DE60034929T2 - Wuschel (WUS)-Proteine - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Pflanzen-Molekularbiologie. Spezifischer betrifft diese Erfindung Nukleinsäurefragmente, die Wuschel (WUS)-Proteine in Pflanzen und Samen codieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Organbildung in Pflanzen erfolgt über die Aktivität von apikalen Meristemen. Pflanzenmeristeme enthalten einen Pool von Stammzellen, die dazu fähig sind, sich selbst aufrecht zu erhalten, die zur Entstehung einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich der Zellen, die für die Organinitiation erforderlich sind, führen. Die Initiation und Aufrechterhaltung von Stammzellen und ihre Integration in Organ-bildende Meristeme sind somit die Basis für die kontinuierliche Pflanzenentwicklung.
  • Das Wuschel-Protein, hiernach mit WUS bezeichnet, spielt eine Schlüsselrolle bei der Initiation und Aufrechterhaltung des apikalen Meristems, das einen Pool pluripotenter Stammzellen enthält (Endrizzi et al., 1996, Plant Journal 10:967-979; Laux et al., 1996, Development 122:87-96; und Mayer et al., 1998, Cell 95:805-815). Arabidopsis-Pflanzen, die hinsichtlich des WUS-Gens mutant sind, enthalten Stammzellen, die falsch spezifiziert sind und die anscheinend einer Differenzierung unterworfen sind. WUS codiert für ein neues Homöodomänenprotein, das vermutlich als Transkriptionsregulator funktioniert (Mayer et al., 1998, Cell 95:805-815). Es wird angenommen, dass die Stammzellpopulation von Arabidopsisschössling-Meristemen durch eine regulatorische Schleife zwischen den CLAVATA (CLV)-Genen, die die Organinitiation fördern, und dem WUS-Gen, das für die Stammzellidentität erforderlich ist, aufrechterhalten wird, wobei die CLV-Gene WUS auf der Transkriptebene reprimieren und die WUS-Expression hinreichend ist, um die Meristem-Zellidentität und die Expression des Stammzellmarkers CLV3 zu induzieren (Brand et al. (2000), Science 289:617-619; Schoof et al. (2000), Cell 100:635-644). Es ist kürzlich gezeigt worden, dass die konstitutive Expression von WUS in Arabidopsis zu einer Prolifertion von Adventivsprossen aus Blättern (in planta) führt (Laux, T., Vortrag, präsentiert auf dem XVI International Botanical Congress Meeting, 1.-7. August 1999, St. Louis, MO).
  • Es gibt ein sehr großes Interesse an der Identifizierung der Gene, die für Proteine codieren, die an der Entwicklung von Pflanzen beteiligt sind, im Allgemeinen mit dem Ziel des Änderns des Pflanzenwachstums und der Pflanzenarchitektur. WUS stellt ein solches Gen dar. Jedoch kann das WUS-Gen auch für die neuartige Anwendung des Stimulieren von in vitro-Wachstum von Pflanzengewebe und die Verbesserung der Transformation verwendet werden. Auf diese Weise kann dieses Gen den Bereich von Gewebetypen, die zur Transformation targetiert werden, ausdehnen. Spezifischerweise kann das WUS-Gen verwendet werden, um Meristem-Transformationsfrequenzen zu verbessern, und es könnte in einer Genotyp-unabhängigen Transformation vieler bedeutender Nutzpflanzen, wie z.B. Mais, Sojabohne und Sonnenblume, resultieren. Ferner würde die Transformation bzw. Umwandlung in Meristeme die Bildung neuer apikaler Initiale stimulieren, wobei die chimäre Natur der transgenen Ereignisse verringert wird. Schließlich würde die ektopische Expression in nicht-meristematische Zellen die Adventivmeristembildung stimulieren. Dies könnte zur Transformation nicht-traditioneller Gewebe, wie z.B. Blättern, Blattbasen, Stängelgewebe bzw. Stammgewebe usw., führen. Alternativ könnte die Transformation eines traditionelleren Ziels, wie z.B. Kallus oder das Scutellum unreifer Embryonen, eine "nicht-traditionelle" Wachstumsantwort, d.h., Meristeme anstelle somatischer Embryonen, fördern. Darüber hinaus kann WUS auch als genetischer Marker für Meristeme verwendet werden. Demgemäß würde die Verfügbarkeit von Nukleinsäuresequenzen, die für das gesamte oder einen Teil eines WUS-Proteins codieren, Studien zum besseren Verständnis der programmierten Entwicklung in Pflanzen erleichtern, genetische Tools bzw. Werkzeuge zum Erhöhen der Effizienz des Gentransfers in Meristemgewebe bereitstellen und dabei helfen, alternative Transformationsverfahren bei etlichen bedeutenden Nutzpflanzen bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukldeotid, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das mindestens 100 Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 8 basierend auf der Clustal-Alignment-Methode mindestens 80% Identität aufweisen;
    wobei die folgenden Default-Parameter bzw. vorgegebenen Parameter in der Clustal-Alignment-Methode benutzt werden: KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5;
    und wobei das Polypeptid ein WUS-Protein ist, das imstande ist, das in vitro-Wachstum von Pflanzengewebe zu stimulieren.
  • Es ist bevorzugt, dass das isolierte Polynukleotid der beanspruchten Erfindung eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder 7 umfasst, die für das Polypeptid von SEQ ID NO: 6 oder 8 codiert.
  • Die Erfindung betrifft auch ein chimäres Gen, das ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit wenigstens einer geeigneten Regulatorsequenz umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine isolierte Wirtszelle, die ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung oder ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung umfasst. Die Wirtszelle kann eukarytoisch, z.B. eine Hefe- oder eine Pflanzenzelle, oder prokaryotisch, z.B. eine Bakterienzelle, sein. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Virus, vorzugsweise einen Baculovirus, der ein isoliertes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung oder ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer isolierten Wirtszelle, die ein chimäres Gen der vorliegenden Erfindung oder ein isoliertes Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei das Verfahren entweder das Transformieren oder das Transfizieren einer isolierten kompatiblen Wirtszelle mit einem chimären Gen oder einem isolierten Polynukleotid in der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes WUS-Polypeptid, das durch ein Polynukleotid der Erfindung codiert wird.
  • Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur positiven Selektion einer transformierten Zelle, umfassend: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem chimären Gen der vorliegenden Erfindung; und (b) Züchtung der transformierten Wirtszelle, vorzugsweise eine Pflanzenzelle, wie z.B. eine Monokotyle oder Dikotyle, unter Bedingungen, die die Expression des WUS-Polynukleotids für eine Zeit, die zum Induzieren einer Organogenese hinreichend ist, um ein positives Selektionsmittel bereitzustellen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR UND DES SEQUENZPROTOKOLLS
  • Die Erfindung kann ausgehend von der nachstehenden detaillierten Beschreibung und der begleitenden Figur und dem Sequenzprotokoll, die einen Teil dieser Anmeldung bilden, vollständiger verstanden werden.
  • 1 zeigt ein Alignment bzw. eine Angleichung der Aminosäuresequenzen des WUS-Proteins, codiert durch die Nukleotidsequenzen, die von dem Getreide- bzw. Maisklon cpilc.pk012.p19 (SEQ ID NO: 4), Maisklon p0058.chpab57r (SEQ ID NO: 10), Sojabohnenklon ses4d.pk0033.c8 (SEQ ID NO: 20), Sojabohnenklon sgs5c.pk0002.f2 (SEQ ID NO: 22) abgeleitet sind und ein Contig bzw. eine zusammenhängende Sequenz, die unter Verwendung des Sojabohnenklons ssm.pk0060.h4 und der NCBI GenBank-Kennzahl (GI) No. 4395781 (SEQ ID NO: 24) und dem WUS-Protein aus Arabidopsis thaliana (NCBI GI No. 4090200; SEQ ID NO: 25) zusammengesetzt wurde. Aminosäuren, die bei allen und wenigstens zwei Sequenzen mit einer Aminosäure an dieser Position konserviert sind, sind mit einem Asterisken (*) angezeigt. Von dem Programm werden Gedankenstriche verwendet, um das Alignment der Sequenzen zu maximieren.
  • Tabelle 1 listet die Polypeptide, die hierin beschrieben sind, die Bezeichnung der cDNA-Klone, die die Nukleinsäurefragmente, die für Polypeptide codieren, die die gesamten oder einen wesentlichen Teil dieser Polypeptide darstellen, umfassen, und die entsprechenden Kennzahlen (SEQ ID NO:), wie sie im beigefügten Sequenzprotokoll verwendet werden, auf. Tabelle 1 identifiziert auch die cDNA-Klone als individuelle ESTs ("EST"), die Sequenzen der gesamten cDNA-Inserts, umfassend die angegebenen cDNA-Klone ("FIS"), Contigs, die aus zwei oder mehr ESTs zusammengesetzt sind ("Contig"), Contigs, die aus einem FIS und einem oder mehreren ESTs oder einer PCR-Fragmentsequenz zusammengesetzt sind ("Contig*") oder Sequenzen, die für das gesamte Protein codieren, abgeleitet von einem EST, einem FIS, einem Contig oder einer FIS- und einer PCR-Fragmentsequenz ("CGS"). TABELLE 1 WUS-Proteine
    SEQ ID NO:
    Protein (Pflanzenquelle) Klonbezeichnung Status (Nukleotid) (Aminosäure)
    WUS-Protein (Mais) Contig von cpg1c.pk006.b16 cpi1c.pk012.p19 Contig 1 2
    WUS-Protein (Mais) cpi1c.pk012.p19 (FIS) CGS 3 4
    WUS-Protein (Mais) p0016.ctsas50r EST 5 6
    WUS-Protein (Mais) p0016.ctsas50r FIS 7 8
    WUS-Protein (Mais) p0058.chpab57r (FIS) CGS 9 10
    WUS-Protein (Mais) p0083.cldev71r EST 11 12
    WUS-Protein (Mais) p0083.cldev71r FIS 13 14
    WUS-Protein (Sojabohne) Contig von scr1c.pk001.d2 ses4d.pk0033.c8 Contig 15 16
    WUS-Protein (Sojabohne) scr1c.pk001.d2 FIS 17 18
    WUS-Protein (Sojabohne) ses4d.pk0033.c8 (FIS) CGS 19 20
    WUS-Protein (Sojabohne) sgs5c.pk0002.f2 (EST) CGS 21 22
    WUS-Protein (Sojabohne) Contig von ssm.pk0060.h4 (FIS) NCBI GI Nr. 4395781 CGS 23 24
  • Das Sequenzprotokoll enthält den Ein-Buchstaben-Code für die Symbole der Nukleotidsequenz und den Drei-Buchstaben-Code für Aminosäuren, wie sie in Übereinstimmung mit den IUPAC-IUBMB-Standards, beschrieben in Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) und in Biochemical J. 219 (Nr. 2):345-373 (1984), sind. Die für die Nukleotid- und Aminosäuresequenzdaten verwendeten Symbole und das dafür verwendete Format entsprechen den Regeln, die in 37 C.F.R. §1.822 angegeben sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Im Kontext dieser Offenbarung soll eine Anzahl von Begriffen eingesetzt werden. Die Begriffe "Polynukleotid", "Polynukleotidsequenz", "Nukleinsäuresequenz" und "Nukleinsäurefragment/isoliertes Nukleinsäurefragment" werden hierin austauschbar verwendet. Diese Begriffe umfassen Nukleotidsequenzen und dergleichen. Ein Polynukleotid kann ein Polymer aus RNA und DNA sein, das einzel- oder doppelsträngig ist, das gegebenenfalls synthetische, nicht-natürliche oder veränderte Nukleotidbasen enthält. Ein Polynukleotid in der Form eines DNA-Polymers kann aus einem oder mehreren Abschnitten von cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA oder Gemischen davon bestehen. Ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung kann wenigstens eines aus 60 zusammenhängenden Nukleotiden, vorzugsweise wenigstens eines aus 40 zusammenhängenden Nukleotiden, am stärksten bevorzugt eines aus wenigstens 30 zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet von SEQ ID NOs: 5 oder 7, oder das Komplement derartiger Sequenzen umfassen.
  • Der Begriff "isoliertes" Polynukleotid bezieht sich auf ein Polynukleotid, das im Wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuresequenzen, wie z.B. anderer chromosomaler und extrachromosomaler DNA und RNA, die es normalerweise begleiten oder mit ihm Wechselwirken, wie es in seiner natürlich auftretenden Umgebung gefunden wird. Isolierte Polynukleotide können aus einer Wirtszelle, in der sie natürlicherweise vorkommen, gereinigt werden. Herkömmliche Nukleinsäure-Reinigungsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, können verwendet werden, um isolierte Polynukleotide zu erhalten. Der Begriff umfasst auch rekombinante Polynukleotide und chemisch synthetisierte Polynukleotide.
  • Der Begriff "rekombinant" bedeutet beispielsweise, dass eine Nukleinsäuresequenz durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Abschnitten einer Sequenz, z.B. mittels chemischer Synthese oder mittels der Manipulation der isolierten Nukleinsäuren durch Gentechnologietechniken, hergestellt wird.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Contig" auf eine Nukleotidsequenz, die aus zwei oder mehr Nukleotidsequenzbestandteilen zusammengesetzt ist, die gemeinsame oder überlappende Sequenzhomologieregionen haben. Z.B. können die Nukleotidsequenzen von zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten verglichen und angeglichen werden, um gemeinsame oder überlappende Sequenzen zu identifizieren. Wenn gemeinsame oder überlappende Sequenzen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten bestehen, können die Sequenzen (und somit ihre entsprechenden Nukleinsäurefragmente) zu einer einzigen zusammenhängenden Nukleotidsequenz zusammengesetzt werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "im Wesentlichen ähnlich" auf Nukleinsäurefragmente, worin Änderungen in einer oder mehreren Nukleotidbasen in der Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren resultieren, aber die funktionellen Eigenschaften des durch die Nukleotidsequenz codierten Polypeptids nicht beeinträchtigen. "Im Wesentlichen ähnlich" bezieht sich auch auf Nukleinsäurefragmente, worin Änderungen in einer oder mehreren Nukleotidbasen die Fähigkeit des Nukleinsäurefragments, die Änderung der Genexpression durch Gene silencing durch, beispielsweise, Antisense- oder Co-Suppressiontechnologie, zu vermitteln, nicht beeinträchtigen. "Im Wesentlichen ähnlich" bezieht sich auf Modifikationen der Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung, wie z.B. Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden, das/die die funktionellen Eigenschaften des resultierenden Transkripts hinsichtlich der Fähigkeit, Gene silencing oder eine Änderung der funktionellen Eigenschaften des resultierenden Proteinmoleküls zu vermitteln, nicht wesentlich beeinträchtigt/beeinträchtigen. Es ist somit zu verstehen, dass die Erfindung mehr als die spezifischen beispielhaften Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen umfasst und funktionelle Äquivalente davon umfasst. Die Begriffe "im Wesentlichen ähnlich" und "im Wesentlichen entsprechend" werden hierin austauschbar verwendet.
  • Im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäurefragmente können ausgewählt werden, indem Nukleinsäurefragmente, die Subfragmente oder Modifikationen der Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung darstellen, worin eines oder mehrere Nukleotide substituiert, deletiert und/oder insertiert sind, auf ihre Fähigkeit, den Spiegel des Polypeptids, das durch das unmodifizierte Nukleinsäurefragment codiert wird, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle zu beeinträchtigen, durchmustert bzw. gescreent werden. Beispielsweise kann ein im Wesentlichen ähnliches Nukleinsäurefragment, das wenigstens eines von 30 zusammenhängenden Nukleotiden, die von dem vorliegenden Nukleinsäurefragment abgeleitet sind, wiedergibt, konstruiert und in eine Pflanze oder Pflanzenzelle eingeführt werden. Der Spiegel bzw. die Konzentration des Polypeptids, das durch das unmodifizierte Nukleinsäurefragment codiert wird, der/die in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, die dem im Wesentlichen ähnlichen Nukleinsäurefragment ausgesetzt wurde, vorliegt, kann dann mit dem Spiegel des Polypeptids in einer Pflanze oder Pflanzenzelle verglichen werden, die dem im Wesentlichen ähnlichen Nukleinsäurefragment nicht ausgesetzt ist.
