DE60215938T2 - Verfahren zur herstellung einer monokotylen pflanze, welche ein gewünschtes gen ohne fremdsequenzen enthält - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer monokotylen pflanze, welche ein gewünschtes gen ohne fremdsequenzen enthält Download PDF

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DE60215938T2
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer monokotylen Pflanze, welche ein gewünschtes Gen ohne zusätzliche Fremdsequenz enthält.
  • Bei der pflanzlichen Gentechnik wird bzw. werden in einer Pflanze ein oder mehrere Gene aus unterschiedlichen Organismen (Bakterien, Viren, Insekten, Pflanzen) eingebracht, und zwar mit dem Ziel, ihr neue Merkmale zu verleihen und gewisse landwirtschaftliche Qualitäten oder Nahrungsqualitäten zu verbessern. Die enorme Mannigfaltigkeit der Gene, die an der Entwicklung der traditionellen Techniken der Gentransformation beteiligt ist, hat zur Erzeugung von neuen Pflanzensorten geführt. In gewissen Fällen hat die Einführung von Merkmalen, die eine Resistenz gegen ein Herbizid, gegen Pathogene oder gegen verschiedene Streßfaktoren bewirken, dazu geführt, daß die Kulturmaßnahmen erleichtert und die Erträge erhöht werden können. In anderen Fällen können der Nährwert der Pflanze und der Gehalt an gewissen essentiellen Verbindungen verbessert sein. Die Integration von Genen in ein Genom während eines Transformationsvorgangs erfolgt jedoch mit einer sehr niedrigen Häufigkeit. Aus diesem Grund verbindet man in den meisten Fällen die interessierenden Gene genetisch entweder mit einem Selektionsmarkergen, das zu einem Selektionsvorteil bei den transformierten Zellen führt, oder mit einem phänotypischen Marker, aufgrund dessen der Fachmann die transformierten Zellen unter den anderen Zellen identifizieren kann.
  • Die Selektionsmarkergene, wie die Gene für Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide, sind für die Auffindung der Transformationsereignisse von wesentlicher Bedeutung. Sie verbleiben jedoch in der Pflanze und können daher auch in Form von DNA oder von Proteinen in gewissen Verarbeitungsprodukten nachgewiesen werden, obwohl sie im allgemeinen keinen Mehrwert der erhaltenen transformierten Pflanze bedingen. Das Vorhandensein dieser Gene, insbesondere der Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, stellt derzeit das Hauptthema zahlreicher Debatten über genetisch modifizierte Organismen dar (Flavell et al., 1992; Chesson et al., 2000).
  • Es ist daher erforderlich, Systeme zu entwickeln, mit denen diese Selektionsgene eliminiert werden können, sobald die Transformanten mittels des Selektionsmittels und/oder durch molekulare Analysen isoliert worden sind. Es wurden mehrere mehr oder minder aufwendige Eliminationsverfahren untersucht, wie zum Beispiel:
    • – Die Cotransformation, die daraus besteht, daß man zwei T-DNAs (Transfer-DNAs) in den Organismus einbringt, wobei die erste das interessierende Gen trägt und die zweite das Selektionsgen. Dieses Verfahren wird eher für Arten mit einem kurzen Reproduktionszyklus verwendet. Anschließend werden in der Nachkommenschaft Transformanten selektiert, die das interessierende Transgen tragen, jedoch aufgrund von Aufspaltung das Selektionsgen verloren haben.
    • – Systeme, bei denen die Rekombination mit spezifischen Rekombinationsstellen genutzt wird, wie das cre/lox-System des Bakteriophagen P1 oder das FLP/FRT-System der Hefe (FliPase Rekombinase; Lyzrik et al., 1997), die für Arten mit einem langen Reproduktionszyklus verwendet werden (Mais, Sträucher). Diese Systeme sind jedoch nach wie vor aufwendig und umständlich.
    • – Eliminationssysteme, bei denen die Eigenschaften von mobilen Genen genutzt werden, die in zahlreichen Genomen vorkommen, wie Retroelemente und Transposons, insbesondere das Ac/Ds-System des Maises, und die bei zahlreichen Arten verwendet werden.
  • Die transponierbaren Elemente, darunter insbesondere
  • das Ac/Ds-System, können sich allgemein während der Zellentwicklung herausspleißen und in das Genom neu insertieren. Diese Elemente können auch keine Rezeptorstelle, in die sie sich insertieren können, finden und werden in solch einem Fall von Nukleasen abgebaut. Die Transposons, die in erster Linie für die Klonierung und Markierung von gewissen Genen mit sichtbaren Expressionsphänotypen verwendet werden (Dellaporta et al., 1988) können auch der Mobilisierung, dem Herausspleißen und der Elimination von Genen dienen (PCT/US91/04679).
  • Ein System, bei dem das Mais-Ac/Ds verwendet wird und mit dem Selektionsmarkergene bei der Tomate, einer Pflanzenart, die im natürlichen Zustand kein Ac/oder Ds-Element aufweist, eliminiert werden können, wurde von Yoder et al. (1993) beschrieben.
  • Dieses System, das sich bei heterologen Pflanzen des dikotylen Typs (Tomate, Arabidopsis, Tabak) bewährt hat, schien bis heute bei den Monokotyledonen, insbesondere beim Mais, einer Art, in der Ac/Ds auf natürliche Weise vorkommt, schwierig zu nutzen. Das Vorhandensein von endogenen Elementen macht nämlich die Beherrschung und Nutzung dieses Systems schwierig. Wenn also in WO 98/38323 vorgeschlagen wird, daß dieses System im Mais genutzt werden könnte, so wird die Durchführung nur für dikotyle Pflanzen beispielhaft belegt.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es den Erfindern nun gelungen, ein neues, neuartiges Verfahren zur Entfernung von Markergenen bei monokotylen Pflanzen, insbesondere beim Mais, zu entwickeln, bei dem ein endogenes Transposonsystem, wie zum Beispiel das Ac/Ds-System, verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen monokotylen Pflanze, welche ein gewünschtes Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
    • a) Transformation von mindestens einer Pflanzenzelle ohne aktive Transposase mit einem Vektor, der zwei Expressionskassetten enthält, wobei die eine eine gewünschte Nukleotidsequenz (i) enthält und die andere eine Nukleotidsequenz enthält, die für einen Selektionsmarker (ii) codiert und die von den mobilisierbaren Sequenzen eines Transposons eingerahmt ist, wobei die Expressionskassette, die eine gewünschte Nukleotidsequenz (i) enthält, außerhalb des Transposonelements liegt;
    • b) Selektion von transformierten Pflanzen mit dem Selektionsmarker (ii);
    • c) Kreuzen einer transformierten Pflanze mit einer anderen Pflanze, die zu einer Linie gehört, die in ihrem Genom ein Gen enthält, das für eine endogene aktive Transposase codiert und das innerhalb eines phänotypischen Exzisionsmarkers (iii) liegt, wodurch man zu einer F1 oder einem sonstigen Einzelorganismus einer Folgegeneration gelangt;
    • d) Selektion von Zellen oder Einzelorganismen, die das gewünschte Gen ohne zusätzliche Fremdsequenz enthalten, wobei von der F1-Generation ausgegangen wird;
    • e) Regeneration von Pflanzen aus den in (d) selektierten Zellen oder Einzelorganismen.
  • Unter "zusätzlichen Fremdsequenzen" versteht man Sequenzen (ii), die für einen Selektionsmarker codieren, bei dem es sich auch um einen phänotypischen Marker handeln kann, mit Hilfe dessen eine transformierte Pflanze von einer Pflanze, die keine transfizierte Fremd-DNA enthält, selektiert werden kann. Als Sequenz, die für einen Selektionsmarker codiert, oder als Selektionsmarkergen, ist insbesondere ein Gen zu nennen, das eine Resistenz gegen ein Antibiotikum (Herrera-Estrella et al., 1983) oder eine Resistenz gegen ein Herbizid ( EP 242 246 ) vermittelt oder
    • – das sul-Gen, das die Resistenz gegen das Sulfonamidherbizid Asulam vermittelt (WO 98/49316),
    • – das nptII-Gen, das die Resistenz gegen Kanamycin vermittelt (Bevan et al., 1983),
    • – das hph-Gen, das die Resistenz gegen Hygromycin vermittelt (Herrera-Estrella et al., 1983),
    • – das bar-Gen, das die Toleranz gegen Bialafos vermittelt (White et al., 1990),
    • – das EPSPS-Gen, das die Toleranz gegen Glyphosate vermittelt ( US 5,188,642 ),
    • – das HPPD-Gen, das die Toleranz gegen Isoxazole vermittelt (WO 96/38567),
    • – das Gen der Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT), die Chloramphenicol entgiftet.
  • Im Rahmen der Erfindung wird man vorzugsweise das bar-Gen oder das nptII-Gen verwenden.
  • Als Sequenz, die für einen phänotypischen Marker codiert, oder phänotypisches Markergen, die bzw. das sich als Selektionsmarker (ii) in dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet, sind die Reportergene zu nennen, die eine Selektion mittels eines phänotypischen, kolorimetrischen oder lumineszierenden und einfach nachzuweisenden Kriteriums ermöglichen, wie zum Beispiel
    • – das Gen, das für das Enzym β-Glucuronidase (GUS) codiert (Jefferson et al., 1987),
    • – das Gen, das für das grün fluoreszierende Protein GFP codiert, das eine Sichtbarmachung der transformierten Zellen unter UV ermöglicht (Chalfie et al., 1994) sowie alle anderen fluoreszierenden Proteine, die sich vom GFP ableiten,
    • – das nptII-Gen, das in niedriger Dosierung die Chloroplastensynthese hemmt, oder allgemeiner ausgedrückt jegliches Gen, das die Expression eines Pigments ermöglicht, wie zum Beispiel die Gene, die in die Synthese von Flavonoiden (Anthozyanen, Phlobaphenen und Derivaten) eingreifen und die als Reportergene bei der Transformation von Getreiden verwendet werden können. Das Reportersystem ermöglicht die Expression von Pigmenten in gewissen transformierten Geweben, die von rot bis violett reichen. Beispielsweise sind zu nennen Lc-Regulatorgene (Ludwig et al., 1990) B- und C1-Regulatorgene, die in die Anthozyansynthese eingreifen sowie das P-Gen, das in die Phlobaphensynthese eingreift (Grotewold et al., 1998).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann man in die Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für einen Selektionsmarker (ii) codiert, ein weiteres phenotypisches Markergen des Typs Rapportergen für die nichtdestruktive Selektion integrieren, um die Selektionsschritte durch nichtdestruktive einfache visuelle Beobachtung zu ermöglichen. Beispielhaft sind zu nennen das von Nielsen et al. (1999) beschriebene GFP sowie jegliche andere GFP-Variante, die in Pflanzen verwendet werden kann, zum Beispiel diejenigen, die von Seth J. Davis (1998) beschrieben wurden.
  • Für die obige Sequenz, die für einen Selektionsmarker (ii) codiert, wird man vorteilhaft einen Promoter verwenden, der für ein Gewebe oder ein Organ spezifisch ist, um zwischen der Expression dieses phänotypischen Markergens (ii) gegenüber der Expression des phänotypischen Exzisionsmarkers (iii) der in Schritt (c) verwendeten Pflanze zu differenzieren, um die transformierte Pflanze zu kreuzen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein System aus zwei Komponenten, die in 1 dargestellt sind:
    • – eine erste Pflanze, die keinerlei aktive Transposase aufweist, jedoch über ein endogenes Transposonsystem verfügt, und in die ein Konstrukt, das die Expressionskassette des interessierenden Gens (i) sowie diejenige des Selektionsmarkergens (ii) umfaßt, integriert werden kann.
