificar para proteínas o
transcritos ARN antisentido que pueden permitir mejorar los valores
nutricionales, el rendimiento, la resistencia a los patógenos, a las
enfermedades, a la sequía…. Tales genes son particularmente
descritos en las solicitudes de patente WO 91/02071 y WO
95/06128.
Las secuencias nucleicas de interés pueden
igualmente ser introducidas como instrumento genético para generar
mutantes y/o ayudar en la identificación, el marcaje molecular o el
aislamiento de segmentos de genes de plantas. Otros ejemplos son
descritos en Weising y otros, 1995.
Según la presente invención, el ácido nucleico
de interés (i) es insertado en una construcción de ácidos nucleicos,
llamada casete de expresión del gen de interés, y está relacionado
de manera operacional con elementos que permiten su expresión y
eventualmente su regulación.
Entre estos elementos, pueden citarse los
promotores, los activadores y los terminadores de transcripción.
Entre los promotores de transcripción que pueden
ser utilizados, pueden citarse en particular promotores
constitutivos, promotores específicos de tejidos o de órganos, así
como promotores específicos de desarrollo.
De manera general, se utilizará preferiblemente
un promotor constitutivo tal como el promotor pAct 1 del gen Act 1
del arroz contenido en el plásmido pAct1-F4 (Mc
Elroy y otros, 1991) o el promotor p35S (Kay y otros,
1987), o un promotor de tejido específico como el promotor HMWG del
trigo o de la cebada, o además el promotor pCRU del gen de la
crucífera del rábano, que permiten los tres una expresión de la
proteína de interés en las semillas (Robert y otros, 1989;
Anderson O.D y otros, 1989; Depigny-This y
otros, 1992).
Otros elementos tales como los intrones,
mejoradores, secuencias de poliadenilación y derivados, pueden
igualmente estar presentes en la secuencia nucleica de interés,
para mejorar la expresión o el funcionamiento del gen
transformante.
De manera ventajosa, el casete de expresión
puede también contener secuencias 5' no traducidas llamadas
"leader". Tales secuencias pueden mejorar la traducción.
Entre los terminadores utilizables en las
construcciones de la invención, se puede citar en particular: el
terminador Nos correspondiente a la región 3'
no-codificadora del gen de la nopalina sintasa del
plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y
otros, 1982).
El casete de expresión del gen de interés (i) es
insertado en un vector nucleotídico, tal como un plásmido, que
comprende además el casete de expresión del gen marcador (ii)
insertado entre dos ITR.
Según la presente invención, el casete de
expresión del gen marcador (ii) comprende el ácido nucleico
codificador del marcador de selección o el marcador fenotípico,
flanqueado por elementos necesarios para su expresión, en
particular los promotores, los activadores y los terminadores, tales
como son descritos anteriormente.
Según un modo de realización del proceso de la
invención, las células vegetales son transformadas por un vector
tal como es definido anteriormente, transferido a un hospedero
celular susceptible de infectar dichas células vegetales
permitiendo la integración en el genoma de estas últimas, de las
secuencias nucleotídicas de interés inicialmente contenidas en el
genoma del vector antes mencionado. Ventajosamente, el hospedero
celular utilizado es una cepa bacteriana, tal como Agobacterium
tumefaciens, en particular según el método descrito en el
artículo de An y otros, (1986), o además Agrobacterium
rhizogenes, en particular según el método descrito en el
artículo de Guerche y otros, (1987).
Por ejemplo, la transformación de las células
vegetales puede ser realizada por la transferencia de la región T
del plásmido circular extra cromosómico indicador de tumores Ti de
Agrobacterium tumefaciens, utilizando un sistema binario
(Watson y otros, 1994). Para hacerlo, dos vectores son construidos.
En uno de esos vectores, la región T fue eliminada por supresión, a
excepción de los bordes izquierdo y derecho, siendo insertado un
gen marcador entre ellos para permitir la selección en las células
de plantas. El otro elemento del sistema binario es un plásmido Ti
auxiliar, plásmido modificado que no tiene ya región T pero que
contiene todavía los genes de virulencia vir, necesario para la
transformación de la célula vegetal.
Según un modo preferido, se puede utilizar el
método descrito por Ishida y otros (1996), para la transformación
de las monocotiledóneas.
Pueden citarse también otros modos de
realización del proceso de la invención, en particular los métodos
de transferencia directa de genes a las células vegetales tales
como la microinyección directa en embrioides de planta (Neuhaus y
otros, 1987), la infiltración en planta de inflorescencias (Bechtold
y otros, 1993) o la electroporación de protoplastos (Chupeau
y otros 1989) o además la precipitación directa al medio de
PEG de protoplastos (Schocher y otros, 1986) o el bombardeo
de callos o de embriones por un dispositivo emisor de partículas
recubiertas del ADN plasmídico de interés (Fromm M. y otros,
1990).
Según otro protocolo, la transformación es
realizada según el método descrito por Finer y otros (1992),
utilizando un dispositivo emisor de partículas de tungsteno o
ventajosamente de oro, sobre callos o embriones.
La selección en la etapa (b) de las células de
plantas transformadas puede ser efectuada en medio selectivo o por
simple observación visual en el caso de la utilización de un gen
marcador fenotípico.
El cruzamiento de la etapa (c) se realiza entre
la planta transformada y otra planta, teniendo una transposasa
activa endógena y que está en medio de un marcador fenotípico de
escisión (iii), para obtener una F1 o cualquier otro individuo de
generación ulterior según las técnicas conocidas por el
especialista. La otra planta es preferiblemente una descendencia
elite con caracteres agronómicos de interés.
Según la presente invención, se entiende por
transposasa activa endógena una transposasa activa obtenida de
forma no transgénica.
Según la presente invención, la planta
transformada e identificada es cruzada en la etapa (c) con otra
planta perteneciendo a una descendencia conteniendo en su genoma un
gen, que codifica para una transposasa activa endógena, y que se
encuentra insertada en un marcador fenotípico de escisión (iii).
Los transposones tienen tendencia a metilarse
durante generaciones, en particular en el maíz, entonces ya ningún
transcrito es detectable. La fase activa del transposón corresponde
por consiguiente a un estado de débil metilación que permite la
transcripción normal del gen. Asociando al transposón un marcador
fenotípico de escisión se pueden visualizar las células en las que
hubo transposición y cuantificar el nivel de actividad del
transposón en el organismo y así visualizar la producción de
transposasa. Usualmente el transposón es insertado entre el
promotor y la parte codificadora del marcador fenotípico de
escisión, lo que hace imposible su expresión. Cuando el transposón
expresa la transposasa, puede extirparse del gen en el cual fue
insertado, lo que restablece la actividad del gen. Se puede así
visualizar por análisis fenotípico las células en las cuales hubo
producción de la transposasa susceptible de extirpar el elemento
Ds::M.
Por "marcador fenotípico de escisión"
(iii), se entiende cualquier gen codificador de un pigmento o
cualquier otro gen que permita seguir la evolución de la escisión
del elemento Ac. A modo de ejemplo un marcador fenotípico de
escisión puede ser cualquier gen cuya mutación ofrezca un fenotipo
visible en la semilla o la planta o una parte de la planta por
ejemplo genes que intervienen en la vía bioquímica de las
antocianinas o de los flobafenos. Se pueden citar los genes
constitutivos A1, A2, C2, Bz1 o Bz2 y los genes reguladores C1, Vp1,
PI, P1 y R1. Según la presente invención el alelo preferido puede
ser el alelo R-nj que es un marcador fenotípico
endógeno de la familia R1 presente en algunas descendencias de maíz.