  • Beispielsweise ist es im Fachgebiet gut bekannt, dass eine Antisense-Suppression und Co-Suppression der Genexpression bewerkstelligt werden kann durch Verwendung von Nukleinsäurefragmenten, die weniger als die gesamte codierende Region eines Gens darstellen, und durch Verwendung von Nukleinsäurefragmenten, die keine 100%ige Sequenzidentität mit dem zu supprimierenden Gen aufweisen. Darüber hinaus sind Abänderungen in ein Nukleinsäurefragment, die in der Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einem gegebenen Ort resultieren, aber die funktionellen Eigenschaften des codierten Polypeptids nicht beeinträchtigen, im Fachgebiet gut bekannt. Somit kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon, das für einen anderen, weniger hydrophoben Rest, wie z.B. Glycin, oder einen hydrophoberen Rest, wie z.B. Valin, Leucin oder Isoleucin, codiert, substituiert werden. Gleichermaßen kann erwartet werden, dass Änderungen, die in der Substitution eines negativ geladenen Rests durch einen anderen, z.B. Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder eines positiv geladenen Rests durch einen anderen, wie z.B. Lysin für Arginin, resultieren, ein funktionell äquivalentes Produkt ergeben. Es würde auch nicht erwartet werden, dass Nukleotidänderungen, die in der Abänderung der N-terminalen und C-terminalen Teile des Polypeptidmoleküls resultieren, die Aktivität des Polypeptids verändern. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen liegt innerhalb der routinemäßigen Fähigkeiten im Fachgebiet, wie auch die Bestimmung der Beibehaltung der biologischen Aktivität der codierten Produkte. Folglich können ein isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz aus wenigstens einem aus 60 (vorzugsweise wenigstens einem aus 40, am stärksten bevorzugt wenigstens einem aus 30) zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet von einer Nukleotidsequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs: 5 oder 7, und die Ergänzung bzw. das Komplement einer derartigen Nukleotidsequenz in Verfahren zum Selektieren eines isolierten Polynukleotids, das die Expression eines WUS-Polypeptids in einer Wirtszelle beeinträchtigt, verwendet werden. Ein Verfahren zum Selektieren eines isolierten Polynukleotids, das den Level bzw. Spiegel der Expression eines Polypeptids in einem Virus oder einer Wirtszelle (eukaryotisch, wie z.B. eine Pflanze oder Hefe, prokaryotisch, wie z.B. eine bakterielle (Zelle)) beeinflusst, kann die Stufen:
    Konstruieren eines isolierten Polynukleotids der vorliegenden Erfindung oder eines isolierten chimären Gens der vorliegenden Erfindung; Einführen des isolierten Polynukleotids oder des isolierten chimären Gens in eine Wirtszelle; Messen des Spiegels eines Polypeptids oder der/einer Enzymaktivität in der Wirtszelle, die das isolierte Polypeptid enthält; und Vergleichen des Spiegels eines Polypeptids oder der/einer Enzymaktivität in der Wirtszelle, die das isolierte Polynukleotid enthält, mit dem Spiegel eines Polypeptids oder der/einer Enzymaktivität in einer Wirtszelle, die das isolierte Polynukleotid nicht enthält, umfassen.
  • Darüber hinaus können im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäurefragmente auch durch ihre Fähigkeit zu hybridisieren gekennzeichnet sein. Abschätzung einer derartigen Homologie werden entweder mittels DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen unter Bedingungen der Stringenz bereitgestellt, wie es von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden wird (Hames und Higgins, Hrsg. (1985), Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.). Die Stringenzbedingungen können angepasst werden, um auf in moderater Weise ähnliche Fragmente, wie z.B. homologe Sequenzen aus entfernt verwandten Organismen, bis zu in hohem Maße ähnlichen Fragmenten, wie z.B. Gene, die funktionelle Enzyme aus eng verwandten Organismen duplizieren, zu durchmustern. Die Waschschritte nach der Hybridisierung bestimmen die Stringenzbedingungen. Ein Satz bevorzugter Bedingungen verwendet eine Reihe von Waschschritten, beginnend mit 6 × SSC, 0,5% SDS bei Raumtemperatur für 15 min, dann wiederholt mit 2 × SSC, 0,5% SDS bei 45°C für 30 min, und dann zweimal wiederholt mit 0,2 × SSC, 0,5% SDS bei 50°C für 30 min. Ein stärker bevorzugter Satz stringenter Bedingungen verwendet höhere Temperaturen, bei denen die Waschschritte identisch zu den oben stehenden sind, abgesehen davon, dass die Temperatur für die abschließenden zwei 30-minütigen Waschschritte in 0,2 × SSC, 0,5% SDS auf 60°C erhöht wurde. Ein weiterhin bevorzugter Satz hochstringenter Bedingungen verwendet zwei abschließende Waschschritte in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C.
  • Im Wesentlichen ähnliche Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können auch gekennzeichnet sein durch die prozentuale Identität der Aminosäuresequenzen, für die sie codieren, zu den hierin offenbarten Aminosäuresequenzen, wie durch Algorithmen bestimmt wird, die herkömmlicherweise von Fachleuten auf dem Gebiet eingesetzt werden. Geeignete Nukleinsäurefragmente (isolierte Polynukleotide der Erfindung) codieren für Polypeptide, die mit den hierin angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens etwa 80% identisch sind. Bevorzugte Nukleinsäurefragmente codieren für Aminosäuresequenzen, die zu den hierin angegebenen Aminosäuresequenzen zu etwa 85% identisch sind. Stärker bevorzugte Nukleinsäurefragmente codieren für Aminosäuresequenzen, die zu den hierin angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens etwa 90% identisch sind. Am stärksten bevorzugte Nukleinsäurefrag mente codieren für Aminosäuresequenzen, die zu den hierin angegebenen Aminosäuresequenzen zu mindestens etwa 95% identisch sind. Geeignete Nukleinsäurefragmente weisen nicht nur die obigen Identitäten auf, sondern codieren typischerweise für ein Polypeptid mit mindestens 50 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren, stärker bevorzugt mindestens 150 oder 180 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt mindestens 200 oder 230 Aminosäuren, und am stärksten bevorzugt mindestens 250 Aminosäuren. Sequenz-Alignments und Berechnung der prozentualen Identität wurden unter Verwendung des Megalign-Programms des LASERGENE-Bioinformatik-Berechnungspakets (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt. Multiple bzw. mehrfache Alignments der Sequenzen wurden unter Verwendung der Clustal-Alignment-Methode (Higgins und Sharp (1989), CABIOS. 5:151-153) mit den vorgegebenen Parameter bzw. Defaultparametern durchgeführt (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Die Default-Parameter für paarweise Alignments unter Verwendung der Clustal-Methode waren KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5.
  • Ein "wesentlicher Teil" einer Aminosäure oder Nukleotidsequenz umfasst eine Aminosäure- oder Nukleotidsequenz, die hinreichend ist, um eine putative Identifizierung des Proteins oder Gens, welches die Aminosäure- oder Nukleotidsequenz umfasst, zu ermöglichen. Aminosäure- und Nukleotidsequenzen können entweder manuell durch einen Fachmann oder unter Verwendung Computer-basierter Sequenzvergleichs- und -identifizierungstools, die Algorithmen, wie z.B. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993), J. Mol. Biol. 215:403-410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), verwenden, ausgewertet werden. Im Allgemeinen ist eine Sequenz von 10 oder mehr zusammenhängenden Aminosäuren oder 30 oder mehr zusammenhängenden Nukleotiden nötig, um eine Polypeptid- oder Nukleinsäuresequenz putativ als homolog zu einem bekannte Protein oder Gen zu identifizieren. Darüber hinaus können hinsichtlich Nukleotidsequenzen genspezifische Oligonukleotidsonden, die 30 oder mehr zusammenhängende Nukleotide umfassen, in Sequenz-abhängigen Verfahren zur Genidentifizierung (z.B. Southern-Hybridisierung) und -Isolierung (z.B. in situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagen-Plaques) verwendet werden. Außerdem können kurze Oligonukleotide von 12 oder mehr Nukleotiden als Amplifikationsprimer in der PCR verwendet werden, um ein bestimmtes Nukleinsäurefragment, das die Primer umfasst, zu erhalten. Ein "wesentlicher Teil" an Nukleotidsequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, die eine spezifische Identifizierung und/oder Isolierung eines Nukleinsäurefragments, das die Sequenz umfasst, ermöglichen wird. Die vorliegende Beschreibung beschreibt Aminosäure- und Nukleotidsequenzen, codierend für Polypeptide, die ein oder mehrere bestimmte Pflanzenproteine umfassen. Der Fachmann kann nun unter dem Vorteil der hierin beschriebenen Sequenzen die gesamten oder den wesentlichen Teil der offenbarten Sequenzen für Zwecke nutzen, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung die vollständigen Sequenzen, wie sie im begleitenden Sequenzprotokoll angegeben sind, sowie wesentliche Teile der Sequenzen, wie sie nachstehend definiert sind.
  • "Codondegeneriertheit" bezieht sich auf die Divergenz im genetischen Code, die eine Variation der Nukleotidsequenz ohne Beeinträchtigung der Aminosäuresequenz eines codierten Polypeptids erlaubt. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung jedes beliebige Nukleinsäurefragment, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die gesamten oder einen wesentlichen Teil der hierin dargelegten Aminosäuresequenzen codiert. Der Fachmann ist sich der "Codonpräferenz" ("Codon-bias"), die eine spezifische Wirtszelle in der Verwendung von Nukleotidkodons zum Spezifizieren einer gegebenen Aminosäure zeigt, wohl bewusst. Wenn ein Nukleinsäurefragment zur verbesserten Expression in einer Wirtszelle synthetisiert wird, ist es deshalb wünschenswert, das Nukleinsäurefragment so zu entwerfen, dass sich seine Häufigkeit des Codongebrauchs der Häufigkeit des bevorzugten Codongebrauchs der Wirtszelle annähert.
  • "Synthetische Nukleinsäurefragmente" können aus Oligonukleotid-Bausteinen zusammengesetzt werden, die unter Verwendung von Verfahrensweisen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, chemisch synthetisiert werden. Diese Bausteine werden ligiert und angelagert, so dass sie größere Nukleinsäurefragmente bilden, die dann enzymatisch zusammengesetzt werden können, um das gesamte gewünschte Nukleinsäurefragment zu konstruieren. "Chemisch synthetisiert", wie auf ein Nukleinsäurefragment bezogen, bedeutet, dass die Nukleotidbestandteile in vitro zusammengesetzt wurden. Viele chemische Synthesen von Nukleinsäurefragmenten können unter Verwendung gut etablierter Verfahrensweisen bewerkstelligt werden, oder es können automatisierte chemische Synthesen durchgeführt werden, wobei eine aus einer Anzahl im Handel erhältlicher Maschinen verwendet wird. Demgemäß können die Nukleinsäurefragmente für eine optimale Genexpression, basierend auf der Optimierung der Nukleotidsequenz, so dass sie die Codonpräferenz der Wirtszelle widerspiegelt, maßgeschneidert werden. Der Fachmann schätzt die Wahrscheinlichkeit erfolgreicher Genexpression, wenn die Codonverwendung in Richtung jener Codons verschoben wird, die durch den Wirt begünstigt sind. Die Bestimmung bevorzugter Codons kann auf einer Überwachung von Genen, die aus der Wirtszelle stammen, bei denen eine Sequenzinformation verfügbar ist, basieren.
  • "Gen" bezieht sich auf ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, einschließend Regulationssequenzen, die der codierenden Sequenz vorangehen (5'-nicht-codierende Sequenzen) und nachfolgen (3'-nicht-codierende Sequenzen). "Natives Gen" bezieht sich auf ein Gen, wie es in der Natur mit seinen eigenen Regulationssequenzen gefunden wird. "Chimäres Gen" bezieht sich auf jedes Gen, das kein natives Gen ist, umfassend Regulations- und codierende Sequenzen, die in der Natur nicht zusammen gefunden werden. Demgemäß kann ein chimäres Gen Regulationssequenzen und codierende Sequenzen, die aus verschiedenen Quellen stammen, oder Regulationssequenzen und codierende Sequenzen, die aus der gleichen Quelle stammen, aber auf eine andere Weise als die, die in der Natur gefunden wird, angeordnet sind, umfassen. "Endogenes Gen" bezieht sich auf ein natives Gen in seiner natürlichen Umgebung im Genom eines Organismus. Ein "fremdes Gen" bzw. "Fremdgen" bezieht sich auf ein Gen, das im Wirtsorganismus normalerweise nicht gefunden wird, aber mittels Gentransfer in den Wirtsorganismus eingeführt ist. Fremde Gene können native Gene, eingefügt in einen nicht-nativen Organismus, oder chimäre Gene umfassen. Ein "Transgen" ist ein Gen, das mittels einer Transformationsverfahrensweise in das Genom eingeführt worden ist.
  • "Codierende Sequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für eine spezifische Aminosäuresequenz codiert. "Regulatorsequenzen" beziehen sich auf Nukleotidsequenzen, die stromaufwärts (5'-nicht-codierende Sequenzen), innerhalb oder stromabwärts (3'-nicht-codierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz lokalisiert sind und die die Transkription, RNA-Prozessierung oder -Stabilität oder Translation der damit assoziierten codierenden Sequenz beeinflussen. Regulationssequenzen können Promotoren, Translationsleadersequenzen, Introns und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen umfassen.
  • "Promotor" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die zum Kontrollieren der Expression einer codierenden Sequenz oder funktionellen RNA fähig ist. Im Allgemeinen ist eine codierende Sequenz 3' zu einer Promotorsequenz lokalisiert. Die Promotorsequenz besteht aus proximalen und distaleren stromaufwärtigen Elementen, wobei die letzteren Elemente oft als Enhancer bezeichnet werden. Demgemäß ist ein "Enhancer" eine Nukleotidsequenz, die eine Promotoraktivität stimulieren kann, und kann ein dem Promotor eigenes Element oder ein heterologes Element, das eingefügt ist, um den Level oder die Gewebespezifität eines Promotors zu erhöhen, sein. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet sein oder können aus verschiedenen Elementen, die aus verschiedenen Promotoren, die in der Natur gefunden werden, abgeleitet sind, zusammengesetzt sein, oder sie können sogar synthetische Oligonukleotid-Segmente umfassen. Es wird von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden, dass verschiedene Promotoren die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder in verschiedenen Entwicklungsstufen oder in Reaktion auf verschiedene Umweltbedingungen steuern können. Promotoren, die bewirken, dass ein Nukleinsäurefragment in den meisten Zelltypen zu den meisten Zeiten exprimiert wird, werden im Allgemeinen als "konstitutive Promotoren" bezeichnet. Neue Promotoren zahlreicher Typen, die in Pflanzenzellen nützlich sind, werden andauernd entdeckt; zahlreiche Beispiele können in der Zusammenfassung von Okamuro und Goldberg (1989), Biochemistry of Plants 15:1-82, gefunden werden. Da in den meisten Fällen die genauen Grenzen der Regulationssequenzen nicht vollständig definiert worden sind, ist ferner anerkannt, dass Nukleinsäurefragmente verschiedener Längen eine identische Promotoraktivität aufweisen können.
  • "Translationsleadersequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die zwischen der Promotorsequenz eines Gens und der codierenden Sequenz lokalisiert ist. Die Translationleadersequenz liegt in der vollständig prozessierten mRNA stromaufwärts der Translationsstartsequenz vor. Die Translationsleadersequenz kann die Prozessierung des primären Transkripts zur mRNA, die mRNA-Stabilität oder die Translationseffizienz beeinflussen. Beispiele für Translationsleadersequenzen sind beschrieben worden (Turner und Foster (1995), Mol. Biotechnol. 3:225-236).
  • "3'-nicht-codierende Sequenzen" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die stromabwärts einer codierenden Sequenz lokalisiert sind, und umfassen Polyadenylierungserkennungssequenzen und andere Sequenzen, die für Regulationssignale codieren, die zur Beeinflussung der mRNA-Prozessierung oder Genexpression fähig sind. Das Polyadenylierungssignal ist üblicherweise dadurch gekennzeichnet, dass es die Addition von Polyadenylsäure-Trakten ("polyadenylic acid tracts") an das 3'-Ende des mRNA-Vorläufers beeinflusst. Die Verwendung verschiedener 3'-nicht-codierender Sequenzen wird beispielhaft dargelegt von Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell 1:671-680.