    • – eine zweite Pflanze, die in ihrem Genom ein Gen enthält, das für eine endogene aktive Transposase codiert und das in einen phänotypischen Exzisionsmarker (iii) insertiert wird.
  • Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße transformierte monokotyle Pflanze keinerlei aktive Transposase, weist jedoch ein endogenes Transposonsystem auf. Vorzugsweise kann die transformierte monokotyle Pflanze eine Maispflanze sein und sie kann zu den folgenden Linien gehören:
    • – der Linie A188, die keinerlei aktive Transposase enthält
    • – einer M1-Linie ohne jegliche aktive Transposase, wobei diese Linie aus der Kreuzung der Linien A188 und B73 hervorgegangen ist und zur Bildung von stark regenerationsfähigen Typ-II-Kalli fähig ist
    • – oder allgemeiner ausgedrückt zu einer beliebigen anderen Linie, die keinerlei aktive Transposase enthält.
  • Bei den erfindungsgemäßen transposierbaren Elementen kann man zum Beispiel Transposonfamilien, die bei den monokotylen Pflanzen nachgewiesen wurden, verwenden, wie zum Beispiel
    • – das Element Dotted (Dt), das beim Mais nachgewiesen wurde,
    • – die Familie der Mutator-like (Mu) Elemente, die beim Mais und beim Reis nachgewiesen wurde,
    • – die Activator/Dissociation-like (Ac/Ds) Familie, die beim Mais (Müller-Neumann et al., 1984), bei der Gerste (Chernyshev et al., 1988) und bei der Hirse (MacRae et al., 1994) nachgewiesen wurde
    • – die CACTA-like Familie, die beim Mais (Pereira et al., 1986), bei Sorghum (Chopra et al., 1999), bei der Gerste (Chernyshev et al., 1988) und beim Reis (Mototashi R. et al., 1996) nachgewiesen wurde
    • – die copia-like Familie, die bei der Gerste nachgewiesen wurde (Mannimem et al., 1993).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Eliminationssystem für Markergene das Ac/Ds-System des Maises.
  • Die Elemente der Activator/Dissociation (Ac/Ds) Familie gehören zu den transponierbaren Elementen des Typs II und setzen sich daher in erster Linie aus zwei Domänen zusammen:
    • – einem Gen, das für das die Mobilität von Kopien erforderliche Protein, die Transposase, codiert
    • – zwei invertierte wiederholte terminate Enden mit der Bezeichnung ITR (Inverted Terminal Repeat). Die ITRs und gewisse flankierende Sequenzen scheinen als Bezugspunkte für die Kontrolle der Transposasewirkung zu dienen.
  • Das Ds-Element ist ein Ac-Element, bei dem in der für die Transposase codierenden Sequenz große Mutationen oder Deletionen stattgefunden haben. Es kann sich nur in Gegenwart eines aktiven Transposase-Startpunkts Ac aus seiner Insertionsstelle herausspleißen. Es ist daher Ac-abhängig.
  • Dementsprechend kann man als Ds-Element jegliches Element bezeichnen, das aus zwei ITRs besteht, die eine beliebige interne Sequenz umgeben, deren Größe kleiner als die Größe des autonomen Elements ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das im Schritt (a) verwendete DNA-Konstrukt eine Expressionskassette des interessierenden Gens (i) und eine Expressionskassette des Selektionsmarkergens (ii).
  • Das zu eliminierende Markergen (ii) ist zwischen zwei Borders integriert, die von den Enden eines Ac-Elements abstammen und die für die Transposition erforderlichen Sequenzen enthalten. Das ganze ist in die T-DNA insertiert, die somit ein defizientes Ds-artiges Transposonelement trägt, welches das Selektionsgen enthält. Dieses Element wird Ds::M genannt (M steht für Selektions-Marker oder phänotypischer Marker).
  • Das interessierende Gen wiederum liegt auf der T-DNA und außerhalb des transponierbaren Elements Ds::M.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die interessierenden Nukleotidsequenzen (i) beliebige Nukleinsäuresequenzen sein, die es ermöglichen, ein interessierendes Charaktermerkmal bei der erhaltenen transgenen Pflanze bereitzustellen oder zu verbessern. So kann zum Beispiel die Nukleinsäuresequenz für Proteine oder antisense-RNA-Transkripte codieren, die es ermöglichen können, die Nährwerte, den Ertrag, die Resistenz gegen Pathogene, gegen Krankheiten, gegen Trockenheit usw. zu verbessern. Solche Gene sind insbesondere in den Patentanmeldungen WO 91/02071 und WO 95/06128 beschrieben.
  • Die interessierenden Nukleinsäuresequenzen können auch als genetisches Werkzeug eingeführt werden, um Mutanten zu erzeugen und/oder die Identifikation, die molekulare Markierung oder die Isolation von Gensegmenten von Pflanzen zu unterstützen. Weitere Beispiele sind in Weising et al., 1995 beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die interessierende Nukleinsäure (i) in ein Nukleinsäurekonstrukt, das Expressionskassette des interessierenden Gens genannt wird, insertiert und wird operativ mit Elementen, die ihre Expression und schließlich und endlich ihre Regulation gestatten, verknüpft.
  • Unter diesen Elementen sind Promoter, Aktivatoren und Terminatoren der Transkription zu nennen.
  • Unter den Transkriptionspromotern, die verwendet werden können, sind insbesondere konstitutive Promoter, gewebe- oder organspezifische Promoter sowie entwicklungsspezifische Promoter zu nennen.
  • Allgemein ausgedrückt wird man vorzugsweise einen konstitutiven Promoter verwenden, wie den pAct 1 Promoter des Act 1 Gens des Reises, der in dem Plasmid pAct1-F4 (Mc Elroy et al., 1991) enthalten ist, oder den p35S-Promoter (Kay et al., 1987), oder einen gewebespezifischen Promoter wie den HMWG-Promoter des Weizens oder der Gerste, oder auch den pCRU-Promoter des Rettich-Cruciferingens, die alle drei eine Expression des interessierenden Proteins in den Körnern gestatten (Roberts et al., 1989; Anderson O.D et al., 1989; Depigny-This et al., 1992).
  • Andere Elemente wie Introns, Enhancer, Polyadenilierungssequenzen und abgeleitete Sequenzen können ebenfalls in der interessierenden Nukleinsäuresequenz vorhanden sein, um die Expression oder die Funktion des transformierenden Gens zu verbessern.
  • Die Expressionskassette kann vorteilhaft auch nichttranslatierte 5'-Sequenzen, sogenannte "Leader"-Sequenzen, enthalten. Solche Sequenzen können die Translation verbessern.
  • Unter den Terminatoren, die bei den Konstrukten der Erfindung verwendet werden können, ist insbesondere folgender zu nennen: der Nos-Terminator, der der 3' gelegenen nichtcodierenden Region des Gens der Nopalinsynthase des Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens entspricht (Depicker et al., 1982).
  • Die Expressionskassette des interessierenden Gens (i) wird in einen Nukleotidvektor wie ein Plasmid insertiert, der außerdem die Expressionskassette des Markergens (ii) zwischen zwei ITRs insertiert enthält.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die Expressionskassette des Markergens (ii) die Nukleinsäure, die für den Selektionsmarker oder den phänotypischen Marker codiert und die von für ihre Expression erforderlichen Elementen, insbesondere den Promotern, den Aktivatoren und den Terminatoren der Transkription, wie sie oben beschrieben sind, flankiert ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Pflanzenzellen mit einem wie oben definierten Vektor transformiert, der in eine Wirtszelle eingebracht wird, die fähig ist, diese Pflanzenzellen zu infizieren und dabei die Integration von interessierenden Nukleotidsequenzen, die ursprünglich in dem Genom des oben genannten Vektors enthalten sind, in das Genom der Pflanzenzellen zu ermöglichen. Vorteilhaft handelt es sich bei der verwendeten Wirtszelle um einen Bakterienstamm wie Agrobacterium tumefaciens, insbesondere nach dem in der Arbeit von An et al., (1986), beschriebenen Methode, oder auch Agrobacterium rhizogenes, insbesondere nach der in der Arbeit von Guerche et al., (1987) beschriebenen Methode.
  • So können zum Beispiel Pflanzenzellen dadurch transformiert werden, daß man die T-Region des extrachromosomalen ringförmigen Plasmids, das Ti-Tumore von Agrobacterium tumefaciens anzeigt, überträgt, und zwar dadurch, daß man ein binäres System verwendet (Watson et al., 1994). Zu diesem Zweck werden zwei Vektoren konstruiert. In einem dieser Vektoren wurde die T-Region mit Ausnahme der linken und rechten Borders durch Deletion entfernt, wobei zwischen die beiden Borders ein Markergen, das die Selektion in Pflanzenzellen gestattet, insertiert wurde. Der zweite Bestandteil des binären Systems ist ein Ti-Helferplasmid, ein modifiziertes Plasmid, das über keine T-Region mehr verfügt, das jedoch noch die vir-Virulenzgene, die für die Transformation der Pflanzenzelle erforderlich sind, enthält.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann man die von Ishida et al., (1996) für die Transformation von monokotylen Pflanzen beschriebene Methode verwenden.
  • Ebenfalls zu nennen sind weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere die Methoden des direkten Transfers von Genen von Pflanzenzellen wie die direkte Mikroinjektion in pflanzliche Embryoide (Neuhaus et al., 1987), die in-planta-Infiltration von Blütenständen (Bechtold et al., 1993) oder die Elektroporation von Protoplasten (Chupeau et al., 1989) oder auch die direkte Fällung von Protoplasten mittels PEG (Schocher et al., 1986) oder der Beschluß von Kalli oder Embryonen mit einer Genkanone mit Teilchen, die mit der interessierenden Plasmid-DNA beschichtet sind (Fromm M. et al., 1990).
  • Gemäß einer weiteren Vorschrift wird die Transformation nach dem von Finer et al. (1992) beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei die Wolframpartikelkanone oder vorteilhaft die Goldpartikelkanone bei Kalli oder Embryonen angewandt wird.
  • Die Selektion von Zellen von transformierten Pflanzen in Schritt (b) kann auf einem selektiven Medium oder durch einfache visuelle Beobachtung bei der Verwendung eines phänotypischen Markergens erfolgen.
  • Das Kreuzen in Schritt (c) wird zwischen der transformierten Pflanze und einer anderen Pflanze mit einer endogenen aktiven Transposase in der Mitte eines phänotypischen Exzisionsmarkers (iii) nach fachbekannten Techniken durchgeführt, wodurch man zu einer F1 oder einem sonstigen Einzelorganismus einer Folgegeneration gelangt. Bei der anderen Pflanze handelt es sich vorzugsweise um eine Elitelinie mit interessierenden agronomischen Eigenschaften.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung versteht man unter endogener aktiver Transposase eine aktive Transposase, die nicht gentechnisch erhalten wird.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die transformierte identifizierte Pflanze in Schritt (c) mit einer anderen Pflanze gekreuzt, die zu einer Linie gehört, die in ihrem Genom ein für eine endogene aktive Transposase codierendes Gen, das in einen phänotypischen Exzisionsmarker (iii) insertiert vorliegt, enthält.