El alelo R-nj::transposón es portador de un
elemento Ac activo, al ser particularmente hipometilada la región
cromosómica a la cual pertenece R-nj (Brink y
otros, 1973). Cuando el Ac se transpone fuera del gen
R-nj, este último vuelve a ser usualmente funcional,
lo que se traduce en la producción de sectores antocianinados
violeta de tipo "navajo" visibles en la corona de la semilla,
de ella su embrión. Este fenotipo variegado es un buen medio para
evaluar y localizar eventos por los cuales hubo producción de
transposasa. Además, permite verificar la actividad del transposón
durante generaciones y seguir la transposasa a lo largo de los
cruzamientos.
A modo de ejemplo de descendencias utilizables
en la etapa (c) conteniendo en su genoma un gen codificador de una
transposasa activa endógena, y que se encuentra insertada en un
marcador fenotípico de escisión, pueden citarse las
descendencias:
- W22/R-nj::Ac, descendencia
homocigota para el alelo R-nj::Ac salida de semillas
provenientes del Stock Center (http://www.agron.missouri.edu/).
- A188/R-nj::Ac, descendencia
homocigota para el alelo R-nj::Ac introgresado en el
fondo genético de A188.
- Hill/R-nj::Ac descendencia
homocigota para el alelo R-nj::Ac introgresado en el
fondo genético de Hill.
- W23/P-w, descendencia
homocigota para el alelo P-w salido de semillas
provenientes del Stock Center. Un elemento Ac es insertado en el
alelo P-rr.
- o más usualmente cualquier descendencia
poseyendo un transposón activo insertado en un gen de fenotipo
visible y poseyendo el genotipo necesario para su expresión.
El alelo portador del elemento Ac, aunque
inestable puede ser transferido a otras descendencias por numerosos
cruzamientos. Basta verificar antes de la introgresión que la
descendencia receptora posea bien la totalidad de los alelos
necesarios para la expresión del fenotipo. En el caso del alelo
R-nj::Ac, los alelos A1, A2, Bz1, Bz2 y C1 deben
ser presentados o pueden ser introgresados.
La selección, en la etapa (d), de los individuos
que portan el gen de interés (i) sin secuencia auxiliar foránea
puede ser realizada en plantas F1, o plantas F2, o callos nacidos de
embriones F1. La selección de los individuos puede ser apreciada
por técnicas conocidas por el especialista como las técnicas de PCR
y de Southern, o de observaciones fenotípicas. Por consiguiente, es
realizada por ejemplo una identificación de los eventos
transformados que hayan integrado en su genoma el
ADN-T portador del gen marcador de selección (ii), y
en particular una selección de los eventos monocopia. Es posible
efectuar una selección de las plantas F1 resistentes para buscar
escisiones somáticas, y un análisis de las plantas F2 sensibles para
detectar eventuales escisiones germinales.
La presente invención se refiere igualmente a un
método de obtención de una planta monocotiledónea transgénica
conteniendo un gen de interés sin secuencia auxiliar foránea en la
cual la selección en la etapa (d) de los individuos se hace por vía
reproductiva y comprende las siguientes etapas:
- selección de los granos F1 variegados;
- selección de los eventos de escisión somática
del elemento DS::M por técnica PCR;
- selección de los eventos de escisión germinal
del elemento DS::M por técnica PCR;
- obtención de semilleros de plantas F2 a partir
de estos eventos.
Así según la presente invención la selección de
los individuos portadores del gen de interés (i) sin secuencia
auxiliar foránea puede ser resultado de un análisis de la
variegación del alelo marcador de escisión del transposón, en las
espigas F1.
Igualmente entra en el marco de la invención un
método de obtención de una planta monocotiledónea transgénica
conteniendo un gen de interés (i) sin secuencia auxiliar foránea en
el cual la selección de los individuos, en la etapa (d), se hace
por vía vegetativa y comprende las siguientes etapas:
- producción de callos a partir de embriones
inmaduros F1.
- selección visual de los callos que contienen
el ADN-T y el elemento Ds::M
- multiplicación de callos y búsqueda de
sectores de escisión del elemento Ds::M
- regeneración de plantas F1 a partir de estos
sectores de escisión.
Según la presente invención, plantas F1 pueden
ser obtenidas directamente por regeneración a partir de callos
seleccionados en la etapa (d), por la vía de cultivo in vitro
de embriones inmaduros de espigas F1.
La invención permite obtener monocotiledóneas
transgénicas o partes de plantas, tales como células o callos,
conteniendo un gen de interés sin secuencias auxiliares.
Las plantas monocotiledóneas híbridas,
caracterizadas porque son obtenidas por el cruzamiento de las
plantas obtenidas por los procesos descritos anteriormente, pueden
también ser obtenidas, a través de un proceso según la
invención.
Éste concierne en particular a las plantas de
maíz.
La invención utiliza un método de selección en
callos de los eventos presentando una escisión del elemento Ds::M
para la obtención de plantas transgénicas conteniendo un gen de
interés (i) sin secuencia auxiliar foránea, y comprendiendo las
etapas:
- producción de callos a partir de embriones
inmaduros F1
- selección visual de los callos conteniendo el
ADN-T y el elemento Ds::M
- Multiplicación de callos y búsqueda de
sectores de escisión del elemento Ds::M
- regeneración de plantas F1 a partir de estos
sectores de escisión.
La formación de callo es debida a una
proliferación celular, es decir una aglomeración de células
indiferenciadas y rejuvenecidas que podrán dar nacimiento a
embriones bipolares. Estos embriones bipolares pueden, en ciertas
condiciones conocidas por el especialista, comportarse como
embriones cigotos -salidos de la fecundación entre una célula
sexual femenina y una célula sexual masculina- y dar una planta.
Durante divisiones celulares que tienen lugar
durante el cruzamiento del callo, cierto número de eventos de
escisión del transposón Ds::M van a tener lugar. El callo así
constituido es por consiguiente quimérico y contiene sectores de
células que poseen el Ds::M y sectores de células que no poseen ya
el Ds::M.
El gen marcador fenotípico permite identificar
las células transformadas durante procesos de transgénesis que
posean un fenotipo pudiendo expresarse en el callo.
Alternativamente, este método puede igualmente
servir para reconocer las células en las cuales el gen marcador
fenotípico (iii) ya no se expresa, ya sea a causa de una extinción
del gen, ya sea a causa de la escisión del gen. Se escogerá
preferiblemente un gen marcador fenotípico del tipo GFP, antocianina
o cualquier otro gen marcador con expresión colorimétrica. Se puede
igualmente utilizar el gen nptII que inhibe la síntesis de
cloroplastos.
La invención utiliza un vector que comprende dos
casetes de expresión como es descrito anteriormente.
Una célula hospedera, por ejemplo una célula de
planta, o un clon de tal célula, transformada por un vector como el
descrito anteriormente, puede ser obtenida.
La presente invención puede igualmente aplicarse
a otras plantas, en particular monocotiledóneas, que posean:
- un sistema transposón como el descrito
anteriormente, y
- un sistema marcador fenotípico; por ejemplo de
tipo antocianina, reencontrado en las Poáceas (maíz, sorgo, trigo,
avena, arroz),
que son los dos componentes esenciales del
proceso según la invención.
Entre las monocotiledóneas que pueden igualmente
ser obtenidas según el mismo protocolo, pueden citarse por ejemplo:
Sorghum bicolor (sorgo), Hordeum vulgare (cebada),
Triticum eastivum (trigo), Oriza sativa (arroz),
Pennisetum glaucum (mijo).
Figura nº 1: esquema de los dos componentes del
sistema: el Ds::M a eliminar y la fuente de transposasa.
