DE69730984T2

DE69730984T2 - Promotor aus tabak

Info

Publication number: DE69730984T2
Application number: DE69730984T
Authority: DE
Inventors: Pierre Fobert; N. Venkatram IYER; Brian Miki; Jiro Hattori; Helène LABBE; Therèse OUELLET; Eva Elizabeth JAMES; Elizabeth Foster-Atkinson
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC; Carleton University
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC; Carleton University
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2017-02-01
Also published as: DE69730984D1; EP0938572B1; ATE278027T1; NZ326284A; AR005688A1; AU713340B2; CN1214736A; ES2229327T3; CO4930312A1; AU1434797A; WO1997028268A1; EP0938572A1; JP2001501804A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor, der in Nicotiana tabacum (Tabakpflanze) identifiziert wurde. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Promotors, um die Expression von exogenen DNAs in transgenen Pflanzen verschiedener Pflanzenspezies zu kontrollieren.
Hintergrund der Erfindung
Bakterien der Gattung Agrobacterium können spezifische DNA-Segmente (T-DNA) in Pflanzenzellen transferieren, wo sie stabil in die im Kern befindlichen Chromosomen integrieren. Analysen von Pflanzen, die T-DNA tragen, zeigten, dass dieses genetische Element an verschiedenen Stellen integriert sein kann und gelegentlich auch innerhalb von Genen gefunden wird. Eine Strategie, die unternommen wurde, um Integrationsereignisse innerhalb von Genen zu identifizieren war es, Pflanzenzellen mit speziell designten T-DNA-Vektoren zu transformieren, welche am Ende der T-DNA ein Reportergen enthalten, welches keine cis-wirkenden transkriptionalen und translationalen Expressionssignale umfasst (d. h. keinen Promotor besaß). Nach Integration wird der Startkodon des promotorlosen Gens (des Reportergens) neben den Pflanzensequenzen liegen. Konsequenz einer T-DNA-Insertion in Nachbarschaft zu bzw. downstream von Genpromotorelementen kann die Aktivierung der Expression eines Reporter – Gens sein. Die resultierende hybriden Gene, die im Weiteren T-DNA – vermittelte Genfusionen genannt werden, bestehen aus unbekannten und daher nicht charakterisierten Pflanzenpromotoren, die an ihrer natürlichen Stelle auf dem Chromosom liegen, und der kodierenden Sequenz eines Markergens, welche auf der insertierten T-DNA liegt (Fobert et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17, 837–851).
Es wurde im Allgemeinen angenommen, dass die Aktivierung von Markergenen, die entweder keinen Promotor oder keine Verstärkerelemente aufwiesen, aus T-DNA-Insertionen innerhalb oder unmittelbar in Nachbarschaft zu Genen resultiert. Die kürzliche Isolierung von einigen T-DNA-Insertionsmutanten (Koncz et al., 1992, Plant Mol. Biol. 20, 963–976; zusammengefasst in Feldmann, 1991, Plant J. 1, 71–82; Van Lijsebettens et al., 1991, Plant Sci. 80, 27–37; Walden et al., 1991, Plant J. 1, 281–288; Yanofsky et al., 1990, Nature 346, 35–39) zeigt, dass dies für mindestens einige Insertionen der Fall ist. Es gibt jedoch weitere Möglichkeiten. Eine dieser Möglichkeiten ist es, dass die Integration der T-DNA stille Regulationssequenzen aktiviert, die nicht mit Genen assoziiert sind. Lindsey et al. (1993, Transgenic Res. 2, 33–47) bezeichnet solche Sequenzen als "Pseudo-Promotoren" und schlug vor, dass sie für die Aktivierung von Markergenen bei manchen transgenen Linien verantwortlich sind. Fobert et al. (1994, Plant J. 6, 567–577) haben solche Sequenzen 2 und bezeichnen diese als "kryptische Promotoren".
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen aus Nicotiana tabacum (Tabakpflanze) identifizierten Promotor.
Die transgene Tabakpflanze T1275 enthielt ein 4,38 kb EcoRI/XbaI-Fragment, welches das promotorlose 2,15 kb lange GUS-nos-Gen und 2,23 kb einer 5'flankierenden DNA aus Tabak umfasste (2225 bp). Die 5'flankierende DNA zeigte keine Homologie zu bekannten Sequenzen.
Daher umfasst die Erfindung einen Promotor, der dadurch charakterisiert ist, dass er mindestens eine 18 bp lange kontinuierliche Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst.
Dieser Promotor konnte mittels Southern Blot Analyse weder in Sojabohnen noch in Kartoffeln, Sonnenblume, Arabidopsis, B. napus, B. oleracea, Mais, Weizen oder Schwarzfichte nachgewiesen werden. Die Expression des klonierten Frag ments in transgenem Tabak, N. tabacum c. v. Petit Havana, SRI und transgenem B. napus c. v. Westar wurde in Blättern, Stängeln, Wurzeln, Fruchtknoten und Blüte beobachtet. Mittels einer Analyse der transienten Expression wurde die GUS-Aktivität auch im Blattgewebe von Sojabohnen, Alfalfa, Arabidopsis, Tabak, B. napus, Erbse und Zellen von Suspensionskulturen aus Hafer, Mais, Weizen und Gerste gefunden.