  • Transposons neigen im Lauf ihrer Generationen zu Methylierung, insbesondere beim Mais, und dann ist kein Transkript mehr nachweisbar. Die aktive Phase des Transposons entspricht daher einem Zustand schwacher Methylierung, der die normale Transkription des Gens ermöglicht. Dadurch, daß man mit dem Transposon einen phänotypischen Exzisionsmarker kombiniert, kann man die Zellen, in denen eine Transposition stattgefunden hat, sichtbar machen und das Aktivitätsniveau des Transposons in dem Organismus quantitativ bestimmen und so die Transposaseproduktion sichtbar machen. Das Transposon wird allgemein zwischen dem Promoter und dem Codierabschnitt des phänotypischen Exzisionsmarkers insertiert, wodurch seine Expression unmöglich gemacht wird. Wenn das Transposon die Transposase exprimiert, kann es sich aus dem Gen, in das es insertiert worden ist, herausspleißen, wodurch die Aktivität des Gens wiederhergestellt wird. So kann man durch phänotypische Analyse die Zellen, in denen eine Produktion der Transposase, die das Ds::M-Element herausspleißen kann, sichtbar machen.
  • Unter "phänotypischem Exzisionsmarker" (iii) versteht man jegliches Gen, das für ein Pigment codiert, oder jegliches sonstige Gen, mittels dessen der Werdegang der Exzision des Ac-Elements verfolgt werden kann. So kann beispielsweise ein phänotypischer Exzisionsmarker ein beliebiges Gen sein, bei dem man eine Mutation zu einem am Samen oder an der Pflanze oder einem Teil der Pflanze sichtbaren Phänotyp führt, zum Beispiel Gene, die in den biochemischen Stoffwechselweg der Anthozyane oder der Phlobaphene eingreifen. Hier sind die konstitutiven Gene A1, A2, C2, Bz1 oder Bz2 und die Regulatorgene C1, Vp1, Pl, P1 und R1 zu nennen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem bevorzugten Allel um das Allel R-nj handeln, das ein endogener phänotypischer Marker der R1-Familie ist und in gewissen Maislinien vorkommt. Das Allel R-nj::Transposon trägt ein aktives Ac-Element, wobei die Chromosomenregion, zu der R-nj gehört, besonders schwach methyliert ist (Brink et al., 1973). Wenn sich nun Ac aus dem Gen R-nj heraustransponiert, so wird dieses Gen wiederum allgemein funktionsfähig, was durch die Entstehung von violetten anthozyanhaltigen Abschnitten des "navajo"-Typs, die auf der Krone des Korns, also dem Embryo, sichtbar sind, erkenntlich ist. Dieser panaschierte Phänotyp stellt eine gute Möglichkeit dar, um Ereignisse, aufgrund deren eine Transposaseproduktion stattgefunden hat, zu orten und auszuwerten. Weiterhin können damit die Aktivität des Transposons im Lauf der Generationen verifiziert und die Transposase im Lauf der Kreuzungen verfolgt werden.
  • Als Beispiele für Linien, die in Schritt (c) verwendet werden können und die in ihrem Genom ein Gen, das für eine endogene aktive Transposase codiert und das in einen phänotypischen Exzisionsmarker insertiert vorliegt, enthalten, sind die folgenden Linien zu nennen:
    • – W22/R-nj::Ac, eine für das Allel R-nj::Ac homozygote Linie aus Samen des Stock Center (http://www.agron.missouri.edu/).
    • – A188/R-nj::Ac, eine für das Allel R-nj::Ac mit Introgression in dem genetischen Hintergrund von A188 homozygote Linie.
    • – HiII/R-nj::Ac, eine für das Allel R-nj::Ac mit Introgression in dem genetischen HiII-Hintergrund homozygote Linie.
    • – W23/P-vv, eine für das Allel P-vv homozygote Linie aus Samen des Stock Center. Ein Ac-Element ist in das Allel P-rr insertiert.
    • – oder allgemeiner ausgedrückt jegliche Linie, die über ein aktives Transposon, das in ein Gen mit sichtbarem Phänotyp insertiert ist, verfügt und die über den für seine Expression erforderlichen Genotyp verfügt.
  • Das Allel, das das Element Ac trägt, kann, obwohl es unstabil ist, durch mehrere Kreuzungen auf andere Linien übertragen werden. Man muß nur vor der Introgression sicherstellen, daß die Rezeptorlinie über die Gesamtheit der für die Expression des Phänotyps erforderlichen Allele verfügt. Beim Allel R-nj::Ac müssen die Allele A1, A2, Bz1, Bz2 und C1 vorhanden sein oder durch Introgression eingeführt worden sein.
  • In Schritt (d) kann die Selektion von Einzelorganismen, die das interessierende Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz enthalten, an F1-Pflanzen oder F2-Pflanzen oder an Kalli, die aus F1-Embryonen hervorgegangen sind, durchgeführt werden. Die Selektion von Einzelorganismen kann mittels fachbekannten Techniken, wie PCR- und Southern-Techniken oder phänotypischer Beobachtung beurteilt werden. Es wird also zum Beispiel eine Identifikation der transformierten Ereignisse, die die T-DNA, die das Selektionsmarkergen (ii) trägt, in ihr Genom integriert haben, durchgeführt, insbesondere eine Selektion von Einzelkopie-Ereignissen. Man kann eine Selektion von resistenten F1-Pflanzen durchführen, um nach somatischen Exzisionen zu suchen, und eine Analyse von sensitiven F2-Pflanzen durchführen, um gegebenenfalls vorhandene Keimbahnexzisionen nachzuweisen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen monokotylen Pflanze, welche ein interessierendes Gen ohne zusätzliche Fremdsequenz enthält, wobei bei dem Verfahren die Selektion von Einzelorganismen in Schritt (d) auf dem reproduktiven Weg erfolgt und die folgenden Schritte umfaßt
    • – Selektion von panaschierten F1-Körnern;
    • – Selektion von somatischen Exzisionsereignissen des defizienten Elements Ds::M mittels PCR-Technik;
    • – Selektion von Exzisionsereignissen des Ds::M-Elements aus der Keimbahn mittels PCR-Technik;
    • – Gewinnung von Samen von F2-Pflanzen ausgehend von diesen Ereignissen.
  • So kann erfindungsgemäß die Selektion von Einzelorganismen, die das interessierende Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz tragen, aufgrund einer Analyse der Panaschierung des Transposonexzisionsmarkerallels an den F1-Kolben erfolgen.
  • Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen monokotylen Pflanze, die ein interessierendes Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz enthält, wobei die Selektion von Einzelorganismen in Schritt (d) auf vegetativem Weg erfolgt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
    • – Produktion von Kalli aus unreifen F1-Embryonen,
    • – optische Selektion der Kalli, die die T-DNA und das Element Ds::M), enthalten,
    • – Vermehrung von Kalli und Suche nach Abschnitten, in denen eine Exzision des Elements Ds::M stattgefunden hat,
    • – Regeneration von F1-Pflanzen aus diesen Exzisionsabschritten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können F1-Pflanzen direkt durch Regeneration aus den in Schritt (d) enhaltenen Kalli erhalten werden, und zwar durch in-vitro-Kultur von unreifen Embryonen von F1-Kolben.
  • Die Erfindung ermöglicht es, transgene monokotyle Pflanzen oder Pflanzenteile wie Zellen oder Kalli zu erzeugen, die ein interessierendes Gen ohne zusätzliche Sequenzen enthalten.
  • Die monokotylen Hybridpflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie durch Kreuzen der in den oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Pflanzen erzeugt werden, können ebenfalls gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
  • Dies betrifft insbesondere Maispflanzen.
  • Bei der Erfindung wird ein Verfahren verwendet, bei dem Ereignisse, die eine Exzision des Elements Ds::M an Kalli darstellen selektiert werden, wodurch man zu transgenen Pflanzen gelangt, die ein interessierendes Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
    • – Produktion von Kalli aus unreifen F1-Embryonen,
    • – visuelle Selektion von Kalli, die die T-DNA und das Element Ds::M enthalten,
    • – Vermehrung von Kalli und Suche nach Abschnitten, in denen eine Exzision des Elements Ds::M stattgefunden hat,
    • – Regeneration von F1-Pflanzen aus diesen Exzisionsabschnitten.
  • Die Kallusbildung beruht auf einer Zellproliferation, also einer Anhäufung von undifferenzierten und verjüngten Zellen, aus denen sich bipolare Embryonen entwickeln können. Diese bipolaren Embryonen können sich unter gewissen fachbekannten Bedingungen wie zygotische Embryonen, wie sie durch Befruchtung zwischen einer weiblichen Geschlechtszelle und einer männlichen Geschlechtszelle entstehen, verhalten und zu einer Pflanze führen.
  • Bei den Zellteilungen, die während des Wachstums des Kallus stattfinden werden, werden in gewissem Ausmaß Exzisionsereignisse des Transposons Ds::M stattfinden. Der dergestalte Kallus ist also panaschiert und enthält Sektoren von Zellen, die Ds::M aufweisen und Sektoren von Zellen, die Ds::M nicht mehr aufweisen.
  • Mittels des phänotypischen Markergens kann man die während der Transgenesevorgänge transformierten Zellen, die einen Phänotyp, der sich im Kallus exprimieren kann, aufweisen, identifizieren.
  • Dieses Verfahren kann jedoch auch zur Identifikation derjenigen Zellen, in denen sich das phänotypische Markergen (iii) entweder aufgrund einer Extinktion des Gens oder aufgrund der Exzision des Gens nicht mehr exprimiert, dienen. Vorzugsweise wird man ein phänotypisches Markergen des GFP-Typs, des Anthozyan-Typs oder ein beliebiges anderes Markergen mit kolorimetrischer Expression wählen. Man kann auch das nptII-Gen, das die Chloroplastensynthese hemmt, verwenden.
  • Bei der Erfindung wird ein Vektor verwendet, der zwei wie oben beschriebene Expressionskassetten umfaßt.
  • Eine Wirtszelle, zum Beispiel eine Pflanzenzelle oder ein Klon solch einer Zelle, die mit einem wie oben beschriebenen Vektor transformiert ist, kann erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung läßt sich auch auf andere Pflanzen anwenden, insbesondere auf monokotyle Pflanzen, die
    • – über ein wie oben beschriebenes Transposonsystem und
    • – ein phänotypisches Markersystem, zum Beispiel des Anthozyantyps, wie es sich bei den Poaceae (Mais, Sorghum, Weizen, Hafer, Reis) findet, verfügen,
    die die beiden Hauptkomponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen.
  • Unter den monokotylen Pflanzen, die ebenfalls nach demselben Protokoll erhalten werden können, sind zum Beispiel folgende zu nennen: Sorghum bicolor (Sorghum), Hordeum vulgare (Gerste), Triticum eastivum (Weizen), Oriza sativa (Reis), Pennisetum glaucum (Hirse).
  • ERLÄUTERUNG DER FIGUREN
  • 1: Schematische Darstellung der beiden Komponenten des Systems: das zu eliminierende Ds::M sowie der Startpunkt der Transposase.
  • 2: Restriktionskarten der Plasmide pBios340-nptII (2A) und pBios342-bar (2B), die sich vom Plasmid pSB12 ableiten.
  • 3: Schematische Darstellung der beiden möglichen Wege zur Erzeugung der transgenen Pflanzen ohne Selektionsmarkergen.
  • 4: Beobachtung der Exzision aus der Keimbahn.
  • 5: Restriktionskarte des Plasmids pBios491, das das GFP-Gen und das NptII-Gen in einem Ds-Element enthält.