Figura nº 2: mapas de restricción de los
plásmidos pBios34o-nptII (figura 2A y
pBios342-bar (figura 2B), derivados del plásmido
pSB12.
Figura nº 3: esquema de las dos vías posibles
para obtener plantas transgénicas sin gen marcador de selección.
Figura nº 4: observación de la escisión
germinal
Figura nº 5: mapa de restricción del plásmido
pBios491 comprendiendo el gen GFP y el gen NptII en un elemento
Ds.
Figura nº 6: mapa de restricción del plásmido
pBios 424 comprendiendo el promotor
A9-barnasa-terminador 3' CaMV y el
gen de resistencia a la kanamicina NptII en un elemento disociador
Ds.
Ejemplo
1
El elemento Ac cuya secuencia sirvió para hacer
los construidos Ds::M es el Ac insertado en el locus p (Lechelt
y otros, 1989) idéntico al Ac9 del gen ceroso (Fedoroff y
otros, 1983).
Los pies del Ds::M fueron seguidamente
construidos por supresiones internas del Ac. Sus tamaños son: -337
pb para extremidad 3'Ac
- 404 pb para la extremidad 5'Ac
El ejemplo propuesto en esta invención trata de
dos vectores que presentan un poliligando en un construido de ADN,
permitiendo así llevar un gen de interés por clonación.
Las transformaciones de las plantas fueron
realizadas con dos vectores pBios340 y pBios342, descritos más
adelante, salidos del mismo vector de partida pSB12 (Japan Tobacco,
EP 672 752), conteniendo los dos bordes LB y RB.
En el interior del elemento Ds, un gen marcador
de selección (MS) fue introducido bajo control del promotor del gen
actina 1 del arroz, seguido por el primer intrón actina del arroz
(Mc Elroy y otros, 1991).
El plásmido pBios340 contiene un
ADN-T constituido por bordes de pSB12, de la
extremidad 5' del elemento Ac, el promotor y el primer intrón del
gen Actina 1 del arroz, el marco de lectura abierto npt II (Bevan
y otros, 1983), el terminador Nos (del gen que codifica la
nopalina sintasa aislada en Agrobacterium tumefaciens) y la
extremidad 3' del elemento Ac.
El Ds::npt II tiene un tamaño de 3428 pb (figura
nº 2).
El plásmido pBios342 tiene la misma organización
que pBios340 y posee el marco de lectura abierto bar (White y
otros, 1990), en lugar del marco de lectura abierto npt II
(figura nº 2).
El Ds::bar tiene un tamaño de 3173 pb.
Para simplificar, el casete de expresión
promotor -intrón actina - marco de lectura npt II o bar - terminador
Nos será considerado como un gen funcional npt II o bar.
Las descendencias, que pueden ser utilizadas,
preferiblemente no deben incluir ninguna transposasa activa para
que el ADN-T sea estable en la planta transformada,
y tener una buena aptitud para la transformación por
Agrobacterium tumefaciens.
Se utiliza así la descendencia A188, que es una
descendencia de la especie Zea mays subsp mays.
A fin de evaluar la actividad de las
transposasas endógenas, es analizado el estado de metilación de los
elementos Ac.
El ADN de cada planta fue asimilado por las
endonucleasas BgIII y PvuII separadamente, luego por una mezcla de
estas dos enzimas.
PvuII es una enzima sensible a la metilación.
Una vez que el residuo Citosina de su sitio específico de corte es
metilado
(5'-C-A-G-^{m}C-T-G-3''),
la enzima ya no puede cortar la secuencia. Esta enzima permite
revelar un estado de metilación de la secuencia. Ella posee
solamente dos sitios de cortes en la secuencia del elemento Ac que
pertenecen ambos a dos regiones ricas en dinucleótidos CpG. Estos
islotes son sensibles a la metilación en las plantas. El fragmento
PvuII-PvuII de Ac hace 2524 pb.
BgIII es una endonucleasa que no posee ningún
sitio en el interior del elemento Ac, pero suficientemente frecuente
en el genoma del maíz.
Los productos de asimilación de ADN genómico
fueron separados por electroforesis en gel de agarosa y transferidos
en membranas nailon.
Una sonda SAc de 1605 pb fue obtenida por
asimilación del elemento Ac por la endonucleosa HindIII. Este
fragmento HindIII-HindIII corresponde a una parte
interna del elemento Ac y por consiguiente no puede hibridarse en
los elementos Ds demasiado suprimidos en relación con Ac y al no
poseer ya esta parte de Ac. La hibridación está por consiguiente
limitada a los elementos transponibles y/o a las secuencias
presentando una buena homología con el elemento Ac. Esta sonda
proviene de un plásmido que contiene el elemento autónomo Ac9
inicialmente insertado en el locus p del maíz. Los fragmentos de
1605 pb fueron extraídos del gel de agarosa después de la
asimilación y migración. Luego ellos fueron purificados antes de ser
hibridados en las membranas nailon.
Solo bandas de tamaños superiores a 8 kb están
presentes en lo alto de cada pista para las muestras de ADN de A188
y de una descendencia elite asimilada por PvuII y BgIII/PvuII;
ninguna banda de tamaño próxima a los 2.5 kb es visible. Este
perfil de asimilación muestra que el ADN genómico fue parcialmente
asimilado por PvuII. La ausencia de esta banda de 2524 pb en las
plantas A188 puede ser debida a un estado de metilación de las
transposasas Ac que por consiguiente serían inactivas o bien con
ausencia de copia completa de un elemento Ac en estos fondos
genéticos.
Además la descendencia A188 contiene todos los
genes constitutivos necesarios (A1, A2, Bz1, Bz2, C2) y los alelos
recesivos de los genes reguladores de la vía de síntesis de las
antocianinas (r-r,C1,pl). Por consiguiente, ella no
expresa ningún pigmento de tipo antocianina, excepto en las anteras
de la funda de las hojas que puede en ocasiones ser roja. Por
consiguiente, ésta es una descendencia receptora interesante para la
expresión del marcador antocianina después del cruzamiento.
La técnica de transformación utilizada es la
descrita por Ishida y otros, 1996. Agrobacterium tumefaciens
fue utilizado, en particular a partir de embriones inmaduros 10 días
después de la fecundación. Todos los medios utilizados son
descritos en la referencia citada. La transformación comienza con
una fase de co-cultivo en la que los embriones
inmaduros de las plantas de maíz son puestos en contacto durante al
menos 5 días con una cepa de Agrobacterium tumefaciens, como
LBA 4404 (Ooms y otros, 1981) u otra EHA 101 (Hood y
otros, 1986), EHA105 (Hood y otros, 1993), AGL1 (Lazo
y otros, 1991) conteniendo los vectores superbinarios. El
plásmido superbinario es el resultado de una recombinación homóloga
entre un vector intermediario portador del ADN-T
conteniendo el gen de interés y/o el marcador de selección derivado
de los plásmidos descritos en los ejemplos precedentes, y el vector
pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) que contiene: los genes virB y
virG del plásmido pTiBo542 presente en la cepa supervirulenta A281
de Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) y una región
homóloga reencontrada en el vector intermediario permitiendo esta
recombinación homóloga. Luego los embriones son situados en un
medio LSAs durante 3 días en la oscuridad y a 25ºC. Una primera
selección es efectuada en los callos transformados: los callos
embriogenes son transferidos a medio LSD5 conteniendo fosfinotricina
a 5 mg/l y cefotaxima a 250 mg/l (eliminación o limitación de la
contaminación por Agrobacterium Tumefaciens). Esta etapa es
desarrollada dos semanas en la oscuridad y a 25ºC. La segunda etapa
de selección realizada por transferencia de los embriones que se
desarrollaron en medio LSD5, en medio LSD10 (fosfinotricina a 10
mg/l) en presencia de cefotaxima, durante 3 semanas en las mismas
condiciones precedentes. La tercera etapa de selección consiste en
extirpar los callos de tipo I (fragmentos de 1 a 2 mm) y en
transferirlos 3 semanas a la oscuridad y a 25ºC en un medio LSD 10
en presencia de cefotaxima.