  • "RNA-Transkript" bezieht sich auf das Produkt, das aus der RNA-Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz resultiert. Wenn das RNA-Transkript eine perfekt komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, wird es als das primäre Transkript bezeichnet, oder es kann eine RNA-Sequenz sein, die aus der posttranskriptionellen Prozessierung des primären Transkripts stammt und wird als die reife RNA bezeichnet. "Messenger-RNA (mRNA)" bezieht sich auf RNA, die ohne Introns ist und die durch die Zelle in Polypeptide translatiert werden kann. "cDNA" bezieht sich auf DNA, die zu einem mRNA-Template bzw. einer mRNA-Matrize komplementär und davon abgeleitet ist. Die cDNA kann einzelsträngig oder zur doppelsträngigen Form umgewandelt sein, wobei beispielsweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I verwendet wird. "Sense-RNA" bzw. "Sinn-RNA" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das die mRNA einschließt und so durch die Zelle in ein Polypeptid translatiert werden kann. "Antisense-RNA" bzw. "Gegensinn-RNA" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das zu einem/einer gesamten Ziel-Primärtranskript oder -mRNA oder einem Teil davon komplementär ist und das die Expression eines Ziel-Gens blockiert (siehe US-Patent Nr. 5 107 065 , hierin durch Bezugnahme aufgenommen). Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit einem beliebigen Teil der spezifischen Nukleotidsequenz vorliegen, d.h., an der 5'-nicht-codierenden Sequenz, der 3'-nicht-codierenden Sequenz, Introns oder der codierenden Sequenz. "Funktionelle RNA" bezieht sich auf Sense-RNA, Anti-Sense-RNA, Ribozym-RNA oder andere RNA, die nicht translatiert sein kann, aber eine Wirkung auf zelluläre Vorgänge hat.
  • Der Begriff "funktionell verknüpft" bezieht sich auf die Assoziierung bzw. Verbindung von zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten auf einem einzigen Polynukleotid, so dass die Funktion von einem durch das/die anderen beeinflusst wird. Beispielsweise ist ein Promotor funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er dazu fähig ist, die Expression dieser codierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h., die codierende Sequenz steht unter der Transkriptionskontrolle des Promotors). Codierende Sequenzen können mit Regulationssequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung funktionell verknüpft sein.
  • Der Begriff "Expression", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense- (mRNA) oder Antisense-RNA, die von den Nukleinsäurefragmenten der Erfindung abgeleitet ist. Expression kann sich auch auf die Translation von mRNA in ein Polypeptid beziehen. "Antisense-Inhibierung" bezieht sich auf die Produktion von Antisense-RNA-Transkripten, die dazu fähig sind, die Expression des Zielproteins zu supprimieren. "Überexpression" bezieht sich auf die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die die Spiegel bzw. Level der Produktion in normalen oder nicht-transformierten Organismen übersteigt. "Co-Suppression" bezieht sich auf die Produktion von Sense-RNA-Transkripten, die dazu fähig sind, die Expression identischer oder im Wesentlichen ähnlicher fremder oder endogener Gene zu supprimieren ( US-Patent Nr. 5 231 020 ).
  • Ein "Protein" oder "Polypeptid" ist eine Kette aus Aminosäuren, die in einer spezifischen Reihenfolge angeordnet sind, die durch die codierende Sequenz in einem Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, bestimmt ist. Jedes Protein oder Polypeptid hat eine einzigartige Funktion. "Veränderte Spiegel/Level" oder "veränderte Expression" beziehen sich auf die Produktion eines Genprodukts/von Genprodukten in transgenen Organismen in Mengen oder Anteilen, die sich von denen normaler oder nicht-transformierter Organismen unterscheiden.
  • "Null-Mutante" bezieht sich hier auf eine Wirtszelle, der entweder die Expression eines bestimmten Polypeptids fehlt, oder die ein Polypeptid exprimiert, das inaktiv ist oder keine detektierbare erwartete enzymatische Funktion aufweist.
  • "Reifes Protein" oder der Begriff "reif", wenn er in der Beschreibung eines Proteins verwendet wird, bezieht sich auf ein posttranslational prozessiertes Polypeptid; d.h., eines aus dem jegliche Prä- oder Propeptide, die im primären Translationsprodukt vorhanden sind, entfernt worden sind. "Vorläuferprotein" oder der Begriff "Vorläufer", wenn er in der Beschreibung eines Proteins verwendet wird, bezieht sich auf das primäre Produkt der Translation von mRNA; d.h., mit noch vorhandenen Prä- und Propeptiden. Prä- und Propeptide können intrazelluläre Lokalisierungssignale sein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Ein "Chloroplasten-Transitpeptid" ist eine Aminosäuresequenz, die in Verbindung mit einem Protein translatiert wird und das Protein zum Chloroplasten oder anderen Plastidentypen, die in der Zelle, in der das Protein hergestellt wird, vorhanden sind, führt. "Chloroplasten-Transitsequenz" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die für ein Chloroplasten-Transitpeptid codiert. Ein "Signalpeptid" ist eine Aminosäuresequenz, die in Verbindung mit einem Protein translatiert wird und das Protein zum Sekretionssystem führt (Chrispeels (1991), Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53). Wenn das Protein zu einer Vakuole zu führen bzw. zu bringen ist, kann ferner ein vakuoläres Targetierungssignal (supra) hinzugefügt sein, oder wenn zum endoplasmatischen Reticulum, kann ein Retentionssignal für das endoplasmatische Reticulum (supra) hinzugefügt sein. Wenn das Protein zum Nukleus geführt werden soll, sollte jedes vorhandene Signalpeptid entfernt und stattdessen ein nukleäres Lokalisierungssignal eingeschlossen werden (Raikhel (1992), Plant Phys. 100:1627-1632).
  • "Transformation" bezieht sich auf den Transfer eines Nukleinsäurefragments in das Genom eines Wirtsorganismus, der in einer genetisch stabilen Vererbung resultiert. Wirtsorganismen, die die transformierten Nukleinsäurefragmente enthalten, werden als "transgene" Organismen bezeichnet. Beispiele für Verfahren zur Pflanzentransformation umfassen Agrobacterium vermittelte Transformation (De Blaere et al. (1987), Meth. Enzymol. 143:277) und Partikelbeschleunigte oder "gene gun"-Transformationstechnologie (Klein et al. (1987), Nature (London) 327: 70-73; US-Patent Nr. 4 945 050 ). Somit können isolierte Polynukleotide der vorliegenden Erfindung in rekombinante Konstrukte, typischerweise DNA-Konstrukte, eingebaut werden, die zur Einführung in und Replikation bzw. Vervielfältigung in einer Wirtszelle fähig sind. Solch ein Konstrukt kann ein Vektor sein, der ein Replikationssystem und Sequenzen, die zur Transkription und Translation einer Polypeptid-codierenden Sequenz in einer gegebenen Wirtszelle fähig sind, umfasst. Eine Anzahl an Vektoren, die zur stabilen Transfektion von Pflanzenzellen oder zur Etablierung von transgenen Pflanzen geeignet sind, sind z.B. in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supp. 1987; Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; und Flevin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990, beschrieben worden. Typischerweise umfassen Pflanzenexpressionsvektoren z.B. ein oder mehrere klonierte Pflanzengene unter der Transkriptionskontrolle von 5'- und 3'-Regulationssequenzen und einen dominanten selektierbaren Marker. Derartige Pflanzenexpressionsvektoren können auch eine Promotor-Regulationsregion ("promotor regulatory region") (z.B. eine Regulationsregion, die induzierbare oder konstitutive, Umwelt- oder Entwicklungs-regulierte oder Zell- oder Gewebespezifische Expression kontrolliert bzw. steuert), eine Transkriptionsinitiations-Startstelle, eine Ribosomen-Bindestelle, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und/oder ein Polyadenylierungssignal enthalten.
  • Standard-DNA-Rekombinationstechniken und Standardtechniken der molekularen Klonierung, die hierin verwendet werden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden vollständiger in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (hiernach "Maniatis"), beschrieben.
  • "PCR" oder "Polymerasekettenreaktion" ist Fachleuten auf dem Gebiet gut als eine Technik bekannt, die zur Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte verwendet wird ( US-Patente Nr. 4 683 195 und 4 800 159 ).
  • Nukleinsäurefragmente, die für wenigstens einen Teil mehrerer WUS-Proteine codieren, sind durch Vergleich zufälliger Pflanzen-cDNA-Sequenzen mit öffentlichen Datenbanken, die Nukleotid- und Proteinsequenzen enthalten, unter Verwendung des Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannten BLAST-Algorithmus isoliert und identifiziert worden. Die Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um cDNAs und Gene, die für homologe Proteine codieren, aus den gleichen oder anderen Pflanzenarten zu isolieren. Die Isolation homologer Gene unter Verwendung Sequenz-abhängiger Protokolle ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für Sequenz-abhängige Protokolle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Verfahren der Nukleinsäurehybridisierung und Verfahren der DNA- und RNA-Amplifikation, wie sie durch zahlreiche Verwendungen der Nukleinsäure-Amplifikationstechnologien (z.B. Polymerasekettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion) beispielhaft dargestellt werden.
  • Beispielsweise könnten Gene, die für andere WUS-Proteine codieren, entweder als cDNAs oder genomische DNAs direkt isoliert werden, indem die gesamten oder ein Teil der vorliegenden Nukleinsäurefragmente als DNA-Hybridisierungssonden zum Screenen bzw. Durchmustern von Bibliotheken aus einer beliebigen gewünschten Pflanze unter Einsatz einer Methodologie, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist, verwendet werden. Spezifische Oligonukleotid-Sonden, die auf den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen basieren, können konstruiert und synthetisiert werden mittels Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Maniatis). Darüber hinaus kann eine vollständige DNA-Sequenz verwendet werden, um direkt DNA-Sonden mittels Verfahren zu synthetisieren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, z.B. Zufalls-Primer-DNA-Markierung, Nick-Translation, Endmarkierungstechniken oder RNA-Sonden unter Verwendung verfügbarer in vitro-Transkriptionssysteme. Zusätzlich können spezifische Primer konstruiert und verwendet werden, um die gesamten oder einen Teil der vorliegenden Sequenzen zu amplifizieren. Die resultierenden Amplifikationsprodukte können direkt während der Amplifikationsreaktionen markiert werden oder sie können direkt nach den Amplfikationsreaktionen markiert werden, und als Sonden zum Isolieren von Volllängen-cDNA oder genomischen Fragmenten unter Bedingungen einer geeigneten Stringenz verwendet werden.
  • Zusätzlich können zwei kurze Abschnitte der vorliegenden Nukleinsäurefragmente in Polymerasekettenreaktionsprotokollen zum Amplifizieren längerer Nukleinsäurefragmente, die für homologe Gene codieren, aus DNA oder RNA verwendet werden. Die Polymerasekettenreaktion kann auch an einer Bibliothek klonierter Nukleinsäurefragmente durchgeführt werden, wobei die Sequenz eines Primers von den vorliegenden Nukleinsäurefragmenten abgeleitet ist und die Sequenz des anderen Primers einen Vorteil aus dem Vorhandensein der Polyadenylsäure-Trakte am 3'-Ende des Pflanzen-Gene-codierenden mRNA-Vorläufers zieht. Alternativ kann die zweite Primersequenz auf Sequenzen, die aus dem Klonierungsvektor abgeleitet sind, basieren. Beispielsweise kann der Fachmann dem RACE-Protokoll (Frohman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002) folgen, um cDNAs zu generieren, wobei PCR zum Amplifizieren von Kopien der Region zwischen einem einzelnen Punkt im Transkript und dem 3'- oder 5'-Ende verwendet wird. Primer, die in die 3'- und 5'-Richtungen orientiert sind, können ausgehend von den vorliegenden Sequenzen entworfen werden. Unter Verwendung von im Handel erhältlichen 3'-RACE- oder 5'-RACE-Systemen (BRL) können spezifische 3'- oder 5'-cDNA-Fragmente isoliert werden (Ohara et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673-5677; Loh et al. (1989), Science 243:217-220). Produkte, die mittels der 3'- und 5'-RACE-Verfahrensweisen generiert werden, können zum Erzeugen von Vollängen-cDNAs kombiniert werden (Frohman und Martin (1989), Techniques 1:165). Folglich können ein Polypeptid, umfassend eine Nukleotidsequenz aus mindestens einem von 60 (vorzugsweise mindestens einem von 40, am stärksten bevorzugt einem aus 30) zusammenhängenden Nukleotiden, die aus einer Nukleotidsequenz abgeleitet sind, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ ID NOs: 5 oder 7 und 23, und das Komplemente derartiger Nukleotidsequenzen in derartigen Verfahren verwendet, um ein Nukleinsäurefragment zu erhalten, das für einen wesentlichen Teil einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert.
  • Die Verfügbarkeit der vorliegenden Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen erleichtert das immunologische Screening von cDNA-Expressionsbibliotheken. Synthetische Peptide, die Teile der vorliegenden Aminosäuresequenzen wiedergeben, können synthetisiert werden. Diese Peptide können zum Immunisieren von Tieren verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper mit Spezifität für Peptide oder Proteine, die die Aminosäuresequenzen umfassen, zu produzieren. Diese Antikörper können dann verwendet werden, um cDNA-Expressionsbibliotheken zum Isolieren von Volllängen-cDNA-Klonen von Interesse zu screenen (Lerner (1984), Adv. Immunol. 36:1-34; Maniatis).
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung Viren und Wirtszellen, die entweder die chimären Gene der Erfindung, wie hierin beschrieben, oder ein isoliertes Polynukleotid der Erfindung, wie hierin beschrieben, umfassen. Beispiele für Wirtszellen, die in der Ausführung der Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hefe, Bakterien und Pflanzen.
  • Wie obenstehend bemerkt wurde, können die Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, in denen die offenbarten Polypeptide in höheren oder niedrigeren Spiegeln als normal oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen, in denen sie normalerweise nicht gefunden werden, vorhanden sind. Dies würde die Wirkung der Änderung der Entwicklung (z.B. Initiierung und Aufrechterhaltung von Meristemapikalinitialen) in diesen Pflanzen aufweisen.
  • Eine Überexpression der Proteine der vorliegenden Erfindung kann bewerkstelligt werden, indem zuerst ein chimäres Gen konstruiert wird, in dem die codierende Region funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der dazu fähig ist, die Expression eines Gens in den gewünschten Geweben auf der gewünschten Entwicklungsstufe zu steuern. Das chimäre Gen kann Promotorsequenzen und Translationsleadersequenzen umfassen, die von den gleichen Genen abgeleitet sind. 3'-nicht-codierende Sequenzen, die für Transkriptionsterminationssignale codieren, können ebenfalls bereitgestellt werden. Das vorliegende chimäre Gen kann auch ein oder mehrere Introns umfassen, um die Genexpression zu begünstigen.
  • Plasmidvektoren, die das vorliegende isolierte Polynukleotid (oder chimäre Gen) umfassen, können konstruiert werden. Die Wahl des Plasmidvektors ist abhängig von dem Verfahren, das zum Transformieren von Wirtspflanzen verwendet wird. Der Fachmann ist sich der genetischen Elemente, die auf dem Plasmidvektor zum erfolgreichen Transformieren, Selektieren und Propagieren von Wirtszellen, die das chimäre Gen enthalten, vorhanden sein müssen, wohl bewusst. Der Fachmann wird auch erkennen, dass verschiedene unabhängige Transformationsereignisse in unterschiedlichen Expressionsleveln und -mustern resultieren werden (Jones et al. (1985), EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989), Mol. Gen. Genetics 218:78-86), und dass deshalb mehrfache Ereignisse gescreent werden müssen, um Linien zu erhalten, die den gewünschten Expressionslevel und das gewünschte Expressionsmuster zeigen. Ein derartiges Screening kann mittels Southern-Analyse von DNA, Northern-Analyse der mRNA-Expression, Western-Analyse der Proteinexpression oder Phänotyp-Analyse bewerkstelligt werden.