Die Erfindung stellt daher auch einen konstitutiven Promotor bereit. Außerdem funktioniert dieser Promotor in verschiedenen Pflanzenspezies, wenn er in einen Kloniervektor eingeführt wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso einen konstitutiven Promotor, der eine DNA-Sequenz aufweist, die im Wesentlichen homolog ist zu SEQ ID NO: 1.
Die Transkriptionsstartstelle für das eingeführte GUS-Gen in dem transgenen Tabak lag in der Pflanzen-DNA stromaufwärts von der Insertionsstelle. Sie war identisch in Blättern, Stängel, Wurzel, Samen und Blüte. Weiterhin war die native Stelle sowohl bei untransformiertem als auch bei transgenem Tabak still.
Daher wird erfindungsgemäß ein konstitutiver Promotor aus Tabak zur Verfügung gestellt, welcher kryptisch ist und der in verschiedenen Pflanzenspezies funktioniert, wenn er in einen Kloniervektor eingeführt wird.
Die Erfindung betrifft ebenso ein chimäres Genkonstrukt, welches eine DNA umfasst, welche konstitutiv exprimiert werden soll, und einen konstitutiven Promotor, der mindestens eine 18 bp lange kontinuierliche Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kloniervektor, welcher das chimäre Genkonstrukt umfasst.
Die Erfindung umfasst ebenso eine Pflanzenzelle, die mit dem chimären Gen oder dem Kloniervektor transformiert worden ist. Weiterhin umfasst die Erfindung transgene Pflanzen, die das chimäre Gen enthalten, oder den Kloniervektor.
Die Erfindung betrifft weiterhin jede transgene Pflanze, die einen konstitutiven Promotor mit einer DNA-Sequenz besitzt, die im Wesentlichen homolog ist zu SEQ ID NO: 1, und operativ mit einer DNA-Region verbunden ist, die in RNA transkribiert wird.
Ebenso beinhaltet die vorliegende Erfindung ein Verfahren, die konstitutive Expression eines Gens in einer Pflanze zu vermitteln, umfassend: operative Verbindung einer exogenen DNA, welche konstitutiv exprimiert werden soll, mit einem konstitutiven Promotor, der mindestens eine 18 bp lange kontinuierliche Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst, wodurch ein chimäres Genkonstrukt hervorgebracht wird, sowie die Überführung des chimären Genkonstrukts in eine Pflanze, welche fähig ist, das chimäre Genkonstrukt zu exprimieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Eigenschaften der Erfindung werden noch klarer aus der folgenden Beschreibung, in der auf die angefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, worin:
1 die konstitutive Expression von GUS in allen Geweben der Pflanze T1275 einschließlich von Blattabschnitten (a), Querschnitten des Stängels (b), Wurzel (c), Querschnitten von Blüten (d), Querschnitten des Samenstands (e), nicht ausgereiften Embryonen (f), reife Embryonen (g) und Querschnitten von Samen (h) zeigt.
2 die spezifische GUS-Aktivität zeigt, wobei deutlich wird, dass der Spiegel der GUS-Expression in T1275 vergleichbar ist mit den Spiegeln in Pflanzen, die CaMV 35S-GUS-nos-Gene in Blattgeweben exprimieren.
3 zeigte eine Southern Blot Analyse von mit Eco-R1-verdauter T1275 DNA mit einer Sonde aus der für das GUS-Gen kodierenden Region (Spur 1) und einer Sonde aus der für das nptII Gen kodierenden Region (Spur 2), welche zeigt, dass in der Pflanze T1275 eine einzelne T-DNA Insertionsstelle vorliegt.
4 zeigt das klonierte Fusionskonstrukt des GUS Gens aus pT1275. Der Pfeil zeigt die Startstelle der GUS mRNA innerhalb der Pflanzen DNA Sequenz.
5 zeigt die Restriktionskarte der isolierten Pflanzen DNA Sequenz. Der Pfeil zeigt die GUS mRNA Startstelle innerhalb der Pflanzen DNA Sequenz.
6 zeigt, dass die spezifische Aktivität der GUS in Blättern von zufällig ausgewählten individuellen, regenerierten und im Gewächshaus gezogenen Tabakpflanzen variiert, und im Allgemeinen mit dem Spiegel an GUS mRNA korreliert, welcher durch RNase protection assay sowie Densitometrie der Autoradiogramms (6B) gemessen wird.
7 zeigt, dass der nativen Pflanzensequenz entsprechende Transkripte in situ in Blättern von nicht transformierten (Spur U) oder transgenen (Spur T25) Tabakpflanzen nicht akkumulieren (3), während Transkripte, die der gleichen Pflanzensequenz entsprechen, wobei die Pflanzensequenz mit dem GUS Gen fusioniert ist und auf der in die transgene Pflanze T25 insertierten T-DNA liegt (Spur T25), in dem gezeigten geschützten Fragment vorhanden sind (2). Die unverdaute Probe (1) wird in Spur P als Kontrolle gezeigt.