La regeneración de las plántulas es efectuada
extirpando los callos de tipo I que proliferaron y transfiriéndolos
a un medio LSZ en presencia de fosfinotricina a 5 mg/l y de
cefotaxima durante dos semanas a 22ºC y con luz continua.
Las plántulas que hayan regenerado son
transferidas a un medio RM + G2 conteniendo 100 mg/l de cefotaxima
durante 2 semanas a 22ºC y con iluminación continua para la etapa
de desarrollo. Las plantas obtenidas son entonces transferidas al
fitotrón con vistas a su aclimatación en invernadero.
Numerosos medios selectivos, el medio de
iniciación de callos, de maduración, y de regeneración permiten
eliminar eficazmente los eventos no transformados sensibles al
agente selectivo. Solo los callos transformados son regenerados y
pueden dar plántulas. A fin de eliminar las plántulas resultantes de
un escape eventual y que se desarrollaron en la cercanía de plantas
resistentes (el gen bar produce una proteína que permite a la planta
desintoxicarse del glufosinato), una cubierta es aplicada sobre una
parte de una hoja de la planta (Leaf painting assay) en el estadio
seis hojas con una solución conteniendo glufosinato (Basta 0.5%
(v/v)). Una semana más tarde, la hoja sensible presenta una
desecación característica.
La selección de los eventos de transformación
fue realizada en medios con diferentes concentraciones de kanamicina
o geneticina.
Igualmente fue realizada una prueba de
localización de las plantas transformadas en invernadero. Algunas
gotas de una solución de kanamicina (500 mg/l) y de Tween 20 (0.1%
(p/v)) son depositadas en el cono que forman las hojas de las
plantas jóvenes (estadio tres hojas, aproximadamente de dos a tres
semanas). Las hojas de las plantas sensibles presentan al crecer
sectores blanqueados en el lugar donde estuvieron en contacto con
la solución. Esta prueba no es destructiva y permite recuperar las
plantas sensibles.
Las plantas regeneradas son analizadas por PCR y
por Southern blot a fin de eliminar los escapes e identificar los
eventos de transformación monocopias que serán utilizados en esta
invención de forma preferente. Estas plantas habiendo integrado el
ADN-T en su genoma son las transformantes primarias
T0. La técnica de análisis utilizada es derivada de la descrita por
Southern (1976).
Fueron realizados PCR sobre el ADN extraído de
estas plantas, a fin de verificar que las plantas resistentes a los
agentes selectivos integraron bien en su genoma el
ADN-T y que no hubo transposición del Ds::M.
La pareja de oligonucleótidos
EM13-EM14 (SEQ ID nº 1-SEQ ID nº 2)
amplifica un fragmento cuyO tamaño es 280 pb cuando el Ds::M se
extirpó del ADN-T y ningún fragmento si el Ds::M
está aún insertado en su sitio inicial en el
ADN-T.
La pareja de oligonucleótidos
Actint1-Actint2 (SEQ ID nº 3-SEQ ID
nº 4) amplifica un fragmento del intrón actina presente en el
Ds::Ms cuyo tamaño es 480 pb.
\newpage
Los eventos de transformación seleccionados en
medio selectivo, positivos a la PCR con la pareja
Actint1-Actint2 y negativos a la PCR con la pareja
EM13-EM14 por consiguiente integraron en su genoma
al menos una parte del ADN-T conteniendo el
elemento Ds::M que permaneció en su sitio de inserción inicial.
Análisis moleculares fueron efectuados en el ADN
extraído de hojas de las plantas seleccionadas a fin de determinar
los eventos de transformación monocopias.
El ADN de las plantas positivas Ds::bar fue
asimilado por endonucleasa EcoRV que no incide más que una sola vez
en el ADN-T entre el marco de lectura abierta bar y
el intrón Actina.
El ADN de las plantas positivas fue asimilado
por endonucleasa Ncol que no incide más que una vez en el ADN de
transferencia dentro del marco de lectura abierta npt II.
Después de la electroforesis, fueron efectuadas
transferencias y las membranas resultantes fueron hibridadas
sucesivamente con las siguientes sondas.
Para las plantas Ds::bar, sondas Bar (gen Bar
asimilado por Smal, llamado S006), intrón Actina (llamado S063) y
5'Nos (llamado S064).
Para las plantas Ds::nptII, sondas npt II
(llamadas S020), intrón Actina (llamada S063) y 5'Nos (llamada
S064).
Las sondas intrón Actina, 5'Nos y npt II son
definidas por PCR a partir de oligonucleótidos escogidos según los
métodos conocidos por el especialista. (Ver tabla anexa).
Las sondas Bar, npt II e intrón Actina permiten
estimar el número de copias de ADN de transferencia insertado en el
genoma. La sonda 5'Nos permite poner en evidencia una escisión
potencial del elemento Ds del ADN-T. Estas tres
sondas permiten por consiguiente determinar las plantas poseyendo
una sola copia del ADN de transferencia completa.
Para Ds::bar, cuando la inserción del
ADN-T es única, un fragmento es revelado para cada
una de las tres sondas. Además si el Ds no es extirpado, el tamaño
de los fragmentos de ADN revelados por las dos sondas Bar y 5'Nos
es el mismo.
Para Ds::nptII, cuando la inserción del
ADN-T es única, un fragmento es revelado para las
sondas 5'Nos e Intrón Actina, y dos fragmentos son revelados por la
sonda nptII. Además si el Ds no es extirpado, uno de esos dos
fragmentos es igualmente revelado por la sonda 5'Nos y el otro por
la sonda Intrón Actina.
Según la invención, las plantas escogidas para
los cruzamientos con la fuente de transposasa son preferiblemente
las plantas salidas de los eventos de transformaciones
monocopias.
Ejemplo
2
La descendencia W22/R-nj::Ac
contiene los genes constitutivos C2, A1, A2 y los genes reguladores
C1, pl, B-b. Por consiguiente, esta descendencia
porta todos los factores requeridos para la pigmentación violeta en
la aleurona (identificada como normal). Esta descendencia posee
además el alelo inestable R-nj::Ac creado por
translocación del cromosoma por Dellaporta y otros en 1988.
Esta descendencia homocigota por el alelo
R-nj::Ac y utilizada aquí es resultado de semillas
provenientes del Stock Center (http://www.agron.missouri.edu/) y es
llamada As. Las semillas presentan sectores coloreados más o menos
grandes correspondientes a las células en las cuales el Ac es
extirpado del alelo R-nj.
Análisis moleculares fueron realizados en el ADN
extraído de hojas de plantas As homocigotas para el alelo
R-nj::Ac, a fin de evaluar la actividad del elemento
Ac insertado en el gen R-nj. Este estudio del estado
de metilación de los Ac presentes en las descendencias As fue
realizado tanto para las descendencias A188 como para las
descendencias elites que sirven a la transformación y a la
introgresión de los genes de interés. Numerosas bandas de tamaños
superiores a 8 kb están presentes en lo alto de cada pista de todas
las muestras. Ellas corresponden a ADN no asimilado o parcialmente
asimilado. Sin embargo, la presencia de una banda de 2.5 kb salida
de la asimilación por Pvull, una enzima sensible a la metilación,
indica que al menos una copia del elemento Ac no es metilado en el
genoma de esa descendencia As.