  • Für einige Anwendungen kann es nützlich sein, die vorliegenden Polypeptide zu verschiedenen Zellkompartimenten zu führen oder ihre Sekretion aus der Zelle zu erleichtern. Es ist somit vorgesehen, dass das oben beschriebene chimäre Gen weiter supplementiert werden kann, indem die codierende Sequenz dazu gebracht wird, die vorliegenden Polypeptide mit geeigneten intrazellulären Targetierungssequenzen, wie z.B. Transitsequenzen (Keegstra (1989), Cell 56:247-253), Signalsequenzen oder Sequenzen, die für eine Lokalisierung im plasmatischen Reticulum codieren (Chrispeels (1991), Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53) oder nukleären Lokalisierungssignalen (Raikhel (1992), Plant Phys. 100:1627-1632) zu codieren, wobei Targetierungssequenzen, die bereits vorhanden sind, entfernt werden oder nicht. Während die angeführten Literaturverweise Beispiele für diese geben, ist die Liste nicht erschöpfend, und Targetierungssignale zur Verwendung können in der Zukunft entdeckt werden.
  • Es kann auch wünschenswert sein, für manche Anwendungen die Expression von Genen, die für die vorliegenden Polypeptide in Pflanzen codieren, zu verringern oder zu eliminieren. Um dies zu bewerkstelligen, kann ein für die Co-Suppression des vorliegenden Polypeptids gedachtes chimäres Gen konstruiert werden, indem ein Gen oder Genfragment, das für dieses Polypeptid codiert, mit Pflanzen-Promotorsequenzen verknüpft wird. Alternativ kann ein chimäres Gen, das dazu gedacht ist, Antisense-RNA für das gesamte oder einen Teil des vorliegenden Nukleinsäurefragments zu exprimieren, konstruiert werden, indem das Gen oder Genfragment in umgekehrter Orientierung mit Pflanzenpromotorsequenzen verknüpft wird. Jedes der chimären Co-Suppressions- oder Antisense-Gene könnte über eine Transformation in Pflanzen eingeführt werden, wobei die Expression der korrespondierenden endogenen Gene verringert oder eliminiert wird.
  • Molekulargenetische Lösungen zur Erzeugung von Pflanzen mit veränderter Genexpression haben einen entscheidenden Vorteil gegenüber traditionelleren Pflanzenzüchtungsansätzen. Änderungen in Pflanzenphänotypen können durch spezifisches Inhibieren der Expression von einem oder mehreren Genen durch Antisense-Inhibierung oder Co-Suppression ( US-Patente Nr. 5 190 931 , 5 107 065 und 5 283 323 ) erzeugt werden. Ein Antisense- oder Co-Suppressionskonstrukt würde als ein dominanter negativer Regulator der Genaktivität wirken. Während herkömmliche Mutationen eine negative Regulation der Genaktivität bereitstellen können, sind diese Effekte höchstwahrscheinlich rezessiv. Die dominant negative Regulation, die bei einer transgenen Herangehensweise verfügbar ist, kann aus Züchtungssicht vorteilhaft sein. Zusätzlich kann die Fähigkeit, die Expression eines spezifischen Phänotyps auf die reproduktiven Gewebe der Pflanze zu beschränken, indem Gewebespezifische Promotoren verwendet werden, agro nomische Vorteile in Bezug auf konventionelle Mutationen, die eine Auswirkung in allen Geweben haben können, in denen ein mutantes Gen gewöhnlicherweise exprimiert wird, verleihen.
  • Der Fachmann wird wissen, dass spezielle Erwägungen mit der Verwendung von Antisense- oder Co-Suppressionstechnologien, um die Expression bestimmter Gene zu verringern, zusammenhängen. Beispielsweise kann der geeignete Expressionslevel von Sense- oder Antisense-Genen die Verwendung verschiedener chimärer Gene, die verschiedene Regulationselemente, die dem Fachmann bekannt sind, verwenden, erfordern. Sobald transgene Pflanzen durch eines der oben beschriebenen Verfahren erhalten werden, wird es notwendig sein, einzelne transgene (Pflanzen) ("transgenics") auf jene zu durchmustern, die den gewünschten Phänotyp am wirksamsten zeigen. Demgemäß wird der Fachmann Verfahren zum Durchmustern bzw. Screenen großer Zahlen von Transformanten entwickeln. Die Natur dieser Durchmusterungen wird im Allgemeinen anhand praktischer Gründe gewählt. Beispielsweise kann man durch Suchen nach Änderungen in der Genexpression unter Verwendung von Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind, das durch das supprimierte Gen codiert wird, durchmustern, oder man könnte Assays etablieren, die eine Enzymaktivität in spezifischer Weise messen. Ein bevorzugtes Verfahren wird eines sein, das es erlaubt, große Zahlen von Proben schnell zu bearbeiten, da erwartet wird, dass eine große Zahl von Transformanten hinsichtlich des gewünschten Phänotyps negativ sein wird.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid, das durch ein Polynukleotid der Erfindung codiert wird.
  • Die vorliegenden Polypeptide (oder Teile davon) können in heterologen Wirtszellen, insbesondere den Zellen mikrobieller Wirte, produziert werden und können verwendet werden, um Antikörper gegen diese Proteine mittels Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, herzustellen. Die Antikörper sind zum Detektieren der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in situ in Zellen oder in vitro in Zellextrakten nützlich. Bevorzugte heterologe Wirtszellen zur Produktion der vorliegende Polypeptide sind mikrobielle Wirte. Mikrobielle Expressionssysteme und Expressionsvektoren, die Regulationssequenzen, die zur Expression fremder Proteine auf hohem Level führen, enthalten, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Jegliche von diesen könnten verwendet werden, um ein chimäres Gen zur Produktion der vorliegenden Polypeptide zu konstruieren. Dieses chimäre Gen könnte dann über eine Transformation in einen geeigneten Mikroorganismus eingeführt werden, um die Expression des codierten WUS-Proteins auf hohem Level bereitzustellen. Ein Beispiel für einen Vektor zur Expression der vorliegenden Polypeptide auf hohem Level in einem bakteriellen Wirt wird bereitgestellt (Beispiel 12).
  • Die gesamten oder ein wesentlicher Teil der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden zur genetischen und physikalischen Kartierung ("mapping") der Gene, von denen sie ein Teil sind, verwendet werden und können als Marker für Merkmale, die mit diesen Genen verknüpft sind, verwendet werden. Eine derartige Information kann in der Pflan zenzüchtung nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Beispielsweise können die vorliegenden Nukleinsäurefragmente als Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Maniatis) Restriktionsverdauter genomischer Pflanzen-DNA können mit den Nukleinsäurefragmenten der vorliegenden Erfindung (als Sonde) untersucht werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen unter Verwendung von Computerprogrammen, wie z.B. MapMaker (Lander et al. (1987), Genomics 1:174-181) unterworfen werden, um eine Genkarte zu konstruieren. Zusätzlich können die Nukleinsäurefragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Southern-Blots, die Restriktionsendonuklease-behandelte, genomische DNAs eines Satzes von Individuen, die die Eltern und Nachkommenschaft einer definierten genetischen Kreuzung darstellen, zu untersuchen. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der vorliegenden Nukleinsäuresequenz in der genetischen Karte, die zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde, zu berechnen (Botstein et al. (1980), Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
  • Die Herstellung und Verwendung von von Pflanzengenen abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986), Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41 beschrieben. Zahlreiche Publikationen beschreiben die genetische Kartierung spezifischer DNA-Klone unter Verwendung der obenstehend beschriebenen Methodologie oder von Variationen davon. Beispielsweise können F2-Artenkreuzungspopulationen ("F2 intercross populations"), Rückkreuzungspopulationen, zufällig gepaarte bzw. befruchtete Populationen, nahe-isogene Linien und andere Sätze von Individuen zur Kartierung verwendet werden. Derartige Methodologien sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
  • Nukleinsäuresonden, abgeleitet von den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen, können auch zur physikalischen Kartierung verwendet werden (d.h., Platzierung bzw. Anordnung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319-346, und die darin zitierten Literaturverweise).
  • In einer anderen Ausführungsform können Nukleinsäuresonden, abgeleitet von den vorliegenden Nukleinsäuresequenzen, in der direkten Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs (FISH)-Kartierung (Trask (1991), Trends Genet. 7:149-154) verwendet werden. Obwohl vorliegende Verfahren der FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone (etliche bis etliche hundert KB, siehe Laan et al. (1995), Genome Res. 5:13-20), favorisieren, erlauben Verbesserungen hinsichtlich der Empfindlichkeit die Durchführung einer FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden.
  • Eine Vielfalt an Nukleinsäureamplifizierung-basierten Verfahren der genetischen und physikalischen Kartierung können unter Verwendung der vorliegenden Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Beispiele umfassen Allel-spezifische Amplifikation (Kazazian (1989), J. Lab. Clin. Med. 11:95-96), Polymorphismus PCR-amplifizierter Fragmente (CAPS; Sheffield et al. (1993), Genomics 16:325-332), Allel-spezifische Ligation (Landegren et al. (1988), Science 241:1077-1080), Nukleotidverlängerungsreaktionen (Sokolov (1990), Nucleic Acids Res. 18:3671), Radiation-Hybrid-Kartierung (Walters et al. (1997), Nat. Genet. 7:22-28) und "Happy Mapping" (Dear und Cook (1989), Nucleic Acid Res. 17:6795-6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz eines Nukleinsäurefragments mm Entwerfen und Erzeugen von Primerpaaren zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen verwendet. Der Entwurf derartiger Primer ist Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Bei Verfahren, in denen eine PCR-basierte genetische Kartierung eingesetzt wird, kann es nötig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung ("mapping cross") in der Region, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht, zu identifizieren. Dies ist jedoch im Allgemeinen bei Kartierungsverfahren nicht nötig.
  • Funktionsverlust-mutante Phänotypen können für die vorliegenden cDNA-Klone entweder durch Protokolle der targetierten Genunterbrechung oder durch Identifizieren spezifischer Mutanten für diese Gene, die in einer Maispopulation, die Mutationen in allen möglichen Genen trägt, identifiziert werden (Ballinger und Benzer (1989), Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9402-9406; Koes et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:8149-8153; Sensen et al. (1995), Plant Cell 7:75-84). Der letztgenannte Ansatz kann auf zwei Weisen bewerkstelligt werden. Erstens können kurze Abschnitte der vorliegenden Nukleinsäurefragmente in Polymerasekettenreaktions-Protokollen in Verbindung mit einem Mutations-tag-Sequenz-Primer ("mutation tag sequence primer") auf DNAs angewendet werden, die aus einer Population von Pflanzen hergestellt wurden, in die Mutator-Transposons oder ein anderes Muations-verursachendes DNA-Element eingeführt worden sind (siehe Sensen; supra). Die Amplifikation eines spezifischen DNA-Fragments mit diesen Primer zeigt die Insertion des Mutations-tag-Elements in das oder nahe des Pflanzengen(s), das für das vorliegende Polypeptid codiert, an. Alternativ kann das vorliegende Nukleinsäurefragment als Hybridisierungssonde gegen PCR-Amplifikationsprodukte, erzeugt aus der Mutationspopulation unter Verwendung des Mutations-tag-Sequenz-Primers in Verbindung mit einem Primer für eine zufällige Genomstelle, wie z.B. dem für einen Restriktionsenzymstellen-verankerten synthetischen Adaptor, verwendet werden. Mit beiden Verfahren kann eine Pflanze, die eine Mutation in dem endogenen Gen, das für das vorliegende Polypeptid codiert, enthält, identifiziert und erhalten werden. Diese mutante Pflanze kann dann verwendet werden, um die natürliche Funktion der vorliegenden Polypeptide, die hierin offenbart sind, zu bestimmen oder zu bestätigen.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter definiert, in denen Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind und Grade (Grad) Celsius sind, sofern nicht anders angegeben. Es sollte verstanden werden, dass diese Beispiele, während sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, nur zum Zwecke der Erläuterung angegeben werden. Aufgrund der obenstehenden Diskussion und dieser Beispiele kann ein Fachmann die wesentlichen Merkmale dieser Erfindung ermitteln und kann, ohne von deren Geist und Umfang abzuweichen, zahlreiche Änderungen und Modifikationen der Erfindung erstellen, um sie zahlreichen Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Somit werden zahlreiche Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu denen, die hierin gezeigt und beschrieben sind, Fachleuten auf dem Gebiet aufgrund der vorstehenden Beschreibung offensichtlich sein. Es ist auch beabsichtigt, dass derartige Modifikationen in den Umfang der angehängten Ansprüche fallen.
  • BEISPIEL 1
  • Zusammensetzung von cDNA-Bibliotheken; Isolierung und Sequenzierung von cDNA-Klonen
  • cDNA-Bibliotheken, die mRNAs aus zahlreichen Mais (Zea mays)- und Sojabohnen (Glycine max)-Geweben repräsentieren, wurden hergestellt. Die Merkmale der Bibliotheken sind nachstehend beschrieben. TABELLE 2 cDNA-Bibliotheken aus Mais und Sojabohne
    Bibliothek Gewebe Klon
    cpg1c Mais, gepoolt, BMS, behandelt mit Chemikalien, die mit RNA, DNA-Synthese in Beziehung stehen* cpg1c.pk006.b16
    cpi1c Mais, gepoolt, BMS, behandelt mit Chemikalien, die mit der Synthese biochemischer Verbindungen in Beziehung stehen** cpi1c.pk012.p19
    p0016 Maisquastensprosse ("Corn Tassel Shoots"), gepoolt, 0,1-1,4 cm p0016.ctsas50r
    p0058 Süßmaishybriden (Honey N Pearl)-Sprosskultur p0058.chpab57r
    p0083 Ganze Maiskörner, 7 Tage nach der Bestäubung p0083.cldev71r
    scr1c Sojabohne, embryogene Suspensionskultur, die 4 Vakuumzyklen unterworfen und 12 h später gesammelt wurde scr1c.pk001.d2
    ses4d Sojabohne, embryogene Suspension, 4 Tage nach Subkul ses4d.pk0033.c8
    sgs5c tur sgs5c.pk0002.f2
    ssm Sojabohne, Samen, 4 Tage nach Keimung Sojabohne, Sprossmeristem ssm.pk0060.h4
    • * Die verwendeten Chemikalien umfassten Hydroxyharnstoff, Aphidicolin, HC-Toxin, Actinomycin D, wobei alle von Calbiochem-Novabiochem Corp. erhalten werden können.
    • ** Die verwendeten Chemikalien umfassten Sorbit, Ergosterol, Taxifolin, Methotrexat, D-Mannose, D-Galactose, alpha-Aminoadipinsäure, Ancymidol, wobei alle von Calbiochem-Novabiochem Corp. erhalten werden können
  • cDNA-Bibliotheken können durch ein beliebiges von vielen verfügbaren Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können die cDNAs in Plasmidvektoren eingeführt werden, in dem zuerst die cDNA-Bibliotheken in Uni-ZAPTM-Vektoren gemäß dem Protokoll des Herstellers (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) hergestellt werden. Die Uni-ZAPTMXR-Bibliotheken werden gemäß dem von Stratagene bereitgestellten Protokoll in Plasmid-Bibliotheken umgewandelt. Nach der Umwandlung werden die cDNA-Inserts im Plasmidvektor pBluescript enthalten sein. Zusätzlich können die cDNAs direkt in vorgeschnittene Bluescript II SK(+)-Vektoren (Stratagene) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) eingefügt werden, gefolgt von einer Transfektion in DH10B-Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers (GIBCO BRL-Produkte). Sobald die cDNA-Inserts in Plasmidvektoren sind, werden Plasmid-DNAs aus zufällig abgeimpften Bakterienkolonien, die rekombinante pBluescript-Plasmide enthalten, hergestellt oder die Insert-cDNA-Sequenzen werden über eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primern, die für die Vektorsequenzen, die die insertierten cDNA-Sequenzen flankieren, spezifisch sind, amplifiziert. Amplifizierte Insert-DNAs oder Plasmid-DNAs werden in Farbstoff-Primer-Sequenzierungsreaktionen sequenziert, um partielle cDNA-Sequenzen (expressed sequence tags oder "ESTs"; siehe Adams et al. (1991), Science 252:1651-1656) zu erzeugen. Die resultierenden ESTs werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Sequenziergeräts vom Typ Perkin Elmer, Modell 377, analysiert.
  • "Full-insert"-Sequenz (FIS)-Daten werden unter Verwendung eines modifizierten Transpositionsprotokolls erzeugt. Klone, die für FIS identifiziert sind, werden aus archivierten Glycerin-Stammkulturen ("glycerol stocks") als einzelne Kolonien gewonnen, und Plasmid-DNAs werden über eine alkalische Lyse isoliert. Isolierte DNA-Matrizen werden mit Vektorbasierten ("vector primed") M13-Vorwärts- und -Rückwärts-Oligonukleotiden in einer PCR-basierten Sequenzierungsreaktion umgesetzt und auf automatisierte Sequenziergeräte geladen. Eine Bestätigung des Klons wird mittels Sequenz-Alignment mit der ursprünglichen EST-Sequenz, aus der die FIS-Anfrage erzeugt wird, durchgeführt.