  • 6: Restriktionskarte des Plasmids pBios424, das den CaMV-Promoter A9-Barnase-3'-Terminator und das NptII-Kanamycinresistenzgen in einem dissoziierenden Ds-Element enthält.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1. Erzeugung einer Ac-inaktiven Linie A188, die stabil mit dem Element Ds::M transformiert ist
  • 1.1 Herstellung der Ds::M-Konstrukte
  • Das Ac-Element, mit dessen Sequenz die Ds::M-Konstrukte hergestellt worden sind, ist das in den locus p (Lechelt et al., 1989) insertierte Ac, das mit dem Ac9 des "waxy"-Gens (Fedoroff et al., 1983) identisch ist. Die Ds::M-Pflanzen wurden anschließend durch interne Deletionen des Ac konstruiert. Ihre Größen betragen
    –337 Bp für das 3'-Ende von Ac und
    –404 Bp für das 5'-Ende von Ac
  • Das bei der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Beispiel betrifft zwei Vektoren, die einen Polylinker in einem DNA-Konstrukt darstellen, wodurch man zu einem Gen gelangt, das für die Klonierung von Interesse ist.
  • Die Pflanzentransformationen wurden mit zwei Vektoren pBios340 und pBios342, die im folgenden beschrieben sind und die aus dem gleichen Ausgangsvektor pSB12 (Japan Tobacco, EP 672 752 ) stammen und die zwei Borders LB und RB enthalten, durchgeführt.
  • Innerhalb des Ds-Elements wurde ein Selektionsmarkergen (MS) unter der Kontrolle des Actin-1-Gen-Promoters aus Reis eingeführt, an das sich das erste Actin-Intron aus Reis (Mc Elroy et al., 1991) anschließt.
  • a) Ds::nptII (pBios340)
  • Das Plasmid pBios340 enthält eine T-DNA, die aus den Borders von pSB12, dem 5'-Ende des Ac-Elements, dem Promoter und dem ersten Intron des Actin-1-Gens aus Reis, dem offenen nptII Leseraster (Bevan et al., 1983), dem Nos-Terminator (des Gens, das für die aus Agrobacterium tumefaciens isolierte Nopalinsynthase codiert) und dem 3'-Ende des Ac-Elements besteht.
  • Ds::nptII weist eine Größe von 3428 Bp (2) auf.
  • b) Ds::bar (pBios342)
  • Das Plasmid pBios342 ist gleich wie pBios340 aufgebaut und verfügt statt dem offenen nptII Leseraster über das offene bar Leseraster (White et al., 1990) (2). Ds::bar weist eine Größe von 3173 Bp auf.
  • Zur Vereinfachung soll die Expressionskassette Promoter – Actin-Intron – offenes nptII bzw. bar Leseraster – Nos-Terminator als funktionsfähiges npt II oder bar Gen betrachtet werden.
  • 1.2 Transformation und Regeneration von Mais
  • a) Auswahl einer Linie ohne jegliche aktive Ac-Transposase
  • Die Linien, die verwendet werden können, sollen vorzugsweise keinerlei aktive Transposase enthalten, so daß die T-DNA in der transformierten Pflanze stabil ist, und sich gut für die Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens eignen.
  • Es wird also die Linie A188 verwendet, bei der es sich um eine Linie der Art Zea mays subsp mays handelt.
  • Um die Aktivität von endogenen Transposasen auszuwerten, wird der Methylierungszustand der Ac-Elemente analysiert.
  • Die DNA jeder Pflanze wurde mit den Endonukleasen BglII und PvuII getrennt verdaut und anschließend mit einer Mischung der beiden Enzyme gemeinsam verdaut.
  • PvuII ist ein Enzym, das gegenüber Methylierung sensitiv ist. Sobald der Cytosinrest seiner spezifischen Restriktionsstelle methyliert ist (5'-C-A-G-mC-T-G-3') kann das Enzym nicht mehr die Sequenz schneiden. Mit diesem Enzym kann man einen Methylierungszustand der Sequenz nachweisen. Es verfügt nur über zwei Restriktionsstellen in der Sequenz des Ac-Elements, die beide zu zwei CpG-dinukleotidreichen Regionen gehören. Diese Inselchen sind bei Pflanzen sensitiv gegenüber Methylierung. Das PvII-PvuII-Fragment von Ac weist 2524 Bp auf.
  • BglII ist eine Endonuklease, die innerhalb des Mais-Ac-Elements keinerlei Schnittstelle aufweist, die jedoch über ziemlich häufig auftretende Schnittstellen im Maisgenom verfügt.
  • Die Produkte des Verdaus der genomischen DNA wurden elektrophoretisch auf Agarosegel getrennt und auf Nylonmembranen übertragen.
  • Durch Verdau des Ac-Elements mit der Endonuklease HindIII wurde eine 1605 Bp große SAc-Sonde geschaffen. Dieses HindIII-HindIII-Fragment entspricht einem inneren Abschnitt des Ac-Elements und kann daher im Vergleich zu Ac nicht mit stark deletierten Ds-Elementen hybridisieren und weist diesen Ac-Abschnitt nicht mehr auf. Die Hybridisierung ist daher auf transponierbare Elemente und/oder auf Sequenzen mit guter Homologie mit dem Ac-Element beschränkt. Diese Sonde stammt von einem Plasmid, das das autonome Ac9-Element ursprünglich in den p-locus des Maises insertiert enthält. Nach Verdau und Migration wurden die 1605 Bp großen Fragmente aus dem Agarosegel extrahiert. Sie wurden anschließend aufgereinigt und dann mit Nylonmembranen hybridisiert.
  • Bei den DNA-Proben von A188 und von einer Elite-Linie, die mit PvuII und BglII/PvuII verdaut wurden, sind oben in jeder Bahn nur Banden mit einer Größe oberhalb 8 kB vorhanden; es ist keine Bande mit einer Größe von ungefähr 2,5 kB sichtbar. Dieses Verdauungsprofil zeigt, daß die genomische DNA teilweise von PvuII verdaut wurde. Das Fehlen dieser Bande mit einer Größe von 2524 Bp in den A188-Pflanzen kann auf einen Methylierungszustand der Ac-Transposasen, die also inaktiv wären, oder auch auf das Fehlen einer vollständigen Kopie eines Ac-Elements in diesen genetischen Hintergründen zurückzuführen sein.
  • Weiterhin enthält die Linie A188 alle erforderlichen konstitutiven Gene (A1, A2, Bz1, Bz2, C2) sowie die rezessiven Allele von Genen, die den Anthozyan-Biosyntheseweg regulieren (r-r, C1, pl). Sie exponiert daher kein Pigment des Anthozyan-Typs, außer in den Antheren der Blattscheide, die manchmal rot sein kann. Sie stellt daher eine interessante Rezeptorlinie für die Expression des Anthozyanmarkers nach dem Kreuzen dar.
  • b) Transformation mit Agrobacterium und Regeneration
  • Bei der verwendeten Transformationstechnik handelt es sich um diejenige, die von Ishida et al., 1996 beschrieben wurde. Agrobacterium tumefaciens wurde insbesondere ausgehend von unreifen Embryonen 10 Tage nach der Befruchtung verwendet. Alle verendeten Medien sind in der zitierten Literaturangabe angeführt. Die Transformation beginnt mit einer Cokulturphase, wo die unreifen Embryonen der Maispflanzen mindestens fünf Tage lang mit einem Agrobacterium tumefaciens Stamm wie LBA 4404 (Ooms et al., 1981) oder auch EHA 101 (Hood et al., 1986), EHA 105 (Hood et al., 1993), AGL1 (Lazo et al., 1991), der die superbinären Vektoren enthält, in Kontakt gebracht werden. Das superbinäre Plasmid entsteht durch homologe Rekombination zwischen einem Zwischenvektor, der die T-DNA, die das interessierende Gen und/oder den Selektionsmarker, der von den in den obigen Beispielen beschriebenen Plasmiden abgeleitet ist, enthält, trägt und dann Vektor pSB1 von Japan Tobacco ( EP 672 752 ), der folgendes enthält: das virB-Gen und das virG-Gen des Plasmids pTiBo542, das in dem supervirulenten Stamm A281 von Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) vorliegt sowie eine homologe Region, die auch bei dem Zwischenvektor auftritt und die diese homologe Rekombination ermöglicht. Die Embryonen werden anschließend drei Tage lang im Dunkeln bei 25°C auf LSAs-Medium gelegt. Eine erste Selektion wird mit den transformierten Kalli durchgeführt: die embryogenen Kalli werden auf LSD5-Medium, das Phosphinothricin in einer Konzentration von 5 mg/l und Cefotaxim in einer Konzentration von 250 mg/l enthält (Elimination von bzw. Eingrenzung des Besatzes mit Agrobacterium tumefaciens). Dieser Schritt wird zwei Wochen lang im Dunkeln bei 25°C durchgeführt. Der zweite Selektionsschritt wird dadurch durchgeführt, daß man die Embryonen, die sich auf dem LSD5-Medium entwickelt haben, drei Wochen lang unter denselben Bedingungen wie oben auf LSD10-Medium (10 mg/l Phosphinothricin) in Gegenwart von Cefotaxim umsetzt. Der dritte Selektionsschritt besteht darin, daß man die Typ-I-Kalli (Fragmente mit einer Größe von 1-2 mm) herausseziert und sie drei Wochen lang im Dunkeln bei 25°C auf LSD10-Medium in Gegenwart von Cefotaxim umsetzt.
  • Pflänzchen werden dadurch regeneriert, daß man die Typ-I-Kalli, die proliferiert haben, herausseziert und sie zwei Wochen lang bei 22°C unter Dauerlicht auf LSZ-Medium in Gegenwart von 5 mg/l Phosphinothricin und in Gegenwart von Cefotaxim umsetzt.
  • Die regenerierten Pflänzchen werden zwei Wochen lang bei 22°C unter Dauerlicht auf RM+G2-Medium, das 100 mg/l Cefotaxim enthält, umgesetzt. Die erhaltenen Pflanzen werden nun in ein Phytothron umgestellt, um sie für das Gewächshaus abzuhärten.
  • 1.3 Selektion von resistenten Transformanten und molekulare Analyse
  • a) Selektion auf Selektionsmedium
  • Selektion von glufosinateresistenten Transformationsereignissen (Ds::bar)
  • Mit Hilfe von mehreren Selektionsmedien, dem Kallusinitiationsmedium, dem Reifungsmedium und dem Regenerationsmedium, können die nichttransformierten Ereignisse, die gegenüber dem Selektionsmittel empfindlich sind, wirksam ausgemerzt werden. Nur die transformierten Kalli werden regeneriert und können Pflänzchen ergeben. Zur Ausmerzung der Pflänzchen, die gegebenenfalls von einem Ausreißer stammen und die sich in der Nähe von resistenten Pflanzen entwickelt haben (das bar-Gen erzeugt ein Protein, das der Pflanze ermöglicht, Glufosinate zu entgiften), wird ein Teil eines Blatts der Pflanze im 6-Blatt-Stadium mit einer Lösung bepinselt (Leaf painting assay), die Glufosinate (Basta 0,5% (v/v)) enthält. Eine Woche später weist das empfindliche Blatt ein typisches Austrocknungssymptom auf.
  • Selektion von Transformationsereignissen, die kanamycinresistent sind (Ds::nptII)
  • Die Selektion der Transformationsereignisse wurde auf Medien durchgeführt, die unterschiedliche Kanamycin- oder Geneticinkonzentrationen enthalten.