\newpage
El elemento R-nj::Ac puede ser
ventajosamente introgresado en descendencias conocidas por ser
favorables a la regeneración de callos, como la descendencia A188
(Walbot y otros, 1994) o la descendencia HiII. El elemento
R-nj::Ac puede ser igualmente introgresado en
descendencias elites, utilizadas para la introgresión de los genes
de interés.
Para verificar la actividad del elemento Ac
durante generaciones, un análisis fenotípico fue efectuado en las
semillas de las espigas salidas de estos cruzamientos. Las espigas
obtenidas por estos cruzamientos presentan semillas variegadas.
Los resultados de los cruzamientos entre la
descendencia As y las descendencias elites, o A188 y M1 muestran
que el gen R-nj puede expresarse en otros fondos
genéticos, ya sea por la presencia de genes constitutivos
necesarios para la expresión del fenotipo en esas descendencias
(como es el caso para A188), ya sea porque ellos son aportados a la
célula por la descendencia As.
La variegación observada en las semillas sugiere
que el Ac está siempre activo en esta generación puesto que él
transpone fuera del alelo R-nj en ciertas partes
semillas salidas de estos cruzamientos.
Múltiples introgresiones realizadas en las
descendencias A188 y HiII y en una descendencia elite (hasta 3
cruzamientos en la descendencia, lo que corresponde a
aproximadamente 93% de A188 y 7% de W22) permitieron confirmar
estos resultados. Por consiguiente, descendencias homocigotas para
el alelo R-nj::Ac fueron realizadas por
autofecundaciones.
La fecundación es realizada manualmente por una
técnica conocida por el especialista en el arte mediante el
depósito del polen de la fuente de transposasa As sobre las sedas de
los transformantes, de preferencia en el sentido planta masculina
que posee la transposasa en la planta femenina conteniendo el
elemento Ds::M.
Una parte de la espiga es en ocasiones retirada
a fin de extraer embriones inmaduros destinados a protocolos de
biología celular como la recuperación de embriones o la
callogénesis. La sección cortada es preferiblemente recubierta con
un fungicida a fin de evitar las podredumbres y las bacterias.
Los embriones extraídos de 10 a 15 días después
de la fecundación son colocados, la parte abombada hacia arriba en
25 ml del medio de regeneración RM + (Ishida y otros, 1996),
(Negrotto y otros, 2000). Las cajas son luego ubicadas en un
cuarto de cultivo con un fotoperíodo regulado (16 h de día - 8 h de
noche) y a temperatura constante (23ºC). Las plántulas son luego
aclimatadas al fitotrón al cabo de 10-15 días
después de la puesta en cultivo y antes de ser transferidas a
invernadero.
Ejemplo
3
Los estudios moleculares, descritos en el
ejemplo 1.3, permitieron la identificación de un evento de
transformación monocopia Ds::nptII y de un evento monocopia Ds::bar
utilizados preferiblemente para evaluar una potencial escisión.
Igualmente estos estudios mostraron que el elemento Ds::M es estable
en la descendencia A188 (estudio efectuado en transformantes
primarios T0 y primeros descendientes T1 por PCR y Southern).
Los estudios fenotípicos y moleculares de la
descendencia As, descritos en el ejemplo 2) permitieron mostrar que
existía en su genoma (al menos) una copia del elemento Ac activo que
puede ser extirpada del alelo R-nj en el fondo
genético inicial de la descendencia W22 o en el fondo de otra
descendencia.
El análisis fenotípico de la variegación del
alelo R-nj en las espigas F1 salidas de los
cruzamientos As X Ds::M confirmó que el elemento Ac estaba siempre
activo en esta generación: la presencia de sectores de antocianinas
en todos los granos maduros muestra que hubo producción de
transposasa y escisión somática de la Ac fuera de su sitio de
inserción inicial. El aporte por cruzamiento de un nuevo elemento Ds
en la célula no cambió en nada la capacidad de seguir la actividad
de la fuente de transposasa.
Es considerado que el elemento Ds no está
genéticamente vinculado al alelo R-nj::Ac.
Por consiguiente, queda por determinar si la
transposasa expresada por el elemento Ac insertado en el alelo
R-nj puede permitir la escisión de los elementos
Ds::bar y Ds::nptII.
Cruzamientos fueron emprendidos después del
establecimiento de las descendencias monocopias a fin de verificar
si los elementos Ds::bar y Ds::nptII pueden ser transpuesto en la
planta.
Las plantas fuentes de transposasa sirvieron de
polinizadoras (a razón de una semi-esterilidad
femenina de estas plantas).
Una parte de la descendencia F1 salida de los
cruzamientos entre las plantas DS::MS y las plantas As fue sembrada
y fue aislado ADN de hojas jóvenes de cada planta F1 así generada.
Siendo uno de los padres hemicigoto por el ADN-T,
siendo el otro homocigoto por el alelo R-nj::Ac, es
esperado que los dos componentes Ac y Ds sean transmitidos al 50%
de las plantas F1 salidas de estos cruzamientos.
A fin de identificar las plantas F1 que posean
el ADN-T y detectar eventuales escisiones somáticas,
fueron realizadas pruebas de resistencia al marcador selectivo en
las plantas jóvenes en paralelo con pruebas de amplificación de
secuencia en el ADN de hojas:
Se deposita en el cono formado por las hojas de
la planta de 3 a 5 ml de una solución de sulfato de kanamicina 500
mg/l + 0.1% de tween. Las plantas sensibles desarrollan sectores
cloróticos en las partes de las hojas que estuvieron en contacto
con la solución.
Se realiza un "leaf painting" cubriendo una
hoja con una solución de glufosinato de amonio.
Una primera selección de la resistencia al
antibiótico o al herbicida por una aplicación no destructiva
permitió determinar qué plantas poseían el gen marcador de
selección.
Cuando un elemento Ds se extirpa después de la
producción de transposasa, queda un sitio donante vacío. Una
amplificación por PCR con los oligonucleótidos EM13 (SEQ ID nº 1) y
EM14 (SEQ ID nº 2) permite sintetizar un fragmento específico de
280 pb cuando el ADN-T es suprimido del elemento
Ds::bar o Ds::nptII. Por consiguiente una serie de amplificaciones
fueron realizadas con la pareja EM13-EM14 en el ADN
extraído de las plantas salidas del cruzamiento Ds::nptII X Ac a
fin de detectar una eventual escisión somática en ciertas células de
las muestras de hojas extraídas.
El análisis por PCR de estas plantas F1 mostró
que había presencia de escisión somática para todas las plantas F1
que hayan heredado del ADN-T y del alelo
R-nj:Ac. Ninguna amplificación fue detectada en las
plantas que no poseyendo más que el ADN-T, ni en
las plantas con ninguno de los dos componentes.
Además, todas las plantas, para las cuales una
escisión somática fue detectada, se revelaron globalmente
resistentes al antibiótico.
Esta banda indica por consiguiente la presencia
de una escisión somática en algunas células de los individuos
portadores del ADN-T y del alelo
R-nj::Ac. Conforme a lo que estaba previsto, ningún
evento de escisión germinal del elemento Ds::M es producido por
estas plantas, siendo reagrupados los dos componentes en la misma
célula muy poco después de generaciones celulares (de la
fecundación a la planta joven).
Habría sido necesario que la transposición
hubiera tenido lugar en los gametos, o en las células madres de los
gametos, para poder esperar la observación de una escisión germinal.
Esto aumenta la posibilidad de escisión al nivel de los gametos
débiles, por consiguiente habría sido asombroso obtener una escisión
germinal desde la generación F1.