BESCHREIBUNG EINES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
Die vorliegende Erfindung betrifft regulatorische Sequenzen eines Pflanzengens. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Promotor, welcher mit Hilfe von T-DNA mit einem promotorlosen β-Glucuronidase Gen (GUS) identifiziert wurde, wobei eine transgene N. tabacum Pflanze gebildet wurde, die konstitutiv GUS Aktivität exprimiert.
Die Erfindung betrifft ebenso einen Promotor, der eine Nukleotid Sequenz aus mindestens 18 aufeinander folgenden Basenpaaren aus SEQ ID NO: 1 umfasst. 18 bp lange oder längere Oligonukleotide können für die Konstruktion von heterologen Promotoren, welche Fragmente des SEQ ID NO: 1 definierten Promotors umfassen, verwendet werden. Die Verwendung von solchen heterologen Promotoren ist in der Literatur gut etabliert. Beispielsweise wurden Fragmente spezifischer Elemente innerhalb des 35S CaMV Promotors dupliziert oder mit anderen Promotorfragmenten kombiniert, um chimäre Promotoren mit gewünschten Eigenschaften herzustellen (z. B. U.S. 5, 491, 288, 5, 424, 200, 5, 322, 938, 5, 196, 525, 5, 164, 316). Außerdem sind Oligonukleotide, die 18 bp oder länger sind, als Sonden oder PCR Primer für die Identifizierung oder die Amplifizierung von verwandten DNA oder RNA Sequenzen aus anderen Geweben oder Organismen verwendbar.
Im Zusammenhang dieser Offenbarung betrifft der Ausdruck "Promotor" oder "Promotorregion" eine DNA Sequenz, die gewöhnlicherweise stromaufwärts (5') zu der kodierenden Sequenz eines Strukturgens liegt, und welche die Expression der kodierenden Region durch Bereitstellen der Erkennungsstelle für die RNA Polymerase und/oder anderen Faktoren, die nötig sind, um die Transkription an einer bestimmten Stelle beginnen zu lassen, kontrolliert.
Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Promotoren, induzierbare und konstitutive Promotoren. Ein induzierbarer Promotor ist ein solcher Promotor, der fähig ist, die Transkription einer oder mehrerer DNA Sequenzen oder Genen in Antwort auf einen Induktor direkt oder indirekt zu aktivieren. In Abwesenheit eines Induktors werden die DNA Sequenzen oder Gene nicht transkribiert. Typischerweise wird der Proteinfaktor, der spezifisch an den induzierbaren Promotor bindet, um die Transkription zu aktivieren, in einer inaktiven Form vorhanden sein, welche direkt oder indirekt durch den Induktor in die aktive Form umgewandelt wird. Der Induktor kann ein chemisches Mittel wie beispielsweise ein Protein, ein Metabolit, ein Wachstumsregulationsmittel, ein Herbizid oder eine phenolische Verbindung sein oder es kann sich um physiologischen Stress handeln, der direkt durch Hitze, Kälte, Salz oder toxische Elemente verursacht wird, oder indirekt durch die Wirkung eines Pathogens oder eines Krankheitserregers wie einem Virus. Eine Pflanzenzelle, die einen induzierbaren Promotor enthält, kann dem Induktor ausgesetzt werden, indem der Induktor extern auf die Zelle oder die Pflanze, etwa durch Aufsprühen, Wässern, Erhitzen oder ähnliche Verfahren, aufgebracht wird.
Ein konstitutiver Promotor steuert die Expression eines Gens in verschiedenen Teilen einer Pflanze und während der Pflanzenentwicklung kontinuierlich. Beispiele für bekannte konstitutive Promotoren umfassen solche, die mit dem CaMV 35S Transkript (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810–812), dem Reis Actin 1 (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155–1165) den Triosephosphat Isomerase 1 Genen (Xu et al., 1994, Plant Physiol, 106: 459–467), dem Mais Ubiquitin 1 Gen (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637–646), dem Arabidopsis Ubiquitin 1 und 6 Genen (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637–646), und dem Gen für den Translations Initations Faktor 4A aus Tabak (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995–1004) assoziierrt sind. Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA Sequenz, welche einen Promotor enthält, der fähig ist, die Expression eines Gens zu steuern. Vorzugsweise ist dieser Promotor ein konstitutiver Promotor isoliert aus N. tabacum.
Der Begriff "konstitutiv" wie er vorliegend verwendet wird, bedeutet nicht unbedingt, dass ein Gen im selben Ausmaß in allen Zelltypen exprimiert wird, sondern dass das Gen in einem weiten Bereich von Zelltypen exprimiert wird, obwohl eine gewisse Abweichung der Abundanz häufig beobachtet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein chimäres Gen Konstrukt, welches die experimentelle DNA operativ mit dem erfindungsgemäßen Promotor verbunden enthält. Jedwedes exogene Gen kann erfindungsgemäß verwendet und verändert werden, um die Expression dieses exogenen Gens zu bewirken. Eine experimentelle DNA kann ein Gen umfassen, welches für ein Protein kodiert, eine DNA, welche transkribiert wird, um eine anti-sense RNA herzustellen, oder ein Transkriptionsprodukt, das auf bestimmte Art und Weise wirkt, und die Expression anderer DNAs hervorruft, beispielsweise welches eine Kosuppression von anderen DNAs oder Ähnliches hervorruft, ist jedoch hierauf nicht begrenzt.