  • Bestätigte Matrizen werden transposiert mittels des Primer Island-Transpositionskits (PE Applied Biosystems, Foster City, CA), das auf dem transposierbaren Tyl-Element aus Saccharomyces cerevisiae basiert (Devine und Boeke (1994), Nucleic Acids Res. 22:3765-3772). Das in vitro-Transpositionssystem platziert einzigartige Bindungsstellen zufällig über eine Population großer DNA-Moleküle hinweg. Die transposierte DNA wird dann verwendet, um Elektrokompetente DH10B-Zellen (GIBCO BRL/Life Technologies, Rockville, MD) mittels Elektroporation zu transformieren. Das transposierbare Element enthält einen zusätzlichen selektierbaren Marker (mit DHFR bezeichnet; Fling und Richards (1983), Nucleic Acids Res. 11: 5147-5158), der auf Agarplatten eine duale bzw. doppelte Selektion nur der Klone erlaubt, die das integrierte Transposon enthalten. Mehrfache Subklone werden zufällig aus jeder Transpositionsreaktion ausgewählt, Plasmid-DNAs werden über eine alkalische Lyse präpariert und die Matrizen werden vom Ort des Transpositionsereignisses nach außen sequenziert (ABI Prism dye-terminator ReadyReaction-Gemisch), wobei einzigartige Primer verwendet werden, die für die Bindungsstellen innerhalb des Transposons spezifisch sind.
  • Sequenzdaten werden gesammelt (ABI Prism-Sammlungen) und unter Verwendung von Phred/Phrap (P. Green, University of Washington, Seattle) assembliert bzw. zusammengesetzt. Phrep/Phrap ist ein Public-Domain-Softwareprogramm, das die ABI-Sequenzdaten erneut einliest, die Basen erneut aufruft, Qualitätswerte zuweist und die Basenaufrufe und Qualitätswerte in editierbare Ausgabedateien schreibt. Das Phrap-Sequenzassemblierungsprogramm verwendet diese Qualitätswerte, um die Genauigkeit der assemblierten Sequenz-Contigs zu erhöhen. Die Assemblies bzw. zusammengesetzten Sequenzen werden mittels des Consed-Sequenz-Editors (D. Gordon, University of Washington, Seattle) betrachtet.
  • BEISPIEL 2
  • Identifizierung von cDNA-Klonen
  • cDNA-Klone, die das WUS-Protein codieren, wurden mittels Durchführen von BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. (1993), J. Mol. Biol. 215:403-410; siehe auch www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)-Recherchen auf Ähnlichkeit zu Sequenzen, die in der BLAST "nr"-Datenbank (die alle nicht-redundanten GenBank-CDS-Translationen, Sequenzen, die aus der Brookhaven Protein-Datenbank für dreidimensionale Strukturen abgeleitet sind, die neueste Version der SWISS-PROT-Proteinsequenz-Datenbank, die EMBL- und DDBJ-Datenbanken umfasst), enthalten sind, durchgeführt wurde. Die in Beispiel 1 erhaltenen cDNA-Sequenzen wurden auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen DNA-Sequenzen, die in der "nr"-Datenbank enthalten sind, analysiert, wobei der BLASTN-Algorithmus, bereitgestellt durch das National Center for Biotechnology Information (NCBI), verwendet wurde. Die DNA-Sequenzen wurden in alle Leseraster translatiert und auf Ähnlichkeit mit allen öffentlich zugänglichen Proteinsequenzen, die in der "nr"-Datenbank enthalten sind, verglichen, wobei der BLASTX-Algorithmus (Gish und States (1993), Nat. Genet. 3:266-272), bereitgestellt durch das NCBI, verwendet wurde. Zweckdienlicherweise werden die P-Werte (Wahrscheinlichkeit) der lediglich zufälligen Beobachtung einer Übereinstimmung einer cDNA-Sequenz mit einer Sequenz, die in den durchsuchten Datenbanken enthalten ist, wie sie durch BLAST berechnet werden, hierin als "pLog"-Werte angegeben, die das Negative des Logarithmus des berichteten P-Wertes darstellen. Demgemäß ist die Wahrscheinlichkeit, dass die cDNA-Sequenz und der BLAST-"Treffer" homologe Proteine darstellen, um so größer, je größer der pLog-Wert ist.
  • ESTs, die zur Analyse eingegeben werden, werden mit der Genbank-Datenbank wie oben beschrieben verglichen. ESTs, die Sequenzen enthalten, die eher in 5' oder in 3' sind, können gefunden werden, indem der BLASTn-Algorithmus (Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) gegen die proprietäre DuPont-Datenbank angewendet wird, wobei Nukleotidsequenzen verglichen werden, die gemeinsame oder überlappende Regionen der Sequenzhomologie haben. Wenn gemeinsame oder überlappende Sequenzen zwischen zwei oder mehr Nukleinsäurefragmenten bestehen, können die Sequenzen zu einer einzigen zusammenhängenden Nukleotidsequenz assembliert werden, wodurch das ursprüngliche Fragment entweder in der 5'- oder 3'-Richtung verlängert wird. Sobald der am weitesten in 5' liegende EST identfiziert ist, kann seine vollständige Sequenz mittels full-insert-Sequenzierung bestimmt werden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Homologe Gene, die zu verschiedenen Arten gehören, können gefunden werden, indem die Aminosäuresequenz eines bekannten Gens (entweder eine proprietäre Quelle oder eine öffentliche Datenbank) gegen eine EST-Datenbank unter Anwendung des tBLASTn-Algorithmus verglichen wird. Der tBLASTn-Algorithmus sucht eine Aminosäureanfrage in einer Nukleotid-Datenbank, die in alle 6 Leseraster translatiert ist. Diese Recherche ermöglicht Unterschiede in der Nukleotidkodonverwendung zwischen verschiedenen Arten, und sie ermöglicht die Codondegeneriertheit.
  • BEISPIEL 3
  • Charakterisierung von cDNA-Klonen, die für WUS-Protein-Homologe codieren
  • Die BLASTX-Recherche unter Verwendung der EST-Sequenzen aus den in Tabelle 3 aufgelisteten Klonen, offenbarte eine Ähnlichkeit der Polypeptide, die von den cDNAs codiert werden, zu WUS-Proteinen aus Arabidopsis thaliana (NCBI GenBank-Identifikator bzw. -Kennzahl (GI) Nr. 3785979) und Arabidopsis thaliana (NCBI GI Nr. 4090200). In Tabelle 3 sind die BLAST-Ergebnisse für einzelne ESTs ("EST"), die Sequenzen der gesamten cDNA-Inserts, die die angegebenen cDNA-Klone ("FIS") umfassen, oder Contigs, assembliert aus zwei oder mehr ESTs ("Contig"), angegeben: TABELLE 3 BLAST-Ergebnisse für Sequenzen, die Polypeptide codieren, die zu Arabidopsis thaliana-WUS-Proteinen homolog sind
    Klon Status BLAST-pLog-Bewertung
    Contig, bestehend aus: cpg1c.pk006.b16 cpi1c.pk012.p19 Contig 14,30 (NCBI GI Nr. 3785979)
    p0016.ctsas50r EST 31,00 (NCBI GI Nr. 4090200)
    p0083.cldev7lr EST 17,40 (NCBI GI Nr. 3785979)
    Contig, bestehend aus: scr1c.pk001.d2 ses4d.pk0033.c8 Contig 24,52 (NCBI GI Nr. 3785979)
  • Die Daten in Tabelle 4 geben eine Berechnung der prozentualen Identität der Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NOs: 2, 6, 12 und 16 angegeben sind und den Arabidopsis thaliana (NCBI GI Nr. 3785979) und (NCBI GI Nr. 4090200)-Sequenzen wieder. Die prozentuale Identität zwischen den in SEQ ID NOs: 2, 6, 12 und 16 angegebenen Sequenzen reichte von 35-40%. TABELLE 4 Prozentuale Identität der Aminosäuresequenzen, die aus den Nukleotidsequenzen von cDNA-Klonen, die für Polypeptide codieren, die zu Arabidopsis thaliana-WUS-Proteinen homolog sind, abgeleitet wurden
    SEQ ID NO. Prozentuale Identität zu
    2 43% (NCBI GI Nr. 3785979)
    6 45% (NCBI GI Nr. 4090200)
    12 37% (NCBI GI Nr. 3785979)
    16 37% (NCBI GI Nr. 3785979)
  • Die Sequenz der gesamten cDNA-Inserts in den meisten der in Tabelle 3 aufgelisteten Klone wurde bestimmt. Eine weitere Sequenzierung und Recherche in der proprietären DuPont-Datenbank ermöglichte die Identifizierung anderer Mais- und Sojabohnenklone, die für WUS-Proteine codieren. Die BLASTX-Recherche unter Verwendung der EST-Sequenzen aus den in Tabelle 5 aufgelisteten Klonen offenbarte eine Ähnlichkeit der durch die cDNAs codierten Polypeptide mit WUS-Proteinen aus Arabidopsis thaliana (NCBI GI Nrn. 3785979, 4090200, 4580396, 9294502 und 6091768) und Oryza sativa (NCBI GI Nr. 8099120). In Tabelle 5 sind die BLAST-Ergebnisse für einzelne ESTs ("EST"), die Sequenzen der gesamten cDNA-Inserts, die die angegebenen cDNA-Klone umfassen ("FIS"), Sequenzen von aus zwei oder mehr ESTs assemblierten Contigs ("Contig"), Sequenzen von aus einem FIS und einem oder mehreren ESTs oder einer PCR-Fragmentsequenz assemblierten Contigs ("Contig*") oder Sequenzen, die für das ganze Protein codieren, abgeleitet von einem EST, einer FIS, einem Contig oder einer FIS- und PCR-Fragmentsequenz ("CGS") gezeigt: TABELLE 5 BLAST-Ergebnisse für Sequenzen, die für Polypeptide, die zu WUS-Proteinen homolog sind, codieren
    Klon Status BLAST-Ergebnisse:
    NCBI-GI-Nr. BLAST-pLog-Bwertung
    cpi1c.pk012.p19 (FIS) CGS 3785979 21,30
    p0016.ctsas50r FIS 4090200 27,00
    p0058.chpab57r (FIS) CGS 6091768 36,52
    p0083.cldev71r FIS 4580396 15,70
    scr1c.pk001.d2 FIS 3785979 20,04
    ses4d.pk0033.c8 (FIS) CGS 3785979 21,10
    sgs5c.pk0002.f2 (EST) CGS 8099120 23,70
    Contig von ssm.pk0060.h4 (FIS) NCBI GI Nr. 4395781 CGS 9294502 23,00
  • 1 stellt ein Alignment bzw. eine Angleichung der Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NOs: 4, 10, 20, 22 und 24 angegeben sind, und der Arabidopsis-thaliana-Sequenz (NCBI-GI-Nr. 4090200; SEQ ID NO:25) dar. Die Daten in Tabelle 6 stellen eine Berechnung der prozentualen Identität der Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NOs 4, 10, 20, 22 und 24 angegeben sind, und der Arabidopsis-thaliana-Sequenz (NCBI-GI-Nr. 4090200; SEQ ID NO: 25) dar. TABELLE 6 Prozentuale Identität von Aminosäuresequenzen, die aus den Nukleotidsequenzen von cDNA-Klonen, die für Polypeptide codieren, die zu WUS-Protein homolog sind, abgeleitet sind
    SEQ ID NO. Prozentuale Identität zu NCBI-GI-Nr. 4090200; SEQ ID NO:25
    4 22,7
    10 18,2
    20 25,0
    22 21,6
    24 22,2
  • Die Sequenz-Alignments und die Berechnungen der prozentualen Identität wurden unter Verwendung des Megalign-Programms des LASERGENE-Bioinformatics-Berechnungspakets (DNASTAR Inc., Madison, WI) durchgeführt. Mehrfache Alignments der Sequenzen wurden unter Verwendung der Clustal-Alignment-Methode (Higgins und Sharp (1989), CABIOS. 5:151-153) mit den Default-Parameter (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10) durchgeführt. Die Default-Parameter für paarweise Alignments unter Anwendung der Clustal-Methode waren KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5.
  • Die Sequenz-Alignments und BLAST-Bewertungen und -Wahrscheinlichkeiten weisen darauf hin, dass die Nukleinsäurefragmente, die die vorliegenden cDNA-Klone umfassen, für einen wesentlichen Teil eines WUS-Proteins codieren. Diese Sequenzen stellen die ersten der Anmelderin bekannten Mais- und Sojabohnensequenzen, die für WUS-Proteine codieren, dar.
  • BEISPIEL 4
  • Sonnenblumen-Meristemtransformation
  • Es gibt eine Anzahl veröffentlichter Beispiele für Meristemtransformationssysteme für dikotyle Arten, einschließlich Sojabohne, Sonnenblume (Bidney et al., 1992) und Baumwolle, wobei chimäre Gene an Zellen des Meristems abgegeben werden und dann an der Bildung von Sprossen, Reproduktionsstrukturen und schließlich Samen teilnehmen. Die Transgenabgabe wird sowohl mittels Standardpartikelbombardierungsprotokollen, wie für Sojabohne beschrieben, oder mittels T-DNA- und Agrobacterium-Protokollen, wie für Sonnenblume und Baumwolle beschrieben, bewerkstelligt. Das WUS-Gen könnte an dikotyle Meristemziele, entweder zur stabilen oder transienten bzw. vorübergehenden Transformation, abgegeben werden, um die Transformationsantwort zu beeinflussen. WUS könnte zusammen mit anderen agronomischen Genen abgegeben werden oder es könnte als eine Konditionierungsbehandlung vor oder im Anschluss an das Protokoll zur DNA-Abgabe verwendet werden. Die Verfahren zur Sonnenblumen-Meristemtransformation folgen.
  • Sonnenblumen-Meristemtransformation wird mittels eines Protokolls für direkte DNA-Abgabe durch Partikelbombardierung oder ein Protokoll, das eine Kombination aus Bombardierung mit DNA-freien Partikeln, gefolgt von der Verwendung einer Agrobacterium-Inokulation zur DNA-Abgabe, wie in Bidney et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:301-313 beschrieben, umfasst, erreicht., Die Sonnenblumenlinie SMF3, beschrieben in Burrus et al., 1991, Plant Cell Rep. 10:161-166, wird verwendet. Die Explantatquelle ist trockener Sonnenblumensamen, der imbibiert und zu Meristemexplantaten dissektiert wird. Die Samen werden geschält bzw. entspelzt und oberflächensterilisiert, dann in sterile Petrischalen auf zwei Lagen Filterpapier, das mit sterilem destillierten Wasser befeuchtet ist, über Nacht zur Imbibition bzw. Quellung gegeben, und zwar im Dunklen bei 26°C in einem Percival-Inkubator. Am nächsten Tag werden die Keimblätter und Keimwurzel entfernt, und Meristemexplantate werden auf 374E-Medium (MS-Salze, Shepard-Vitamine, 40 mg/l Adeninsulfat, 3% Saccharose, 0,5 mg/l 6-BAP, 0,25 mg/l IAA, 0,1 mg/l GA, pH 5,6 und 0,8% Phytagar) transferiert. Die Explantate werden für 24 h auf 374E-Medium im Dunkeln bei 26°C kultiviert. Nach dieser Kulturzeitdauer wurden die verlängerten Primärblätter entfernt, um das Apikalmeristem freizulegen. Die Meristemexplantate wurden im Zentrum von Petrischalen mit 374M-Medium (374E mit 1,2% Phytagar) in Vorbereitung der Partikelbombardierung platziert und dann für eine weitere 24-stündige Periode bei 26°C zurück ins Dunkle gebracht.