Sin embargo en la estrategia considerada
constituye la frecuencia de escisión germinal preferencial para la
eliminación del gen marcador:
- una escisión somática no toca usualmente los
gametos y conduce a la formación de semillas y de individuos
quiméricos de los cuales la mayor parte de las células poseen aún el
marcador de escisión.
- una escisión germinal toca las células, que
van a diferenciarse en la vía de la gametogénesis, y conduce a la
formación de semillas y de individuos constituidos por células en
las que el Ds fue extirpado (y puede ser reinsertado) y que no
poseen ya el gen marcador de selección.
Es por esto que la búsqueda de una escisión
germinal se efectuó en la generación F2. Las bandas de amplificación
específica de la escisión fueron dosificadas para cada planta F1,
permitiendo esta dosificación reflejar, a través de la tasa de
escisión somática, la actividad de la fuente de transposasa.
Las plantas F1 presentando la mayor escisión
somática fueron cruzadas con plantas de la descendencia A188 o con
plantas de una descendencia elite. Estos cruzamientos fueron
realizados en los dos sentidos, las plantas poseyendo los dos
componentes Ac/Ds::M habiendo servido de femeninas y/o masculinas
para aumentar las posibilidades de escisión germinal por planta F1.
Las semillas así formadas fueron llevadas a maduración. Fueron
sembrados lotes de semillas F2 provenientes de plantas F1 Ds::nptII
X Ac resistentes a la kanamicina y de plantas F1 Ds::bar X Ac
resistentes al glufosinato y salidas de diversos cruzamientos.
Ningún examen fenotípico portando la variegación fue aquí
realizado. Las semillas expresando el fenotipo o las semillas no
pigmentadas fueron escogidas para la siembra con la misma
probabilidad, para evitar cualquier sesgo.
Una manera simple de probar la frecuencia de
escisión germinal en este sistema consiste en seleccionar las
plantas F2 por su sensibilidad al agente selectivo y en probarlas
por análisis moleculares. Plantas F2 Ds::bar y plantas F2 Ds::nptII
fueron así probadas para la amplificación por PCR de la banda
específica de escisión de 280 pb.
Una planta F2 es sensible al agente selectivo ya
sea por la vía de la segregación, y en consecuencia la banda de 280
pb no debe ser amplificada, ya sea por escisión germinal del gen
marcador, y en este caso, la banda específica de escisión es
detectable por PCR. Este estudio permitió amplificar la banda
específica de escisión a partir del ADN de plantas F2 salidas de
los cruzamientos:
- Ds::bar/Ac X A188,
- Ds::bar/Ac X descendencia elite
- descendencia elite X Ds::nptII/Ac
- Ds::nptII/Ac X descendencia elite
Hibridaciones Southern así como análisis PCR
fueron efectuados en estas plantas seleccionadas así como en las
plantas iniciales T1 Ds::bar y T0 Ds::nptII y los resultados
obtenidos son los siguientes.
Los análisis por PCR y Southern muestran que las
plantas F2 seleccionadas heredaron una parte del
ADN-T conteniendo el borde izquierdo, las
secuencias de interés, la cicatriz dejada por la escisión del Ds y
el borde derecho, el elemento Ds::M no fue genéticamente
transmitido a las plantas F2 como lo fuera para la F1. Estas plantas
F2 son por consiguiente plantas salidas de eventos de escisión
germinal del elemento Ds::M fuera del ADN-T.
Las frecuencias globales de escisión germinal
son variables de una descendencia F2 a la otra y son bastante
débiles. En lo concerniente al construido Ds::bar, en las plantas
habiendo heredado el ADN-T, solo algunas plantas no
poseen ya el elemento Ds::bar, lo que ofrece una frecuencia de
escisión germinal del 0.4%. La frecuencia de escisión germinal del
elemento Ds::nptII es un poco más elevada y alcanza un 0.7%.
Esta frecuencia de escisión germinal es
relativamente baja. El fenómeno de transición floral es más escaso
en el maíz que en el tomate o el arabette: en el maíz, solo hay dos
o tres meristemos por individuos que se diferencian por los órganos
sexuales y forman los gametos: uno para la panícula (órgano
masculino) y uno o dos para las espigas (órganos femeninos). Por
tanto es necesario que la escisión germinal toque, ya sea uno de
esos meristemos antes de la gametogénesis, ya sea un gameto.
Una vez que la planta F2 portando el
ADN-T sin el gen marcador de selección fue
caracterizada, se puede proceder a la segregación de la transposasa
insertada en R-nj y del ADN-T. Esta
segregación puede tener lugar durante la introgresión del
ADN-T en la descendencia elite. Basta con
seleccionar las plantas que portan el ADN-T, pero
que no expresan pigmento antocianina de tipo navajo. Esta
segregación puede igualmente ser seguida por análisis moleculares
de tipo Southern gracias a las sondas Sac y S064.
A fin de aumentar la frecuencia de escisión
germinal, una etapa de callogénesis fue realizada en embriones F1
inmaduros que poseen los dos componentes, es decir el elemento
Ds::nptII insertado en el ADN-T y la fuente de
transposasa Ac insertada en el alelo R-nj. La
descendencia escogida como fuente de transposasa es aquí una fuente
homocigota salida de la primera introgresiónn de
W22/R-nj::Ac en A188. El callo posee en consecuencia
aproximadamente el 75% del genoma de A188 y el 25% del genoma de
W22. A188 es una descendencia que permite obtener el callo de tipo
II.
Durante el crecimiento del callo y a partir de
una célula habiendo sufrido un evento de escisión somática, es
posible generar un sector de callo embriogén constituido por una
aglomeración de células somaclonales no poseyendo ya el gen
marcador de selección. Una identificación fenotípica o molecular de
este sector permitiría regenerar un individuo sin gen marcador a
partir de estas células con una frecuencia más significativa que
por la vía clásica.
\newpage
Embriones F1 salidos de los cruzamientos entre
las plantas transgénicas Ds::M y las fuentes de transposasa
homocigotas para el alelo R-nj::Ac fueron extraídos
de 10 a 12 días después de la fecundación, colocados estérilmente
en un medio N6 y puestos en cultivo en un cuarto oscuro a fin de
iniciar la formación de callos indiferenciados de tipo II según el
método de Armstrong y otros, 1985.
Después de haber eliminado los ejes germinativos
luego de 15 días de iniciación, los callos son mantenidos en la
oscuridad a 25ºC durante todo el tiempo que dure la inducción de
callos y la primera parte de la multiplicación. Los callos
comienzan a hacerse visibles 1 semana después de la iniciación. En
cada sub-cultivo, es decir cada dos o tres semanas,
las partes blancas, embriogenes y pulverizables son seleccionadas y
separadas de las partes más compactas o mucosas.
Al cabo de 2 a 3 semanas de iniciación, los
callos formados son duplicados en dos partes:
- una mitad es colocada en un medio N6 no
selectivo, para continuar la multiplicación de callos.
- la otra mitad es colocada en un medio N6
conteniendo kanamicina 50 mg/l, para identificar los callos
resistentes portadores del ADN-T. La selección de
callos con la kanamicina necesita de una etapa a la luz, en cuarto
de cultivo. En efecto, el antibiótico inhibe la síntesis de los
péptidos en las mitocondrias y los cloroplastos. La inhibición está
basada en la similitud entre la síntesis proteica de estos elementos
celulares y la síntesis proteica bacteriana. Las células vegetales
son por consiguiente usualmente intolerantes a los aminoglucósidos
como la kanacima o la gentamicina. Pero para una dosis relativamente
débil, la kanamicina no es destructiva y permite una selección por
fenotipo colorimétrico: los callos resistentes poseyendo el gen
nptII reverdecen cuando son expuestos a la luz (los cloroplastos
funcionales acumulan la clorofila), mientras que los callos
sensibles permanecen amarillos.