Das chimäre Gen Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine 3' nicht translatierte Region umfassen. Eine 3' nicht translatierte Region betrifft die Region eines Gens, welche ein DNA Segment das ein Polyadenylierungssignal und andere regulatorische Signale, die fähig sind, die Prozessierung einer mRNA oder die Genexpression zu beeinflussen, umfasst. Das Polyadenylierungssignal wird normalerweise dadurch charakterisiert, dass es das Hinzufügen eines Polyadenylsäureschwanzes an das 3'-Ende des mRNA Vorläufers bewirkt. Polyadenylierungssignale werden im Allgemeinen dadurch erkannt, dass eine Homologie zu der kanonischen Form 5'-AATAAA-3' auftritt, obwohl Abweichungen davon nicht ungewöhnlich sind.
Beispiele für geeignete 3'-Regionen sind die 3'-transkribierten, nicht translatierten Regionen, welche das Polyadenylisierungssignal aus Agrobakterium Tumor induzierenden (Ti) Plasmidgenen umfassen, beispielsweise wie die Nopalinsynthase (Nos Gen) und Pflanzengene wie die Sojabohnenspeicherprotein-Gene und die Gene für die kleine Unterreinheit der Ribulose-1, 5-Bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO). Die 3' nicht translatierte Region aus dem Strukturgen des vorliegenden Konstrukts kann daher verwendet werden, um chimäre Gene für die Expression in Pflanzen zu konstruieren.
Das chimäre Gen-Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann weiterhin weitere Verstärker je nach Bedarf umfassen, entweder Translations- oder Transkriptionsverstärker. Diese Verstärkerregionen sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen das ATG Startkodon und benachbarte Sequenzen. Das Startkodon muss "in phase" mit dem Leserahmen der kodierenden Sequenz liegen, um die Translation der vollständigen Sequenz sicherzustellen. Die Translationskontrollsignale und die Startkodons können aus unterschiedlichen Ursprüngen stammen, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Die Translationsinitiierungsregionen können von der Quelle der Transkriptionsinitiierungsregion stammen oder von dem Strukturgen. Die Sequenz kann ebenso von dem Promotor stammen, der ausgewählt wurde, um das Gen zu exprimieren, und kann spezifisch modifiziert sein, um beispielsweise die Translation der mRNA zu erhöhen.
Um die Identifizierung von transformierten Pflanzenzellen zu erleichtern, können die Konstrukte der vorliegenden Erfindung weiterhin so ausgestaltet sein, dass sie selektierbare Pflanzenmarker umfassen. Verwendbare selektierbare Marker umfassen Enzyme, welche eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum wie Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin und Ähnlichen verleiht. Gleichermaßen sind Enzyme verwendbar, die die Produktion einer Verbindung vermitteln, die über einen Farbwechsel identifizierbar ist, wie beispielsweise die GUS (β-Glucuronidase) oder Lumineszens, wie beispielsweise die Luciferase.
Ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung werden transgene Pflanzen angesehen, die das chimäre Genkonstrukt einschließlich des Promotor der vorliegenden Erfindung umfassen. Verfahren zur Regenerierung von vollständigen Pflanzen aus Pflanzenzellen sind auf dem Fachgebiet bekannt, und das Verfahren zum Erhalten von transformierten und regenerierten Pflanzen stellt daher kein Problem der vorliegenden Erfindung dar. Im Allgemeinen werden transformierte Pflanzenzellen in einem geeigneten Medium kultiviert, das selektive Mittel wie Antibiotika enthalten kann, und wobei selektierbare Marker verwendet werden, um die Identifizierung von transformierten Pflanzenzellen zu ermöglichen. Sobald ein Kallus vorliegt, kann die Sprossbildung in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren durch Einsatz von geeigneten Pflanzenhormonen induziert werden, und die Sprösslinge werden dann in ein Auswurzelmedium zur Regenerierung von vollständigen Pflanzen überführt. Die Pflanzen können dann verwendet werden, um aufeinander folgende Generationen zu etablieren, entweder aus den Samen oder unter Verwendung von vegetativen Vermehrungstechniken.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, der direkten DNA-Transformation, der Mikro-Injektion, der Elektroporation, usw. eingeführt werden. Für eine Zusammenfassung solcher Verfahren siehe beispielsweise Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421–463 (1988); und Geierson und Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988). Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin einen geeigneten Vektor, welcher das chimäre Genkonstrukt umfasst.