  • Die Partikelpräparation für das Agrobacterium-basierte Protokoll erfolgt, indem 18,8 mg 1,8 μm-Wolframpartikel oder 21,6 mg 2,0 μm-Goldpartikel in 200 μl absolutem Ethanol suspendiert werden. Nach dem Resuspendieren der Partikel mittels Ultraschallbehandlung und kräftigem Mischen, werden 10 μl der Partikelsuspension auf das Zentrum der Oberfläche eines Macro-Carriers aufgetropft. Platten aus 374M-Medium, enthaltend Sonnenblumen-Meristemexplantate, werden zweimal mittels einer Heliumkanone vom Typ DuPont Biolistics PDS1000 mit einem auf 26 Hg abgesenkten Vakuum, mit 650 psi-Berstscheiben und in der höchsten Einstellung der Kanone beschossen. Nach der Partikelbombardierung werden die Explantate auf den 374M-Platten ausgebreitet, mit einer Agrobacterium-Suspension inokuliert und unter Licht bei 26°C für 4 d co-kultiviert. Die Agrobacterium-Inokulationssuspension wird hergestellt, indem zuerst eine 5 ml-Flüssigkultur in 60A-Medium mit Kanamycin (YEP-Medium – 10 g/l Bactopepton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Natriumchlorid, pH 7,0 und 50 mg/l Kanamycin), gewachsen bis zur log-Phase (OD600 0,5-1,0), gestartet wird. Die Agrobacterium-Suspension im log-Phasen-Wachstum wird bei 6K für 5 min zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Das Bakterienpellet wird in Inokulationsmedium (IM) (IM – 12,5 mM MES, 1 g/l Ammoniumchlo rid, 0,3 g/l Magnesiumsulfat, pH 5,7) zu einer finalen berechneten OD600 vis von 4,0 resuspendiert. Die Agrobacterium-Inokulationssuspension wird zweimal unter Verwendung einer Mikropipette und 0,5 μl Suspension pro Explantat angewandt. Nach der 4-tägigen Co-Kultivierung der Sonnenblumen-Meristemexplantate werden die explantierten Basen der Explantate abgetrennt, und sie werden auf 374C-Medium (374E ohne Hormone, aber unter Zugabe von 250 mg/l Cefotaxim) transferiert und für zwei Wochen im Licht unter 18 h Tageslänge bei 26°C kultiviert.
  • Alternativ kann ein direktes DNA-Abgabeprotokoll auf die Sonnenblumen-Meristemexplantate, hergestellt wie oben beschrieben, angewandt werden. Die Partikel werden wie folgt hergestellt: Zu 50 μl einer 15 mg/ml 0,6 μm Goldpartikelsuspension wird (in dieser Reihenfolge) gegeben: 10 μl DNA (0,1 μg/μl), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl2 (2,5 M). Die Partikelzubereitung wird dann für drei Minuten geschüttelt, in einer Mikrozentrifuge für 10 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden dann einmal in 500 μl 100% Ethanol gewaschen und in 30 μl 100% Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension kann dreimal für je eine Sekunde Ultraschallbehandelt werden. Fünf μl der DNA-beschichteten Goldpartikel werden dann auf jede Macro-Carrier-Scheibe geladen. Meristemexplantate werden bombardiert, wie im obigen Absatz beschrieben, auf 374M-Medium ausgebreitet und für 4 d in einem Percival-Inkubator unter einer Tageslänge von 18 h bei 26°C kultiviert. Die expandierten Basen der Explantate werden dann abgeschnitten, und die Explantate werden auf 374C-Medium für eine 2-wöchige Kultur unter Langtagsbedingungen bei 26°C transferiert.
  • Nach zwei Wochen entwickeln sich Sonnenblumensprossen bzw. -schösslinge aus den Meristemexplantaten auf dem 374C-Medium. Die Sprossen können zerstörend oder nicht-zerstörend hinsichtlich der Frequenz bzw. Häufigkeit transgener Sektoren pro Experiment und die Qualität von Sektoren mit längeren, breiteren und tieferen transgenen Sektoren, die wünschenswerter sind, bewertet werden. Sie können bewertet und mit einer Kontrolle verglichen werden, wobei bewertbare Marker, wie z.B. das GUS-Enzym oder grünes Fluoreszenzprotein (GFP) verwendet werden. Transgene Pflanzen und Samen können erhalten werden, indem der Verfahrensweise Stufen, wie sie nachstehend dargelegt sind, hinzugefügt werden. Ein Assay, wie z.B. ein Enzym-Assay oder ein ELISA für ein agronomisches Protein von Interesse, ist erforderlich. Es wird ein Beispiel bereitgestellt, worin das Enzym Oxalatoxidase als bewertbarer Marker verwendet wird. Für diesen Transformationsprozess ist keine chemische Selektion erforderlich.
  • Primärsprossen nach 2-wöchiger Kultur auf 374C-Medium werden unter Verwendung des Oxalatoxidase-Enzymassays durchmustert. Die Oxalatoxidase-Enzymassays werden unter Verwendung von frischem Blatt- oder Keimblattgewebe aufgesetzt, um Transformanten zu identifizieren. Die Assaymethode wird gemäß dem Protokoll von Suigura et al., 1979, Chem. Pharm. Bull. 27(9):2003-2007, durchgeführt. Der Assay ist eine zweistufige Reaktion, in der Wasserstoffperoxid in der ersten Stufe durch Oxalatoxidase gebildet wird und dann quantitativ durch eine Peroxidase-abhängige Farbreaktion in der zweiten Stufe detektiert wird. Die Farbreaktion wird dann unter Verwendung eines Spektrophotometers unter Verwendung von sichtbarem Licht bei 550 nm gemessen.
  • Transformierte T0-Pflanzen werden ferner durch Oxalatoxidase-Aktivitätsassays charakterisiert, um das fortgesetzte Vorhandensein eines aktiven Transgens zu verifizieren und um festzustellen, ob das Transgen in floralem Gewebe bzw. Blütengewebe vorhanden sein würde. Falls es einen Sektor der Transformation gibt, der sich nicht in einen neuen Teil der wachsenden T0-Pflanze entwickelte, wird dieser Pflanzenteil abgetrennt, um die Initiierung einer Blütenknospe aus Axillarmeristemen zu induzieren. T0-Blüten werden geselbstet, T1-Samen wird gewonnen, und der T1-Samen wird zur Identifizierung transgener T1-Pflanzen gekeimt. Keimblatt- oder Blattgewebe von T1-Sämlingen wird beprobt und verwendet, um hinsichtlich des bewertbaren Transgens zu durchmustern.
  • BEISPIEL 5
  • Ektopische Expression von Sojabohnen-WUS zum Induzieren von Organogenese
  • Zusätzlich zur Untersuchung von WUS in der Meristemtransformation können andere Gewebeexplantate auf die Bildung von Adventivmeristemen nach einer stabilen oder transienten Transformation durch WUS untersucht werden. Die Explantattypen sind auf dem Gebiet der Transformation von dikotylen Pflanzen gut bekannt und könnten Hypokotylexplantate, Blattexplantate, Keimblattexplantate oder unreife Gewebe, wie z.B. einen Embryo oder ein Primärblatt, wie hier für die Sonnenblume beschrieben, umfassen. Wie für Meristemexplantate beschrieben, kann die DNA-Abgabe entweder mittels der direkten Abgabe der Partikelbombardierung oder mittels Agrobacterium-Abgabe durch T-DNA erfolgen. Bei Verwendung des Sonnenblumen-Genotyps SMF3 als Beispiel werden Primärblätter aus Meristemexplantaten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, isoliert. Nach der Übernachtkultur dissektierter Samen auf 374E-Medium haben sich die Primärblätter verlängert. Diese werden entfernt und in das Zentrum steriler Petrischalen auf Filter, die mit 530-Medium (MS-Salze, B5-Vitamine, 3% Saccharose, 4 mg/l p-Chlorphenoxyessigsäure, pH 5,8) befeuchtet sind, in Vorbereitung der Partikelbombardierung platziert. Die Primärblattexplantate werden so über das Zentrum dieser Schalen verteilt, dass keine davon mit anderen überlappen. Die Partikelbombardierung wird genau so durchgeführt, wie es für die direkte DNA-Abgabe an Meristemexplantate beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass ein steriles 70 μm-Nitex-Gewebe über der Oberseite der Explantate platziert wird, um beim Verhüten einer Verschiebung während der Bombardierung zu helfen. Die abgegebene DNA könnte ein chimäres Gen, bestehend aus einem konstitutiven Promotor, wie z.B. SCP1, kombiniert mit dem selektierbaren Marker NPTII und der PINII-3'-Region, die das bevorzugte Wachstum transformierten Gewebes ermöglicht, umfassen. Alternativ könnte das WUS-Gen dem Gewebe einen Wachstumsvorteil verleihen, so dass ein selektierbarer Marker nicht erforderlich ist. Nach der Partikelbombardierung werden die Explantate für 3d auf Filtern kultiviert, die kontinuierlich mit 530-Medium befeuchtet werden, indem 0,5 ml zusätzliches Flüssigmedium je 24 h zugegeben werden. Sie werden in der Percival-Wachstumskammer im Licht unter einer Tageslänge von 18 h und bei 26°C kultiviert. Primärblattexplantate, die ein Wachstum gezeigt haben, werden dann auf 374E-Medium, enthaltend 50 mg/l Kanamycin, transferiert, wenn das selektierbare Markergen verwendet wurde, und werden für 2 bis 3 Wochen kultiviert, um die Bildung von transgenem Kallus und transgenen Sprossen zu ermöglichen. Kulturen, die nicht reagieren, werden alle zwei Wochen auf 374E mit 50 mg/l Kanamycin transferiert, bis gewinnbare Sprosse gebildet werden. Die Sprosse werden beprobt, selektiert und für das Gewächshaus erlangt, wie oben für Meristemexplantate beschrieben.
  • Sonnenblumen-Primärblätter können unter Verwendung von Agrobacterium mit geringfügigen Modifikationen an den obigen Protokollen transformiert werden. Die Explantate auf 530-Medium werden bombardiert, wie es für Meristemexplantate in der obigen Agrobacterium-Verfahrensweise beschrieben ist. Eine Agrobacterium-Suspension wird genau so hergestellt, wie es für Meristemexplantate beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass die Flüssigkultur 25 ml statt 5 ml ist. Die Agrobacterium-Zellen werden zentrifugiert, der Überstand an Wachstumsmedium wird verworfen und die Zellen werden zu einer berechneten OD600 von 0,6 in Inokulationsmedium resuspendiert. Primärblattexplantate werden in dieser Suspension für 10 min inokuliert, dann zurück auf 530-Medium gegeben und für 3d unter den oben beschriebenen Wachstumskammer-Bedingungen co-kultiviert. Die Explantate werden dann auf 374D-Medium (374E, 50 mg/l Kanamycin, 250 mg/l Cefotaxim) transferiert und für 2-3 Wochen kultiviert. Die Explantate können alle zwei Wochen auf frisches 374D-Medium transferiert werden, bis Sprosse gewonnen werden können.
  • BEISPIEL 6
  • Expression chimärer Gene in monokotylen Zellen
  • Ein chimäres Gen, das eine cDNA, die für das vorliegende Polypeptid codiert, in Sinnorientierung hinsichtlich des Mais-27 kD-Zein-Promotors, der 5' zu dem cDNA-Fragment lokalisiert ist, und das 10 kD-Zein-3'-Ende, das 3' zu dem cDNA-Fragment lokalisiert ist, umfasst, kann konstruiert werden. Das cDNA-Fragment dieses Gens kann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Polynukleotid-Primer erzeugt werden. Klonierungsstellen (NcoI oder SmaI) können in die Oligonukleotide eingebaut werden, um eine korrekte bzw. entsprechende Orientierung des DNA-Fragments bereitzustellen, wenn es in den verdauten Vektor pML103 insertiert wird, wie oben beschrieben. Dann wird eine Amplifikation in einer Standard-PCR durchgeführt. Die amplifizierte DNA wird dann mit dem Restriktionsenzymen NcoI und SmaI verdaut und an einem Agarosegel fraktioniert. Die entsprechende Bande kann aus dem Gel isoliert und mit einem 4,9 kb großen NcoI-SmaI-Fragment des Plasmids pML103 kombiniert werden. Das Plasmid pML103 ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) hinterlegt worden und trägt die Eingangsnummer ATCC 97366. Der DNA-Abschnitt aus pML103 enthält ein 1,05 kb großes SalI-NcoI-Promotorfragment des Mais-27 kD-Zein-Gens und ein 0,96 kb großes SmaI-SalI-Fragment aus dem 3'-Ende des Mais-10 kD-Zein-Gens im Vektor pGem9Zf(+) (Promega). Vektor und Insert-DNA können bei 15°C über Nacht ligiert werden, wie es im Wesentlichen beschrieben ist (Maniatis). Die ligierte DNA kann dann verwendet werden, um E. coli XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 BlueTM, Stratagene) zu transformieren. Bakterielle Transformanten können mittels Restriktionsenzymverdau von Plasmid-DNA und einer limitierten Nukleotidsequenzanalyse unter Verwendung des Didesoxyketten-Terminationsverfahrens (SequenaseTM-DNA-Sequenzierungskit; U.S. Biochemical) durchmustert werden. Das resultierende Plasmidkonstrukt würde ein chimäres Gen umfassen, das in 5'- nach 3'-Richtung für den Mais-27 kD-Zein-Promotor, ein cDNA-Fragment, das für das vorliegende Polypeptid codiert, und die 10 kD-Zein-3'-Region codiert.
  • Das oben beschriebene chimäre Gen kann dann mittels der folgenden Verfahrensweise in Maiszellen eingeführt werden. Unreife Maisembryonen können aus sich entwickelnden Karyopsen, die aus Kreuzungen der Mais-Inzuchtlinien H99 und LH132 stammen, dissektiert werden. Die Embryonen werden 10-11 Tage nach der Bestäubung isoliert, wenn sie 1,0 bis 1,5 mm lang sind. Die Embryonen werden dann mit der Achsenseite nach unten und in Kontakt mit Agarose-verfestigtem N6-Medium (Chu et al. (1975), Sci. Sin. Peking 18:659-668) platziert. Die Embryonen werden im Dunklen bei 27°C gehalten. Zerreiblicher embryogener Kallus, bestehend aus undifferenzierten Massen von Zellen mit somatischen Proembryoiden und Embryoiden, die an Suspensorstrukturen entstehen, proliferiert aus dem Scutellum dieser unreifen Embryonen. Der aus dem Primärexplantat isolierte embryogene Kallus kann auf N6-Medium kultiviert und auf diesem Medium alle 2 bis 3 Wochen subkultiviert werden.
  • Das Plasmid p35S/Ac (erhalten von Dr. Peter Eckes, Hoechst AG, Frankfurt, Deutschland) kann in Transformationsexperimenten verwendet werden, um einen selektierbaren Marker bereitzustellen. Dieses Plasmid enthält das Pat-Gen (siehe europäische Patentveröffentlichung 0 242 236 ), das für Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT) codiert. Das Enzym PAT verleiht eine Resistenz gegenüber Herbiziden-Glutaminsynthetase-Inhibitoren, wie z.B. Phosphinothricin. Das pat-Gen in p35S/Ac steht unter der Kontrolle des 35S-Promotors aus dem Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al. (1985), Nature 313:810-812) und der 3'-Region des Nopalinsynthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens.
  • Das Partikelbombardierungsverfahren (Klein et al. (1987), Nature 327:70-73) kann verwendet werden, um Gene in die Kalluskulturzellen zu transferieren. Gemäß diesem Verfahren werden Goldpartikel (1 μm Durchmesser) mit DNA gemäß der folgenden Technik beschichtet. 10 μg Plasmid-DNAs werden zu 50 μl einer Suspension von Goldpartikeln (60 mg/ml) gegeben. Calciumchlorid (50 μl einer 2,5 M-Lösung) und Spermidin-freie Base (20 μl einer 0,1 M-Lösung) werden zu den Partikeln gegeben. Die Suspension wird während der Zugabe dieser Lösungen gevortext. Nach 10 Minuten werden die Röhrchen kurz zentrifugiert (5 s bei 15.000 U/min), und der Überstand wird entfernt. Die Partikel werden in 200 μl absolutem Ethanol resuspendiert, wiederum zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Der Ethanol-Waschschritt wird erneut ausgeführt, und die Partikel werden in einem Endvolumen von 30 μl Ethanol resuspendiert. Ein Aliquot (5 μl) der DNA-beschichteten Goldpartikel kann im Zentrum einer Berstscheibe ("flying disc") vom Typ KaptonTM (Bio-Rad Labs) aufgegeben werden. Die Partikel werden dann mittels eines Geräts mit der Bezeichnung BiolisticTM PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules, CA) in das Maisgewebe beschleunigt, wobei ein Heliumdruck von 1000 psi, ein Spaltabstand von 0,5 cm und eine Flugdistanz von 1,0 cm angewendet werden.