Esta etapa de selección permite identificar los
callos que posean el ADN-T y el elemento Ds::nptII y
eliminar los callos que no poseen en su genoma más que el
componente R-nj::Ac (en el caso de una fuente de
transposasa homocigota).
Las partes de los callos resistentes que fueron
duplicadas y colocadas en medio no selectivo son cultivadas en la
oscuridad. Por consiguiente hay multiplicación de las células que
poseen los dos componentes. Durante esta multiplicación, va a haber
producción de transposasa y un cierto número de células van a ser
resultantes de eventos de escisión del elemento Ds::nptII fuera del
ADN-T. Estas células al multiplicarse van a conducir
a la formación de callos quiméricos constituidos por sectores de
escisión somática del Ds::nptII y de sectores sin escisión.
Los callos son luego puestos a la luz, durante
una semana. Las partes amarillas son fuertemente aisladas.
Los extremos de callos aislados son colocados
para regenerar en un medio no selectivo en cuarto de cultivo y a la
luz. Algunas plantas son así regeneradas a partir de las diferentes
partes embriogenes y potencialmente a partir de un sector de
escisión del elemento Ds::nptII.
Las plantas, cuando hayan alcanzado el estadio
tres hojas son tratadas con una solución de sulfato de kanamicina.
Las plantas presentando sectores cloróticos son por tanto plantas
sensibles al agente selectivo que son salidas de un callo
inicialmente resistente. Entre las plantas examinadas, algunas
plantas originarias del mismo embrión resultaron ser sensibles a la
kanamicina.
Los análisis PCR y Southern en efecto mostraron
que el elemento Ds::nptII había sido extirpado de su ubicación
inicial y no se había reinsertado. La frecuencia de escisión es por
consiguiente considerablemente aumentada por la vía del cultivo de
callos y alcanza un 8% de las plantas así regeneradas.
Un secuenciamiento de las cicatrices dejadas en
el ADN-T por la escisión del elemento DS::nptII fue
efectuado para las plantas generadas por la vía reproductora y por
la vía vegetativa. El análisis de las secuencias obtenidas muestra
que algunas plantas de la vía reproductora son salidas de dos
eventos de escisión germinal diferentes aunque salidas del mismo
cruzamiento. Por el contrario, las secuencias de las cicatrices para
las plantas obtenidas por callogénesis son idénticas. Esto
confirmaría que estas plantas son salidas del mismo evento de
escisión.
Según un modo de realización preferido de la
invención, el casete de expresión comprendiendo una secuencia
nucleotídica codificadora de un marcador de selección (ii) comprende
igualmente, en el interior del elemento Ds, otro gen marcador
fenotípico de tipo gen reportero no destructivo. Este gen reportero
puede ser por ejemplo el gen codificador de una proteína
fluorescente verde GFP (Nielsen y otros 1999), cuya detección de la
expresión en los tejidos no es destructiva: la observación es
realizada con una lupa equipada con un alumbrado de longitud de
onda específica. Cuando el elemento Ds se extirpa, el gen GFP no
está ya presente, y los sectores de escisión somática son
localizables con la "lupa GFP" porque ya no son
fluorescentes.
En el marco de este ejemplo, el plásmido
pBios491 es derivado del plásmido pBios340 (Ds::nptII) descrito en
el ejemplo 1a, por una inserción, en el interior del elemento Ds y
en el mismo marco de lectura que el casete NptII, de un casete de
expresión conteniendo el promotor CsVMV del virus del mosaico de las
nervaduras de mandioca (WO 97/48819), el primer intrón del gen
actina 1 del arroz, el marco de lectura abierto GFP (Nielsen y
otros 1999) y el terminador Nos.
El Ds::GFP-nptII tiene un tamaño
de 5473 pb (Figura nº 5).
Como es descrito en los ejemplos 3.1 y 3.2, la
selección de los eventos de escisión germinal puede seguir las
siguientes etapas:
- -
- los embriones T1 salidos del cruzamiento entre los transformantes portando el casete gen de interés - Ds::MS y la fuente de transposasa son recuperados 10 días después de la polinización.
- -
- estos embriones son extraídos y puestos en cultivo en un medio de callogénesis no selectivo en la oscuridad durante 15 a 30 días.
- -
- los callos son entonces observados con lupa GFP y la fracción no fluorescente del callo, correspondiente a los sectores de escisión somática, es entonces extraída para multiplicación y regeneración de la planta. Las plantas así producidas contienen el gen de interés sin secuencia auxiliar foránea.
El interés de este vector
Ds::GFP-MS en el marco de la invención es por
consiguiente múltiple, en efecto:
- -
- la identificación de los embriones inmaduros F1 portadores del transgén, que fluorescente, se logra por simple observación visual con la lupa GFP;
- -
- la callogénesis a partir de embriones seleccionados puede hacerse en un medio no selectivo a fin de inducir numerosas salidas de callos y así favorecer la salida de zonas de escisión somática desprovistas del gen de selección.
- -
- la selección de los callos salidos de células en las que hubo escisión somática es facilitada con la lupa de fluorescencia; además estos callos pueden ser directa y precisamente extraídos a fin de ser puestos en regeneración
- -
- una vez regeneradas las plantas, la ausencia de fluorescencia (escisión somática) puede también ser confirmada.
El plásmido pBios424 es derivado del plásmido
pBios340 descrito en el ejemplo 1a por inserción del casete "gen
de interés" comprendiendo el promotor A9 (WO 92 11379),
correspondiente a la región 5' no codificadora del gen A9 de
Arabidopsis thaliana, el marco de lectura abierto del gen
barnasa (Hartley, 1988; Gene Bank nº X 12871) y el terminador
3'CaMV (Franck y otros 1980; Gene Bank nº V 00141), fuera del
elemento Ds. El gen barnasa, que confiere la esterilidad masculina,
codifica una Ribonucleasa (RNase). Este gen fue aislado a partir de
Bacillus amyloliquefasciens y es descrito en la publicación
de Hartley (1988).
El
A9-barnasa-Ds::nptII tiene un tamaño
de 12495 pb (Figura 6).
El plásmido superbinario pRec424 utilizado para
la transformación es obtenido por recombinación homóloga entre un
vector intermediario derivado del plásmido pBios424 y el vector pSB1
de Japan Tobacco (EP 672 752), como es descrito en el ejemplo
1b.
7 eventos de transformación fueron producidos de
ellos 5 fueron seleccionados por ser masculinos estériles
(A9-barnasa) y resistentes a la kanamicina
(NptII).
El análisis molecular de estos eventos fue
realizado para determinar las inserciones simples. Este análisis
permite caracterizar los eventos de transformación retenidos en
término de número de copias del ADN-T integrado y
del número de loci de integración puestos en juego. Para esto,
diferentes sondas moleculares son utilizadas.
El ADN genómico de las plantas fue asimilado por
la enzima de restricción Ncol, separado por electroforesis en gel
de agarosa y transferido en membrana de nailon (membranas Hybond N+)
con vistas a la hibridación con las diferentes sondas
moleculares.
- \bullet
- La utilización de las sondas Promotor A9 (S007, SEQ ID NO:7), Barnasa (S032, SEQ ID NO:8), Intrón actina, unida a la restricción enzimática Ncol, permite caracterizar el perfil molecular de los eventos de transformación.