Wenn in vorliegender Erfindung auf spezifische Sequenzen Bezug genommen wird, wird davon ausgegangen, dass diese Sequenzen auch solche Sequenzen umfassen, die "im Wesentlichen homolog sind" zu diesen spezifischen Sequenzen. "Im Wesentlichen homologe" Sequenzen sind solche, welche mindestens etwa 70%, vorzugsweise mindestens etwa 80%, und besonders bevorzugt mindestens etwa 90% Nukleotid-Identität über eine definierte Länge des Moleküls zeigen. "Im Wesentlichen homologe" Sequenzen umfassen jedwede Substitution, Deletion oder jeden Zusatz innerhalb der Sequenz. DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Hybridisierungsexperimente nach Southern identifiziert werden, beispielsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory) (1982) S. 387 bis 389).
Die in der vorliegenden Erfindung so bezeichneten spezifischen Sequenzen umfassen ebenfalls solche Sequenzen, die "funktionell äquivalent" zu den spezifischen Sequenzen sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beziehen sich funktionell äquivalente Sequenzen auf Sequenzen, die die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Funktion bereitstellen, obwohl sie nicht identisch mit den spezifischen Sequenzen sind. Funktionell äquivalente DNA-Sequenzen umfassen jedwede Substitution, Deletion oder Zusatz innerhalb der Sequenz. Unter Bezugnahme auf die vorliegende Erfindung werden funktionell äquivalente Sequenzen die Expression eines exogenen Gens konstitutiv steuern.
Die vorliegende Erfindung wurde detailliert unter besonderer Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei diese Ausführungsbeispiele dargestellt wurden, um die Erfindung zu erläutern, nicht jedoch zu begrenzen.
BEISPIELE
Charakterisierung einer konstitutiven Promotor – GUS Fusion
Der Transfer binärer Konstrukte in Agrobacterium und die Transformation von Blattscheiben aus N. tabacum SR1 wurde wie von Fobert et al. (1991, Plant Mol. Biol. 17, 837–851) beschrieben durchgeführt. Das Pflanzengewebe wurde während der gesamten In-vitro-Kultivierung einer Konzentration von 100 μg/ml Kanamycinsulfat (Sigma) ausgesetzt.
Eine der so hergestellten transgenen Pflanzen, T1275, wurde wegen ihres hohen Spiegels an und der konstitutiven Expression von GUS für detailliertere Untersuchungen ausgewählt.
Fluorogene und histologische GUS-Tests wurden entsprechend Jefferson (Plant Mol. Biol. Rep., 1987, 5, 387–405) unter Berücksichtigung der Modifizierungen von Fobert et al. (Plant Mol. Biol., 1991, 17, 837–851) durchgeführt. Für das anfängliche Durchmustern wurden die Blätter von in-vitro-gezüchteten Pflänzchen geerntet. Später wurden neun unterschiedliche Gewebe verwendet: Blatt (L), Stängel (S), Wurzel (R), Anthere (A), Blütenblatt (Petal, P), Fruchtknoten (Ovary, O), Kelchblatt (Sepal, Se), Samen 10 Tage nach Blütezeit (S1) und Samen 20 Tage nach Blütezeit (S2) wurden von Pflanzen, die im Gewächshaus gezüchtet wurden, gesammelt und analysiert. Für eine genauere, quantitative Analyse der GUS-Aktivität wurden Blatt, Stängel und Wurzelgewebe von Kanamycinresistenter F1-Nachfolgegeneration, welche in vitro gezüchtet wurde, verwendet. Florale Gewebe wurden in den Entwicklungsstufen 8–10 (Koltunow et al., 1990, Plant Cell 2, 1201–1224) von den ursprünglichen transgenen Pflanzen geerntet. Die Blüten wurden außerdem markiert, und die sich entwickelnden Samen wurden aus den Kapseln bei 10 und 20 dpa gesammelt. In all diesen Fällen wurde das Gewebe gewogen, unmittelbar in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Die durch histologische Tests untersuchten Gewebe waren aus den gleichen Entwicklungsstadien wie die oben angegebenen. Verschiedene Handschnitte wurden für jedes Organ analysiert. Für jede Pflanze wurden pro histologischem Test mindestens 2 unterschiedliche Schnitte untersucht, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Außer für florale Organe wurden alle Gewebe in einen Phospatpuffer nach Jefferson (1987, Plant Mol. biol. Rep. 5, 387–405) mit 1 mM X-Gluc (Sigma) als Substrat getestet. Blüten wurden in demselben Puffer, enthaltend 20 (v/v) Methanol, untersucht (Kosugi et al., 1990, Plant Sci. 70, 133–140).
In der Pflanze T1275 wurde GUS-Aktivität in allen Geweben nachgewiesen. 1 zeigt die konstitutive Expression von GUS in T1275 mittels histochemischem Anfärben mit X-Gluc, einschließlich Blatt (a), Spross (b), Wurzel (c), Blüte (d), Fruchtknoten (e), Embryos (f und g) und Samen (h).