  • Es wurde auch ein Identifikationstest für transformierte Pflanzen im Gewächshaus durchgeführt. Einige Tropfen einer Lösung von Kanamycin (500 mg/l) und Tween 20 (0,1% (p/v)) werden in die tütchenförmige Öffnung, die von den Blättern der jungen Pflanzen (3-Blatt-Stadium, ungefähr 2 bis 3 Wochen) gebildet wird, gegeben. Die Blätter von empfindlichen Pflanzen weisen beim Heranwachsen an der Stelle, mit der sie in Kontakt mit der Lösung waren, ausgebleichte Abschnitte auf. Mit diesem nichtdestruktiven Test können die empfindlichen Pflanzen weitergeführt werden.
  • b) Molekulare Analyse
  • Die regenerierten Pflanzen werden mittels PCR und Southern-Blot analysiert, um Ausreißer auszumerzen und Ein-Kopien-Transformationsereignisse, die vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu identifizieren. Diese Pflanzen, die die T-DNA in ihr Genom integriert haben, sind die Primärtransformanten T0. Die verwendete Analysetechnik leitet sich von der von Southern (1976) beschriebenen Technik ab.
  • Identifikation mittels PCR
  • Zur Überprüfung, ob die gegenüber Selektionsmitteln resistenten Pflanzen auch wirklich die T-DNA in ihr Genom integriert haben und dass keine Transposition von Ds::M stattgefunden hat, werden mit von diesen Pflanzen extrahierter DNA PCRs durchgeführt.
  • Das Oligonukleotidpaar EM13-EM14 (SEQ ID Nr. 1-SEQ ID Nr. 2) amplifiziert ein Fragment mit einer Größe von 280 Bp, wenn das Ds::M sich aus der T-DNA herausgespleißt hat und kein Fragment, wenn das Ds::M nach wie vor in seiner ursprüngliche Stelle auf der T-DNA intertiert ist.
  • Das Oligonukleotidpaar Actint1-Actint2 (SEQ ID Nr. 3-SEQ ID Nr. 4) amplifiziert ein Fragment des Actin-Introns, das im Ds::MS vorliegt und das eine Größe von 480 Bp aufweist.
  • Die auf Selektivmedium selektierten Transformationsereignisse, die in der PCR mit dem Paar Actint1-Actint2 positiv sind und in der PCR mit dem Paar EM13-EM14 negativ sind, haben daher in ihr Genom zumindest einen Teil der T-DNA, die das Element Ds::M enthält und die in ihrer ursprünglichen Insertionsstelle verblieben ist, integriert.
  • Bestimmung der Kopienzahl der T-DNA
  • An DNA, die aus Blättern der selektierten Pflanzen extrahiert wurde, wurden molekulare Analysen durchgeführt, um die Ein-Kopien-Transformationsereignisse zu bestimmen.
  • Die DNA von Ds::bar-positiven Pflanzen wurde mit der Endonuklease EcoRV, die nur ein einziges Mal in der T-DNA zwischen dem offenen Leseraster von bar und dem Actin-Intron schneidet, verdaut.
  • Die DNA von positiven Pflanzen wurde mit der Endonuklease NcoI verdaut, die nur ein einziges Mal in der Transfer-DNA innerhalb des offenen Leserasters von nptII schneidet, verdaut.
  • Nach der Elektrophorese wurden Transfers durchgeführt und die erhaltenen Membranen wurden nacheinander mit den folgenden Sonden hybridisiert.
  • Ds::bar-Pflanzen: bar-Sonden (mit SmaI verdautes bar-Gen, Bezeichnung 5006), Actin-Intron-Sonde (Bezeichnung 5063) und 5'Nos-Sonde (Bezeichnung 5064).
  • Ds::nptII-Pflanzen: nptII-Sonden (Bezeichnung S020), Actin-Intron-Sonde (Bezeichnung 5063) und 5'Nos-Sonde (Bezeichnung 5064).
  • Die Actin-Intron-, die 5'Nos- und die nptII-Sonde werden mittels PCR ausgehend von Oligonukleotiden, die nach fachbekannten Methoden gewählt wurden, definiert (siehe beigelegte Tabelle).
  • Mit der Bar-, der nptII- und der Actin-Intron-Sonde kann die Kopienzahl der in das Genom insertierten Transfer-DNA abgeschätzt werden. Mit der 5'Nos-Sonde kann eine gegebenenfalls vorhandene Exzision des Ds-Elements aus der T-DNA nachgewiesen werden. Mit diesen drei Sonden können also diejenigen Pflanzen bestimmt werden, die nur eine einzige Kopie der vollständigen Transfer-DNA aufweisen.
  • Bei Ds::bar wird bei unikärer Insertion der T-DNA mit jeder der drei Sonden ein Fragment nachgewiesen. Außerdem ist, wenn das Ds nicht herausgespleißt wurde, die Größe der von den zwei Sonden Bar und 5'Nos nachgewiesenen DNA-Fragmente gleich.
  • Bei Ds::nptII wird bei unikärer Insertion der T-DNA mit den Sonden 5'Nos und Actin-Intron ein Fragment nachgewiesen und mit der Sonde nptII werden zwei Fragmente nachgewiesen. Außerdem wird, wenn das Ds nicht herausgespleißt wurde, eines dieser beiden Fragmente auch mit der Sonde 5'Nos und das andere mit der Actin-Intron-Sonde nachgewiesen.
  • Erfindungsgemäß handelt es sich bei den für die Kreuzungen mit dem Transposasestartpunkt verwendeten Pflanzen vorzugsweise um Pflanzen, die aus Ein-Kopie-Transformationsereignissen hervorgegangen sind.
  • Beispiel 2. Kreuzung mit einer Linie R-nj::Ac, bei der die Ac-Transposase in ein phänotypisches Markergen insertiert ist
  • 2.1 Transposase-Startpunkt R-nj::Ac
  • Die Linie W22/R-nj::Ac enthält die konstitutiven Gene C2, A1, A2 und die Regulatorgene C1, pl, B-b. Diese Linie trägt daher alle Faktoren, die für die violette Pigmentierung im Aleuron (die normal ist) erforderlich sind. Diese Linie verfügt weiterhin über das unstabile Allel R-nj::Ac, das mittels der von Dellaporta et al. im Jahr 1988 durchgeführten Chromosomentranslokation erzeugt wurde.
  • Diese Linie, die für das Allel R-nj::Ac homozygot ist und die hier verwendet wird, stammt aus Samen des Stock Center (http://www.agron.missouri.edu/) und wird As genannt. Die Samen weisen mehr oder weniger große gefärbte Abschnitte auf, die den Zellen entsprechen, in denen das Ac aus dem Allel R-nj herausgespleißt wurde.
  • Und die Aktivität des in das Gen R-nj insertierten Ac-Elements auszuwerten, wurden mit DNA, die aus Blättern von As-Pflanzen, die für das Allel R-nj::Ac homozygot sind, molekulare Analysen durchgeführt. Diese Untersuchung des Methylierungszustands von Ac, die in den As-Linien vorliegen, wurde wie bei den Linien A188 und den Elitelinien, die für die Transformation und Introgression von interessierenden Genen dienen, durchgeführt. Bei allen Proben sind oben in jeder Bahn zahlreiche Banden mit einer Größe über 8 kB vorhanden. Sie entsprechen nichtverdauter oder teilweise verdauter DNA. Das Vorhandensein einer 2,5 kB großen Bande, die bei Verdau mit PvuII, einem methylierungsempfindlichen Enzym, entsteht, zeigt jedoch, daß mindestens eine Kopie des Elements Ac im Genom dieser Linie As nicht methyliert ist.
  • 2.2 Introgression des Allels R-nj::Ac in andere Linien
  • Mit dem Element R-nj::Ac kann vorteilhaft eine Introgression in Linien erfolgen, von denen bekannt ist, daß sie sich für die Regeneration von Kalli eignen, zum Beispiel die Linie A188 (Walbot et al., 1994) oder die Hill-Linie. Mit dem Element R-nj::Ac kann auch eine Introgression in Elitelinien, die für die Introgression von interessierenden Genen verwendet werden, durchgeführt werden.
  • Um die Aktivität des Elements Ac im Verlauf der Generationen zu überprüfen, wird an den Körnern von Kolben aus diesen Kreuzungen eine phänotypische Analyse durchgeführt. Die von diesen Kreuzungen erhaltenen Kolben weisen panaschierte Körner auf.
  • Die Ergebnisse der Kreuzungen zwischen der Linie As und den Elitelinien oder A188 und M1 zeigen, daß das Gen R-nj in anderen genetischen Hintergründen exprimieren kann, und zwar entweder aufgrund des Vorhandenseins von konstitutiven Genen, die für die Expression des Phänotyps in diesen Linien erforderlich sind (wie dies bei A188 der Fall ist), oder deshalb, weil sie durch die Linie As in die Zelle eingebracht wurden.
  • Die an den Körnern beobachtete Panaschierung legt nahe, daß Ac in dieser Generation noch immer aktiv ist, da es in gewissen Teilen von Körnern aus diesen Kreuzungen außerhalb des Allels R-nj transponiert.
  • Mit zahlreichen Introgressionen, die bei der Linie A188 und der Hill-Linie sowie in einer Elitelinie durchgeführt wurden (bis zu 3 Kreuzungen in der Linie, was ungefähr 93% A188 und 7% W22 entspricht) konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Nun wurden durch Selbstbefruchtung Linien erzeugt, die für das Al1el R-nj::Ac homozygot sind.
  • 2.3 Kreuzungen
  • Die Befruchtung erfolgt von Hand mit einer fachbekannten Technik durch Ablegen von Pollen des Ausgangsmaterials der Transposase As auf die Narbenfäden der Transformanten, und zwar vorzugsweise in Richtung männliche Pflanze mit Transposase in weibliche Pflanze, die das Element Ds::M enthält.
  • Ein Teil des Kolbens wird manchmal entfernt, um unreife Embryonen zu entnehmen, mit denen zellbiologische Protokolle wie die Gewinnung von Embryonen oder Kallusbildung durchgeführt werden sollen. Die Schnittfläche wird vorzugsweise mit einem Fungizid bedeckt, um Fäulnis und Bakterien zu vermeiden.
  • Die Embryonen, die 10 bis 15 Tage nach der Befruchtung entnommen werden, werden mit dem runden Teil nach oben auf 25 ml RM+ Regenerationsmedium (Ishida et al., 1996; Negrotto et. al., 2000) gelegt. Die Schalen werden anschließend in eine Kulturkammer mit geregelter Fotoperiode (16 Std. Tag – 8 Std. Nacht) und konstanter Temperatur (23°C) gestellt. Die Pflänzchen werden anschließend nach 10-15 Tagen nach Beginn der Kultivierung und vor dem Umsetzen ins Gewächshaus im Phytothron abgehärtet.
  • Beispiel 3: Selektion von Ereignissen mit Exzision des Elements Ds::MS
  • Mit den in Beispiel 1.3 beschriebenen molekularen Untersuchungen konnten ein Ein-Kopie-Ds::nptII-Transformationsereignis sowie ein Ein-Kopie-Ds::bar-Ereignis identifiziert werden, die sich vorzugsweise für die Auswertung einer eventuell stattgefundenen Exzision eignen. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, daß das Element Ds::M in der Linie A188 stabil ist (die Untersuchung wurde an T0-Primärtransformanten sowie den ersten T1-Nachkommen mittels PCR und Southern durchgeführt).
  • Mit den in Beispiel 2) beschriebenen phänotypischen und molekularen Untersuchungen der Linie As konnte gezeigt werden, daß in ihrem Genom (mindestens) eine Kopie des aktiven Ac-Elements vorliegt, das sich in dem ursprünglichen genetischen Hintergrund der Linie W22 oder im Hintergrund einer anderen Linie aus dem Allel R-nj herausspleißen kann.