  • Zur Bombardierung wird das embryogene Gewebe auf Filterpapier über Agaroseverfestigtem N6-Medium platziert. Das Gewebe wird als dünner Rasen angeordnet und bedeckt eine kreisförmige Fläche mit etwa 5 cm Durchmesser. Die das Gewebe enthaltende Petrischale kann in der Kammer der PDS-1000/He ungefähr 8 cm vor dem Stoppschirm platziert werden. Die Luft in der Kammer wird dann bis zu einem Vakuum von 28 Zoll Hg evakuiert. Der Macrocarrier wird mit einer Heliumschockwelle unter Verwendung einer Berstmembran beschleunigt, die birst, wenn der Heliumdruck im Schockrohr 1000 psi erreicht.
  • Sieben Tage nach der Bombardierung kann das Gewebe auf N6-Medium transferiert werden, das Bialaphos (5 mg pro Liter) enthält und dem Kasein oder Prolin fehlen. Das Gewebe setzt auf diesem Medium langsames Wachstum fort. Nach weiteren 2 Wochen kann das Gewebe auf frisches N6-Medium, das Bialaphos enthält, transferiert werden. Nach 6 Wochen können Gebiete von etwa 1 cm Durchmesser aus aktiv wachsendem Kallus auf einigen der Platten, die das Bialaphos-supplementierte Medium enthalten, identifiziert werden. Diese Kalli können das Wachstum fortsetzen, wenn sie auf dem Selektivmedium subkultiviert werden.
  • Pflanzen können aus dem transgenen Kallus regeneriert werden, indem zuerst Gewebecluster auf N6-Medium, supplementiert mit 0,2 mg pro Liter 2,4-D, transferiert werden. Nach zwei Wochen kann das Gewebe auf Regenerationsmedium (Fromm et al. (1990), Bio/Technology 8:833-839) transferiert werden.
  • BEISPIEL 7
  • Transformation und Regeneration von Maisembryonen
  • Unreife Maisembryonen aus Gewächshaus-Donor-Pflanzen werden mit einem Plasmid, enthaltend das Gen der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einem Promotor, bombardiert; dieser könnte ein schwacher Promotor, wie z.B. nos, ein induzierbarer Promotor, wie z.B. ln2, oder ein starker Promotor, wie z.B. Ubiquitin, plus ein Plasmid, enthaltend das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37), das eine Resistenz gegenüber dem Herbizid Bialaphos verleiht, sein. Die Transformation wird wie folgt durchgeführt.
  • Maiskolben werden 8-14 Tage nach der Bestäubung geerntet und in 30%iger Chlorox-Bleiche plus 0,5% Micro-Detergens für 20 Minuten oberflächensterilisiert und zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die unreifen Embryonen werden exzidiert und mit der Embryoachsenseite nach unten (Scutellumseite nach oben) zu 25 Embryonen pro Platte angeordnet. Diese werden auf 560L-Medium 4 Tage vor der Bombardierung im Dunklen kultiviert. Medium 560L ist ein N6-basiertes Medium, enthaltend Eriksson's Vitamine, Thiamin, Saccharose, 2,4-D und Sil bernitrat. Am Tag der Bombardierung werden die Embryonen für 4 Stunden auf 560Y-Medium transferiert und innerhalb der 2,5 cm -Zielzone angeordnet. Medium 560Y ist ein hochosmotisches Medium ("high osmoticum medium") (560L mit hoher Saccharose-Konzentration).
  • Ein Plasmidvektor, der das Gen der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit dem ausgewählten Promotor umfasst, wird konstruiert. Diese Plasmid-DNA plus Plasmid-DNA, die einen PAT-selektierbaren Marker enthält, wird auf Wolfram-Pellets von 1,1 μm (mittlerer Durchmesser) unter Anwendung einer CaCl2-Präzipitationsverfahrensweise wie folgt präzipitiert: 100 μl vorbereitete Wolframpartikel in Wasser, 10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg gesamt), 100 μl 2,5 M CaCl2, 10 μl 0,1 M Spermidin.
  • Jedes Reagens wird der Wolframpartikelsuspension sequenziell zugegeben, während diese auf dem Multitube-Vortexer gehalten wird. Das endgültige Gemisch wird kurz Ultraschallbehandelt und unter konstantem Vortexen für 10 Minuten inkubiert. Nach der Präzipitationszeitdauer werden die Röhrchen kurz zentrifugiert, die Flüssigkeit wird entfernt, es wird mit 500 μl 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden zentrifugiert. Wiederum wird die Flüssigkeit entfernt, und 105 μl 100% Ethanol werden zu dem endgültigen Wolframpartikel-Pellet gegeben. Für die Partikelkanonenbombardierung werden die Wolfram/DNA-Partikel kurz Ultraschallbehandelt, und es werden 10 μl auf das Zentrum jedes Macrocarriers aufgetüpfelt und für etwa 2 Minuten vor der Bombardierung trocknen gelassen.
  • Die Probenplatten werden 2 Ebenen über der Stoppplatte zur Bombardierung in einer DuPont-Helium-Partikelkanone positioniert. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss bei 750 psi, wobei eine Gesamtzahl von zehn Aliquots aus jedem Röhrchen der vorbereiteten Partikel/DNA entnommen wird. Als Kontrolle werden Embryonen mit DNA bombardiert, die den PAT-selektierbaren Marker, wie oben beschrieben, ohne das Gen der Erfindung enthalten.
  • Nach der Bombardierung werden die Embryonen für 2 Tage auf 560Y-Medium, einem N6-basierten Medium, gehalten, dann auf 560R-Selektionsmedium, ein N6-basiertes Medium, das 3 mg/l Bialaphos enthält, transferiert und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach näherungsweise 10 Wochen der Selektion werden Selektions-resistente Kallusklone für die PCR und Aktivität des interessierenden Gens beprobt. Relativ zur Kontrolle ist in das WUS-Gen enthaltenden Behandlungen das Wachstum stimuliert und steigen die Transformationsfrequenzen. Positive Linien werden auf 288J-Medium, ein MS-basiertes Medium mit niedrigeren Saccharose- und Hormonkonzentrationen, transferiert, um die Pflanzenregeneration zu initiieren. Nach der Reifung somatischer Embryonen (2-4 Wochen), werden gut entwickelte somatische Embryonen auf Medium zur Keimung transferiert und in den beleuchteten Kulturraum transferiert. Näherungsweise 7-10 Tage später werden sich entwickelnde Pflänzchen für 7-10 Tage auf Medium in Röhrchen transferiert, bis Pflänzchen gut etabliert sind. Die Pflanzen werden dann in Einsätze in Multitopfpaletten ("flats") (entsprechend einem 2,5''-Topf), die Topferde enthalten, transferiert und für 1 Woche in einer Wachstumskammer gezogen bzw. wachsen gelassen, nachfolgend weitere 1-2 Wochen im Gewächshaus gezogen, dann in "Classic 600"-Töpfe (1,6 Gallonen) transfe riert und bis zur Reife gezogen. Die Pflanzen werden auf die Expression des interessierenden Gens überwacht.
  • BEISPIEL 8
  • Ektopische Expression von Mais-WUS zum Induzieren von Organgenese
  • Unter Verwendung des Gentyps High type II als Beispiel, werden Embryonen isoliert und für 3-5 Tage auf 560P-Medium kultiviert. Zwölf Stunden vor der Bombardierung werden diese Embryonen auf hochosmotisches 560Y-Medium transferiert. Espressionskassetten, die die WUS-cDNA enthalten, werden dann zusammen mit einer Expressionskassette, die das Bar- oder Pat-Gen enthält, unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet für Partikelkanonentransformationen gut beschrieben sind, in die Scutellae dieser Embryonen co-eingeführt. Zwölf bis 24 Stunden nach der Bombardierung werden die Embryonen dann zurück auf 560P-Kulturmedium transferiert und im Dunklen bei 26°C inkubiert. Nach einwöchiger Kultur werden diese Embryonen auf 560R-Selektionsmedium verbracht. Die Kulturen werden dann alle zwei Wochen transferiert, bis transformierte Kolonien erscheinen. Die Expression von WUS wird die Adventivmeristem (Spross) -Bildung stimulieren. Dies wird offensichtlich werden, wenn die Kulturen mit Kontrollen (transformiert ohne die WUS-cDNA oder nicht induziert) verglichen werden. Unter Verwendung von entweder induzierbaren Expressionskassetten, Gewebespezifischen Promotoren oder Promotoren variierender Stärken wird es möglich, die Level der Expression zu kontrollieren, um die Bildung von Adventivmeristemen zu maximieren. Unter Verwendung von entweder nicht-antwortenden bzw. nicht-reagierenden Gentypen oder suboptimalen Kulturbedingungen bei antwortenden bzw. reagierenden Genotypen werden nur die transformierten Zellen, die die WUS-cDNA exprimieren, Meristeme bilden und Pflanzen regenerieren. Für Experimente, in denen WUS-induzierte Sprossproliferation über eine ektopische Meristembildung auftritt, kann WUS als positiver selektiver Phänotyp verwendet werden, und ein Selektionsmittel ist im Medium nicht erforderlich. Auf diese Weise kann das WUS-Gen als positiver selektiver Marker verwendet werden (nur die Zellen, die die cDNA exprimieren, werden Sprossmeristeme bilden), und Transformanten können ohne ein negatives Selektionsmittel (d.h., Bialaphos, Basta, Kanamycin usw.) gewonnen werden.
  • BEISPIEL 9
  • Transiente Expression des WUS-Genprodukts zum Induzieren einer Sprossorganogenese
  • Es kann wünschenswert sein, die Meristembildung durch transientes Exprimieren des WUS-Genproduktes zu "kick-starten". Dies kann bewirkt werden, indem 5'-gecappte polyadenylierte WUS-RNA, Expressionskassetten, die WUS-DNA enthalten, oder WUS-Gen abgegeben bzw. bereitgestellt werden. Alle diese Moleküle können unter Verwendung einer Biolistics-Partikelkanone abgegeben werden. Beispielsweise kann 5'-gecappte polyadenylierte WUS-RNA in vitro unter Verwendung des mMessage mMachine-Kits von Ambion leicht hergestellt werden. Nach der oben dargelegten Verfahrensweise wird RNA zusammen mit DNA, die eine agronomisch nützliche Expressionskassete enthält, co-abgegeben. Die Zellen, die die RNA empfan gen, werden sofort Sprossmeristeme bilden, und ein großer Teil von diesen wird das agronomische Gen integriert haben. Pflanzen, die aus diesen Embryonen regeneriert werden, können dann auf das Vorhandensein des agronomischen Gens durchmustert werden.
  • BEISPIEL 10
  • Mais-Meristemtransformation
  • Meristemtransformationsprotokolle beruhen auf der Transformation von Apikalinitialen oder Zellen, die Apikalinitiale nach Reorganisation aufgrund einer Verletzung oder Selektionsdrucks werden können. Die Vorläufer bzw. Vorfahren dieser Apikalinitialen differenzieren sich, um die Gewebe und Organe der reifen Pflanze (d.h., Blätter, Stängel, Ähren bzw. Kolben, Farnen usw.) zu bilden. Die Meristeme der meisten Angiospermen sind geschichtet, wobei jede Schicht ihren eigenen Satz an Initialen hat. Normalerweise mischen sich diese Schichten im Sprossapex selten. In Mais differenziert sich die äußere Schicht des Apikalmeristems, die L1, um die Epidermis zu bilden, während die Abkömmlinge bzw. Nachfahren von Zellen in der inneren Schicht, der L2, zur Entstehung innerer Pflanzenteile, einschließlich der Gameten, führen. Die Initialen in jeder dieser Schichten sind einzig durch die Position definiert und können durch benachbarte Zellen ersetzt werden, wenn sie getötet oder beeinträchtigt werden. Die Meristemtransformation targetiert häufig eine Teilmenge der Population an Apikalinitialen, und die resultierenden Pflanzen sind chimär. Wenn z.B. 1 von 4 Initialen in der L1-Schicht des Meristems transformiert wird, würde nur 1/4 der Epidermis transformiert sein. Selektionsdruck kann angewendet werden, um Sektoren zu vergrößern, aber diese Selektion muss nicht letal sein, da eine große Gruppe von Zellen für die Meristemfunktion und das Meristemüberleben erforderlich ist. Die Transformation einer Meristemzelle mit einer WUS-Sequenz unter der Expression eines Promotors, der im Apikalmeristem aktiv ist (entweder Meristem-spezifisch oder konstitutiv), würde es den tranformierten Zellen erlauben, die Initiierung neuer Apikalinitialen erneut zu steuern, wobei das Meristem in Richtung der Homogenität getrieben und die chimäre Natur des Pflanzenkörpers minimiert wird. Um dies zu zeigen, wird die WUS-Sequenz in eine Kassette mit einem Promotor, der innerhalb des Meristems aktiv ist (d.h., entweder ein starker konstitutiver Mais-Promotor, wie z.B. der Ubiquitin-Promotor, einschließlich des ersten Ubiqutin-Introns, oder ein Promotor, der in meristematischen Zellen aktiv ist, wie z.B. der Maishiston-, cdc2- oder Actin-Promotor) kloniert. Embryonen in der Blattkeimscheiden- bzw. Coleoptilenstufe werden isoliert und mit dem Meristem nach oben auf einem Reifungsmedium mit hohem Saccharosegehalt (siehe Lowe et al., 1997, in Genetic Biotechnology and Breeding of Maize and Sorghum, AS Tsaftaris, Hrsg. Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, S. 94-97) ausplattiert. Die WUS-Expressionskassette zusammen mit einem Reporterkonstrukt, wie z.B. Ubi:GUS:pinII, kann dann (vorzugsweise 24 Stunden nach der Isolation) in den exponierten apikalen Wachstumskegel co-abgegeben werden, wobei herkömmliche Partikelkanonen-Transformationsprotokolle angewendet werden. Als Kontrolle kann das WUS-Konstrukt durch eine äquivalente Menge an pUC-Plasmid-DNA ersetzt werden. Nach einer Woche bis 10 Tagen der Kultur auf Reifungs medium können die Embryonen auf ein Saccharose-armes, Hormon-freies Keimungsmedium transferiert werden. Blätter aus den sich entwickelnden Pflänzchen können für die GUS-Färbung verwendet bzw. geopfert werden. Eine transiente Expression der WUS-Sequenz in Meristemzellen, durch die Bildung neuer Apikalinitialen, wird in breiteren Sektoren oder vollständig transformierten Meristemen resultieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Keimbahntransformation erhöht wird. Die Integration und Expression der WUS-Sequenz wird den exprimierenden Zellen einen kompetitiven Vorteil verleihen, was in einer progressiven Vergrößerung des transgenen Bereichs resultiert. Aufgrund der WUS-induzierten Aufrechterhaltung von Apikalinitialen und des Wachstums ihrer transformierten Derivate werden sie die Wildtyp-Meristemzellen verdrängen bzw. ersetzen, wenn die Pflanze das Wachstum fortsetzt. Das Ergebnis wird sowohl die Vergrößerung transgener Bereiche in einer gegebenen Zellschicht (d.h., periclinale Expansion) als auch in benachbarte Zellschichten hinein (d.h., anticlinale Invasionen) sein. Da Zellen, die das WUS-Gen exprimieren, einen zunehmend großen Teil des Meristems besitzen, steigt die Frequenz der Transgen-Keimbahnvererbung entsprechend an. Eine Anwendung von WUS auf diese Weise auf Zielmeristeme wird die Transformationsraten relativ zur Kontrollbehandlung erhöhen. Embryos in der Blattkeimscheidenstufe, verwendet als eine Quelle für Meristeme, werden als Beispiel verwendet, aber andere Meristemquellen, z.B. unreife Blütenstände, könnten ebenso verwendet werden.