Die konstitutive GUS-Expression wurde mit Hilfe der sensitiveren fluorogenen Tests von Pflanzengeweben aus der transformierten Pflanze T1275 bestätigt. Diese Resultate sind in 2 gezeigt. Die GUS-Expression konnte in allen Gewebetypen einschließlich Blatt (L), Stängel (S), Wurzel (R), Anthere (A), Stempel (P), Fruchtknoten (O), Kelchblatt (Se), Samen nach 10 dpa (S1) und 20 dpa (S2) nachgewiesen werden. Weiterhin ist der Spiegel der GUS-Expression vergleichbar mit dem Spiegel der Expression in transformierten Pflanzen, welche den konstitutiven Promotor CaMV 35S in eine GUS nos Fusion enthalten. Wie von Fobert et al. (1991, Plant Molecular biology, 17: 837–851) berichtet, betrug die GUS Aktivität in transformierten Pflanzen, welche pB1121 (Clontech) enthielten, welches wiederum ein chimäres CaMV-35S-GUS-nos-Gen enthielt, bis zu 18.770 ± 2450 (pmol MU pro Minute pro mg Protein).
Genetische Analyse der transgenen Pflanze T1275
Die T-DNA enthält ein Kanamycin Resistenzgen. Samen von selbst befruchteten transgenen Pflanzen wurden in 70% Ethanol für eine Minute und in verdünntem Javex-Bleichmittel für 25 Minuten (6% Natriumhypochlorid) oberflächensterilisiert. Die Samen wurden dann mehrmals mit sterilem destillierten Wasser gewaschen, unter der Steril-Flow getrocknet und in Petrischalen, welche ein mit 100 μg/ml Kanamycin supplementiertes MSO-Medium wie von Miki et al. (1993, Methods in Plant Molecular Biology und Biotechnology, Eds., B. R. Glick und J. E. Tompson, CRC Press, Boca Raton, 67–88) beschrieben enthielten überführt. Für jeden Transformanten wurden mindestens 90 Keimlinge gezählt. Die Anzahl der grünen (Kanamycin-resistenten) und gebleichten (Kanamycin-sensitiven) Keimlingen wurden nach vier bis sechs Wochen gezählt, und unter Verwendung eines Chi²-Tests mit einer Signifikanz von P < 0,05 analysiert.
Die Resultate der genetischen Analyse sind unten in Tabelle 1 gezeigt, in der gezeigt wird, dass die T-DNA Loci als ein einzelner Insertionslokus segregieren.
Tabelle 1 Genetische Analyse von transgenen T1275-Pflanzen
Southern-Blot-Analyse
Die T-DNA in der transgenen T1275 Pflanze wurde unter Verwendung entweder einer Sonde aus der kodierenden Region des GUS Gens oder einer Sonde aus der kodierenden Region des nptII Gens analysiert.
Die genomische DNA wurde aus gefriergetrockneten Blättern unter Verwendung des Verfahrens nach Sanders et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 1543–1558) isoliert. 10 Mikrogramm T1275 DNA wurden einige Stunden mit EcoRI unter Verwendung des geeigneten, vom Hersteller gelieferten Puffers, welcher mit 2,5 mM Spermidin supplementiert wurde, verdaut. Nach einer Elektrophorese in einem 0,8% TAE Agarose Gel wurde eine Southern Blot Analyse unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt. Da die T-DNA aus dem Konstrukt, welches das Konstrukt konstitutiver Promotor-GUS-nos enthielt, nur eine einzige EcoRI Erkennungsstelle umfasst, bestehen die hybridisierenden Fragmente aus T-DNA- und flankierenden Tabak-DNA-Sequenzen. Die Länge des Fragments wird in Abhängigkeit von der Stelle der nächsten EcoRI Schnittstelle variieren. Unter Verwendung des GUS Gens als Sonde (3 – Spur 1) wird das Fragment mit der nächsten EcoRI Schnittstelle in der Pflanzen DNA detektiert werden. Bei T1275 wurde ein solches Fragment nachgewiesen. Unter Verwendung der kodierenden Region für nptII als Sonde (3 – Spur 2), welche mit Sequenzen hybridisiert, die gegenüber der Eco-RI-Schnittstelle liegen, wurde wiederum nur eine einzige Hybridisierungsbande nachgewiesen. Außerdem ist aus 3 ersichtlich, dass innerhalb der T-DNA keine Rearrangements auftraten.
Klonieren und Analyse des konstitutiven Promotors – GUS-Fusion-Konstrukts
Genomische DNA wurde aus Blättern nach Hattori et al. (1987, Anal. Biochem: 165, 70–74) isoliert. 10 μg der Gesamt-DNA aus T1275 wurden mit EcoRI und XbaI entsprechend den Herstellerangaben verdaut. Die verdaute DNA wurde in einem 0,7% Agarosegel nach Größe fraktioniert. DNA Fragmente von etwa 4 bis 6 kb wurden aus dem Gel unter Verwendung des Elu-Quick Kits (Schleicher und Schuell) isoliert, und in LambdaGEM-2 Arme ligiert, die zuvor mit EcoRI und XbaI verdaut und mit Phosphatase behandelt wurden. Etwa 40.000 Plaques wurden auf eine Nylonmembran (Hybond, Amersham) transferiert, und mit ³²P-markiertem 2 kb-GUS-Insert, isoliert aus pB1121, wie im Wesentlichen von Rutledge et al. (1991, Mol. Gen Genet. 229, 31–40) beschrieben, durchmustert. Die positiven Klone wurden isoliert. Die XbaI EcoRI Fragmente (siehe Restriktionskartierung der 4 und 5) wurde aus dem Lambda-Phagen isoliert und in pTZ19R kloniert, welches zuvor mit XbaI und EcoRI verdaut, und mit intestinaler Phosphatase aus Kalb behandelt worden war.