  • Die phänotypische Analyse der Panaschierung des Allels R-nj auf den F1-Kolben, die aus den Kreuzungen As X Ds::M hervorgegangen sind, hat bestätigt, daß das Ac-Element in dieser Generation noch immer aktiv war: Das Vorhandensein von Anthozyanabschnitten auf allen reifen Körnern zeigt, daß eine Transposaseproduktion und eine somatische Exzision von Ac aus seiner ursprünglichen Insertionsstelle stattgefunden hat. Die durch Kreuzung erfolgte Hinzufügung eines neuen Elements, nämlich Ds, zur Zelle hat die Fähigkeit, die Aktivität des Transposase-Startpunkts zu verfolgen, auf keinerlei Weise verändert.
  • Man ist der Meinung, daß das Ds-Element genetisch nicht mit dem Allel R-nj::Ac gekoppelt ist. Man muß also nur noch bestimmen, ob die von dem Ac-Element, das in das Allel R-nj insertiert worden ist, exprimierte Transposase die Exzision der Elemente Ds::bar und Ds::nptII ermöglicht.
  • 3.1 Ausgangsmaterial: F1-Pflanzen (traditionelle Vorgehensweise)
  • Nach Etablierung von Ein-Kopien-Linien wurden Kreuzungen durchgeführt, um zu überprüfen, ob sich die Elemente Ds::bar und Ds::nptII in der Pflanze transponieren können.
  • Die als Ausgangsmaterial der Transposase dienenden Pflanzen wurden als Pollenspender verwendet (und zwar deshalb, weil diese Pflanzen teilweise weiblich-steril waren).
  • a) Ermittlung von somatischer Exzision an F1-Pflanzen, die gegenüber dem Selektionsmittel resistent sind, mittels PCR
  • Ein Teil der F1-Nachkommenschaft aus den Kreuzungen zwischen den Ds::MS-Pfanzen und den As-Pflanzen wurde ausgesät und DNA wurde von jungen Blättern jeder so erzeugten F1-Pflanze isoliert. Da eine der Elternpflanzen für die T-DNA hemizygot ist und die andere für das Allel R-nj::Ac homozygot ist, wird erwartet, daß die zwei Komponenten Ac und Ds zu 50% an die aus diesen Kreuzungen hervorgehende F1-Pflanzen weitergegeben werden.
  • Um die F1-Pflanzen mit der T-DNA zu identifizieren und somatische Exzisionen, die gegebenenfalls stattgefunden haben, nachzuweisen, wurden mit den Jungpflanzen Tests für Resistenz gegen den Selektionsmarker sowie parallel dazu Sequenzamplifikationstests an der DNA der Blätter durchgeführt, und zwar:
    • – bei den Ds::nptII-Pfanzen werden in die von den Blättern der Pflanze gebildete tütchenförmige Vertiefung 3 bis 5 ml einer Lösung von 500 mg/l Kanamycinsulfat + 0,1% Tween gegeben. Die empfindlichen Pflanzen bilden an denjenigen Teilen der Blätter, die in Kontakt mit der Lösung standen, chlorotische Abschnitte;
    • – bei den Ds::bar-Pflanzen wird ein "leaf painting" durch Bepinseln eines Blatts mit einer Ammonium-Glufosinate-Lösung durchgeführt.
  • Mit Hilfe einer ersten Selektion auf Resistenz gegen das Antibiotikum oder das Herbizid durch nichtdestruktive Behandlung konnte bestimmt werden, welche Pflanzen das Selektionsmarkergen enthielten.
  • Wenn ein Ds-Element nach der Transposaseproduktion herausgespleißt wird, verbleibt eine leere Donatorstelle. Mit Hilfe einer PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotiden EM13 (SEQ ID Nr. 1) und EM14 (SEQ ID Nr. 2) kann ein spezifisches 280 Bp großes Fragment synthetisiert werden, wenn die T-DNA aus dem Ds::bar- oder dem Ds::nptII-Element deletiert wird. Es wurde also eine Amplifikationsserie mit dem Paar EM13-EM14 an der von Pflanzen, die aus der Kreuzung Ds::nptII X Ac hervorgegangen sind, extrahierten DNA durchgeführt, um eine somatische Exzision, die gegebenenfalls in gewissen Zellen der Proben von entnommenen Blättern stattgefunden hat, nachzuweisen.
  • Die PCR-Analyse dieser F1-Pflanzen hat gezeigt, daß eine somatische Exzision bei allen F1-Pflanzen, an die die T-DNA und das Allel R-nj::Ac vererbt worden ist, stattgefunden hat. An den Pflanzen, die nur die T-DNA besaßen, sowie an den Pflanzen, die keine der beiden Komponenten besaßen, wurde keinerlei Amplifikation nachgewiesen.
  • Weiterhin hat sich herausgestellt, daß alle Pflanzen, bei denen eine somatische Exzision nachgewiesen worden ist, allgemein gegenüber dem Antibiotikum resistent sind.
  • Diese Bande zeigt daher das Vorhandensein einer somatischen Exzision in gewissen Zellen von Einzelpflanzen, die die T-DNA und das Allel R-nj::Ac tragen, an. Wie erwartet hat bei diesen Pflanzen kein Exzisionsereignis des Elements Ds::M in der Keimbahn stattgefunden, die zwei Komponenten haben sich in derselben Zelle innerhalb nur weniger Zellgenerationen (von der Befruchtung bis zur Jungpflanze) umgruppiert.
  • Um eine Exzision in der Keimbahn erhoffen zu können, hätte die Transposition in dem Gameten oder in den Gametenmutterzellen stattfinden müssen. Dies erhöht die Möglichkeit einer Exzision bei schwachen Gameten, und es wäre daher überraschend gewesen, gleich bei der F1-Generation zu einer Exzision in der Keimbahn zu gelangen.
  • Bei der in Betracht gezogenen Strategie ist es jedoch die Häufigkeit der Exzision aus der Keimbahn, die für die Ausmerzung des Markergens bevorzugt wird:
    • – eine somatische Exzision betrifft im allgemeinen nicht die Gameten und führt zur Bildung von chimären Samen und Einzelpflanzen, bei denen die Mehrzahl der Zellen noch den Exzisionsmarker enthält
    • – eine Exzision aus der Keimbahn betrifft die Zellen, die sich im Zug der Gametogenese differenzieren werden und führt zur Bildung von Samen und Einzelpflanzen, die aus Zellen bestehen, wo das Ds herausgespleißt worden ist (und erneut insertiert werden kann) und die nicht mehr das Selektionsmarkergen aufweisen.
  • b) PCR-Untersuchung von möglichen Exzisionen des Markergens aus der Keimbahn bei den empfindlichen Pflanzen
  • Aus diesem Grunde wurde die Untersuchung einer Exzision aus der Keimbahn an der F2-Generation durchgeführt. Die für die Exzision spezifischen Amplifikationsbahnen wurden für jede F1-Pflanze quantitativ bestimmt, woraus sich über die somatische Exzisionsrate hinweg auf die Aktivität des Transposase-Startpunkts schließen läßt.
  • Die F1-Pflanzen mit der höchsten somatischen Exzisionsrate wurden mit Pflanzen der Linie A188 oder mit Pflanzen einer Elitelinie gekreuzt. Diese Kreuzungen wurden reziprok durchgeführt, wobei die Pflanzen mit den beiden Komponenten Ac/Ds::M als weiblicher bzw. männlicher Kreuzungspartner gedient haben, um die Möglichkeiten einer Exzision in der Keimbahn pro F1-Pflanze zu erhöhen. Die so gebildeten Samen wurden heranreifen gelassen. Chargen von F2-Samen, die von den kanamycinresistenten Ds::nptII X Ac F1-Pflanzen und von glufosinateresistenten Ds::bar X Ac F1-Pflanzen stammten und aus unterschiedlichen Kreuzungen hervorgingen, wurden ausgesät. Hierbei wird keinerlei phänotypische Überprüfung bezüglich Panaschierung durchgeführt. Zur Vermeidung jeglicher Verzerrung werden die Samen, die den Phänotyp exprimieren bzw. die nichtpigmentierten Samen mit der gleichen Wahrscheinlichkeit für die Saat ausgewählt.
  • Eine einfache Art der Überprüfung der Häufigkeit, mit der in diesem System aus der Keimbahn herausgespleißt wird, besteht darin, die F2-Pflanzen aufgrund ihrer Sensitivität gegenüber dem Selektionsmedium zu selektieren und sie mit molekularen Analysen zu testen. So wurden Ds::bar F2-Pflanzen und Ds::nptII F2-Pflanzen auf Amplifikation der exzisionsspezifischen 280 Bp großen Bande mittels PCR geprüft.
  • Eine F2-Pflanze ist entweder aufgrund der Aufspaltung gegenüber dem Selektionsmittel sensitiv, und die 280 Bp große Bande darf daher nicht amplifiziert werden, oder sie ist aufgrund einer Exzision des Markergens aus der Keimbahn gegenüber dem Selektionsmittel sensitiv, wobei in diesem Fall die spezifische Exzisionsbande mittels PCR nachgewiesen werden kann. Mit dieser Untersuchung konnte man die spezifische Exzisionsbande aus der DNA von aus den folgenden Kreuzungen hervorgegangenen F2-Pflanzen amplifizieren:
    • – Ds::bar/Ac X A188,
    • – Ds::bar/Ac X Elitelinie,
    • – Elitelinie X Ds::nptII/Ac
    • – Ds::nptII/Ac X Elitelinie.
  • Mit diesen selektierten Pflanzen sowie mit den Ds::bar T1-Ausgangspflanzen und den Ds::nptII T0-Ausgangspflanzen wurden Southern-Hybridisierungen sowie PCR-Analysen durchgeführt; man gelangt zu den folgenden Ergebnissen.
  • Die PCR- und die Southern-Analysen zeigen, daß die selektierten F2-Pflanzen einen Teil der T-DNA geerbt haben, der die linke Border, die interessierenden Sequenzen, die durch die Exzision von Ds hinterbliebene Schnittstelle und die rechte Border enthält; das Element Ds::M ist genetisch nicht an die F2-Pflanzen weitergegeben worden, wie dies bei der F1 der Fall war. Diese F2-Pflanzen sind daher Pflanzen, die aus Exzisionsereignissen des Elements Ds::M in der Keimbahn außerhalb der T-DNA hervorgegangen sind.
  • Die Exzisionshäufigkeiten in der Keimbahn insgesamt schwanken zwischen den einzelnen F2-Nachkommenschaften und sind ziemlich niedrig. Bezüglich des Konstrukts Ds::bar ist zu sagen, daß bei den Pflanzen, die die T-DNA geerbt haben, nur einige wenige Pflanzen nicht mehr das Element Ds::bar aufweisen, was zu einer Exzisionshäufigkeit in der Keimbahn von 0,4% führt. Die Exzisionshäufigkeit des Elements Ds::nptII in der Keimbahn ist mit 0,7% etwas höher.
  • Diese Exzisionshäufigkeit in der Keimbahn ist relativ niedrig. Das Phänomen des Übergangs zur Blüte ist beim Mais seltener als bei der Tomate oder bei Arabidopsis: beim Mais differenzieren sich nur zwei oder drei Meristeme pro Einzelpflanze zu Geschlechtsorganen und bilden die Gameten: eines für die Fahne (männliches Organ) und eines oder zwei für die Kolben (weibliche Organe). Die Exzision in der Keimbahn muß daher entweder eines dieser Meristeme vor der Gametogenese oder einen Gameten betreffen.