  • BEISPIEL 11
  • Expression von chimären Genen in dikotylen Zellen
  • Eine Samen-spezifische Expressionskassette, bestehend aus dem Promotor und dem Transkriptionsterminator aus dem Gen, das für die β-Untereinheit des Samenspeicherproteins Phaseolin aus der Bohne Phaseolus vulgaris codiert (Doyle et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:9228-9238), kann zur Expression der vorliegenden Polypeptide in transformierter Sojabohne verwendet werden. Die Phaseolin-Kassette umfasst etwa 500 Nukleotide stromaufwärts (5') des Translationsinitiationskodons und etwa 1650 Nukleotide stromabwärts (3') des Translations-Stoppkodons von Phaseolin. Zwischen den 5'- und 3'-Regionen sind die einzigartigen bzw. singulären Restriktionsendonukleasestellen NcoI (welche das ATG-Translationsinitiationskodon umfasst), SmaI, KpnI und XbaI. Die gesamte Kassette wird von HindIII-Stellen flankiert.
  • Das cDNA-Fragment dieses Gens kann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) des cDNA-Klons unter Verwendung geeigneter Oligonukleotid-Primer erzeugt werden. Die Klonierungsstellen können in die Oligonukleotide eingebaut werden, um eine entsprechende Orientierung des DNA-Fragments, wenn es in den Expressionsvektor insertiert wird, bereitzustellen. Die Amplifikation wird dann durchgeführt, wie es oben beschrieben ist, und das isolierte Fragment wird in einen pUC18-Vektor, der die Samenexpressionskassette trägt, insertiert.
  • Dann können Sojabohnenembryonen mit dem Expressionsvektor, der Sequenzen, die für die vorliegenden Polypeptide codieren, umfasst, transformiert werden. Um somatische Embryonen zu induzieren, können Keimblätter, 3-5 mm lang, aus Oberflächen-sterilisierten, unreifen Samen des Sojabohnenkultivars A2872 dissektiert, unter Licht oder im Dunklen bei 26°C auf einem geeigneten Agarmedium für 6-10 Wochen kultiviert werden. Somatische Embryonen, die Sekundärembryonen erzeugen, werden dann exzidiert und in ein geeignetes Flüssigmedium gegeben. Nach wiederholter Selektion auf Cluster somatischer Embryonen, die sich als Embryonen der frühen, globulären Stufe vervielfältigten, werden die Suspensionen aufrecht erhalten, wie es nachstehend beschrieben ist.
  • Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können in 35 ml Flüssigmedien auf einem Rotationsschüttler bei 150 U/min, bei 26°C unter Fluoreszenzlampen mit einem 16:8-Stunden-Tag/Nacht-Zeitplan aufrechterhalten werden. Die Kulturen werden alle zwei Wochen subkultiviert, indem näherungsweise 35 mg Gewebe in 35 ml Flüssigmedium inokuliert werden.
  • Embryogene Sojabohnen-Suspensionskulturen können dann mittels des Verfahrens der Partikelkanonenbombardierung (Klein et al. (1987), Nature (London), 327:70-73, US-Patent Nr. 4 945 050 ) transformiert werden. Ein Instrument vom Typ DuPont BiolisticTM PDS1000/HE (Helium-Nachrüstung) kann für diese Transformation verwendet werden.
  • Ein selektierbares Markergen, das zum Erleichtern der Sojabohnentransformation verwendet werden kann, ist ein chimäres Gen, bestehend aus dem 35S-Promotor aus Blumenkohlmosaikvirus (Odell et al. (1985), Nature 313:810-812), dem Hygromycin-Phosphotransferase-Gen aus dem Plasmid pJR225 (aus E. coli; Gritz et al. (1983), Gene 25:179-188) und der 3'-Region des Nopalin-Synthase-Gens aus der T-DNA des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens. Die Samenexpressionskassette, umfassend die Phaseolin-5'-Region, das Fragment, das für das vorliegende Polypeptid codiert, und die Phaseolin-3'-Region, kann als ein Restriktionsfragment isoliert werden. Dieses Fragment kann dann in eine singuläre Restriktionsstelle des Vektors, der das Markergen trägt, insertiert werden.
  • Zu 50 μl einer 60 mg/ml Suspension von 1 μm-Goldpartikeln werden (in dieser Reihenfolge) gegeben: 5 μl DNA (1 μg/ml), 20 μl Spermidin (0,1 M) und 50 μl CaCl2 (2,5 M). Die Partikelzubereitung wird dann für drei Minuten geschüttelt, in einer Mikrozentrifuge für 10 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden dann einmal in 400 μl 70% Ethanol gewaschen und in 40 μl wasserfreiem Ethanol resuspendiert. Die DNA/Partikel-Suspension kann dreimal für je eine Sekunde Ultraschallbehandelt werden. 5 μl der DNA-beschichteten Goldpartikel werden dann auf jede Macrocarrier-Scheibe geladen.
  • Näherungsweise 300-400 mg einer zwei Wochen alten Suspensionskultur werden in eine leere Petrischale von 60×15 mm gegeben, und die restliche Flüssigkeit wird mit einer Pipette vom Gewebe entfernt. Für jedes Transformationsexperiment werden normalerweise näherungsweise 5-10 Platten bombardiert. Der Membranberstdruck wird auf 1100 psi eingestellt, und die Kammer wird auf ein Vakuum von 28 Zoll Quecksilber(säule) evakuiert. Das Gewebe wird näherungsweise 3,5 Zoll vom Rückhalteschirm entfernt angeordnet und dreimal bombardiert. Nach der Bombardierung kann das Gewebe hälftig geteilt werden und in Flüssigkeit bzw. Flüssigmedium zurückgegeben und wie oben beschrieben kultiviert werden.
  • Fünf bis sieben Tage nach der Bombardierung können die Flüssigmedien durch frische Medien und elf bis zwölf Tage nach der Bombardierung durch frische Medien, enthaltend 50 mg/ml Hygromycin, ersetzt werden. Diese Selektivmedien können wöchentlich aufgefrischt werden. Sieben bis acht Wochen nach der Bombardierung kann grünes transformiertes Gewebe beobachtet werden, das aus nicht-transformierten, nekrotischen, embryogenen Cluster (hraus-) wächst. Isoliertes grünes Gewebe wird entfernt und in einzelne Kolben inokuliert, um neue, klonal propagierte, transformierte embryogene Suspensionskulturen zu erzeugen. Jede neue Linie kann als ein unabhängiges Transformationsereignis behandelt werden. Diese Suspensionen können dann subkultiviert und als Cluster unreifer Embryonen aufrecht erhalten oder zu vollständigen Pflanzen durch Reifung und Keimung einzelner somatischer Embryonen regeneriert werden.
  • BEISPIEL 12
  • Expression chimärer Gene in mikrobiellen Zellen
  • Die cDNAs, die für die vorliegenden Polypeptide codieren, können in den T7-E. coli-Expressionsvektor pBT430 insertiert werden. Dieser Vektor ist ein Derivat von pET-3a (Rosenberg et al. (1987), Gene 56:125-135), welches/welcher das Bakteriophagen-T7-RNA-Polymerase/T7-Promotor-System einsetzt. Das Plasmid pBT430 wurde konstruiert, indem zunächst die EcoRI und HindIII-Stellen in pET-3a in ihren ursprünglichen Positionen zerstört wurden. Ein Oligonukleotid-Adaptor, enthaltend EcoRI- und HindIII-Stellen, wurde an der BamHI-Stelle von pET-3a insertiert. Dies erzeugte pET-3aM mit zusätzlichen einzigartigen bzw. singulären Klonierungsstellen zur Insertion von Genen in den Expressionsvektor. Dann wurde die NdeI-Stelle an der Position der Translationsinitiation in eine NcoI-Stelle umgewandelt, wobei Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese verwendet wurde. Die DNA-Sequenz von pET-3aM in dieser Region, 5'-CATATGG, wurde zu 5'-CCCATGG in pBT430 umgewandelt.
  • Plasmid-DNA, die cDNA enthält, kann in geeigneter Weise verdaut werden, um ein das Protein codierendes Nukleinsäurefragment freizusetzen. Dieses Fragment kann dann an einem 1%igen niederschmelzenden Agarosegel gereinigt werden. Puffer und Agarose enthalten 10 μg/ml Ethidumbromid zur Sichtbarmachung des DNA-Fragments. Das Fragment kann dann aus dem Agarosegel mittels Verdau mit GELaseTM (Epicentre Technologies, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt, Ethanol-gefällt, getrocknet und in 20 μl Wasser resuspendiert werden. Geeignete Oligonukleotid-Adapter können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs (NEB), Beverley, MA) an das Fragment ligiert werden. Das die ligierten Adapter enthaltende Fragment kann von den überschüssigen Adapter gereinigt werden, wobei niederschmelzende Agarose wie oben beschrieben verwendet wird. Der Vektor pBT430 wird verdaut, mit alkalischer Phosphatase (NEB) dephosphoryliert und mit Phenol/Chloroform wie oben beschrieben deproteiniert. Der vorbereitete Vektor pBT430 und das Fragment können dann bei 16°C für 15 Stunden ligiert werden, gefolgt von einer Transformation in Elektrokompetente DH5-Zellen (GIBCO BRL). Transformanten können auf Agarplatten, die LB-Medium und 100 μg/ml Ampicillin enthalten, selektiert werden. Transformanten, die das Gen, das für das vorliegende Polypeptid codiert, enthalten, werden dann auf die korrekte Orientierung hinsichtlich des T7-Promotors mittels Restriktionsenzymanalyse durchmustert.
  • Für eine Expression auf hohem Level kann ein Plasmidklon mit dem cDNA-Insert in der korrekten Orientierung relativ zu dem T7-Promotor in den E. coli-Stamm BL21(DE3) (Studier et al. (1986), J. Mol. Biol. 189:113-130) transformiert werden. Die Kulturen werden in LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 mg/l), bei 25°C gezüchtet. Bei einer optischen Dichte bei 600 nm von näherungsweise 1, kann IPTG (Isopropylthio-β-galactosid, der Induktor) in einer Endkonzentration von 0,4 mM zugesetzt und die Inkubation für 3 h bei 25°C fortgesetzt werden. Die Zellen werden dann mittels Zentrifugation geerntet und in 50 μl 50 mM Tris-HCl bei pH 8,0 enthaltend 0,1 mM DTT und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, resuspendiert. Eine kleine Menge von 1 mm Glaskügelchen kann zugegeben und das Gemisch 3 Mal für jeweils etwa 5 Sekunden mit einem Mikrosonden-Ultraschallbehandlungsgerät Ultraschall-behandelt werden. Das Gemisch wird zentrifugiert, und der Proteingehalt des Überstands wird bestimmt. 1 μg Protein aus der löslichen Fraktion der Kultur kann mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt werden. Die Gele können hinsichtlich Banden, die mit dem erwarteten Molekulargewicht wandern, beobachtet werden.
  • BEISPIEL 13
  • Anwendung des Flp/Frt-Systems zum Exzidieren der WUS-Kassette
  • In Fällen, in denen das WUS-Gen integriert und die WUS-Expression bei der Gewinnung transgener Maispflanzen nützlich ist (d.h., unter Bedingungen, bei denen die kontinuierliche Expression von WUS die Adventivmeristembildung fördert), aber schlussendlich im Endprodukt nicht gewünscht ist, kann die WUS-Expressionskassette (oder ein beliebiger Teil davon, der von geeigneten FRT-Rekombinationssequenzen flankiert wird) unter Verwendung einer FLP-vermittelten Rekombination (siehe US-Patentanmeldung 08/972 258 , eingereicht am 18. November 1997, und WO99/25841, veröffentlicht am 27. Mai 1999) exzidiert werden.
  • Die obenstehenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung zu erläutern, beschränken aber ihren Umfang nicht. Andere Varianten der Erfindung werden für Durchschnittsfachleute auf dem Gebiet in einfacher Weise offensichtlich sein und sind von den angehängten Ansprüchen umfasst.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (31)

  1. Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das mindestens 100 Aminosäuren umfasst, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 basierend auf der Clustal-Alignment-Methode mindestens 80% Identität aufweisen; wobei die folgenden vorgegebenen Parameter in der Clustal-Alignment-Methode benutzt werden: KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 und DIAGONALS SAVED = 5; und wobei das Polypeptid ein WUS-Protein ist, das imstande ist, das in-vitro-Wachstum von Pflanzengewebe zu stimulieren.
  2. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids und SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 eine Sequenzidentität von mindestens 90 oder 95% besitzt.
  3. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid SEQ ID NO:6 oder SEQ ID NO:8 umfasst.
  4. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 umfasst.
  5. Die Ergänzung des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Ergänzung und das Polynukleotid aus der gleichen Anzahl von Nukleotiden bestehen und zu 100% komplementär sind.
  6. Isoliertes Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Polynukleotid eine funktionelle RNA ist.
  7. Die Ergänzung nach Anspruch 5, wobei die Ergänzung eine funktionelle RNA ist.
  8. Verfahren zur vorübergehenden Modulation des Spiegels von WUS-Protein in einer Pflanzenzelle, das die Einbringung des isolierten Polynukleotids nach Anspruch 6 in die Pflanzenzelle umfasst.
  9. Verfahren zur vorübergehenden Modulation des Spiegels von WUS-Protein in einer Pflanzenzelle, das die Einbringung der Ergänzung nach Anspruch 7 in die Pflanzenzelle umfasst.
  10. Chimäres Gen, das das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1-4 in funktioneller Verknüpfung an eine geeignete Regulatorsequenz umfasst.
  11. Transgene Pflanze, die das chimäre Gen nach Anspruch 10 umfasst.
  12. Transgene Pflanze nach Anspruch 11, wobei die Pflanze Mais, Soja, Weizen, Reis, Alfalfa, Sonnenblume, Raps oder Baumwolle ist.
  13. Samen der transgenen Pflanze nach Anspruch 11, die das chimäre Gen nach Anspruch 10 umfasst.
  14. Samen nach Anspruch 13, wobei der Samen von Mais, Soja, Weizen, Reis, Alfalfa, Sonnenblume, Raps oder Baumwolle ist.
  15. Isoliertes Polypeptid, codiert durch die Nukleotidsequenz, die von dem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1-4 umfasst ist.
  16. Verfahren zur vorübergehenden Modulation des Spiegels von WUS-Protein in einer Pflanzenzelle, das die Einbringung des isolierten Polypeptids nach Anspruch 15 in die Pflanzenzelle umfasst.
  17. Verfahren zur Induktion von Meristem-Wachstum in einer Pflanzenzelle, das die Einbringung des isolierten Polypeptids nach Anspruch 15 in die Pflanzenzelle umfasst.
  18. Verfahren zur Induktion von Meristem-Wachstum in einer Pflanzenzelle, umfassend: (a) Transformation der Pflanzenzelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 10, und (b) Expression des Polypeptids nach Anspruch 15 für eine ausreichende Zeit, um Meristem-Wachstum zu erzeugen.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, das weiter das Züchten des Meristems unter Pflanzenzüchtungsbedingungen zur Erzeugung einer regenerierten Pflanze umfasst.
  20. Verfahren zur positiven Selektion einer transformierten Pflanzenzelle, umfassend: (a) Transformation der Pflanzenzelle mit dem chimären Gen nach Anspruch 10, und (b) Züchtung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids nach Anspruch 15 für eine ausreichende Zeit erlauben, um die Organogenese zu induzieren, um ein Mittel zur positiven Selektion bereitzustellen.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Polynukleotid nach den Ansprüchen 1-4 ausgeschnitten ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Polynukleotid von FRT-Sequenzen flankiert ist, um FLP vermitteltes Ausschneiden des Polynukleotids zu erlauben.
  23. Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle, das eine Einbringung des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1-4 in die Zelle umfasst.
  24. Transgene Wirtszelle, die das chimäre Gen nach Anspruch 10 umfasst.
  25. Verfahren zur Transformation einer Wirtszelle, das die Einbringung der Ergänzung nach Anspruch 5 in die Zelle umfasst.
  26. Verfahren nach Anspruch 23 oder 25, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
  27. Zelle nach Anspruch 24, die eine Pflanzenzelle ist.
  28. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 15 zur transienten Modulation des Spiegels von WUS-Protein in einer Pflanzenzelle.
  29. Verwendung eines chimären Gens nach Anspruch 10 oder eines Polypeptids nach Anspruch 15 zur Induktion von Meristem-Wachstum in einer Pflanzenzelle.
  30. Verwendung eines chimären Gens nach Anspruch 10 zur positiven Selektion einer transformierten Pflanzenzelle.
  31. Verwendung des isolierten Polynukleotids nach Anspruch 1 zur Stimulierung von in-vitro-Wachstum von Pflanzengewebe oder zur Verbesserung der Transformation einer Pflanze.
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