Die in dem Klon gefundene Pflanzen-DNA-Sequenz wurde vorher in Sequenzdatenbanken nicht beschrieben. Sie tritt auch in verschiedenen anderen Arten nicht auf, was gezeigt werden konnte, da sie in Southern-Blots-Analysen keine hybridisierenden Banden mit dem Fragment in Sojabohne, Kartoffel, Sonnenblume, Arabidopsis, B. napus, B. oleracea, Mais, Weizen oder Schwarzfichte (Daten nicht gezeigt). In Tabak zeigten die Southern-Blots keine Anzeichen für Ekel erregende Umordnungen bei oder stromaufwärts von der T-DNA Insertionsstelle (Daten nicht gezeigt).
Zur Analyse der transienten Expression von GUS-Aktivität, welche biolistisch übertragen wurde (Sandfort et al., 1983, Methods Enzymol, 217: 483–509) wurde das XbaI-EcoRI-Fragment in pUC19 subkloniert, und die GUS-Aktivität wurde über Färbung mit X-Gluc wie oben beschrieben, nachgewiesen. Blattgewebe aus im Gewächshaus gezogenen Pflanzen oder Suspensionszellkulturen wurden hinsichtlich der Anzahl der gefärbten blauen Flecken untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war das T1275-Promotor-GUS-nos-Gen in jeder der unterschiedlichen untersuchten Arten aktiv.
Tabelle 2 Transiente Expression von GUS-Aktivität in Geweben von verschiedenen Pflanzenarten
Das 4,2 kb-Fragment, welches etwa 2,2 kb des T1275-Promotors fusioniert mit dem GUS-Gen und der 3'-Region des nos Gens enthielt, wurde durch Verdauen von pTZ-T1275 mit HindIII und EcoRI isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den pRD400-Vektor (Datla et al., 1992, Gene, 211: 383–384) ligiert, welcher zuvor mit HindIII und EcoRI verdaut und mit intestinaler Phosphatase aus Kalb behandelt worden war. Der Transfer des binären Vektors auf Agrobakterium tumefaciens und die Transformation von Blattscheiben von N. tabacum SR1 wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die GUS-Aktivität wurde in verschiedenen Organen vieler unterschiedlicher transgener Linien untersucht. Die GUS mRNA wurde ebenso im gleichen Organ durch RNase protection assay (Melton et al., 1984, Nucleic Acids Res. 121: 7035–7056) unter Verwendung einer Probe, die mit dem mRNA 5' Ende sowohl in untransformierten als auch in transgenen Geweben übereinstimmte, untersucht. RNA wurde aus gefriergemahlenen Geweben unter Verwendung des TRIZOL-Reagenz (Life Technologies) wie durch den Hersteller beschrieben isoliert. Für jeden Test wurden 10–30 μg Gesamt-RNA mit einer Anti-sense RNA-Sonde hybridisiert, die 600 Basen der T1275-Pflanzensequenz und 400 Basen des GUS-Gens entsprach. Die Tests wurden nach Herstellerangaben unter Verwendung des RPAII-Kits (Ambion CA) durchgeführt. Die geschützten Fragmente wurden auf einem denaturierenden 5%-Langbereichs-Acrylamid-Gels getrennt, welches getrocknet wurde und einer Autoradiographie mit Kodak X-RP-Film unterzogen wurde.
Die Analyse von Blättern von zufällig ausgewählten, aus einer Gewebekultur regenerierten und im Gewächshaus gezüchteten Pflanzen zeigte einen weiten Bereich von spezifischen GUS-Aktivitäten (6A). Pflanzen, die mit pB1121 (KLONETECH) transformiert wurden, welcher das 35S-GUS-nos-Gen enthielt, zeigten vergleichbare Spiegel an spezifischer Aktivität (Daten nicht gezeigt). Im Allgemeinen korrelierten die Spiegel an GUS mRNA in den Blättern mit der spezifischen Aktivität von GUS. Außerdem zeigte die Gegenwart einer einzelnen Bande von etwa 600 Basen in allen Proben, dass die Startstelle der GUS-Transkription etwa 180 Basen stromaufwärts der T-DNA-Insertionsstelle innerhalb der Pflanzen-DNA-Sequenz lag.