  • c) Aufspaltung der T-DNA und des Allels R-nj::Ac
  • Sobald die F2-Pflanze, die die T-DNA ohne das Selektionsmarkergen trägt, charakterisiert worden ist, kann die Aufspaltung der in R-nj insertierten Transposase und der T-DNA erfolgen. Diese Aufspaltung kann während der Introgression der T-DNA in die Elitelinie stattfinden. Man braucht nur die Pflanzen, die die T-DNA tragen, die jedoch kein Anthozyanpigment des navajo-Typs exprimieren, zu selektieren. Diese Aufspaltung kann auch mit molekularen Analysen des Southern-Typs verfolgt werden, und zwar mit den Sonden Sac und 5064.
  • 3.2 Kallusselektionsverfahren für die Ds::nptII X As F1-Embryonen
  • Um die Exzisionsfrequenz in der Keimbahn zu erhöhen, wurde mit unreifen F1-Embryonen, die die beiden Komponenten aufweisen, also das Element Ds::nptII, das in die T-DNA insertiert ist, und den Transposase-Startpunkt Ac, das in das Allel R-nj insertiert ist, ein Kallusbildungsschritt durchgeführt. Die als Transposaseausgangsmaterial gewählte Linie ist hier ein homozygotes Ausgangsmaterial, das aus der ersten Introgression von W22/R-nj::Ac in A188 hervorgegangen ist. Der Kallus weist also ungefähr 75% des Genoms von A188 und 25% des Genoms von W22 auf. Bei A188 handelt es sich um eine Linie, mit der Typ-II-Kallus erhalten werden kann.
  • Bei dem Wachstum des Kallus ausgehend von einer Zelle, bei der ein somatisches Exzisionsereignis stattgefunden hat, kann man einen embryogenen Kallusabschnitt erzeugen, der aus einer Anhäufung von somaklonalen Zellen besteht, die nicht mehr das Markergen aufweisen. Mittels einer phänotypischen oder molekularen Identifikation dieses Abschnitts kann man, ausgehend von diesen Zellen, eine Einzelpflanze ohne Markergen mit einer höheren Häufigkeit als auf dem traditionellen Weg regenerieren.
  • a) Kallusinitiation bei unreifen F1-Embryonen auf
  • Selektionsmedium sowie Selektion von resistenten Kalli F1-Embryonen, die aus Kreuzungen zwischen den transgenen Ds::M-Pflanzen und den Transposaseausgangsmaterialien, die für das Allel R-nj::Ac homzygot sind, hervorgegangen sind, wurden 10 bis 12 Tage nach der Befruchtung herausseziert, steril auf ein N6-Medium gelegt und in einer dunklen Kammer kultviert, um nach der Methode von Armstrong et al., 1985, die Bildung von undifferenzierten Typ-II-Kalli zu initieren.
  • Nachdem ungefähr 15 Tage nach der Initiation die Keimachsen entfernt worden waren, werden die Kalli im dunkeln bei 25°C erhalten, und zwar über den gesamten Zeitraum der Kallusinduktion und des ersten Abschnitts der Vermehrung. Die Kalli werden eine Woche nach der Initiation sichtbar. Bei jeder Subkultivierung, also alle 2 oder 3 Wochen, werden die weißen, embryogenen, lockeren Teile selektiert und von den kompakteren oder schleimigeren Teilen getrennt.
  • Nach 2 bis 3 Wochen Initiation werden die gebildeten Kalli in zwei Teile geteilt:
    • – eine Hälfte wird auf nichtselektives N6-Medium gegeben, um die Kalli weiter zu vermehren,
    • – die andere Hälfte wird auf ein N6-Medium, das 50 mg/l Kanamycin enthält, gegeben, um die resistenten Kalli, die die T-DNA tragen, zu identifizieren. Bei der Selektion von Kalli mittels Kanamycin ist ein Schritt mit Licht in einem Kulturraum notwendig. Das Antibiotikum hemmt nämlich die Peptidsynthese in den Mitochondrien und den Chloroplasten. Die Hemmung beruht auf der Ähnlichkeit zwischen der Proteinsynthese dieser Organellen und der Proteinsynthese der Bakterien. Die pflanzlichen Zellen vertragen daher im allgemeinen Aminoglycoside wie Kanamycin oder Gentamycin nicht. In einer relativ niedrigen Dosis wirkt Kanamycin jedoch nicht vernichtend und ermöglicht eine Selektion aufgrund des kolorimetrischen Phänotyps: die resistenten Kalli, die das nptII-Gen aufweisen, ergrünen, wenn sie dem Licht ausgesetzt werden (die funktionsfähigen Chloroplasten häufen Chlorophyll an), während die sensitiven Kalli gelb bleiben.
  • Mit diesem Selektionsschritt kann man die Kalli, die die T-DNA und das Element Ds::nptII aufweisen, identifizieren und die Kalli, die in ihrem Genom nur die Komponente R-nj::Ac aufweisen (bei homozygotem Transposase-Ausgangsmaterial) ausmerzen.
  • b) Vermehrung von resistenten Kalli auf nichtselektivem Medium
  • Die Teile der resistenten Kalli, die verdoppelt und auf nichtselektives Medium gegeben worden sind, werden im Dunklen kultiviert. Es findet also eine Vermehrung von Zellen statt, die beide Komponenten enthalten. Während dieser Vermehrung wird eine Transposaseproduktion stattfinden und eine gewisse Anzahl Zellen wird aus Exzisionsereignissen des Elements Ds::nptII aus der T-DNA entstehen. Diese Zellen werden bei ihrer Vermehrung zur Bildung von chimären Kalli, die aus Abschnitten mit somatischer Exzision von Ds::nptII und aus Abschnitten ohne Exzision bestehen, führen.
  • Die Kalli werden anschließend eine Woche lang ins Licht gestellt. Die gelben Teile werden grob isoliert.
  • c) Regeneration von Pflänzchen aus einem Exzisionsabschnitt
  • Die Enden von isolierten Kalli werden auf einem nichtselektiven Medium in einem Kulturraum bei Licht regenerieren gelassen. Es werden also Pflanzen aus unterschiedlichen embryogenen Teilen, möglicherweise aus einem Abschnitt mit Exzision des Elements Ds::nptII, regeneriert.
  • d) Untersuchung von sensitiven Pflanzen auf Exzision in der Keimbahn
  • Wenn die Pflanzen das 3-Blatt-Stadium erreicht haben, werden sie mit einer Kanamycinsulfatlösung behandelt. Bei den Pflanzen mit chlorotischen Abschnitten handelt es sich also um Pflanzen, die gegenüber dem Selektionsmittel empfindlich sind und die aus einem ursprünglich resistenten Kallus hervorgegangen sind. Unter den geprüften Pflanzen haben sich gewisse Pflanzen, die aus demselben Embryo entstanden sind, als empfindlich gegenüber Kanamycin erwiesen.
  • PCR- und Southern-Analysen haben nämlich gezeigt, daß sich das Element Ds::nptII aus seiner ursprünglichen Umgebung herausgespleißt hat und sich nicht wieder neu insertiert hat. Die Exzisionsfrequenz wird daher aufgrund der Kalluskultur beträchtlich erhöht und erreicht 8% der so regenerierten Pflanzen.
  • Bei den auf reproduktivem Weg und auf vegetativem Weg erzeugten Pflanzen wurde eine Sequenzierung der auf der T-DNA durch Exzision des Elements Ds::nptII hinterlassenen Exzisionsstellen durchgeführt. Die Analyse der erhaltenen Sequenzen zeigt, daß gewisse Pflanzen, die auf reproduktivem Weg erhalten wurden, aus zwei unterschiedlichen Exzisionsereignissen in der Keimbahn hervorgegangen sind, obwohl sie aus der selben Kreuzung hervorgegangen sind. Im Gegensatz dazu sind die Exzisionsstellensequenzen bei den mittels Kallusbildung erhaltenen Pflanzen identisch. Dies bestätigt, daß diese Pflanzen aus demselben Exzisionsereignis hervorgegangen sind.
  • 3.3 Verbessertes Verfahren zur Selektion von Exzisionsereignissen in der Keimbahn in der F1-Generation
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Expressionskassette, die eine für einen Selektionsmarker (ii) codierende Nukleotidsequenz enthält, auch innerhalb des Elements Ds noch ein anderes phänotypisches Markergen des Typs zerstörungsfreies Reportergen. Bei diesem Reportergen kann es sich zum Beispiel um das Gen handeln, das für ein grün fluoreszierendes Protein GFP codiert (Nielsen et al., 1999), bei dem der Nachweis der Expression in den Geweben zerstörungsfrei ist: Die Beobachtung erfolgt unter dem Ablesemikroskop, das mit einer Beleuchtung mit einer spezifischen Wellenlänge ausgestattet ist. Wenn das Element Ds sich herausspleißt, ist das GFP-Gen nicht mehr vorhanden, und die Abschnitte mit somatischer Exzision können, da sie nicht mehr fluoreszieren, unter dem "GFP-Ablesemikroskop" ausgemacht werden.
  • Im Rahmen dieses Beispiels leitet sich das Plasmid pBios491 von dem in Beispiel 1a beschriebenen Plasmid pBios340 (Ds:nptII) durch eine Insertion einer Expressionskassette, die den CsVMV-Promoter des "cassava mosaic vein virus" (WO 97/48819), das erste Intron des Actin-l-Gens des Reises, das offene GFP-Leseraster (Nielsen et al., 1999) und den Nos- Terminator enthält, in das Element Ds im selben Leseraster wie die NptII-Kassette ab.
  • Ds::GFP-nptII weist eine Größe von 5473 Bp auf (Figur Nr. 5).
  • Wie in Beispiel 3.1 und 3.2 beschrieben kann die Selektion von Exzisionsereignissen in der Keimbahn unter Durchführung der folgenden Schritte erfolgen:
    • – die T1-Embryonen, die aus der Kreuzung zwischen den Transformanten mit der Kassette interessierendes Gen – Ds::MS und dem Transposaseausgangsmaterial hervorgehen, werden 10 Tage nach der Bestäubung gewonnen,
    • – diese Embryonen werden herausseziert und auf einem nichtselektiven Kallusbildungsmedium im Dunkeln 15 bis 30 Tage lang kultiviert,
    • – die Kalli werden nun unter dem GFP-Ablesemikroskop beobachtet, und der nichtfluoreszierende Teil des Kallus, der Abschnitten mit somatischer Exzision entspricht, wird nun für die Vermehrung und regeneration der Pflanze herausseziert. Die so hergestellten Pflanzen enthalten das interessierende Gen ohne zusätzliche Feinsequenz.
  • Dieser Vektor Ds::GFP-MS ist daher für die Erfindung von mehrfacher Bedeutung, nämlich:
    • – die Identifikation von unreifen F1-Embryonen, die das Transgen tragen und die fluoreszieren, erfolgt durch einfache visuelle Beobachtung unter dem GFP-Ablesemikroskop;
    • – die Kallusbildung aus selektierten Embryonen kann auf einem nichtselektiven Medium erfolgen, um zahlreiche Kallusausgangsstellen zu induzieren und so Ausgangsstellen von Zonen mit somatischer Exzision, denen des Selektionsgen fehlt, zu begünstigen.
    • – die Selektion von Kalli, die aus Zellen, bei denen eine somatische Exzision stattgefunden hat, hervorgegangen sind, wird unter dem Fluoreszenz-Ablesemikroskop erleichtert; außerdem können diese Kalli direkt und präzise herausseziert werden, um regeneriert zu werden
    • – sobald die Pflanzen regeneriert sind, kann das Fehlen von Fluoreszenz (somatische Exzision) ebenfalls bestätigt werden.