- \bullet
- Siendo conocida la secuencia del plásmido de base, parejas de oligonucleótidos específicos de las regiones plasmídicas situadas en el exterior del ADN-T fueron sintetizadas luego utilizadas como incentivos para generar por PCR una sonda extraborde derecho (RB) y una sonda extraborde izquierda (LB). Del lado derecho, en 40 pares de bases del borde derecho, la amplificación PCR generó una sonda de 353 pares de bases y del lado izquierdo, en 29 pares de bases del borde izquierdo, la amplificación generó una sonda de 299 pares de bases. La sonda llamada "sonda extrabordes" está constituida por una mezcla de las dos sondas descritas anteriormente. Su utilización permite señalar las plantas no presentando integración de regiones del plásmido próximas al ADN-T.
El tamaño de los signos esperados después de la
hibridación con las diferentes sondas para una inserción única del
ADN-T no truncada y cuando no sobrepasa el borde, es
la siguiente:
El balance de los signos observados en los
transformantes primarios muestra que los 5 eventos presentan
perfiles de inserción simples (1 ó 2 copias).
Los transformantes primarios presentando
perfiles de inserción simple fueron cruzados con la fuente de
transposasa homocigota para el alelo Rnj-Ac como es
descrito en el ejemplo 2.
Los embriones correspondientes a la generación
T1 (o F1) fueron retirados 15 días después de la fecundación, y
colocados en cultivo in vitro en medio de cultivo conteniendo
50 mg de Kanamicina.
Un análisis PCR con oligonucleótidos adecuados
puede permitir verificar si estos eventos de escisión somática
tuvieron lugar en las T1 seleccionadas.
Las muestras de ADN de las plantas T0 y T1
fueron sometidas a una amplificación PCR con la ayuda de los
oligonucleótidos Barn5 (SEQ ID NO:6) y EM111 (SEQ ID NO:5). Si el
Ds::nptII es extirpado del T-DNA, un
fragmento de 760 pb puede ser amplificado. Si no es extirpado el
fragmento de 4160 pb que debería ser amplificado, no aparece en
estas condiciones de PCR. La banda de amplificación de 760 pb
revelando la escisión del Ds::nptII está presente en la
mayor parte de las muestras de plantas T1 pero no en las T0. Ninguna
escisión somática fue puesta en evidencia en las T0, lo que
demuestra que la escisión está bien controlada.
El gel de electroforesis fue transferido en
membrana de nailon, para ser hibridado con una sonda 3'CaMV a fin
de confirmar la identidad del fragmento amplificado.
Las experiencias de PCR permitieron por
consiguiente confirmar bien la presencia de escisión somática en la
mayor parte de las plantas T1 portando los dos constituyentes:
Ds::nptII y transposasa.
Después de la salida de in vitro las
plantas T1 son aclimatadas al fitotrón luego en invernadero. En la
floración, las plantas T1 seleccionadas son cruzadas con una
descendencia elite, definida como siendo una descendencia
presentando un potencial agronómico y comercial significativo, en un
período dado. Según el método de la invención, eventos de escisión
germinal pueden ser encontrados cribando un gran número de F2
salidas de estas descendencias T1.
\newpage
Cebadores utilizados para
detectar elementos Ds::Bar y Ds::npt
II
Cebadores utilizados para
detectar los transformantes Ds::npt
II
Las sondas utilizadas para los Southern blots
son presentadas a continuación
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monocotiledónea conteniendo un gen de interés sin secuencia
auxiliar foránea
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PM 01015
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> FR 0107597
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<151>
2001-06-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacaatctg atcatgagcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttaataaca cattgcggac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaattcgcg ccggtaac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtgccgaa ttcgatatca agc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético EM11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgcggac gtttttaatg tactg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido sintético Barn6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtttcgctc atgtgttgag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 985
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 898
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus
amyloliquefaciens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Método de obtención de una planta
monocotiledónea transgénica conteniendo un gen de interés (i) sin
secuencia auxiliar foránea, comprendiendo las siguientes
etapas:
- a)
- transformación de al menos una célula de planta que no posee ninguna transposasa activa, con un vector comprendiendo dos casetes de expresión, uno comprendiendo una secuencia nucleotídica de interés (i), el otro comprendiendo una secuencia nucleotídica codificadora de un marcador de selección (ii) enmarcada por las secuencias movibles de un transposón, dicho casete de expresión comprendiendo una secuencia nucleotídica de interés (i) que está fuera del elemento transposón;
- b)
- selección de las plantas transformadas con el marcador de selección (ii);
- c)
- cruzamiento de una planta transformada con otra planta perteneciente a una descendencia conteniendo en su genoma un gen, codificador de una transposasa activa endógena, y que se encuentra en medio de un marcador fenotípico de escisión (iii), para obtener una F1 o cualquier otro individuo de generación ulterior;
- d)
- selección de las células o los individuos portadores del gen de interés sin secuencia auxiliar foránea, a partir de la generación F1;
- e)
- regeneración de las plantas a partir de las células o de los individuos seleccionados en (d).
2. Método según la reivindicación 1, en el cual
las secuencias auxiliares ajenas codifican para gen marcador de
selección (ii) confiriendo una resistencia a un antibiótico o a un
herbicida, como el gen nptII o el gen bar.
3. Método según la reivindicación 1, en el cual
las secuencias auxiliares ajenas codifican un gen marcador
fenotípico (ii).
4. Método según una de las reivindicaciones 1 a
3, en el cual las secuencias movibles de un transposón enmarcan,
además del casete de expresión que comprende una secuencia
nucleotídica codificadora de un marcador de selección (ii), un
segundo casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica
codificadora de un gen reportero de selección no destructivo.
5. Método según la reivindicación 4, en el cual
la secuencia nucleotídica codificadora de un gen reportero de
selección no destructiva codifica para una GFP.
6. Método según una de las reivindicaciones 1 a
5, en el cual la planta monocotiledónea transgénica es una planta
de maíz.
7. Método según una de las reivindicaciones 1 a
6, en el cual el sistema transposón es el sistema Ac/Ds.
8. Método según una de las reivindicaciones 1 a
7, en el cual los individuos en la etapa (d) pueden ser plantas F1,
plantas F2 o callos.
9. Método según la reivindicación 6, en el cual
la planta transformada pertenece a la línea A188.
10. Método según una de las reivindicaciones 6 a
9, en el cual la planta transformada es cruzada en la etapa (c) con
otra planta, en el cual el elemento Ac activo está situado en una
región cromosómica tal que la escisión de dicho elemento Ac se
traduce en la producción de sectores antocianinados en la corona de
la semilla, o sea el embrión.
11. Método según una de las reivindicaciones 1 a
10, en el cual la selección de los individuos en la etapa (d) se
hace por vía reproductiva, comprendiendo las etapas siguientes:
- -
- selección de los granos F1 variegados;
- -
- selección de los eventos de escisión somática del elemento transposón defectivo de tipo Ds conteniendo el gen de selección (llamado Ds::M) por técnica PCR;
- -
- Selección de los eventos de escisión germinal del elemento Ds::M por técnica PCR;
- -
- obtención de semilleros de plantas F2 a partir de estos eventos.
12. Método según una de las reivindicaciones 1 a
10, en el cual la selección de los individuos en la etapa (d) se
hace por vía vegetativa, comprendiendo las siguientes etapas:
- -
- producción de callos a partir de embriones inmaduros F1
- -
- selección visual de los callos que contienen el ADN-T y el elemento transposón defectivo de tipo Ds conteniendo el gen de selección (llamado Ds::M)
- -
- Multiplicación de callos y búsqueda de sectores de escisión del elemento Ds::M
- -
- regeneración de plantas F1 a partir de estos sectores de escisión.
13. Método según la reivindicación 10 para la
obtención de plantas F1 directamente regeneradas a partir de callos
seleccionados, por la vía de cultivo in vitro de embriones
inmaduros de espiga F1.
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