Für die Analyse der GUS-Expression in verschiedenen Organen wurden Linien detailliert untersucht, die von der Nachkommenschaft der obigen Linien stammten. Tabelle 3 zeigt die spezifischen Aktivitäten von GUS in einer dieser Pflanzen. Es wird in Blatt, Stängel, Wurzel, sich entwickelten Samen und den Blütenorganen, Kelchblatt, Blütenblatt, Antheren, Stempel und Fruchtknoten in unterschiedlichen Spiegeln exprimiert, was eine konstitutive Expression bestätigt. Die Einführung des gleichen Vektors in B. napus führte ebenso zur GUS-Aktivitäts-Expression in diesen Organen (Daten nicht gezeigt), wodurch gezeigt wird, dass die konstitutive Expression nicht spezifisch ist für Tabak. Die Untersuchung der GUS mRNA in den Tabakorganen zeigte, dass die Transkriptionsstartstelle jeweils gleich war und dass der Spiegel an mRNA ähnlich war, außer in Blütenknospen, wo er etwas niedriger war (Tabelle 3).
Die in mit RNA aus Blättern, Stängel, Wurzel, sich entwickelnden Samen und Blüten von nicht transformiertem Tabak durchgeführten Tests zeigten kein geschütztes Fragment unter Verwendung der obigen Sonde (7). Es wird daher angenommen, dass die Insertionsseite in nicht transformiertem Tabak transkriptionell still ist, und durch die T-DNA-Insertion aktiviert wird. Die Region stromaufwärts von der Insertionsstelle ist daher ein weiteres Beispiel für einen kryptischen Pflanzenpromotor (Fobert et al., 1994, Plant J. 6: 568–577).
Tabelle 3 Spezifische GUS-Aktivität und relative RNA-Spiegel in den Organen von Nachkommen der transgenen Linie T64
Alle wissenschaftlichen Publikationen und Patentdokumente sind hier durch Bezugnahme mit aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf die bevorzugten Ausführungsbeispiele beschrieben. Es wird dem Fachmann jedoch klar sein, dass eine Reihe von Variationen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er in den folgenden Ansprüchen beschrieben ist, abzuweichen.
Sequenzprotokoll

Claims

Ein isolierter Promotor umfassend eine Nukleotid-Sequenz, welche mindestens eine 18 Basenpaar lange kontinuierliche Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst.
Der isolierte Promotor nach Anspruch 1, umfassend ein DNA-Fragment, wie es durch die Restriktionskarte aus 5 von XbaI bis SalI charakterisiert ist.
Der isolierte Promotor nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Der isolierte Promotor nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein kryptischer Promotor ist.
Der isolierte konstitutive Promotor nach Anspruch 3, wobei dieser Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die zu mindestens 70%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% mit den Nukleotiden aus SEQ ID NO: 1 übereinstimmt.
Der isolierte konstitutive Promotor nach Anspruch 3, wobei dieser Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die funktionell zu SEQ ID NO: 1 äquivalent ist und welche die Expression eines exogenen Gens konstitutiv steuert.
Ein isoliertes DNA-Molekül umfassend die Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1.
Ein chimeres Gen-Konstrukt umfassend eine interessierende DNA, welche konstitutiv exprimiert werden soll und den konstitutiven Promotor nach Anspruch 3.
Das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 8, wobei der konstitutive Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die zu mindestens 70%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% mit den Nukleotiden aus SEQ ID NO: 1 übereinstimmt.
Ein chimeres Gen-Konstrukt umfassend das isolierte DNA-Molekül nach Anspruch 7.
Ein Vektor umfassend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 9.
Ein Vektor umfassend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 10.
Verfahren zur Übertragung der konstitutiven Expression eines Genes in einer Pflanze, umfassend das funktionsfähige Verbinden einer interessierenden DNA, die konstitutiv exprimiert werden soll, mit einem konstitutiven Promotor aus Tabak, wobei der konstitutive Promotor eine mindestens 18 Basenpaar lange durchgängige Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst, um ein chimeres Gen-Konstrukt herzustellen und das chimere Gen-Konstrukt in eine Pflanze, die fähig ist, das chimere Gen-Konstrukt zu exprimieren, einzuführen.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei der konstitutive Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die zu mindestens 70%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% mit den Nukleotiden aus SEQ ID NO: 1 übereinstimmt.
Eine transgene Pflanze, enthaltend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 8.
Die transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 15, wobei der konstitutive Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die zu mindestens 70%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% mit den Nukleotiden von SEQ ID NO: 1 übereinstimmt.
Eine transgene Pflanzenzelle, enthaltend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 10.
Die transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 16, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tabak, N. Tabacum, B. Napus, Soyabohne, Alfalfa, Arabidopsis, Mais, Weizen und Gerste.
Eine transgene Pflanze, enthaltend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 8.
Die transgene Pflanze nach Anspruch 19, wobei der konstitutive Promotor eine Nukleotid-Sequenz aufweist, die zu mindestens 70%, vorzugsweise 80% und besonders bevorzugt 90% mit den Nukleotiden aus SEQ ID NO: 1 übereinstimmt.
Eine transgene Pflanze, enthaltend das chimere Gen-Konstrukt nach Anspruch 10.
Die transgene Pflanze nach Anspruch 21, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tabak, B. Napus, Soyabohne, Alfalfa, Arabidopsis, Mais, Weizen und Gerste.