  • 4. Erzeugung von pollensterilen Pflanzen ohne Kanamycinmarkergen
  • 4.1 Erzeugung von A9-Barnase-Ds::nptII – Konstrukten
  • Das Plasmid pBios424 leitet sich von dem in Beispiel 1a beschriebenen Plasmid pBios340 durch Insertion der "interessierendes Gen"-Kassette, die den A9-Promoter (WO 92 11379), der der nichtcodierenden 5'-gelegenen Region des A9-Gens von Arabidopsis thaliana entspricht, das offene Leseraster des Barnasegens (Hartley, 1988; Gene Bank Nr. X 12871) und den 3'-Terminator von CaMV (Franck et al. 1980; Gene Bank Nr. V 00141) enthält, außerhalb des Elements Ds ab. Das Barnase-Gen, das Pollensterilität vermittelt, codiert für eine Ribonuklease (RNase). Dieses Gen wurde aus Bacillus amyloliquefasciens isoliert und ist in der Arbeit von Hartley (1988) beschrieben.
  • Das Konstrukt A9-Barnase-Ds::nptII weist eine Größe von 12495 Bp auf (6).
  • Das für die Transformation verwendete superbinäre Plasmid pRec424 wird durch homologe Rekombination zwischen einem vom Plasmid pBios424 abgeleiteten Zwischenvektor und dem Vektor pSB1 von Japan Tobacco ( EP 672 752 ) erhalten, wie dies in Beispiel 1b beschrieben ist.
  • 4.2 Selektion von resistenten Transformanten und molekulare Analyse
  • Es wurden 7 Transformationsereignisse erzeugt, von denen 5 als pollensteril (A9-Barnase) und Kanamycinresistent (NptII) selektiert wurden.
  • Zur Bestimmung der einfachen Insertionen wurde mit diesen Ereignissen eine molekulare Analyse durchgeführt. Mit dieser Analyse kann man die Transformationsereignisse charakterisieren, die bezüglich der Kopienzahl der integrierten T-DNA und der Anzahl der verwendeten Integrationsloci erhalten geblieben sind. Für diesen Zweck verwendet man unterschiedliche molekulare Sonden.
  • Die genomische DNA der Pflanzen wurde mit dem Restriktionsenzym NocI verdaut, mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nylonmembran (Hybond N+ Membranen) übertragen, um diese mit den verschiedenen molekularen Sonden zu hybridisieren.
  • Auswahl der molekularen Sonden:
    • • Mit den Sonden Promoter A9 (5007, SEQ ID NO:7), Barnase (S032, SEQ ID NO:8), Actin-Intron, die mit der enzymatischen Restriktion mit NcoI gekoppelt ist, kann man das molekulare Profil der Transformationsereignisse charakterisieren.
    • • Da die Sequenz des Basisplasmids bekannt ist, wurden Oligonukleotidpaare, die für Plasmidregionen außerhalb der T-DNA spezifisch sind, synthetisiert und anschließend als Primer verwendet, um mittels PCR eine Sonde für außerhalb der rechten Border (RB) und eine Sonde für außerhalb der linken Border (LB) zu erzeugen. Rechts wurde mittels PCR-Amplifikation 40 Basenpaare von der rechten Border eine 353 Basenpaare große Sonde erzeugt und links 29 Basenpaare von der linken Border eine Sonde mit 299 Basenpaaren. Die "Sonde für außerhalb der Border" genannte Sonde besteht aus der Mischung der beiden oben genannten Sonden. Damit lassen sich diejenigen Pflanzen ausfindig machen, die keine Integration von Plasmidregionen in der Nähe der T-DNA aufweisen.
  • Die Größe der nach der Hybridisierung mit den unterschiedlichen Sonden für eine einmalig auftretende Insertion einer nicht verkürzten T-DNA erwarteten Signale ist, wenn die Border nicht überschritten wird, folgendermaßen:
    Figure 00460001
  • Die Bilanz der an den Primärtransformanten beobachteten Signale zeigt, daß die 5 Ereignisse einfache Insertionsprofile (1 oder 2 Kopien) aufweisen.
  • 4.3 Kreuzung mit einer R-nj::Ac-Linie und Selektion von Ereignissen mit Exzision des Ds::MS-Elements
  • Die Primärtransformanten mit einfachen Insertionsprofilen wurden mit dem für das Allel Rnj-Ac homozygoten Transposaseausgangsmaterial, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist, gekreuzt.
  • Die Embryonen, der der T1- (bzw. F1-) Generation entsprechen, wurden 15 Tage nach der Befruchtung entnommen und in vitro auf Kulturmedium mit 50 mg Kanamycin kultiviert.
  • Mit einer PCR-Analyse mit entsprechenden Oligonukleotiden kann überprüft werden, ob diese somatischen Exzisionsereignisse in den selektierten T1-Organismen stattgefunden haben.
  • Mit DNA-Proben der T0- und T1-Pflanzen wurde eine PCR-Amplifikation mit den Oligonukleotiden Barn5 (SEQ ID NO:6) und EM11 (SEQ ID NO:5) durchgeführt. Wenn Ds::nptII sich aus der T-DNA herausgespleißt hat, kann ein 760 Bp großes Fragment amplifiziert werden. Wenn es sich nicht herausgespleißt hat, so erscheint das 4160 Bp große Fragment, daß amplifiziert werden müßte, nicht unter diesen PCR-Bedingungen. Die 760 Bp große Amplifikationsbande, die die Exzision von Ds::nptII anzeigt, ist bei den meisten Proben der T1-Pflanzen, jedoch nicht bei den T0-Pflanzen, vorhanden. Bei den T0-Pflanzen wurde keinerlei somatische Exzision nachgewiesen, was zeigt, daß die Exzision gut unter Kontrolle ist. Das Elektrophoresegel wurde auf eine Nylonmembran übertragen um zur Bestätigung der Identität des amplifizierten Fragments mit einer CaMV-3'-Sonde hybridisiert zu werden.
  • Mit den PCR-Versuchen konnte also das Vorliegen einer somatischen Exzision in den meisten T1-Pflanzen mit den zwei Bestandteilen Ds::nptII und Transposase gut bestätigt werden.
  • Nach der in-vitro-Kultur werden die T1-Pflanzen im Phytotron und anschließend im Gewächshaus abgehärtet. Zum Blütezeitpunkt werden die selektierten T1-Pflanzen mit einer Elitelinie, die als eine in zu einem gegebenen Zeitraum kommerziell wichtige, agronomisch wertvolle Linie definiert wird, gekreuzt. Exzisionsereignisse in der Keimbahn können gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch aufgefunden werden, daß man eine große Anzahl von F2-Organismen, die aus diesen T1-Linien hervorgehen, durchmustert.
  • Für den Nachweis der Exzision der Elemente Ds::Bar und Ds::npt II verwendete Primer
    Figure 00470001
    Figure 00480001
  • Für den Nachweis der Ds::nptII-Tranformanten verwendete Primer
    Figure 00480002
  • Die für die Southern-Blots verwendeten Sonden sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
    Figure 00480003
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001

Claims (13)

  1. Verfahren zur Herstellung einer monokotylen Pflanze, welche ein gewünschtes Gen (i) ohne zusätzliche Fremdsequenz enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Transformation von mindestens einer Pflanzenzelle ohne aktiver Transposase mit einem Vektor, der zwei Expressionskassetten enthält, wobei die eine eine gewünschte Nukleotidsequenz (i) enthält und die andere eine Nukleotidsequenz enthält, die für einen Selektionsmarker (ii) codiert und die von den mobilisierbaren Sequenzen eines Transposons eingerahmt ist, wobei die Expressionskassette, die eine gewünschte Nukleotidsequenz (i) enthält, außerhalb des Transposonelements liegt; b) Selektion von transformierten Pflanzen mit dem Selektionsmarker (ii); c) Kreuzen einer transformierten Pflanze mit einer anderen Pflanze, die zu einer Linie gehört, die in ihrem Genom ein Gen enthält, das für eine endogene aktive Transposase codiert und das innerhalb eines phänotypischen Exzisionsmarkers (iii) liegt, wodurch man zu einer F1 oder eines sonstigen Einzelorganismus einer Folgegeneration gelangt; d) Selektion von Zellen oder Einzelorganismen, die das gewünschte Gen ohne zusätzliche Fremdsequenz enthalten, wobei von der F1-Generation ausgegangen wird; e) Regeneration von Pflanzen aus dem in (d) selektierten Zellen oder Einzelorganismen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zusätzlichen Fremdsequenzen für ein Selektionsmarkergen (ii) codieren, das eine Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein Herbizid vermittelt, wie das nptII-Gen oder das bar-Gen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zusätzlichen Fremdsequenzen für ein phänotypisches Markergen (ii) codieren.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die mobilisierbaren Transposonsequenzen zusätzlich zu der Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz, die für einen Selektionsmarker (ii) codiert, enthält, eine zweite Expressionskassette, die eine Nukleotidsequenz, die für ein Reportergen für die nichtdestruktive Selektion codiert, enthält, einrahmen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Nukleotidsequenz, die für ein Reportergen für die nichtdestruktive Selektion codiert, für ein GFP codiert.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei der transgenen monokotylen Pflanze um eine Maispflanze handelt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei dem Transposonsystem um das Ac/Ds-System handelt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei den Einzelorganismen im Schritt (d) um F1-Pflanzen, F2-Pflanzen oder Kalli handeln kann.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die transformierte Pflanze zur Linie A188 gehört.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem die transformierte Pflanze im Schritt (c) mit einer anderen Pflanze gekreuzt wird, in der sich das aktive Ac-Element in einer Chromosonenregion befindet, sodaß sich die Exzision dieses Ac-Elements durch Produktion von anthozyanhaltigen Abschnitten im Kronenteil des Korns, darunter auch den Embryo, ausdrückt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei diese Selektion von Einzelorganismen in Schritt (d) auf reproduktivem Weg erfolgt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: – Selektion von panaschierten F1-Körnern; – Selektion von somatischen Exzisionsereignissen des defektiven Ds-Typ-Transposonelements, das das Selektionsgen enthält (mit der Bezeichnung Ds::M), mittels PCR-Technik; – Selektion von Exzisionsereignissen des Ds::M-Elements aus der Keimbahn; – Gewinnung von Samen von F2-Pflanzen ausgehend von diesen Ereignissen.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der die Selektion von Einzelorganismen in Schritt (d) auf vegetativem Weg erfolgt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: – Produktion von Kalli aus unreifen F1-Embryonen, – optische Selektion von Kalli, die die T-DNA und das defektive Ds-Typ-Transposonelement, das das Selektionsgen enthält (mit der Bezeichnung Ds::M), enthalten, – Vermehrung der Kalli und Suche nach Abschnitten, in denen eine Exzision des Elements Ds::M stattgefunden hat, – Regeneration von F1-Pflanzen aus diesen Exzisionssektoren.
  13. Verfahren nach Anspruch 10 zur Gewinnung von F1-Pflanzen, die direkt ausgehend von selektierten Kalli regeneriert werden, und zwar mittels in-vitro-Kultur von unreifen Embryonen von F1-Ähren.
DE60215938T 2001-06-11 2002-05-16 Verfahren zur herstellung einer monokotylen pflanze, welche ein gewünschtes gen ohne fremdsequenzen enthält Expired - Lifetime DE60215938T2 (de)

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